II. TRANSPLANTACE I. – přednášky

II. TRANSPLANTACE I. – přednášky
7. STRUKTURA A ČINNOST ČESKÉHO REGISTRU DÁRCŮ KRVETVORNÝCH
BUNĚK
Ivašková E, Kupková L., Vágnerová D., Kolaříková I., Krákora T., Stříž I.
Institut klinické a experimentální medicíny Praha
Český registr dárců (CBMD) získává, eviduje a vyhledává potenciální nepříbuzné
dárce kostní dřeně, periferních kmenových buněk a pupečníkové krve pro
transplantace českých a zahraničních pacientů. Od počátku svého vzniku v r. 1991
se stal členem mezinárodní asociace registrů Bone Marrow Donor Worldwide a
počítačové sítě EDS. National Marrow Donor Program (NMDP) poskytuje dárce na
podkladě zvláštní smlouvy, která byla uzavřena v r. 1997.
S registrem spolupracuje 5 dárcovských center. Největší počet dárců byl vyšetřen
v IKEM (50 %) a Transfúzní stanici (TS) v Brně (32 %). Zbývající centra – TS
Zbraslav, Hradec Králové, Plzeň a ÚHKT – se podílejí 2 – 8 %.
Celkový počet dobrovolníků se blíží 16ti tisícům. Současně je evidováno 885
zmražených vzorků pupečníkové krve. Ročně přibývá 1000 – 2000 nových
evidovaných dárců. Od r. 1994 do 31.12.2002 vyhledal CBMD dárce pro 144 českých
pacientů, u kterých se uskutečnila transplantace. Další 2/3 pacientů, indikovaných
k transplantaci, k ní nedospěje. Během posledních devíti let poskytli čeští dárci
krvetvorné buňky 33 českým a zahraničním pacientům. 16 x se jednalo o kostní dřeň,
13 x o buňky z periferní krve a 4 x o pupečníkovou krev. Největší počet dárců
pochází ze zahraničních registrů, zvláště z Německa – 43 %, z NMDP – 12 %, Anglie
– 9 %, Francie – 5 %. Řada dalších evropských států se podílí 1 %. 15 % našich
pacientů má dárce z CBMD.
V poslední době stoupá počet transplantací periferních kmenových buněk.
Transplantační centra v Praze a Brně provedla v posledních čtyřech letech 25 těchto
transplantací.
8. NEPŘÍBUZENSKÝ TRANSPLANTAČNÍ PROGRAM V ČR Z POHLEDU DAT
ČESKÉHO NÁRODNÍHO REGISTRU DÁRCŮ DŘENĚ (ČNRDD)
Koza V., Jindra P., Pittrová H., Navrátilová J., Ambrůzová Z., Banzetová H.,
artoníčková A., Bohoněk M., Čermáková Z., Herynková R., Jílková B., Masopust J.,
Vyskočilová E.
Český národní registr dárců dřeně Plzeň
ČNRDD zahájil činnost v roce 1992. Po deset let provádí nejen nábor a HLA typizaci
dárců a vyhledávání vhodného dárce pro pac. indikované k UBMT, ale vede i
podrobná data o dárcích, žádostech transplantačních center (TC), transplantačních
indikacích, průběhu vyhledávání a samozřejmě jednotlivých odběrech. K 31.12.2002
evidoval ČNRDD 23 960 dárců vyšetřených na HLA I.třídu, 14 103 (60%) a 985 (4%)
z nich vyšetřených molekulárně DR, resp. ABDR. Medián věku dárců je 33 let,
zařazených v posledních 2 létech 28 let. Úspěšnost získání vzorku k DR či CT
vyšetření je přes 95% a díky rozsáhlému depozitáři DNA dárců pracuje registr velice
rychle. Medián doby od předběžné žádosti do data odběru je 2,5 měsíce. Žádosti
zahraničních TC o vyhledání dárce vykazují v létech 1998-2002 exponenciální nárůst
(90-163- 287-327-582), na rozdíl od ČR TC (74-66-78-78-152). Aktivita ČR TC v roce
2002: Brno 12, H.Králové 16, Plzeň 51, Motol 20, Olomouc 17, ÚHKT 36 žádostí.
Hlavní indikace ČR TC k UBMT AML (22%), CML (20%), ALL (14%) korespondují
s indikacemi zahraničních TC. K prosinci 2002 umožnil ČNRDD 134
nepříbuzenských transplantací, z toho 97 odběry vlastních a 37 odběry zahraničních
dárců. V létech 92-96 prováděl registr 1-3 odběry ročně, v roce 2002 uskutečnil 40
odběrů nepříbuzných dárců. Cíle registru do budoucna: 1. Doplnit max. molekulární
DR typizaci již zařazených dárců. 2. Zvýšit počet AB DNA typizovaných dárců,
zvláště AB sérologických homozygotů 3. Udržovat nízký medián věku dárců limitem
věku pro zařazení do registru 35 let. 4. Udržovat standardy registru v plné
kompatibilitě s WMDA standardy a připravenost k WMDA akreditaci. 5. Nabízet ČR
TC co nejlepší spolupráci s cílem zvýšit počet žádostí o vyhledání dárce na úroveň
zahraničních TC.
9. ANALÝZA PRVÝCH 500 PO SOBĚ JDOUCÍCH AUTOLOGNÍCH
TRANSPLANTACÍ KRVETVORNÝCH BUNĚK (ASCT) – ZKUŠENOST JEDNOHO
PRACOVIŠTĚ
Trněný M.1, Pytlík R.1, Vacková B.1, Slabý J.1,2, Benešová K.1,3, Trnková M.1, Kobylka
P.3, Gašová Z.3, Černý J.1,4, Slavíčková A.1, Šilerová B.1, Řehořová I.1, Procházka
B.5,
Klener P.1,3
1
I.interní klinika VFN a 1.LF UK, 2OKH FNKV, 3ÚHKT, 4Roger William Medical
Center, 5SZÚ Praha
Od 12/1993 do 2/2003 bylo na našem pracovišti provedeno celkem 500 (ASCT) u
389 nemocných (nem) s mediánem věku 47 let (18-70). Ženy tvořily 52,2% (n=203).
