Zjišťování toxicity - Ústav chemie ochrany prostředí

Zjišťování toxicity
Základy toxikologie a ekologie
Marek Šír
[email protected]
Souhrn
• Závislost účinku na dávce
• Od akutní přes chronickou toxicitu po testy
karcinogenity – experimentální toxikologie
• Zdroje dat, legislativa, expoziční limity,
analýza rizika
• Expozice toxickým látkám v běžném životě
Závislost účinku na dávce
podíl odpovědí %
• Kumulativní závislost
• Diferenciální závislost
log D
• Hormeze a homeostáze
podíl odpovědí %
• Práh účinku
• Opakovaná expozice
log D
Testování toxicity
• In vitro – v moderní toxikologii nejvýznamnější zdroj
poznatků, na biomolekulách, buněčných preparátech, s
využitím jednoduchých organismů (bakterie, prvoci)
• In vivo – pokusy v živém organismu, na zvířatech
• Ex vivo – mimo živý organismus, např. na tkáních z
poraženého dobytka
• (In silico) – SAR, QSAR
Testy akutní toxicity
•
•
•
•
Cíl – zjistit závislost akutního účinku na dávce testované látky
Nejčastěji letální účinek – mortalita
Medián letální dávky – LD50, medián letální koncentrace LC50
Tvar křivky – v závislosti na obsazenosti receptoru
S+R
k1
k2
SR
Stanovení LD50, LC50
•
•
•
Minimálně 3 dávky – pod, blízko a nad očekávanou LD50
Poté 2 týdny sledování – latence, další projevy
Testování nejčastěji na hlodavcích, skupiny mezi 5 – 10
•
•
Účel - klasifikace látek podle toxicity, např. pro silně toxické léčiva
Problém - přenesení na jiné druhy (člověka)
5 zvířat
5 mg/kg
A
T+
B
T+
C
5 zvířat
50 mg/kg
A
T+
B
T
C
5 zvířat
300 mg/kg
A
T
B
Xn
Metoda fixní dávky
A – alespoň 2 zvířata
uhynou
B – uhyne 1, nebo 1
zjevné známky
toxicity
C – žádné neuhyne
ani známky
toxicity
T + - vysoce toxické
T – toxické
Xn – zdraví škodlivé
N – neklasifikované
podle toxicity
C
5 zvířat
2000 mg/kg
A
Xn
B
N
C
N
•
•
•
•
Pro klasifikaci látek podle toxicity
Šetrnější na počet zvířat
Neumožňuje stanovit LD50
Neměří kvantitativně míru toxicity
podíl odpovědí %
Subchronické testy
NOAEL
Práh
účinku
log D
•
•
Subakutní 2 - 4 týdny
Subchronické 14 - 90 dní
•
Min. 3 dávkové hladiny, 1
neexponovaná skupina, někdy
pozitivní kontrola, skupin 10 – 20
zvířat
•
Nejvyšší hladina max. 10% úhyn
•
Měření odpovědí – ztráta
(přírůstku) hmotnosti,
biochemické parametry, aktivity
enzymů
•
Posuzování bezpečnosti léčiv,
potravinových aditiv, pesticidů
LOAEL
NOAEL (no observed adverse effect level) – nebyl pozorován účinek
LOAEL (the lowes observed adverse effect level) – nejnižší dávka, kdy byl pozorován
podíl odpovědí %
Chronické testy
•
Cíl – stanovení dlouhodobého
působení látek, kumulativních
účinků
•
Opakované dávky po dobu
dospělého života myši (6
měsíců), potkana (2 roky)
•
Maximální tolerovaná dávka
(MTD) ze subchronického testu
(slabý pokles hmotnosti), 1/2
MTD, 1/4 MTD, neexponovaná
skupina
•
Kontrolní populace má zásadní
význam
% odpovědí v
kontrolní populaci
log D
NOAEL
Práh
účinku
LOAEL
LOAEL – nejnižší dávková hladina, při které je podíl odpovědí statisticky odlišný od
kontrolní populace
Testy karcinogenity
• Cíl – identifikovat látky, které vyvolávají novotvary (benigní a maligní
nádory) a získat tak podklady pro stanovení přijatelných denních dávek a
pro analýzu rizika
• Nutné velké množství zvířat, myš, potkan, skupiny nejméně 100 zvířat (50
samců, 50 samic), často speciální kmeny – transgenické myši – např. s
nedostatečně aktivními nebo nefunkčními opravnými mechanismy DNA
• 3 – 4 dávkové hladiny, MTD, 1/2MTD, 1/3MTD, 1/4MTD
• Problém – poškození buněk v důsledku toxicity vysokých dávek látky
Zákon č. 246/1992
• Zákon na ochranu zvířat proti týrání
• ČÁST TŘETÍ – Ochrana pokusných zvířat
Zejména:
Cíle pokusů eticky opodstatněné a jsou nezbytné.
