FMR1 Sizing Kit Manuál

FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
TM
FastFraX
FMR1 Sizing Kit
Katalogové číslo: F2-050-V
Manuál
Pro In vitro diagnostiku
Skladování:
2-8°C pro okamžité použití
≤ -20°C pro dlouhodobé skladování
Chraňte před světlem
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
1. Úvod
Syndrom fragilního X (FXS) je způsoben mutacemi v genu FMR1 (fragile X mental retardation 1
gene) na chromozomu X. Mutace způsobuje expanzi CGG repetic v 5´regionu (UTR-untranslated
region) genu FMR1 a spolu s jejich možnou metylací má za následek umlčení genu a zastavení
produkce FMR1 proteinu. Inaktivace genu FRM1 má za následek nulovou expresi FMR1 proteinu
(FMRP) [1], který se dominantně vyskytuje v neuronech, kde se podílí na stabilitě, transportu a
translaci mRNA. FMRP má významnou roli v synaptické plasticitě a dendritickém rozvoji [2].
Umlčení FMRP má za následek manifestaci FXS, což je je jedna z nejčastějších příčin dědičné
mentální poruchy [3].
Na základě závažnosti mutace rozdělujeme pacienty do následujících genotypů: normální, šedá
zóna, premutace a plná mutace. Typ genotypu určuje klinickou závažnost FXS [4]. Plná mutace
alel s počtem repetic větším než 200 a s methylací vede klasicky k přítomnosti FXS, takto
postižení jedinci vykazují kognitivní poruchy, autismus, a poruchy chování, jako je porucha
pozornosti s hyperaktivitou (ADHD). Nosiči premutovaných alel (55-200 repetic) nemají
vyvinutou FXS, ale hrozí jim jiné zdravotní problémy v dospělosti, jako je S fragilním X asociovaná
primární ovariální nedostatečnost (FXPOI) u žen a tremor/ataxie (FXTAS) u obou pohlaví.
Důležité je, že ženy přenašečky s premutací mají riziko přenosu plné mutace na své děti.
Jedinci s normálním počtem repetic (6 až 44) mají normální hladinu FMRP a jsou klinicky
nepostižení. Jedince z šedé zóny (intermediate 45 až 54 repetic) najdeme v zóně mez
normálními a premutovanými jedinci a jsou svázáni s repetiční instabilitou, ačkoliv asociace
s fenotypovým projevem je stále nejasná.
Vzhledem k rozsahu FXS-souvisejících poruch a jejich značnému vlivu, je genetické testování
důležité pro potvrzení klinické diagnózy FXS a souvisejících poruch a k identifikaci nosičů
expandovaných alel, kteří plánují rodinu.
Interpretace FXS alelické klasifikace
Velikost CGG repetice v genu FMR1 od normální po intermediate je v obecné populace vysoce
polymorfní a to v rozmezí od přibližně 5 do 50 repetic s nejvyšším výskytem repetic 29-30.
Aktuální guideline American College of medical Genetics [5] definují čtyři FMR1 alelické formy:
i.
ii.
iii.
iv.
Normální (NL), přibližně 5-44 repetic;
Intermediate (IM), přibližně 45-54 repetic;
Premutace (PM), přibližně 55-200 repetic; a
Plná mutace (FM), vice než 200 repetic.
Stávající metody FXS testování
CGG repetice v FMR1 se obvykle detekuje analýzou Southern blot jako velká GC-bohatá
repetice. Standardní PCR techniky neumožňují amplifikaci nad ~ 100 repetic, což má za následek,
že velké premutace a plné mutací nejsou detekovány, protože dochází k přednostní amplifikaci
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
menších alel (repetic). Navíc, ženské vzorky homozygotní pro FMR1 musí být doanalyzovány
pomocí Southern blotu, aby se vyloučila možnost nezjištěné expandované alely. Southern blot
analýza, na druhé straně, je pracná, časově náročná, a vyžaduje velké množství DNA. Rozlišení
Southern blot analýzy je také nízké. Tyto metody jsou proto nevhodné pro rutinní testování a /
nebo screening FMR1 CGG expanse u velkého množství vzorků.
FastFraXTM FMR1 Sizing Kit řeší problémy pro sizing analýzu CGG repetitivního region genu
FMR1. CGG opakování v genu FMR1 jsou amplifikovány triplet-primed PCR následovanou
fragmentační analýzou na kapilární elektroforéze (CE). Metodika kitu umožňuje sizování až 200
CGG repetic a detekci alel s > 200 repetic. Souprava také dává určitou informaci o umístění AGG
přerušení v CGG oblasti. Použitím kitu lze take rozlišit zygositu u žen.
2. Skladování a použití
Reagencie mohou být skladovány při 2-8°C v případě, že budete okamžitě používat a při -20°C
při dlouhodobém skladovaní. Před otevřením zkumavek je krátce centrifugujte, abyste
odstranili kapky z víčka. Přípravu reakčních mixů je možné provádět při laboratorní teplotě.
3. Použití
FastFraXTM FMR1 Sizing kit amplifikuje CGG repetice v 5´- netranslačního regionu FMR1 a
detekuje tak expanzi CGG repetic v tomto regionu. Použití kitu pro stanovení CGG repetic v
množství až 200 a detekci alel s > 200 repeticemi. Test využívá přímé triplet-primed
polymerázové řetězové reakce (dTP-PCR) genomové DNA, následovanou fragmentační
analýzou na Genetickém analyzátoru Applied Biosystems, k určení počtu CGG repetic. Tento
test je určen pro profesionální použití v klinických laboratořích, pro pomoc při diagnóze
syndromu fragilního X a jiných souvisejících stavů, jako je s fragilním X vázaná primární
ovariální nedostatečnost a s fragilním X související tremor / ataxie.
4. Princip testu
Konvenčně se pro detekci fragilního X a počtu repetic CGG ve FMR1 genu využívá kombinace
obvyklých metod PCR a southern blot analýzy. Nicméně, tento pracovní postup je nevhodný
při velkém počtu rutinních testů, protože je časově náročný, nákladný a vyžaduje častý zásah
uživatele. FastFraX™ FMR1 kit překonává tyto nevýhody pomocí vylepšení běžných metod
PCR bez nutnosti provedení Southern blottingu. V sofistikované strategii detekce kitem jsou
použity inovativní PCR techniky pro zvýšení citlivosti a specifičnosti a zároveň se snižuje
celkové zatížení a náklady.
FastFraX™ FMR1 Sizing Kit poskytuje test k určení počtu CGG repetic uvnitř repetitivně
oblasti CGG genu FMR1, a také k určení polohy AGG přerušení v rámci CGG repetitivně
oblasti jak pro mužské tak i pro ženské vzorky.