Nejčastější indikací byly non-hodgkinský lymfom (NHL) (191 ASCT u 169 nem),
mnohočetný myelom (MM) (132 ASCT u 79), Hodgkinův lymfom (HL) (86 ASCT u 68
nem), karcinom prsu (cap) (62 ASCT u 45 nem), chronická lymfatická leukémie (14
ASCT u 14 nem) a u 15 ASCT (14 nem) se jednalo o testikulární tumor, sclerosis
multiplex, AML, MDS a další. Jako zdroj krvetvorných buněk byla použita 5x (1%)
pouze kostní dřeň (BM), 29x (5,8%) kombinace BM a periferních krvetvorných buněk
(PBPC) a v 93,2% samotné PBPC. Medián CD34+ buněk v PBPC byl 5,94x106/kg
(0,58-69,6). V 21 případech jsme použili k transplantaci ex vivo selektované periferní
krvetvorné buňky. Nejčastěji použitým vysokodávkovaným režimem byl BEAM u 231
ASCT (46,2%). 111 transplantací bylo provedeno opakovaně (tandem resp.
retransplantace). S mediánem sledování 33 měsíců byla u nejčastější indikace NHL
dosažena v 5 letech pravděpodobnost PFS (progression free survival), EFS (event
free survival) a OS (overall survival) 42%, 40% a 51%, s dosažením plateu u
nemocných transplantovaných v 1.remisi (OS 73%). U nemocných s difúzním
velkobuněčným lymfomem transplantovaných v 1.remisi, chemosensitivním relapsu a
chemoresist. onem. ve 3.letech byl OS 71%, 65% a 12%, u nemocných s FCL to bylo
85% a 69%. Budou prezentovány výsledky u ostatních diagnóz.
Závěr: HDT s ASCT je standardní metodou v léčbě řady chorob, v současné době je
cílem zlepšit výsledky zavedením nových metod (např. monoklonální protilátky)
zároveň se snížením komplikací.
10. SROVNÁNÍ PŘEŽITÍ NEMOCNÝCH NAD 60 LET VĚKU S KONTROLNÍ
SKUPINOU NEMOCNÝCH POD 60 LET PO AUTOLOGNÍ TRANSPLANTACI
PERIFERNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK KRVETVORBY
Černá K., Koza V., Jindra P., Karas M., Škopek P., Vokurka S., Švojgrová M.,
Vozobulová V., Schützová M.
Hematoonkologické oddělení FN Plzeň
Cílem práce bylo v retrospektivní studii srovnat výsledky nemocných (nem.) po ASCT
starších 60-ti let s kontrolní skupinou nem. pod 60 let. Pacienti a metody:
analyzovali jsme 116 nem. (46Ž, 70M) po ASCT v období 1993-2002 rozdělených do
2 skupin se srovnatelnými diagnózami a stavem choroby, lišících se pouze ve věku.
Ve sk.I byl med. věku 64 let (60-73) a ve sk.II 46,5 let (16-53), p<0,0001. Výsledky:
u všech nem. ve sk.I došlo k přihojení štěpu s med. 11 dní (8-14) dosažení ANC nad
500/ul a s med. 15,5 dní (9-16) dosažení trombocytů nad 20.000/ul. Ve sk.II
s výjimkou 1 nem. došlo u všech k přihojení štěpu s med. 11 dní (8-17) dosažení
ANC nad 500/ul, p=0,82 a s med. 12 dní (9-19) dosažení trombocytů nad 20.000/ul,
p=0,62. Ve sk.I 22 nem. (38%) zemřelo, 3 nem. zemřeli v prvních 100 dnech po
ASCT s celkovou TRM 5%. 23 nem. ve sk.II zemřelo (39%), 2 z nich v prvních 100
dnech po ASCT s celkovou TRM 3,5%, p=1,0. 13 nem. (22%) ve sk.I zrelabovalo a
zemřelo 3-46 měs.(med. 13) po ASCT, 6 nem. (10%) zemřelo na jinou příčinu 6-56
měs. po ASCT (med. 32,5). Ve sk.II 16 nem. (32%) zrelabovalo a zemřelo 3-85 měs.
po ASCT (med. 19), p=0,668. 5 nem. (9%) zemřelo na jinou příčinu 18-73 (med. 34)
měs. po ASCT, p=1,0. Ve sk.I přežívá 36 nem. (62%) s med. 24 měsíců (3-82) a
pravděpodobností přežití 7 let 31%, ve sk.II přežívá 35 nem. (60%) s med. 38 měs.
(2-79) a pravděpodobností přežití 7 let 34%, p=0,311. Závěr: ačkoli nem. ve skupině
nad 60 let byli vstupně selektováni s ohledem na celkový status před ASCT, je
zřejmé, že engraftment, časná TRM a celkové přežití po vysocedávkované
chemoterapii s podporou ASCT u starších nemocných je srovnatelné s obdobnou
skupinou mladších pacientů.
11. VYSOCEDÁVKOVANÁ CHEMOTERAPIE S AUTOLOGNÍ TRANSPLANTACÍ
U INDOLENTNÍCH LYMFOMŮ, NAŠE ZKUŠENOSTI
Vondráková J., Papajík T., Faber E., Jarošová M., Kajaba V., Marešová I., Pikalová
Z., Raida L., Skoumalová I., Szotkowská R., Urbanová R., Vlachová Š., Indrák K.