Pokusy mohou být povoleny pouze po ověření, že při současném stavu nelze
zajistit poznatky nebo jejich využití jinými metodami nebo postupem.
Pokusy se smějí provádět jen v uživatelských zařízeních, kterým bylo Ústřední
komisí pro ochranu zvířat uděleno oprávnění, mají potřebné odborně
způsobilé pracovníky a zařízení vyhovující pro příslušný druh a množství
pokusných zvířat.
Amesův test
Slouží ke stanovení mutagenního a karcinogenního potenciálu chemických sloučenin.
Několik kmenů bakterie Salmonella typhimurium – mutace v genech účastnících se
syntézy aminokyseliny histidinu - vyžadují tedy externí zdroj histidinu. Sleduje se
schopnost testované látky způsobit reverzní mutaci a obnovit růst bakterie v mediu bez
přídavku histidinu.
Potenciální
mutagen
Jaterní
enzymy
Vysoký počet
změněných bakterií (hisna his+) udává, že látka
způsobuje mutace
inkubace
Média s minimálním
množstvím histidinu
inkubace
kmeny Salmonella
(vyžadující histidin)
Kontrola
Klasifikace karcinogenů
• Legislativa EU – Direktiva 67/5448/EHS
• Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC – International
Agency for the Research on Cancer)
• Americký vládní Národní toxikologický program (NTP, National
Toxicology Program)
• Americká agentura pro ochranu životního prostředí (US EPA, United
States Environmental Protection Agency)
• Organizace spojených národů – Globálně harmonizovaný systém
klasifikace a označování chemikálií (GHS, Globally Harmonized
Systém of Classification and Labeling of Chemicals)
Klasifikace karcinogenů
• EU – 3 kategorie
• IARC – 5 skupin
1 – Prokázané lidské karcinogeny
2 – Podezřelé lidské karcinogeny
3 – Látky, které nejsou zařaditelné mezi
karcinogeny
1 – Karcinogenní pro člověka
2A – Pravděpodobně karcinogenní pro člověka
2B – S potenciálním karcinogenním účinkem
pro člověka (možné lidské karcinogeny)
3 – Nejsou klasifikovatelné jako lidské
karcinogeny
4 – Pravděpodobně nekarcinogenní pro
člověka
• US EPA - 5 skupin
A – E, (B1 a B2), + také podrobnější slovní
hodnocení
• NTP- 2 kategorie
• GHS - 2 skupiny (1. má 2
podskupiny)
Látka
EU
IARC
NTP
US EPA
vinylchlorid
1
1
A
A
azbest
1
1
A
B2
chloroform
3
2B
B
B2
Ethanol
neklasifikován
1
neklasifikován
neklasifikován
Převod dat, prahový a bezprahový účinek
• Převedení dat z pokusných zvířat na člověka: vztažené na tělesnou
hmotnost (m), na velikost povrchu těla (S = k m2/3) nebo na
energetické nároky (EN = k m3/4).