POZNÁMKA: Jako screeningový test doporučujeme použít FastFraX™ FMR1 Identification Kit,
který poskytuje efektivnější přístup k rutinnímu testování expandovaných FMR1 alel. Jako
konfirmační test lze použít Fastrax™ FMR1 Methylation kit, který poskytuje další informace,
včetně velikosti repetice a methylačního statusu u mužských a ženských vzorků.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
FastFraXTM Sizing kit využívá dTP-PCR a CE pro sizovaní FMR1 alel
FastFraX ™ FMR1 Sizing Kit využívá dTP-PCR, která zahrnuje kombinaci amplifikací
primovaných zevnitř opakování CGG. Sady použitých primerů jsou navrženy tak, aby
amplifikovaly od 3 'konce repetitivní oblasti CGG nemodifikované genomové DNA. Po
amplifikaci jsou nepurifikované PCR amplikony denaturovány přídavkem Hi-Di formamidu a
sizovány za použití kapilární elektroforézy společně s ROX 1000 size standardu. Amplikony
jsou sizovány na libovolném Applied Biosystems genetickém analyzátoru na POP-7 polymeru.
U expandovaných alel lze pozorovat elektroferogram mnoha píků, které odpovídají počtu
FMR1 CGG repeticím přítomným ve vzorku. Vzhledem k tripletovému opakování CGG v
repetitivní oblasti jsou amplifikační píky v elektroforeogramu od sebe periodicky vzdáleny 3páry bází (obr. 1). Spočítáním píků lze určit počet CGG repetic (viz oddíl 9: Analýza dat).
Ženský vzorek s plnou
mutací
(GM07537)
29 (9+9+9)/>200rpts
Obrázek 1. Amplifikační píky získané kapilární elektroforézou pro dTP-PCR. Píky vykazují
periodicitu po 3-párech bází.
Elektroforeogramy získané kapilární elektroforézou rovněž ukazují kontinuitu CGG repetic v
regionu. Přítomnost vložené AGG sekvence v CGG repetitivním regionu vede k produkci
klastrů píku oddělených mezerami bez produktu amplifikace. Kromě toho lze identifikovat
ženskou zygositu z profilu píků.
Použití kontrol v každém runu
Doporučujeme přidání pozitivní a negativní kontroly do každého runu pro zajištění integrity
reagencií a Genetického analyzátoru. Negativní netemplátová kontrola obsahuje všechny
reagencie vyjma genomové DNA. Jako pozitivní kontrolu doporučujeme použít ženský vzorek
s plnou mutací (viz sekce 5: Materiál)
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
5. Materiál
Reagencie, které jsou součástí kitu (5 zkumavek)
Tabulka 1. Reagenci dodané v kitu.
Katalogové číslo.
Komponenta
Počet zkumavek Objem
F2-PRI-01
Sizing Primer Mix
1
50 µl
F2-PCR-02
Sizing PCR Mix A
1
125 µl
FX-PCRB-02
Sizing PCR Mix B
1
375 µl
FX-TAQ-02
Taq Polymerase
1
50 µl
FX-TAQP-01
Taq Plus
1
50 µl
Počet reakcí
- Množství reagencií dodaných v kitu je dostatečné pro více než 50 reakcí.
- Doporučujeme připravovat master mixy pro přesný počet vzorků v runu.
Doporučené pozitivní kontroly (Nejsou součástí kitu)
- Ženský vzorek s plnou mutací (NA07537 z Coriell Cell Repositories)
Další reagencie (Nejsou součástí kitu)
- Reagencie pro izolaci genomové DNA
- Nuclease-free voda
Materiál pro kapilární elektroforézu (Není součástí kitu)
- Genetický analyzátor Applied Biosystems s 50 cm kapilárou, POP7 polymerem pro ABI
3130xl, 3730xl nebo 3500 DNA Analyzer kalibrované na DS-30, DS-31, DS-33 nebo DS-40
dyeset.
POZNÁMKA: Dyeset musí být zvolen tak, aby byl vhodný pro použitý size standard.
- Pro ABI 3730xl: 96-well Plate Septa, Plate Reatiner (septa seal) a Plate Base (septa seal),
Applied Biosystems #4315933, #4334869, #4334873.
POZNÁMKA: Používejte vhodný spotřební materiál pro každý ABI DNA analyzátor dle
doporučení výrobce.
- Hi-DiTM Formamide: Applied Biosystems, #4311320 nebo ekvivalentní.
- MapMarker® 1000-ROX: Bioventures, #MM-1000-ROX. Mohou být použity i ostatní ROX
nebo LIZ-značené size standardy s velikostí až do 1000 bp, pokud splňují denaturační
podmínky kitu. (Nelze použít GeneScanTM 1200 LIZ®).
Ostatní potřebný spotřební materiál a vybavení (Není součástí kitu)
- Minicentrifuga (1,5 - 2 ml zkumavky)
- Mikrocentrifuga (0,2 ml zkumavky)
- Vortex
- Thermal cycler: BioRad C1000TM Thermal Cycler s 96well modulem nebo ekvivaletní.
- Pipety s přesností mezi 0,2 – 2 µl, 1 - 10 µl, 2 - 20 µl, 20 - 200 µl a 100 - 1000 µl.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
- PCR zkumavky a víčka.
6. Varování a bezpečnostní opatření











FastFraXTM Sizing kit je míněn jako sizovací test a nemůže být použit pro potvrzení
velikosti opakování FMR1 genu nebo jako klinická diagnóza.
Osoba provádějící test musí být vyškolena v používání PCR a kapilární elektroforézy.
Všechny nepoužité reagencie musí být zlikvidovány v souladu s místními předpisy o
chemické bezpečnosti, biobezpečnosti a ochraně životního prostředí.
Všechny použité a nepoužité reagencie je nutné likvidovat v souladu s místními předpisy
o chemické bezpečnosti, s biologické bezpečnosti a předpisy na ochranu životního
prostředí.
Všechny vzorky DNA by měly být považovány za potenciálně nebezpečné. Při práci by se
měly používat ochranné prostředky. Vyvarujte se rozlití a kontaktu s pokožkou.
Dezinfikujte pomocí 10% bělidla nebo 70% alkoholu, pokud je třeba. Řezy a rány musí
být chráněny. Ruce musí důkladně být umyty před a po použití kitu a vzorků.
Nepoužívejte prošlé reagencie.
Nemíchejte reagencie z různých kitů a šarží.
Ujistěte se, že použité vybavení je kalibrováno a používáno v souladu s doporučením
výrobce.
Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování kitu.
Ujistěte se, že jsou reagencie skladovány v temnotě.
Po otevření má kit trvanlivost 3 měsíce, pokud je skladován při -20°C.
7. Příprava vzorku
Izolace DNA
Genomová DNA izolovaná z plné krve (v EDTA) běžnými izolačními metodami je kompatibilní
s Identifikačním kitem FastFraXTM FMR1 Sizing kit. Po izolaci a přečištění (pokud je nutné)
změřte koncentraci genomové DNA (OD 260) a její čistotu (OD 260/280) a skladujte při -20°C
pokud není použita ihned.