Hemato-onkologická klinika FN a LF UP Olomouc
Volba optimální léčebné strategie u indolentních lymfoproliferací s typickým
chronickým, recidivující průběhem má pro pacienta zásadní význam. V některých
případech se setkáváme s agresivnějším průběhem choroby, a proto stratifikace
těchto nemocných, vyžadujících intenzivnější léčbu již na začátku onemocnění, může
prodloužit období bez známek aktivity nemoci. V našem sdělení hodnotíme
retrospektivní soubor nemocných diagnostikovaných a léčených na HOK FN
Olomouc v letech 1990-2002. Diagnostika se opírala o histologii, imunofenotypizaci,
molekulární biologii a cytogenetiku, hodnocení klinického stádia dle Ann Arbor, IPI,
prognostických markerů /B2M, sTK/. Od r. 1997
bylo transplantováno 101
nemocných (37%) pro NHL, 92 autologně, 9 alogenně. Autologní transplantaci po
přípravném režimu BEAM podstoupilo 23 nemocných s folikulárním NHL (6 mužů a
17 žen ve věku 30 – 66 let, průměr 46 let), 12 nemocných bylo transplantováno v CR,
9 v PR, 2 refrakterní. Indikováni k transplantaci byli nemocní s inic. pokročilou
chorobou, ev. bulky, extranodálním postižením, nepříznivým IPI či opakovaně
relabující. Po primingovém režimu nasbíráno v průměru 8,75 . 10 6 /kg CD 34+ buněk
( interval 2,12 – 23,5). Nikdo nezemřel do dne +30 po ATPKB. 2 chemorezistentní
nemocní na uvedenou léčbu nezareagovali, ostatní v den +100 hodnoceni jako
CR/MRD, 2x trvající PR.V současnosti je 13 nemocných v CR, 2x PR, 8 zrelabovalo,
z toho 4 exitovali na progresi choroby. Podrobná analýza souboru uvedená ve
sdělení dokládá léčebný přínos intenzivnějšího způsobu terapie u indolentních
lymfomů.
Podpořeno grantem MŠ č. MSN 15110004.
12. TRANSPLANTACE KRVETVORNÝCH BUNĚK V LÉČBĚ ROZTROUŠENÉ
SKLERÓZY, KLINICKÝ EFEKT A VÝSLEDKY IMUNOLOGICKÉHO
MONITOROVÁNÍ
Kozák T.1, Havrdová E.2, Piťha J.3, Trněný M.4, Gregora E.1, Pytlík R.4, KozaV. 5,
Škopek V.5, Kobylka P.6, Vodvářková Š.6
1
OKH FNKV, 2Neurologická klinika VFN, 3Neurologická klinika FNKV, 4I.interní klinika
VFN, 5Hematoonkologické oddělení FN Plzeň, 6ÚHKT, Praha
Dle registru EBMT/EULAR bylo do XII/02 provedeno v Evropě 420 transplantací
krvetvorných buněk pro autoimunitní onemocnění, z toho 11 alogenních. Zde
prezentujeme soubor 22 pacientů se sekundárně progredující RS, kteří se na 3
pracovištích v ČR podrobili imunoablační terapii s podporou autologních krvetvorných
buněk. Jde o největší soubor v Evropě. S výjimkou jedné pacientky všichni pacienti
vstoupili do studie na chronické dávce kortikosteroidů. V předchozím období byly
v léčbě neúspěšně použity alespoň 2 z následujících látek: interferon beta,
mitoxantron, cyklofosfamid, pulsy vysokých dávek metylprednisolonu, azathioprin,
metotrexát. Mobilizace autologních PBSC byla provedena pomocí cyklofosfamidu 3-4
g/m2 + G-CSF 7-10 µg/kg. Dvacet pacientů podstoupilo transplantaci krvetvorných
buněk po přípravném režimu BEAM. Věkový medián transplantovaných pacientů byl
35 let (23 – 51).
Klinické výsledky: Toxicita mobilizace a sběru PBPC nebyla odlišná od
hematologických malignit. U 14 pacientů byl štěp podroben T depleci, resp. selekci
CD34+ buněk in vitro. U 8 pacientů byl použit ATG D+1 a D+2 po převodu PBPC jako
forma T deplece in vivo. Toxicita léčebného režimu byla individuální. U 2 pacientů
byla
významná
s
rozvojem
respirační
insuficience
při
oboustranné
bronchopneumonii, resp. krvácení do plic a s nutností přechodné umělé plicní
ventilace. Oba pacienti tuto komplikaci překonali. Medián sledování je 28 měsíců.
Medián EDSS při vstupu do studie byl 6,5 (6,0-8,5), medián EDSS při posledním
sledování byl 6,5 (5,5-10,0). U 3 pacientů došlo k výraznému zlepšení
neurologického nálezu v EDSS (1,0-1,5 bodu), u dalších 6 pacientů ke zlepšení o 0,5
bodu. Alespoň ke stabilizaci onemocnění došlo u 17 pacientů (77%). Ke zhoršení
neurologického deficitu došlo u 3 pacientů, z nichž 1 pacientka na základní
onemocnění zemřela 30 měsíců po léčbě. V klinickém efektu u pacientů
transplantovaných s in vitro čištěným štěpem oproti transplantovaným s ATG není
významný rozdíl. Po dobu sledování jsou průběžně analyzovány lymfocytové
pupulace v periferní krvi. 12 měsíců po léčbě přetrvává statisticky významné snížení
IRI a procenta CD4+ a CD4+CD45RA+ lymfocytů.