Prahový účinek:
lze určit přípustnou denní dávku ADI – acceptable daily intake, zanedbatelné
nebo žádné riziko při celoživotní expozici
ADI = NOAEL / (UF.MF)
UF (uncertainty factor) – faktor neurčitosti, hodnoty 1-10,
MF (modifying factor) – modifikující faktor, 0<MF<10
RfD = BMD10 / (UF.MF)
Bezprahový účinek:
např. genotoxické karcinogeny
Vyjadřuje se statisticky významný nárůst výskytu nádorů, obvykle se volí
přípustná míra rizika 1 . 10-6.
Extrapolace experimentálních dat k velmi nízkým hladinám – řada
matematických modelů
Predikční metody
•
•
•
•
SAR, QSAR – (quantitative structure-activity relationship)
Kvantitativní vztah mezi strukturou a biologickou aktivitou
Toxikofor – nitroareny, halogenalkeny, aromatické aminy…
Plánování nových léčiv…
2-fenylethylamin
adrenalin
dopamin
methamfetamin
Epidemiologické studie
•
•
•
Kohortní – sledování změn ve vybrané skupině exponované určité látce oproti
kontrolní skupině, dlouhé časové období, srovnává se: výskyt určitých nemocí,
úroveň expozice, počet úmrtí…
Případové – skupina jedinců s určitou nemocí se srovnává s kontrolní skupinou
zdravých jedinců (co nejvíce podobní – věk, pohlaví), cíl: identifikace rizikových
faktorů
Průřezové – náhodný výběr, jednorázový sběr dat o zdravotním stavu a úrovni
expozice, pak následuje odpovídající vyšetření, cíl: popsat vztah mezi nemocí a
faktory, které ji mohou vyvolat nebo ovlivnit
Onemocnění
Expozice
Celkem
ANO
NE
ANO
a
b
a+b
NE
c
d
c+d
Celkem
a+c
b+d
n
Relativní riziko: R = [a/(a+b)] / [c/(c+d)]
Klinické studie
• Záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků
• Státní ústav pro kontrolu léčiv
•
V několika fázích, jejichž cílem je získat pro navržený účel použití léku dostatek
informací, aby se mohl vyhodnotit poměr mezi jeho prospěchem a riziky:
•
I. Fáze
představuje studie/klinická hodnocení nejčastěji prováděná na zdravých dobrovolnících. Výzkum na
zdravých dobrovolnících se neprovádí, je-li podání látky zdravému člověku vysoce nevhodné (např. u
cytostatik). Zjištění – působení v organismu, dávkování pro minimalizaci nežádoucích účinků, od
nízkých dávek, NE hodnocení účinnosti léčivého přípravku.
•
II. Fáze
Látka podávána v dané indikaci malému počtu vybraných nemocných (desítky až stovky). Ověřují se
léčebné účinky.
•
III. Fáze
Studie s velkým souborem testovaných osob (stovky až tisíce pacientů) – pak žádost o registraci a
používání.
•
IV. Fáze
Shromažďování informací.