8. FastFraXTM FMR1 Sizing kit protokol
FastFraXTM FMR1 Sizing kit protokol sestává z dvou klíčových kroků:
I.
dTP-PCR; a
II.
Kapilární elektroforézy
Následující pokyny jsou psány pro jedinou reakci; pro více reakcí se doporučuje příprava
master mixu. Reakční činidla dodaná v kitu jsou dostatečná pro až 50 reakcí.
Vzhledem k pravděpodobnosti kontaminace preamplifikačních reagencií PCR amplikony, se
doporučuje jednosměrný workflow. Příprava master mixu (před částí I, krok 6) by měla být
provedena v oblasti oddělené od post-amplifikačních prostor pro zpracování vzorků (Po části
I, krok 6). Vybavení použité v post-amplifikačních prostorách zpracování vzorků by se nemělo
používat v preamplifikačním prostoru, aby se minimalizovala kontaminace amplikonem.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Pro každý run použijte dvě kontroly:
- ženský vzorek s plnou mutací jako pozitivní kontrola (viz sekce 5: Materiál) a
- netemplátová negativní kontrola (NTC).
ČÁST I. příprava dTP-PCR
1. Nechte všechny reagencie (kromě Taq a Taq Plus) rozmrznout při laboratorní teplotě. Taq
a Taq Plus uchovávejte na ledu. Lehce vortexujte (kromě Taq a Taq Plus) a centrifugujte
zkumavky před otevřením.
2. Pro každý vzorek připravte dTP-PCR mix v PCR zkumavce dle složení uvedeného v tabulce
2. Test může být proveden v PCR stripech, PCR zkumavkách nebo 96-well destičce.
Tabulka 2. příprava dTP-PCR.
Reagencie
Objem pro jednu reakci (µl)*
Sizing Primer Mix
1,0
Sizing PCR Mix A
2,5
Sizing PCR Mix B
7,5
Taq Polymerase
1,0
Taq Plus
1,0
DNA templát (100 ng)
Nuclease-free voda
Celkový objem
X
2,0-X
15,0
*POZNÁMKA: Příprava master mixu je doporučena pro analýzu více vzorků. Master mix
obsahuje všechny reagencie kromě DNA templátu.
3. Ujistěte se, že jsou zkumavky pevně uzavřeny.
4. Promíchejte zkumavky.
5. Centrifugujte zkumavky nebo destičku.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
6. Přeneste uzavřené zkumavky nebo zalepenou destičku do BioRad C1000TM Thermal
Cycleru nebo ekvivalentního cycleru a spusťte run dle programu uvedeného v tabulce 3.
Tabulka 3. program dTP-PCR amplifikace.
Teplota
Čas
Počet cyklů
95°C
15 min
99°C
55°C
70°C
72°C
45 sec
45 sec
8 min + přídavek 15 sec/cyklus*
10 min
11°C
End
1
40
1
1
*POZNÁMKA: Přídavek 15 sec/cyklus znamená 8 min v první cyklu, 8 min 15 sec
v druhém cyklu, 8 min 30 sec v třetím cyklu a tak dále.
7. Přeneste PCR produkty pro kapilární elektroforézu do ledničky (4°C) a chraňte je před
světlem do doby než je budete analyzovat*.
*POZNÁMKA: Proveďte analýzu na kapilární elektroforéze co nejdříve po PCR reakci,
abyste minimalizovali degradaci PCRproduktů.
ČÁST II. kapilární elektroforéza (s polymerem POP-7)
1.
2.
Nechte rozmrznout Hi-DiTM Formamide a MapMarker® 1000-ROX pro laboratorní
teplotě. Lehce vortexujte a centrifugujte před otevřením zkumavek.
Připravte následující mix do jednotlivých zkumavek 96-well destičky pro kapilární
elektroforézu dle složení v tabulce 4. Ujistěte se že jsou vzorky dobře promíchány
propipetováním ode dna 2-3x.Vzorky napipetujte do jamek dle pořadí uvedeného
v programu genetického analyzátoru- Pokud je počet vzorků nižší než je počet kapilár,
napipetujte do prázdných jamek 13,5 µl Hi-DiTM Formamidu.
Tabulka 4. Mix pro Post-PCR analýzu.
Reagencie
Objem pro jednu reakci (µl)*
PCR produkt
1,0
Hi-DiTM Formamide
9,0
MapMarker® 1000-ROX**
0,5***
Celkový objem
13,5
*POZNÁMKA: Příprava master mixu je doporučena pro analýzu více vzorků. Master
mix obsahuje všechny reagencie kromě PCR produktu.
**POZNÁMKA: Je možné použít i jiné ROX nebo LIZ-značené size standardy o velikosti
alespoň 1000 bp místo MapMarkeru® 1000-ROX, ale pouze pokud fungují za stejných
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
denaturačních podmínek. Pokud je použit LIZ-značený size standard, přístroj musí být
kalibrován na DS-33 nebo DS-40 dyeset.
***POZNÁMKA: Použijte objem size standardu dle doporučení výrobce. Pro příklad,
pokud je doporučený objem size standardu menší než 0,5 µl, snižte objem Hi-DiTM
Formamidu tak, aby výsledný objem byl stejný (13,5 µl).
3.
4.
5.
Uzavřete destičku septem a poklepáním odstraňte případné bubliny. Centrifugujte
destičku a vložte ji do cyckleru.
Denaturujte vzorky 5 minut při 95°C**** a poté chlaďte na 4°C dokud nejste připravení
na vložení destičky do genetického analyzátoru. Doporučujeme analyzovat vzorky do 24
hodin pro optimální výsledky.
****POZNÁMKA: Při spuštění denaturačního programu u septem uzavřené 96-well
destičky v termocykleru, nezavírejte vyhřívané víko termocykleru, jinak dojde
k roztavení septa.
Nastavte genetický analyzátor dle doporučení výrobce. Ujistěte se, že je přístroj
kalibrován pro (1) FAM; a (2) ROX nebo LIZ fluorescenční barvy, v závislosti na tom, jaký
použijete size standard (tabulka 5).
Tabulka 5. Dye sety Applied Biosystems použitelní pro různé size standardy.
Barva size standardu
Dye Set Filter Set
DS-30
D
DS-31
D
DS-33
G5
DS-40
S
ROX (včetně MapMarker® 1000-ROX)
LIZ
6.
Použijte základní protokol Fragment Analysis POP-7 a příslušná délka kapiláry jako
základní protokol, upravte injection time a voltage a run time dle doporučených
parametrů pro různé přístroje v tabulce 6.
Tabulka 5. Dye sety Applied Biosystems použitelní pro různé size standardy.