Závěr: Naše výsledky podporují zahájení randomizované studie u pacientů se
sekundárně progredující RS.
Podporováno grantem IGA MZd č. NF6560-3.
V. TRANSPLANTCE II. – přednášky
25. VOLBA NEMYELOABLATIVNÍHO PŘÍPRAVNÉHO REŽIMU PODLE
PŘÍJEMCOVY T-LYMFOPENIE - PRVNÍ ZKUŠENOSTI U NEMOCNÝCH
S MALIGNÍMI LYMFOPROLIFERACEMI
Raida L.1, Faber E.1, Papajík T.1, Skoumalová I.1, Koupilová M.1, Pikalová Z.1,
Jarošová M1, Vlachová Š.1, Kubaláková R.1, Divoká M.1, Indrák K.1, Zapletalová J.2
1
HOK FN Olomouc, 2Katedra biofyziky LF UP Olomouc
11 nemocných podstoupilo alogenní příbuzenskou nemyeloablativní transplantaci
kmenových buněk (NTKB) pro diagnózu relabujícího nebo refrakterního NHL (8x,
72,7%), resp. B-CLL (3x, 27,3%). Kombinace fludarabinu s melfalanem (2x, 18,2%),
event. doplněná ATG (3x, 27,3%) zajistila v přípravě dostatečnou imunosupresi
příjemce a spolehlivé přihojení dárcovských buněk, byla však spojena s významnou
toxicitou. Nahrazení melfalanu cyklofosfamidem (5x, 45,5%) snižuje časnou
potransplantační toxicitu, avšak bez aplikace ATG (1x, 9,1%) může zajistit
dostatečnou imunosupresi pouze již předtransplantačně výrazně imunodeficitním
nemocným. 4 z 5 nemocných (80%) připravovaných kombinací fludarabinu a
cyklofosfamidu dosáhli již v den +30 kompletního dárcovského chimerismu v Tlymfocytech a následně i remisi (KR) lymfomu. Jejich předtransplantační medián
hodnot CD3+ buněk byl 0,29x109/l. Všech 6 příjemců (100%) připravovaných
intenzivnějšími imunoablativními režimy dosáhlo v den +30 kompletního dárcovského
T-lymfocytárního chimerismu a KR lymfomu. Medián CD3+ buněk byl 0,94x109/l.
Zemřeli 3 pacienti (27,3%) transplantovaní po přípravě obsahující melfalan a jediná
nemocná (9,1%) po kombinaci fludarabinu s cyklofosfamidem. Ani u jednoho z 10
pacientů (90,9%), kteří dosáhli KR, nedošlo při mediánu sledování 284 dnů k relapsu
choroby. Aplikace méně intenzivního nemyeloablativního přípravného režimu
umožňuje u imunosuprimovaných jedinců dostatečné přihojení dárcovských buněk
s následnou kontrolou lymfomu a současně snižuje riziko časných závažných
potransplantačních komplikací.
26. ALOGENNÍ TRANSPLANTACE KRVETVORNÝCH BUNĚK
PO NEMYELOABLATIVNÍM REŽIMU S FLUDARABINEM, BUSULFANEM
A ATG. ZPRÁVA Z JEDNOHO CENTRA
Doubek M., Mayer J., Kořístek Z., Krejčí M., Brychtová Y., Navrátil M., Vášová I.,
Tomíška M., Buchtová I.
Interní hematoonkologická klinika FN Brno
Úvod. Nemyeloablativní režimy umožňují provést alogenní transplantaci
krvetvorných buněk i u nemocných, u nichž nemůže být konvenční
předtransplantační
režim
podán.
2
Cíle a metody. Nemyeloablativní režim s fludarabinem (30 mg/m /den; 5 dní),
busulfanem (celkem 8 mg/kg) a ATG (10 mg/kg/den; 4 dny) byl retrospektivně
analyzován u všech 37 nemocných transplantovaných tímto režimem ve Fakultní
nemocnici
Brno.
Výsledky. Medián věku transplantovaných nemocných byl 54 let (27-65). 12
nemocných mělo AML, 10 CML, 5 NHL, 3 HD, 3 CLL, 2 MM, 1 MDS a 1 AA.
Nemocní byli transplatováni krvetvornými buňkami z periferní krve. Profylaxi GvHD
zajišťoval u všech nemocných cyklosporin A, u jednoho pacienta to byl cyklosporin s
metotrexátem. Medián transplantovaných CD34+ buněk a CFU-GM byl 7,6x106/kg,
respektive 105,6x104/kg. K přihojení buněk došlo u 36 nemocných, jeden pacient
zemřel před jeho přihojením. Leukocyty nad 1x109/l stouply v mediánu 19 dní (9-27)
a destičky nad 20x109/l v mediánu 13 dní (0-23). 3 nemocní dostali před přihojením
G-CSF. 76% pacientů mělo febrilní neutropenii. Incidence akutní GvHD byla 24 %,
akutní GvHD III. a IV. stupně 5 %. Limitovaná chronická GvHD se rozvinula u 9
pacientů (24 %), extensivní chronická GvHD u 2 pacientů (5%). 4 pacienti byli
retransplatováni pro relaps nemoci. Nehemtologická toxicita byla minimální. Den +60
mělo 57 % nemocných kompletní chimerismus. CMV nemoc se vyvinula u 1
pacienta. Během sledování relabovala nemoc u 32 % pacientů a 8 pacientů (22 %)
zemřelo.
Závěr. Režim s fludarabinem, busulfanem a ATG je velmi dobře tolerován a
zachovává si dostatečný protinádorový efekt.