TOXNET
• http://toxnet.nlm.nih.gov/
Volně přístupné
Informace o toxicitě látek, životním prostředí, lékařství
•
Využívá řadu databází:
TOXLINE – Toxicology Literature On Line
DART - Developmental and Reproductive Toxicology Database
HSDB - Hazardous Substances Data Bank
CCRIS - Chemical Carcinogenesis Research Information Systém
GENETOX - Genetic Toxicology Data Bank
IRIS - Integrated Risk Information Systém
ITER - International Toxicity Estimates for Risk
LactMed - Drugs and Lactation Database
Household product Database
Zdroje toxikologických dat
• Web of Science (WoS)
http://apps.webofknowledge.com/
přístupné z VŠCHT Praha, přírodní a technické vědy
• Scopus
http://www.scopus.com/
přístupné z VŠCHT Praha, široké zaměření – přírodní, technické,
lékařské a humanitní vědy
• PubMed
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
volně přístupné, medicína, farmakologie
• MedScape
http://emedicine.medscape.com/
volně přístupné, medicína, toxikologie z pohledu medicíny
Informace o toxicitě
• Státní zdravotní ústav – Centrum toxikologie a
zdravotní bezpečnosti (CTZB) - toxikologické metody,
biomedicína, chemická bezpečnost výrobků, toxikogenomika, +
Národní referenční laboratoře a centra (NRL, NRC)
• Toxikologické informační středisko (TIS) –
Co dělat při akutní otravě – volejte 224 91 92 93 nebo
224 91 54 02
• Klinika pracovního lékařství 1. LF UK a
VFN – např. Centrum pracovního lékařství, Laboratoř
průmyslové toxikologie – možnost vyšetření biologického
materiálu
Zákon 350/2011 Sb
o chemických látkách a chemických směsích a o změně
některých zákonů (chemický zákon)
• Upravuje práva a povinnosti právnických osob a podnikajících
fyzických osob při výrobě, klasifikaci, zkoušení nebezpečných vlastností,
•
balení, označování, uvádění na trh, používání, vývozu a dovozu
chemických látek (a směsí)
Definuje vlastnosti látek a směsí a skupiny nebezpečnosti:
•Výbušné
•Oxidující
•Extrémně hořlavé
•Vysoce hořlavé
•Hořlavé
•Vysoce toxické
•Toxické
•Karcinogenní – 3 kategorie
dle EU
•Zdraví škodlivé
•Mutagenní
•Žíravé
•Toxické pro reprodukci
•Dráždivé
•Nebezpečné pro životní
prostředí
•Senzibilizující
Výrobce, dovozce nebo následný uživatel, který uvádí na trh látku nebo směs, ji v
závislosti na intenzitě jejích nebezpečných vlastností při klasifikaci zařazuje do jedné
nebo více skupin nebezpečnosti.
Vyhláška č. 402/2011
o hodnocení nebezpečných vlastností chemických látek a
chemických směsí a balení a označování nebezpečných
chemických směsí
Prováděcí předpis k zákonu 350/2011 Sb
Obsahuje obecné postupy pro hodnocení nebezpečných
vlastností látky a směsí, popis výstražných symbolů,
standardní věty označující specifickou rizikovost a
standardní pokyny pro bezpečné zacházení.
• R – věty (R 41 – Nebezpečí vážného poškození očí)
• S – věty (S 25 – Zamezte styku s očima, S 26 – Při
zasažení očí důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte
lékařskou pomoc)
• Zrušena od 1.6. 2015
Nařízení (ES) č. 1272/2008
o klasifikaci a označování látek a směsí =
nařízení CLP (classification, labelling and
packaging)
• Obsáhlý předpis, včetně příloh již přes 2000 stran,
mnohokrát novelizován
• Nadřazen národním legislativním předpisům
• Obsahuje Standardní věty o nebezpečnosti podle
nařízení GHS a Pokyny pro bezpečné zacházení
Nařízení (ES) č. 1272/2008
• H318 – Způsobuje vážné poškození očí
• P262 – Zabraňte styku s očima, kůží nebo oděvem
• P305+P351+P313 – PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně
oplachujte vodou. Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření
• Výstražné symboly nebezpečnosti
Fyzikální nebezpečnost
Nebezpečnost pro zdraví
Nebezpečnost pro ŽP
Bezpečnostní listy
• Material Safety Data Sheets (MSDS)
Pokud je daná látka klasifikována jako nebezpečná podle nařízení (ES)
č. 1272/2008, je povinností osoby (výrobce i dovozce), která uvádí
látku na trh, vypracovat Bezpečnostní list (u nás např. Penta,
Sigma-Aldrich)
• Skládá se z několika oddílů –
Identifikace látky/směsi a
společnosti, Identifikace nebezpečnosti, Složení/Informace o složkách, Pokyny pro
první pomoc, Opatření pro hašení požáru, Opatření v případě náhodného úniku,
Zacházení a skladování, Osobní ochranné prostředky, Fyzikální a chemické
vlastnosti, Stálost a reaktivita, Toxikologické informace, Ekologické informace,
Pokyny pro odstraňování, Informace o přepravě, Informace o předpisech
Inhalační expozice
• Ventilace plic
Di = R Vi ci t
R = (ci – ce) / ci
V závislosti na stupni fyzické zátěže.