Run Voltage, Time
Přístroj Délka kapiláry
Injection
3130xl
36 cm
1,2 kV, 18 sec
15 kV, 3000 sec
3730xl
50 cm
1,5 kV, 18 sec
15 kV, 3000 sec
3500
50 cm
1,5 kV, 18 sec
15 kV, 3000 sec
a. Pro jiné přístroje, které zde nejsou uvedeny, se mohou optimální parametry
kapilární elektroforézy lišit a musí být uživatelem zvalidovány.
7.
Po CE mohou být data analyzována na počet CGG repetic.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
9. Analýza dat
Analýza dat může být provedena s použitím následujícího schématu (obrázek 2). Detailní
instrukce pro každý krok analýzy je vyznačen ve schématu.
Příprava dTP-PCR/CE
Viz sekce 8
Generování CE profilů
Viz sekce 9, část I
Kontrola Size standardu
Viz sekce 9, část II, krok 1a
Kontrola CE profilů kontrol
Viz sekce 9, část II, krok 1b/c
Analýza CE profilů vzorků
140 - ~ 300 bp
Normální nebo intermediate
Určení Prvního píku
Viz sekce 9, část II, krok 2a
Odhad rozpětí velikostí
Viz sekce 9, část II, krok 2b
140 – 450 bp
Premutace
140 - > 450 bp
Velká Premutace nebo Plná mutace
Určení Posledního píku
Viz tabulka 7a
Viz tabulka 7b
Určení přesného počtu repetic
Muž
Viz tabulka 7C
viz sekce 9, část II, krok 3
Žena
Určení zygosity
Interpretace výsledků
Viz sekce 10
Obrázek 2. Data interpretační schéma pro analýzu výsledků
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
Viz tabulka 8
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
ČÁST I.Parametry pro analýzu dat
Výsledky kapilární elektroforézy (CE) z genetických analyzátorů ABI 3130xl a 3730xl mohou
analyzována s použitím softwaru Peak ScannerTM 2 nebo GeneMapper®. Software Peak ScannerTM 2
lze zdarma stáhnout z webu Life Technologies.
CE výsledky z genetického analyzátoru ABI 3500 mohou být analyzovány softwarem GeneMapper®.
Analýza softwarem Peak ScannerTM 2 je popsána zde.
1. Vytvořte nový projekt a přidejte vzorky (sample results files .fsa) do nového projektu požitím
„Add Files“.
2. Pod „Resources“ v levém panelu vytvořte „New Size standard“ s použitím velikostí standardu
MapMarker® 1000-ROX:
 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800,
850, 900, 950 a 1000.
 Barva: Red
Uložte nově vytvořený Size Standard jako „MM-1000“.
POZNÁMKA: Pokud byl použit jiný Size standard, vytvořte příslušný Size standard s příslušnými
velikostmi a barvou dle doporučení výrobce.
3. Pod „Resources“ v levém panelu vytvořte „New Analysis Method“ s použitím defaultní meoty
a následujícími modifikacemi:
a. Peak Detection > Minimum peak heights > Peak treshold pro Blue a Red nastavte na 10.
b. Quality flags > Sizing quality > Low quality range > 0,0 to 0,05.
c. Quality flags > Sizing quality > Pass range > 0,06 to 1,0.
Uložte nově vytvořenou „Analysis Method“ jako „FastFraX Analysis“.
POZNÁMKA: Pokud byl použit LIZ – značený size standard, nastavte Peak treshold pro Blue a
Orange na 10.
4. Pro každý vzorek vyberte MapMarker® 1000-ROX „MM-1000“ a Analysis Method „FastFraX
Analysis“.
5. Stiskněte tlačítko „Analysis“.
6. Při analýze dat vzorku vypněte zelenou, žlutou a oranžovou barvu, protože signál budou
přítomny pouze v modré (FAM) a červené (ROX).
POZNÁMKA: Pokud byl použit LIZ – značený size standard, signál bude přítomen v modré (FAM) a
oranžové (LIZ).
7. Prohlédněte píky v rozmezí od 125 – 1000 bp. Rozmezí může být specifikováno v „Plot
Settings“
.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
ČÁST II. Pokyny pro analýzu dat
1. Kvalifikace platnost runu
a. Kontrola píků ROX size standardu. MapMarker® 1000-ROX produkuje charakteristické
píky s konkrétní velikostí (dle obrázku 3). Nesrovnalosti v intervalu mezi píky těchto
standardních velikostí bude mít vliv na analýzu. Vzorky s nestandardními píky size
standardu (například, píky se nezobrazují v očekávané velikosti párů bází), musí být z
další analýzy vyloučeny.
b. Kontrola negativní kontroly. Ujistěte se, že není přítomen žádný signál v modré (FAM)
barvě (dle obrázku 3).
Obrázek 3. Typický profil netemplátové negativní kontroly.
c. Kontrola pozitivní kontrly (žena s plnou mutací). Ujistěte se, že pozitivní kontrola splňuje
následující parametry:
- shluky píků normální jsou dobře identifikovatelné oproti pozadí expandované alely (dle
obrázku 4a a 4b); a
- kontinuální profil píků plné mutace pokračuje až za 200 repetic (dle obrázku 4c), tj.
pokračuje až za červený pík size standardu o velikosti 715 bp.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Obrázek 4a. Typický profil NA07537.
Obrázek 4b. Zvětšená oblast ukazující shluky píků kratší alely (modře vyplněné) s
označením prvního píku pro analýzu. První pík má velikost přibližně 140 bp a odpovídá
5 repeticím.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Obrázek 4c. Zvětšená oblast kontinuálního profilu delší alely s označením posledního
píku a píku odpovídajícího 200 repeticím (modře vyplněné).
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
2. Určení prvního a posledního píku pro analýzu
a. Určení prvního píku. Píky jsou zobrazeny s periodicitou přibližně 3 bp. První vysoký pík by
měl být zobrazen okolo 140 bp; tento pík odpovídá amplikonu s 5 CGG repeticemi (dle
obrázku 4b). Počítáním následujících píku dojdeme k celkovému počtu CGG repetic.
b. Odhad rozmezí velikostí CE profilu. MapMarker® 1000-ROX obsahuje píky s velikostí 300
bp a 450 bp. S použitím těchto píků lze určit, do které z níže uvedených rozmezí velikostí
CE profil patři (Obrázek 5). Toto bude mít vliv na stanovení posledního píku pro analýzu.
140 - ~300 bp
Normální nebo
intermediate alely (5 –
54 repetic)
140 – 450 bp
Malá premutace
(55 - ~110 repetic)
140 - > 450 bp
Velké premutace a
plné mutace
(~110 - > 200 repetic)
Obrázek 5. Typické CE profily různých rozmezí délek. Rozmezí délek CE profilu se
prodlužuje s množstvím repetic. Pík odpovídající 200 repeticím najdeme v blízkosti
červeného píku 715 bp.
c. Určení posledního píku jak pro mužské, tak i pro ženské vzorky a jeho zahrnutí do
analýzy. Poslední pík, který je zahrnut do analýzy, lze určit dle jeho morfologie a signálu
vzhledem k sousedním píkům. Tabulka 7 uvádí pokyny pro stanovení posledního píku,
který mají být zahrnut do analýzy, v závislosti na rozsahu velikostí CE profilů.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Tabulka 7. Stanovení posledního píku pro analýzu pro jak mužské, tak i ženské vzorky.