27. ALLOGENNÍ TRANSPLANTACE V NEMYELOABLATIVNÍM PŘÍPRAVNÉM
REŽIMU, VÝSLEDKY ÚHKT
Marková M., Vítek A., Sajdová J., Šponerová D., Maaloufová J., Pohlreich D.,
Cetkovský P.
Ústav hematologie a krevní transfúze, Praha
V období červenec 1999 – duben 2003 bylo na ÚHKT Praha provedeno 43
allogenních transplantací v nemyeloablativním přípravném režimu. Jako štěp byla
použita dřeň shodného sourozence (3), periferní kmenové buňky shodného
sourozence (24), dřeň nepříbuzného dárrce (7), periferní kmenové buňky
nepříbuzného dárce (8) a periferní kmenové buňky od HLA neshodné matky (1).
Diagnózy, pro které byli pacienti transplantováni, zahrnovaly : CML 8, AML 13, MDS
6, NHL 6, MM 1, CLL 5, HD 1, renální karcinom 1, melanom 1, myelofibrosa 1.
Použili jsme tyto přípravné režimy: Flu,Bu,ATG (30), Ida,Flu,Bu,ATG (2), Flu,TBI (4),
Flu,TBI,ATG (1), Flu,CPA (3), Flu,Mel (1), Flu,Mel,ATG (1). Průběh samotné
transplantace do přihojení štěpu byl u většiny pacientů nekomplikovaný, pouze u 2
pacientů (4.6%) nedošlo k přihojení štěpu. U 9 % pacientů se vyskytla mírná
mukositida, u 2 pacientů VOD a u 1 pacienta hemorhagická cystitis. U 32% pacientů
byl průběh komplikován krátkodobou febrilní neutropenií. Průměrná doba přihojení
neutrofilů (více než 0.5 x 109 /l) byla 19 dní, průměrná doba přihojení trombocytů (nad
20 x 109 /l) byla 20 dní. U 5 pacientů (11,6%) bylo nutné užití G-CSF.
Celkem bylo u 29 (65.1%) pacientů dosaženo remise onemocnění. U CML to bylo 6
pacientů (75%), avšak samotná transplantace nenavodila molekulárně genetickou
remisi a bylo nutno použít ještě další intervence. U AML zrelabovalo po transplantaci
7 pacientů (53.8%), celkem jsme relaps či progresi zaznamenali u 14 (32.5%)
pacientů. 12 pacientům byly potransplantačně převedeny dárcovské lymfocyty.
Akutní GVHD se rozvinula u 17 (39.5%) pacientů, z toho u 5 až po aplikaci DLI. U 6
(13.9%) pacientů byla samotná GVHD, či infekce provázející její léčbu příčinou smrti
pacienta. Progrese či relaps základního onemocnění byly pak příčinou úmrtí u 10
(23.3%) pacientů . Celkem dosud zemřelo 22 pacientů (51.6 %) s průměrnou dobou
přežití u těchto pacientů od transplantace 196 dní. Žijících pacientů je 21 (48.8%),
s nejdelší dobou přežití od transplantace 1165 dnů.
Závěr: Allogenní transplantace v nemyeloablativním přípravném režimu jsou pacienty
dobře snášené, většinou bez problémů s přihojením, avšak podobně jako v ostatních
transplantačních centrech je hlavním úskalím rozvoj akutní GVHD a progrese, či
relaps základního onemocnění.
28. NEPŘÍBUZENSKÉ HSCT V LETECH 1994–2002 Z HLEDISKA HLA
KOMPATIBILITY
Dobrovolná M.1, Vraná M.1 , Loudová M.1 , Vítek A.1, Sedláček P.2
1
Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, 2II.dětská klinika 2. LF UK, Praha
V ÚHKT Praha provádíme genotypizaci HLA (hlavního histo-kompatibilního systému)
dospělých a dětských pacientů, kterým byla indikována transplantace
hematopoetických kmenových buněk (HSCT) od nepříbuzného dárce.
Od roku l994 provádí naše pracoviště DNA analýzu HLA II.třídy (lokusy -DRB1, DQB1) a od roku 1998 HLA I.třídy (lokusy -A,-B-C) na úrovni určení jednotlivých alel
(medium/high resolution). Za toto období se podařilo shromáždit soubor DNA 106
dvojic transplantovaných pacientů a jejich nepříbuzných dárců, u kterých jsme
schopni definovat jejich HLA kompatibilitu.
Přehled HLA kompatibility testovaného souboru
HLA
shoda nesh. jen I.tř. nesh.jen
II.tř.
počet
45
39
8
dvojic
neshoda
II.tř.
14
I.a
Celkový počet nalezených neshod
A
B lokus C lokus -DRB1
-DQB1
neshoda
lokus
lokus
lokus
alel.skupiny 4
6
39
0
13
alely
6
15
6
8
4
Nízký počet nalezených neshod na úrovni alelických skupin v lokusech -A,-B,-DRB1
je dán skutečností, že právě tyto údaje jsou kritériem výběru nepříbuzného dárce v
registru. Vyšší počet neshod na úrovni alel jsme nalezli u alelických skupin HLA-A
*02; -B *27, *35, *51; -DRB1 *04, *11. Má-li pacient některou z jmenovaných
alelických skupin, je vhodné právě v nich přednostně sledovat shodu mezi pacientem
a dárcem.
Studie byla provedena za podpory grantu IGA MZ, reg. č. NH/7615-3 a
Institucionálního výzkumného záměru ÚHKT CEZ MZ 0023736001.
29. PULZNÍ CYKLOFOSFAMID V LÉČBĚ TĚŽKÉ GVHD
Mayer J., Doubek M., Brychtová Y., Navrátil M., Obořilová A., Král Z., Tomíška M.,
Buchtová I.