• NPK – nejvyšší přípustná koncentrace
• PEL – přípustný expoziční limit
• Imisní limity
• Nařízení č. 361/2007 Sb. – kterým se stanoví podmínky ochrany
zdraví při práci
Látka
NPK - P (mg/m3)
PEL (mg/m3)
Imisní limit (mg/m3)
benzen
10
3
0,005
olovo
0,2
0,05
0,00005
ethanol
3000
1000
-
Expozice požitím a expozice kontaktem s kůží
Pracovní prostředí X Běžný život
US EPA definuje průměrné a maximální hodnoty příjmu
potravy, pitné vody a další veličiny pro stanovení míry
expozice, ADI, RfD [mg/kg.den] a stanovení míry rizika
(např. HQ – hazard quotient a HI – hazard index)
HQ = E/RfD
E – průměrná denní absorbovaná dávka (ADD) nebo průměrná
celoživotní denní absorbovaná dávka (LADD), resp. chronický denní
příjem CDI [mg/kg.den]
Látka
Odhad průměrné hodnoty
Pitná voda
1,4 l za den (dospělí), 1 l za den (děti)
Zelenina
200 g za den
Půda (vstup ústy)
100 mg za den (dospělí), 200 mg za den (děti)
Kombinovaná expozice – např. při užívání vody kontaminované
těkavou látkou – ústy, inhalačně (sprchování - teplá voda), přes
kůži
Biologické indikátory
• Indikátorem expozice je – samotná látka, metabolit,
produkt reakce s biomolekulami, biochemický parametr…
• Biologický expoziční limit (BEL) – limitní hodnota, z
epidemiologické studie, z PEL
• Využití - hodnocení expozice z pracovního prostředí
• Biologický indikátor – dostatečná citlivost, neinvazivnost
odběru, specifičnost, znalost kvantitativní závislosti
Škodlivá látka
Biologický
indikátor
BEL
Vzorek
toluen
Hippuronová
kyselina
1600 mg/g
kreatininu
moč, konec
směny
Vztaženo na koncentraci kreatininu - standardizace
Další informační zdroje
• US EPA (U.S. Environmental Protection Agency) - Protects Our
Health, Environment & Economy
http://www.epa.gov
Rozsáhlé studie: např. EPA-823-R-01-001 - Water Quality Criterion for
the Protection of Human Health: Methylmercury – 303 stran
• US FDA (U.S. Food and Drug Administration) - Protecting and
Promoting Your Health
http://www.fda.gov/
• WHO- World Health Organization
IPCS - International Programme on Chemical Safety
http://www.who.int/ipcs/en/
Vliv chemických látek na lidské zdraví, hodnocení rizika, posílení
chemické bezpečnosti, management
• Evropská Agentura pro bezpečnost a ochranu zdraví při práci
https://osha.europa.eu/cs
RISC
• Software RISC (Risk-Integrated Software for Cleanups)
Odhad nepříznivých vlivů toxických látek na lidské zdraví,
karcinogenních i nekarcinogenních, možnost volit z čtrnácti
expozičních cest.
Potřebné údaje pochází z databází US EPA.
Knihy o toxikologii
Články – WoS, Scopus, PubMed
Bezpečnostní listy
(MSDS)
H – věty
P - věty
Databáze - TOXNET
Hg
SZÚ, TIS, Klinika
pracovního lékařství
RfD, ADI,
TDI, ARfD
Aktuální Studie (WHO,
IPEN, NGOs, BRI)
PEL, NPK,
NPK-P
Zákon 350/2011 Sb
Nařízení (ES) č. 1272/2008
Nařízení vlády 361/2007 Sb.
IARC, NTP, US EPA, GHS
Testy toxicity
RISC - software