Do rozhodnutí o posledním píku je zahrnut pokles signálu a morfologie píku u různých
typů profilů.
Velikostní
CE profil
Zvětšení posledního píku
rozmezí
a) 140 ~300bp
Normální a
intermediání
alely
Zaměřte se na pík shluku nejvíce vpravo. V rámci tohoto shluku píků, vyberte nejvyšší pík vpravo
těsně předtím, než se signál výrazně snižuje. Poslední pík CE profilu a poslední pík v každém
shluku jsou stanoveny podobně. Poslední pík CE profilu by měl být vyšší než falešnými píky
předcházející shluky (viz sekce 11: Další informace týkající se AGG přerušení)
b) 140 – 450
bp
Premutace
Pro premutace s dobře definovaným rozmezím píků, vyberte nejvyšší pík vpravo těsně předtím,
než se signál významně snižuje na úroveň pozadí.
POZNÁMKA:
Za posledním píkem by už neměly být žádné další píky. Přítomnost malých píku po poklesu
signálu může indikovat přítomnost více alel ve vzorku (mozaiky). Viz sekce 12: atypické profily
jako příklad takových profilů.
c) 140 - >
450 bp
Velká
premutace
nebo plná
mutace
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Pro velké premutace a plné mutace s amplifikovanými píky, které vykazují postupný pokles spíše
než výrazný pokles signálu je určení posledního píku založeno na morfologii píku.
 Poslední pík má definovaný tvar (viz výše ve schématu).

Na levé části posledního píku (zelená oblast) jsou odlišné bílé plochy pod píkem jasně
viditelné. Naproti tomu, vrcholy vpravo od posledního píku (vyplněného modře) mají
bílé oblasti špatně definovatelné (oranžová plocha).
 Signál pro vpravo od posledního píku je snížen na úroveň pozadí (přibližně indikováno
červeně čárkovaně).
 Obecně platí, že poslední pík má výšku signálu nižší než 40 RFU. Poslední pík u vzorků s
profily s délkou více než ~ 650 bp může být nízký (10 RFU), ale je platný jen pokud má
dobře definovaný tvar.
Jako doporučení lze říci, že profily přesahující 600 bp mohou být analyzovány pomocí
následujícícch parametrů:
 osa x: 600 bp – 850 bp
 osa y: 0-160 RFU
d. Určení posledního píku druhé (kratší) alely u ženských vzorků. Píky kratší alely by se
měli analyzovat až po dokončení analýzy delší alely. Typicky jsou píky kratší alely u
heterozygotních ženských vzorků výrazně vyšší než zbytek CE profilu. Proto, analýzou
těchto vyšších píku dostaneme počet repetic kratší alely. Tabulka 8 ukazuje způsob
identifikace počtu repetic kratší alely u žen v závislosti na genotypu nebo rozmezí CE
profilu.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Tabulka 8. Stanovení posledního píku kratší alely u žen. Výška píku a pokles signálu jsou
vzaty v potaz u různých profilů.
Velikostní
rozmezí
a) 140 ~300bp
Normální a
intermediáln
í alely
CE profil
Zvětšení posledního píku
V případě, že má ženský vzorek CE profil podobný CE profilu normálního muže (viz
výše, vlevo), jedná se o homozygotní ženu.
Homozygotní žena může mít:
(1) stejný počet repetic u obou alel (např. 29/29 RPT); nebo
(2) rozdíl jedné repetice mezi těmito dvěma alelami (např. 29/28) RPT.
Ženský vzorek s CE profilem obsahujícím shluky píků různou výškou patří
heterozygotní ženě. Ve výše uvedeném příkladu, jsou první tři shluky vyšší než je
výška signálu u čtvrtého shluku. Tento vyšší signál je důsledkem příspěvku jak kratší
tak i delší alely. To znamená, že poslední pík třetího shluku je posledním píkem pro
kratší alelu. Za tímto píkem následuje výrazný pokles hodnot výšek a poté čtvrtý
shluk.
Píky čtvrtého shluku mají významně nižší signál než předchozí tři shluky a je
generován pouze větší alelou. Poslední pík čtvrtého shluku je posledním píkem delší
alely.
POZNÁMKY:
- U některých normálních žen může mít poslední pík shluku viditelně, ale ne
drasticky nižší signál než předcházející shluky (~ 60% v výšky signálu). Tyto ženy
mohou být homozygotní.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
- Některé heterozygotní normální ženy mohou mít CE profily, které je složitější
analyzovat, vzhledem k odlišným vzorům opakovaní u dvou alel (viz sekce 11: Další
informace o AGG Přerušení a sekce 12: atypické profily).
b) 140 – >
~300 bp
Premutace a
plná mutace
Ženy s premutací a plnou mutací jsou obvykle heterozygotní, s jednou
expandovanou alelou a druhou typicky buď normální nebo intermediální alelou.
Menší alela přispívá k shluků píky s vyššími signály, které se střídají v kontinuálním
profilu delší, expandované alely.
U takových uskupení, vyberte nejvyšší pík vpravo těsně předtím, než se signál
významně snižuje a to je poslední pík menších alely.
3. Určení počtu CGG repetic
a. Počítání píků. Jakmile je určen první a poslední pík, lze manuálně spočítat počet píků
mezi nimi a tento počet odpovídá počtu CGG repetic. První pík odpovídá 5 CGG
repeticím.
Počet CGG repetic = Počet píků + 4 + (5 x počet 18 bp mezer)
Příklad, CE profil s nepřerušovaným úsekem 16 píků bez 18 bp mezer indikuje alelu
s počtem repetic 20.
CE profil s třemi shluky po pěti pících v každém shluku, přerušený dvěma mezerami
odpovídajícími 18 bp, indikuje alelu s počtem repetic 29. Další instrukce k určení počtu
repetic najdete v sekci 11: Další informace o AGG přerušeních.
b. Výpočet s použitím vzdálenost mezi píky (v párech bází). Vzhledem k ~ 3 bp periodicitě
amplifikačních píků, lze počet CGG repetic vypočítat a aproximovat pomocí vzdálenosti (v
párech bází), mezi prvním a posledním píkem. Vzorec je následující:
PíkF – Pík1
Počet CGG repetic = -------------------- + 5
2,95
kde PíkF je velikost posledního píku v párech bází a Pík1 je velikost prvního píku v párech
bází.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
2,95 je použito místo 3,0 kvůli zkreslení elektroforetické mobility GC bohatých PCR
produktů. Použití 2,95 je specifické pro přístroj, jeho konfiguraci a použitý size standard a
bylo verifikováno tak, aby dalo přesnost počtu repetic (± 1 repetice) až do 200 repetic při
použití následujících kombinací:
Přístroj Polymer Délka kapiláry Size standard
3130xl
POP-7
36 cm
BioVentures MapMarker® 1000-ROX
3730xl
POP-7
50 cm
BioVentures MapMarker® 1000-ROX
3500
POP-7
50 cm
BioVentures MapMarker® 1000-ROX
*POZNÁMKA: Pro přesnější sizování alel s více než 200 repeticemi použijte počítání píků místo
výpočtu s použitím vzdálenosti mezi píky.