Interní hematoonkologická klinika Fakultní nemocnice Brno
Těžká GvHD je obávanou komplikací alogenních transplantací krvetvorných buněk,
která může nemocného ohrozit na životě. Prognóza této komplikace se dále výrazně
zhoršuje, nedojde-li k promptní reakci na kortikoidy. Steroidrezistentní GvHD má
vysokou mortalitu a její léčba je velmi neuspokojivá, jak svými výsledky, tak cenou
(ATG, ovlivnění cytokinů).Cyklofosfamid je léta používané imunosupresivum. Dobré
výsledky jsou s ním dosahovány v léčbě některých autoimunit, přičemž GvHD se jako
autoimunitní onemocnění chová také. Cyklofosfamid je též základním
imunosupresivem používaným před transplantací krvetvorných buněk k potlačení
imunity příjemce. Na podkladě výše uvedených skutečností jsme se rozhodli začít
používat pulzní cyklofosfamid i k ovlivnění imunitních buněk dárce v případě těžké a
jinak nezvladatelné GvHD, v dávce 1000-2500 mg, podle stavu krevního obrazu.
První nemocné (2 podání s 2-letým odstupem) byl aplikován pulzní cykofosfamid
s velmi dobrým efektem primárně pro hemolytickou anémii v rámci chronické GvHD.
Těžká slizniční GvHD byla ale ovlivněna minimálně. Dalších 8 nemocných (9 podání)
již dostalo cyklofosfamid primárně pro akutní GvHD s malou nebo žádnou odpovědí
na kortikoidy. Typy GvHD a jejich ovlivnění: 1x slizniční v d. ústní – výrazné zlepšení,
obnoven příjem per os; 3x střevní – 1x beze změny, 1x zlepšení, 1x regrese; 5x
jaterní – výrazné zlepšení nálezu, někdy až překvapivě rychlý ústup z hodnot ALT
přes 20 ukat/l; 2x kožní – výrazný ústup až normalizace. Léčebné odpovědi se
většinou dostavily do 7-15 dnů po podání pulzu. Dále pokračováno v kombinované
imunosupresi bez cyklofosfamidu. Komplikace: 5x reaktivace CMV, zvládnuto, z 11
podání 5x mírný přechodný zvladatelný dřeňový útlum.
30. VYSOKÁ HLADINA REZIDUÁLNÍ NEMOCI PŘED TRANSPLANTACÍ
HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK U DĚTÍ S ALL PREDIKUJE
RIZIKO RELAPSU ONEMOCNĚNÍ
Šrámková L.1,2, Krejčí O.1,2, Mužíková K.1,2, Kalinová M.1,2, Zörnerová T.1,2, Sedláček
P.2, Keslová P.2, Zuna J.1,2, Starý J.2, Trka J.1,2
1
CLIP- Childhood Leukaemia Investigation Prague,2II. dětská klinika, UK 2.LF a FN
Motol
Hladina minimální reziduální nemoci (MRN) je důležitým prognostickým znakem u
pacientů s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL) podstupujících allogenní
transplantaci kmenových buněk krvetvorby (SCT). Pro sledování MRN jsme použili
metodiku detekce přestaveb imunoreceptorových genů (IRG) – genů pro
imunoglobuliny (Ig) a T-buněčných receptory (TCR) s následnou kvantitativní PCR s
použitím klonálně specifických primerů. Dosud jsme vyšetřili 13 dětí s ALL, kteří byli
prošli SCT s dobou sledování minimálně 6 měsíců po transplantaci. U všech pacientů
bylo možno sledovat MRN: u 11 pacientů (85%) byla nalezena alespoň jedna
přestavba IRG vhodná ke sledování MRN, 4 pacienti (31%) jsou sledováni pomocí
dvou cílů, 7 pacientů (54%) pomocí jednoho cíle, oba pacienti bez IRG přestavby
jsou sledováni pomocí fúzních genů. U všech pacientů s BCR/ABL přestavbou (n=4)
provádíme současně kvantitativní detekci transkriptu. Ve skupině pacientů s nízkou
MRN (n=9) jsme zaznamenali 1 hematologický a 1 molekulárně genetický relaps, 7
dětí je v kompletní remisi. Ve skupině s vysokou MRN (n=4) prodělali 2 pacienti
potransplantační hematologický relaps, 1 pacient molekulárně genetický relaps a 1
zemřel na časné potransplantační komplikace. Přežití pacientů s vysokou
předtransplantační MRN je významně horší než u pacientů, kteří vstupují do
transplantace s nízkou MRN. Všichni pacienti byli zařazeni do studie mezinárodní
skupiny ESG-MRD-ALL (European Study Group for Minimal Residual Disease in
ALL), která se zabývá standardizací detekce MRN.
Podporováno granty IGA MZ 6512, GAUK 43, FNM, VZ MŠMT 111300003 a
111300005.
XIII. TRANSPLANTACE III. – přednášky
67. BONE MARROW-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS AS
PRECURSORS FOR TUMOR STROMA AND TARGETED DELIVERY OF
THERAPEUTIC GENES IN CANCER
Studeny M.1, Dembinski J., Cabriera-Hansen M., Zompetta C., Champlin R. E.,
Marini III F. C., Andreeff M.
1
National Cancer Institute, Bratislava, Slovakia, Department of Blood and Marrow
Transplantation, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston,
TX
We showed that bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells serve as precursors
for stromal fibroblasts in solid tumors. It allow development of novel therapeutic
strategy based on the local production of biologically active molecules by genemanipulated mesenchymal stem cells (MSC) in the tumor microenvironment.
Mesenchymal stem cells transduced with adenoviral vector carrying human
interferon-beta (MSC-IFN-β directly inhibit growth of malignant cells in coculture
experiments in vitro. MSC-IFN-β intravenously injected into mice with established
breast carcinoma and melanoma, pulmonary metastases gave rise to stromal cells in
tumors and inhibited tumor growth in vivo. In contrast, systemically administered
interferon-beta (IFN-β) was completely ineffective in the same model. Our data
indicate that MSC-IFN-β suppressed malignant cell growth by local production of
IFN-β in the tumor microenvironment and that this effect does not correlate with IFNβ serum levels. Therefore, gene-manipulated mesenchymal stem cells may serve as
a new platform for targeted delivery of therapeutic proteins into sites of cancer.
68. CÍLENÝ HOMING KMENOVÝCH BUNĚK POMOCÍ PHAGE DISPLAY- PRVNI
KROK K TRANSDIFERENCIACI
Černý J.1,2, Demers D.2, Dooner M.S.2, Colvin G.A.2, Queseneberry P.J.2
1 st
1 Department of Internal Medicine Charles University General Hospital, Prague,
Czech Republic, 2Roger Williams Medical Center, Department of Research, Center
for Stem Cell Biology, Providence, Rhode Island, USA
Schopnost krvetvorných kmenových buněk (HSC) přihojit se a diferencovat v buňky
krevní či jiné tkáně (transdiferenciace) závisí na mnoha faktorech. Jedním z velmi
významných faktorů je vliv mikroprostředí a tzv. “homing” HSC. Nedávno jsme
prezentovali, že 48 hodinová expozice HSC (lin-Sca+) cytokínům (IL-3, 6, 11 steel
factor) rezultuje v defektním homingu HSC do kostní dřeně (BM), což má za
následek defekt přihojení. (Cerny et al. J Hematother Stem Cell Res 2002; 11: 813)
Současně jsme pozorovali, že po 24 hodinové kultivaci dochází k desetinasobně
vyššímu homingu lin-Sca+ buněk do plicní tkáně. Pro určení molekulární podstaty
divergentního homingu HSC jsme použili phagemid display cDNA library z plicní
tkáně (PhDL).
Provedli jsme celkem 4 kola in vitro panningu na buňkách kostní dřeně. Vytvořili
jsme následné PhDL: A- PhDL – klony, které se vázaly na buňky čerstvé BM (0
hod); B- PhDL – klony, které se vázaly na buňky BM (0 hod) a dále na BM 24 hod; C
- PhDL – klony, které se nevázaly (supernatant) na buňky BM (0 hod) a dále se pak
vázaly na BM 24 hod; D - PhDL – klony, které se v každém kole nevázaly
(supernatant) na buňky čerstvé BM a dále se pak vázaly na BM 24 hod.
Zhodnocení jednotlivých titrů ukázalo, že v případě klonů A došlo k časnému
nasycení systému, ostatní klony (B, C a D) vykazovaly selektivní narůst.
Sekvenováním namnožených klonů a porovnáním sekvencí pomocí NCBI Genbank
jsme zatím určili homologii např. s beta-chimerinem aj.
Věříme, že znalost molekulární podstaty homingu do nehematopoetických tkání
může přinést nejen vysvětlení, ale i brzké využití transdiferenciace a plasticity
kmenových buněk.
69. EX VIVO EXPANZE NEURÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK A ZACHOVÁNÍ
JEJICH HEMOPOETICKÉ IDENTITY
Filip S.1, Mokrý J.2, Karbanová J.2, Duspivová J.2, Vávrová J.3
1
Klinika onkologie a radioterapie FN, Hradec Králové, 2Ústav embryologie a
histologie LF UK, Hradec Králové, 3Ústav imunologie a radiobiologie VLA JEP,
Hradec Králové
Kmenové buňky pro své jedinečné vlastnosti slibují všestranné využití v klinické
medicíně, zejména možnosti reparace většiny orgánů a tkání lidského těla. Cílem
našeho experimentu je prokázat hematopoetickou identitu neurálních kmenových
buněk s možnosti jejich ex vivo expanze a získávání funkčních buněk, které se
uplatňují v regeneraci po poškození kostní dřeně. V experimentu jsme použili myši
Balb-c. Z myších embryí (D14) jsme izolovali neurální kmenové buňky, které jsme
dále pasážovali s kombinací cytokinů: SCF 50 ng/ml, FLT-3L 50 ng/ng, IL-3 50 ng/ml
a G-CSF 50 ng/ml. Doba pasážování byla 50 dní. Pro identifikaci hemopoetických
buněk jsme použili analýzu Sca-1 (stem cell antigen) a metodu kultivace CFU-GM.
Pro analýzu neurálních kmenových buněk jsme použili retrovirovou transfekci (LacZ) a
histochemickou analýzou X-Gal+ buněk. Po 30 dni pasážování jsme identifikovali již
první hemopoetické buňky. Pro určení zachování hemopoetické identity jsme použili
model, kdy jsme celotělově subletálně ozářeným myším
Balb-c LD 8,5 Gy
(4Gy+4.5Gy) aplikovali expandované plastické neurální kmenové buňky a testovali
jejich hemopoetickou identitu pro reparaci poškozené hematopoézy metodou kultivace
CFU-GM v kostní dřeni a slezině, dále také metodou endogenních slezinných kolonií
(CFU-S). V našem experimentu jsme zjistili, že transplantace expandovaných
plastických neurálních kmenových buněk vedla k reparaci hematopoézy.
70. IZOLACE, KULTIVACE A EXPANZE HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH
BUNĚK EX VIVO
Klabusay M., Kořístek Z., Vinklárková J., Adler J., Mayer J.