*POZNÁMKA: Alely s posledním píkem stanoveným jako > 200 repetic a za červeným píkem
715 bp se klasifikují jako alely s >200 repeticemi.
10. Interpretace dat
Počet CGG repetic pro FMR1 alely může být určen pro 5 až 200 CGG repetic. Všechny alely
s více než 200 CGG repeticemi jsou klasifikovány jako > 200 repetic. U vzorků s více FMR1
alelami je možné reportovat rozsah CGG repetic u obou alel.
Vzorky pacientů mohou být zařazeny do jedné ze čtyř FMR1 alelických tříd na základě
velikosti CGG repetice a struktury CE profilu píků (viz tabulka 9).
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Tabulka 9. Typické CE profily FMR1 genotypů generovaných kitem FastFraXTM FMR1 Sizing.
Klasifikace alely
Počet
Vzorek AGG přerušení
Vzorový CE profil
repetic
Normální (NL) a
5 - 54
Muž
Obvykle jsou přítomny
Malé shluky píků
Intermediální (IM)
jedna nebo dvě
přerušení. Mohou však
být přítomny až čtyři
přerušení.
Žena
Obvykle jsou přítomny
jedna nebo dvě
přerušení. Mohou však
být přítomny až čtyři
přerušení.
Malé shluky píků.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
Počet repet
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Premutace (PM)
55 - 100
Muž
Přerušení jsou nebo
nejsou přítomna.
Kontinuální žebřík píků, které mohou být a nemusí být separovány do shluků.
Žena
Přerušení jsou obvykle
přítomna u kratší alely.
U delší alely jsou anebo
nejsou přerušení
přítomna.
Shluky píků s vysokým signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků. Žebřík
píků může, ale nemusí být rozdělen do shluků.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Premutace (PM)
101 - 200
Muž
Přerušení obvykle nejsou
přítomna.
Kontinuální žebřík píků.
Žena
Přerušení jsou obvykle
přítomna u krátké alely,
ale ne u dlouhé alely.
Shluky píků s vyšším signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Plná mutace
> 200
Muž
Přerušení nejsou
přítomna.
Kontinuální žebřík píků pokračující až za 200 repetic (přibližně okolo 715 bp).
Žena
Přerušení jsou přítomna
u krátké alely, ale ne u
dlouhé alely.
Shluky píků s vyšším signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků, který
pokračuje až za 200 repetic (přibližně okolo 715 bp).
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
11. Další informace k AGG přerušením
CE profily z CGG repetitivní oblasti FMR1 obsahují často shluky píků, které jsou odděleny
mezerami. Tyto mezery mezi shluky naznačují přítomnost AGG přerušení v rámci CGG
repetic. Přítomnost AGG přerušení se vyznačuje významným poklesem signálu, za nímž
následuje obnovení CGG signálu po 18 bp (nebo ekvivalentu 6 CGG píků).
Vzhledem k tomu, primery amplifikují z 3 'konce repetitivní oblasti CGG, 5' → 3 'repetitivní
patern lze číst zprava doleva profilu. Tabulka 10 udává, jak mohou být AGG přerušení
identifikována z CE profilů.
Tabulka 10. Pozice AGG přerušení je indikována mezerami mezi shluky. Pozice AGG přerušení
je označena „+“.
Genotyp
CE profil
Zvětšení shluků
Normální a
intermediáln
í muž
Homozygótn
í normální a
intermediáln
í žena
Přítomnost jednoho AGG přerušení bude mít za následek mezeru mezi shluky píků.
Určení posledního píku v každém shluku s použitím tabulky 6. První pík následného
shluku je ~ 18 bp (nebo 6 píků v intervalu) vzdáled od posledního píku předchozího
shluku.
Ve výše uvedeném příkladu běžného vzorku je počet opakování vypočtený pomocí
následujícího vzorce pro každý pík shluku:
Počet CGG repetic = Počet píků + 4
charakterizován jako 9 + 9 + 9 (9 píků pro každý shluk). Po každém AGG přerušení
se započítává 1 opakování. Profil výše (obsahuje 2 AGG přerušení) má tedy celkem
29 opakování.
POZNÁMKA: Heterozygotní normální a intermediální ženské vzorky mohou mít CE
profily, které jsou složitější analyzovat. Takové případy jsou uvedeny v sekci 12:
Atypické Profily.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Premutace
muž;
premutace
žena
U premutací, dojde AGG přerušením ke vzniku mezery v rámci profilu píků. K určení
posledního píku v každém shluku použijte tabulku 6. . První pík následného shluku
je ~ 18 bp (nebo 6 píků v intervalu) vzdáled od posledního píku předchozího shluku.
Ve výše uvedeném příkladu vzorku premutace mužského vzorku je CGG repetitivní
oblast spojitá pro 82 repetic poté vykazuje značný pokles signálu, což naznačuje
přítomnost AGG přerušení. První pík následujícího shluku je určen spočítáním 6
píkového intervalu od posledního píku předchozího shluku. Počet CGG opakování je
10 + 82 z 5 'konce (shluk s deseti repeticemi a AGG přerušení je na 5' konci
repetitivní CGG oblasti).
Žena;
Premutace a
plná mutace
Zygocitu lze vyřešit pro ženy s dvěma alelami. Shluky píků (PC), které jsou
promíchány s kontinuálním profilem, ukazují na přítomnost dvou alel s různými
CGG repeticemi.
Velikost delší alely může být určena spočítáním počtu píků mezi prvním a
posledním píkem profilu. Ve výše uvedeném příkladu premutace ženy, má delší
alela 122 repetic.
Shluky píků jsou snadno identifikovatelné vzhledem k jejich zvýšené signálu.
Mezery mezi vysokými shluky ukazují na přítomnost AGG přerušení uvnitř CGG
repetitivní oblasti. K určení posledního píku v každém shluku lze použít tabulku 6. .
První pík následujícího shluku je určen spočítáním 6 píkového intervalu od
posledního píku předchozího shluku. Ve výše uvedeném příkladu, je kratší alela
charakterizována jako 9 + 9 + 9 (2 AGG přerušení do 29 repeticích). Dohromady je
počet CGG repetic v tomto vzorku 29 (9 + 9 + 9) / 122 pro obě alely.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
12. Atypické profily
Heterozygotní normální nebo intermediální ženské vzorky mohou generovat atypické CE profily,
které představují složitost a nejistotu při analýze dat. Příklady takových případů, a některé
pokyny pro analýzu jsou uvedeny v tabulce 11.
Tabulka 11. Příklady atypických CE profilů, které mohou způsobit komplikace při analýze dat.
Problém
Výrazné opakující
se vzory u více alel
Typický CE profil
U některých heterozygotních normálních a intermediálních ženských alel, se
může CE profil jevit složitější pro analýzu v důsledku odlišných opakujících se
vzorů dvou alel.
Jako obecné vodítko: shluky píků s vyššími signály naznačují příspěvek dvou alel.
Díky analýze změny výšky signálu, a lokalizaci pozice AGG přerušení 18 bp nebo
intervalu 6 píků je možné opakované vzory dvou alel rozlišit. Pro profil vzorku
výše je větší alela charakterizována jako 29 repetic (9 + 9 + 9), a kratší alela je
charakterizována jako 23 repetic(13 + 9).
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Mnohočetný CGG
patern v jednom
CE profilu
Pro některé CE profily lze odvodit více závěrů.
Například, možné vzory repetic pro ženské vzorek jsou:
Možnost 1
Delší alela:
36,
9+6+9+9
Kratší
alela:
29, 12+6+9
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Možnost 2
Delší alela:
36,
9+9+6+9
Kratší
alela:
29, 9+9+9
To znamená, že vzorek je označena jako mající větší alelu 36 repetic
a menší alelu 29 repetic, s možným větším počtem opakovacích
paternů.
Celosvětově nejčastější jsou opakovací paterny, které obsahují
shluky 9 nebo 10 CGG repetic, a proto je možnost 2
pravděpodobnější genotyp.
Neidentifikovatelný U většiny ženských heterozygotních vzorků lze kratší alelu identifikovat po
počet repetic a
stanovení repetic větší alely. Nicméně, u některých normálních ženských vzorků
AGG přerušení u
je patrné kolísání výšky signálu, což má za následek nemožnost identifikace
kratší alely
vyšších píků kratší alely. Takové vzorky také typicky dělají potíže při identifikaci
AGG přerušení.
V příkladu níže je možné poslední pík delší alely (zvýrazněno) identifikovat.
Nicméně, opakování vzoru u AGG přerušení, jakož i poslední pík kratší alely nelze
určit.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Mosaicismus
Počet CGG repetic u premutace může být obvykle identifikován výrazným
poklesem výšky signálu po poslední pík. Nicméně mnoho vzorků s FMR1
expanzemi (premutace a plné mutace) jsou velikostní mozaiky a může obsahovat
více alel různých velikostí CGG repetic. Tyto vzorky mohou mít nízké píky po
počátečním poklesu signálu.
Níže uvedený vzorek má alespoň dvě alely s 30 a 74 CGG repeticemi.
Avšak přetrvávání nízkých píků po píku odpovídajícímu 74-RPT naznačuje, že
tento vzorek může mít větší třetí alelu v nízkém množství. Tato třetí alela
obsahuje alespoň 108 CGG repetic.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
13. Parametry kitu
Přesnost sizování
Studie pro určení přesnosti byla provedena na 11 reprezentativních vzorcích genomové DNA
z Coriell Cell Repositories, které byly předtím charakterizovány na počet repetic v genu FMR1
s použitím stávajících metod, jako je například Southern blot nebo flanking PCR. Počet repetic
každého vzorku pak byl stanoven prostřednictvím spočítání píků a aproximace pomocí
vzdálenost mezi píky. Výsledky studie ukázaly, že souprava má vynikající výkon a všechny
získané genotypy vzorků souhlasily s referenčními genotypy, které poskytly Coriell Cell
Repositories.
Přesnost sizování byla hodnocena pomocí dat z Coriell referenčních vzorků s dostupnými
informacemi [11]. FastFraXTM FMR1 Sizing Kit udává počet repetic s přesností:
Tabulka 12. Souhrn přesnosti sizování vzorků s různými FMR1 genotypy. Přesnost sizingu
nebyla hodnocena pro vzorky s plnou mutací, protože kit je určen pro detekci a ne pro
sizování takových vzorků.
Referenční genotyp
NL a IM
PN (< 110 repetic]
PM (≥ 110 repetic)
FM (> 200 repetic)
Přesnost sizování
1 repetice
3 repetice
3 repetice
N/A (výsledek je reportován jako > 200 repetic)
Analytická sensitivita a specifita
Pro analytickou citlivost, byla mez detekce ověřena pomocí řady množství DNA. Limit detekce
pro plnou mutaci je 25 ng genomové DNA. Doporučené množství DNA na test je 100 ng, což
umožňuje sizování obou alel u ženských vzorků.
Citlivost soupravy na detekci mosaicismu byla hodnocena pomocí simulovaných mozaikových
vzorků s rozdsahem mosaicismu. Pro NL / PM mozaiky, byla PM alela přesně sizována až na
5% hladině mozaicismu. U 2,5% mosaicismu, byla PM alela správně rozpoznána jako PM. Mez
detekce plné mutace alely byla 10% pro NL / FM mozaiky a 20% u PM / FM mozaiky.
Souprava je schopna detekovat veškeré mutace alel, velké PM u 2,5% pro NL / FM mozaiky a
5% pro PM / FM mozaiky.
Pro analytickou specifičnost byl otestován "non-relevantní" DNA vzorek nesoucí 135-145 CTG
repetici, aby se prověřilo, zda zvýšení koncentrace nukleové kyseliny s potenciálem cross
reaktivity by mohl mít vliv na kit. Výsledky ukazují, že zvyšující se množství "non-relevantní"
DNA neinterferuje s amplifikací, sizováním a rozpoznáváním počtu CGG repetic v genu FMR1.
Přesnost
Opakovatelnost a reprodukovatelnost byly hodnoceny. Variační koeficient hlášených počtů
repetic byl obecně nízký pro NL, IM a PM vzorky (CV <2%). Všechny vzorky s FM mohli být
detekovány jako mající více než 200 CGG repetic.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Klinická výkonnost
Studie vyhodnocení výkonnosti byla provedena na 198 vzorcích genomové DNA izolovaných z
plné krve, které byly dříve charakterizovány na počet CGG repetic FMR1 genu
prostřednictvím kombinace flanking PCR a Southern blottingu. Vzorky byly testovány pomocí
soupravy FastFraX ™ FMR1 Sizing kit na kombinaci termocykleru Biorad C1000 a ABI 3730XL
DNA Analyzeru. Analýza byla proveda zaslepeně a výsledky byl porovnány s referenční
metodou.
Test hlásil dobrou shodu s referenčními údaji, 100% shoda, pokud jde o genotyp (Tabulka 13).
Zejména, všechny vzorky s FM byly úspěšně osizovány jako nesoucí více než 200 RPT (žádné
falešně negativní výsledky, 100% klinická citlivost a klinická specifičnost). Žádný PM vzorek
nebyl klasifikován jako FM (žádné falešné pozitivity). Výsledné klinické výkonnostní vlastnosti
kitu jsou vynikající, s citlivostí 100% a přesnosti ve zjišťování vzorků FM (Tabulka 14).
Tabulka 13. Porovnání referenčního genotypu s výsledky reportovanými kitem FastFraXTM
Sizing.
Výsledek u kitu SZ
NL
IM
PM
FM
Výsledek z referenční metody *
NL
IM
PM
FM
155
0
0
0
0
4
0
0
0
0
21
0
0
0
0
18
Klíč:
Pravdivě negativní
Pravdivě pozitivní
Falešně negativní
Tabulka 14. Souhrn klinických parametrů kitu FastFraXTM Sizing
Statistika
Klinická specifita
Klinická sensitivita
Pozitivní prediktivní hodnota
Negativní prediktivní hodnota
Hodnota
100,00%
100,00%
100,00%
100,00%
95% Cl
97,9% - 100,00%
81,47% - 100,00%
81,47% - 100,00%
97,97% - 100,00%
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
Falešně pozitivní
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
14. Troubleshooting
A) Netemplátová kontrola
Problém
CE profil netemplátové
kontroly obsahuje píky
s periodicitou 3 bp
Pravděpodobná
příčina
Kontaminace master
mixu DNA templátem
Kontaminace pipet
PCR produktem
B) Pozitivní kontrola
Problém
žádné CE profily
NEBO
CE profil
neodpovídá
očekávanému
profilu (viz sekce
4a, b a c)
Doporučení
Opakujte test, dejte pozor, aby
se DNA pipetovala jako
poslední, aby se zabránilo
kontaminaci master mixu.
Dekontaminujte pipety před
opakováním testu.
Ujistěte se, že jsou před
amplifikační a post amplifikační
prostory odděleny.
Pravděpodobná příčina
Doporučení
Chyba při přípravě master mixu
Opakujte test, dejte pozor, že
byly přidány všechny
reagencie ve správném
objemu
Zkontrolujte koncentraci a
kvalitu DNA
Pokud je třeba, použijte
čerstvou DNA (novou šarži
referenční DNA) a opakujte
test
Nedostatečná/degradovaná
DNA
Špatné nastavení PCR
Zkontrolujte run report
z přístroje a ujistěte se, že bylo
použito správné nastavení
Opakujte test, ujistěte se, že je
použito správné nastavení
Špatné nastavení CE
Zkontrolujte run report
z přístroje a ujistěte se, že bylo
použito správné nastavení
Pokud bylo použito správné
nastavení PCR, opakujte CE
protokol na stejných PCR
produktech (sladovaných při
4°C)
Pokud bylo nastavení PCR i CE
v pořádku, opakujte test
Prošlé reagencie
Zkontrolujte exspiraci
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Pokud je třeba, opakujte test
s novým neexspirovaným
kitem
Píky size
standardu jsou
špatně přiřazeny
Použití nevhodného size
standardu pro denaturační
podmínky kitu
Opakujte CE protokol se
stejnými PCR produkty
s použitím vhodného size
standardu, který má stejné
denaturační podmínky jako
MapMarker® 1000-ROX.
Nesrovnalosti v MapMarker®
1000-ROX size standardu
Upravte size standard
v analyzačním softwaru.
- Vyberte velikosti 100, 800,
850, 900, 950 a 10000
- Vymažte vybrané velikosti.
- Reanalyzujte vzorky
s použitím upraveného size
standardu
Zkontrolujte správnost
přiřazení píků size standardu a
upravte, pokud je to třeba
Pro GeneMapper® software,
přepsání „override sizing
quality“ nevyřeší problém
C) VZORKY
Problém
Pravděpodobná příčina
Doporučení
CE profil
neodpovídá
očekávanému
profilu (viz sekce
9)
NEBO
žádné CE profily
(Viz sekce 3)
Nedostatečná/degradovaná
DNA
Zkontrolujte koncentraci a kvalitu
DNA
Pokud je třeba, použijte čerstvou
DNA (opakujte izolaci DNA) a
opakujte test
POZNÁMKA: Pokud se opakují
nulové / atypické výsledky
získané navzdory tomu, že jste
vyloučili technickou chybu, vzorky
mohou mít delece v sekvenci
FMR1. Tyto vzorky by měly být
testovány za použití
alternativních metod, například
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Píky size
standardu jsou
špatně přiřazeny
Použití nevhodného size
standardu pro denaturační
podmínky kitu
Nesrovnalosti v MapMarker®
1000-ROX size standardu
Kitem FastFraXTM FMR1
Methylation.
Opakujte CE protokol se stejnými
PCR produkty s použitím
vhodného size standardu, který
má stejné denaturační podmínky
jako MapMarker® 1000-ROX.
Upravte size standard
v analyzačním softwaru.
- Vyberte velikosti 100, 800, 850,
900, 950 a 10000
- Vymažte vybrané velikosti.
- Reanalyzujte vzorky s použitím
upraveného size standardu
Zkontrolujte správnost přiřazení
píků size standardu a upravte,
pokud je to třeba
Pro GeneMapper® software,
přepsání „override sizing quality“
nevyřeší problém
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
15. Zřeknutí se zodpovědnosti
Výrobce omezuje záruku testovacího kitu, stejně jako, že testovací kit bude
fungovat jako diagnostický test in vitro v rámci omezení a specifikace, jak je
popsáno v manuálu k produktu, při použití přesně v souladu s pokyny v něm
obsažených. Výrobce se zříká jakékoli záruky výslovně uvedené nebo
předpokládané včetně takové výslovně uvedené nebo předpokládané záruky
vzhledem k obchodovatelnosti, vhodnosti pro použití nebo implicitní utility pro
jakýkoliv účel. Odpovědnost výrobce je omezena buď výměnu výrobku nebo
vrácení kupní ceny výrobku, a v žádném případě není povinnen k reklamaci
jakéhokoli druhu za částku vyšší než je kupní cena zboží, které je poškozeno.
Výrobce nenese žádnou odpovědnost vůči kupujícímu nebo třetím osobám za
škodu nebo ekonomickou ztrátu, způsobenou použitím výrobku jakýmkoli
způsobem nebo aplikací.
UPOZORNĚNÍ: Je vynaloženo veškeré úsilí dodávat objednané zásilky podle
uvedeného vzoru, ale vzhledem k neustálému vývoji si společnost vyhrazuje
právo na zlepšení / změny jakékoliv specifikace / komponenty bez předchozího
informace / oznámení kupujícímu.
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
16. Reference
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A
FastFraXTM FMR1 Sizing kit
The Biofactory
Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit
verze A