Interní hematoonkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno
Hematopoetické kmenové buňky jsou schopny úplné obnovy krvetvorby ve všech
liniích, čehož se klinicky využívá při transplantaci krvetvorby. Rychlost engraftmentu
je více ovlivněna zadanými progenitorovými buňkami, pro dlouhodobý engraftment
jsou nepostradatelné pluripotentní kmenové buňky. Podáním dostatečného množství
progenitorových a prekursorových buněk, které lze získat kultivací hematopoetických
kmenových buněk in vitro, je možno teoreticky zkrátit období hluboké pancytopenie
indukované cytostatiky a předejít tak často závažným komplikacím.
Autoři analyzovali metody selekce kmenových buněk pomocí imunomagnetické
separace Lin- buněk a jejich expanzi v podmínkách in vitro kultivace se všemi
možnými kombinacemi 5 cytokinů (SCF, Flt-3, IL-3, IL-6, TPO, +/- G-CSF). Kultury
byly analyzovány kvantitativně, mofrologicky, imunofenotypizačně a testy CFU-GM a
CFU-Meg.
Kmenové buňky v kultuře diferencují a množství progenitorů narůstá, zatímco
relativní zastoupení CD34+ buněk klesá v průměru pod 10% den +14. Množství
progenitorů granulocytární linie koreluje s nárůstem kolonií CFU-GM. Den +14
nejvyšší nárůst CFU-GM kolonií byl dosažen s cytokiny SCF+IL-3, SCF+IL3+FLT3+TPO a/nebo +IL-6, nejvyšší nárůst CFU-Meg kolonií s cytokiny SCF+IL-3+TPO.
Absolutní počet CD34+ buněk narůstá 5-20x den +14. Doplnění G-CSF zvyšuje
celkovou buněčnost kultury 2x, významně přibývá morfologicky zralých forem.
Tyto výsledky ukazují, že kmenové buňky je možné efektivně kultivovat, expandovat
a diferencovat v ex vivo podmínkách. Úspěšný průkaz expanze CFU-GM a CFU-Meg
kolonií podporuje možné použití těchto kultur in vivo u pacientů ke zkrácení doby
pancytopenie.
71. SUBPOPULACE CD34+ BUNĚK: ANALÝZA FENOTYPU PERIFERNÍCH
KMENOVÝCH BUNĚK PACIENTŮ MOBILIZOVANÝCH G-CSF
Klabusay M., Kovářová L., Kořístek Z., Vorlíček J.
Interní hematoonkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno
Hematopoetické kmenové buňky jsou u pacientů podstupujících autologní
transplantaci periferních kmenových buněk (PBSC) mobilizovány do periferní krve
pomocí stimulační chemoterapie s aplikací G-CSF. Populace CD34+ buněk netvoří
homogenní populaci – zahrnuje nejen pluripotentní hematopoetické kmenové buňky,
ale rovněž zadané progenitorové buňky. K analýze fenotypu CD34+ buněk byla
použita vícerozměrná flow cytometrická analýza. Vzorky periferní krve 10 pacientů
s diagnosou non-hodgkinského lymfomu byly analyzovány denně ode dne +10 od
zahájení stimulační chemoterapie, vzorky PBSC z transplantátu byly analyzovány
v den odběru pomocí přímo značených monoklonálních protilátek. Maximální počet
leukocytů v periferní krvi byl dosažen den +15 (21,9x10^9/l), relativní zastoupení
CD34+ buněk dosáhlo maxima den +15 (0,3x10^9/l). Kinetika CD34+ buněk byla
sledována ode dne +11, bez signifikantních změn v expresi antigenů. Průměrné
exprese sledovaných antigenů na CD34+ buňkách byly následující: CD38 92,2%,
CD2 6,0%, CD5 10,6%, CD14 13,7%, CD3 13,7%, CD10 1,8%, CD33 13,2%, CD15
14%, CD41 42,7%, CD61 34,6%, CD7 12,5%, CD135 6,4%, CD235a 40,8%, CD86
5,6%, HLA-DR 52,3%, CD90 1,6%, CD19 21,9%, CD20 8,8%, CD45 99,8%, CD56
14,5%, CD13 22,6%, CD11b 25,2%, CD117 5,9%, CD54 23,7%, CD71 77,2%, CD1a
8,8%. Z uvedených dat vyplývá, že většinu CD34+ buněk tvoří zadané progenitory
jednotlivých linií - 11% CD34+ buněk exprimuje antigeny T-linie, 22% antigeny Blinie, 13% antigeny myeloidní linie, 43% antigeny megakaryocytární linie; minoritní
část CD34+ buněk vykazuje fenotyp hematopoetických kmenových buněk (3,2%
CD34+38- a 1,9% CD34+90+). Tyto výsledky poukazují na možnost identifikace
populací v transplantátu PBSC zodpovídajících za krátkodobý či dlouhodobý
engraftment pomocí fenotypizace.
72. IDENTIFIKACE INDIVIDUÁLNÍCH KLONŮ T LYMFOCYTŮ U PACIENTŮ
PODSTUPUJÍCÍCH ALOGENNÍ TRANSPLANTACI KOSTNÍ DŘENĚ
Michálek J.1-4, Collins R.H.4, Douek D.C.5, Vitetta E.S.4
1
Laboratoř experimentální hematologie a buněčné imunoterapie, 21.Dětská klinika,
3
Klinika dětské onkologie, FN Brno, 4Cancer Immunobiology Center, University of
Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, U.S.A., 5Vaccine Research
Center, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, U.S.A.
Autoři studovali možnost identifikace antigen-specifických T lymfocytů v situaci
alogenní transplantace kostní dřeně. Jednalo se o identifikaci individuálních klonů
dárcovských T lymfocytů vyvolávajících reakci štěpu proti hostiteli (graft-versus-host
disease;GVHD) a dále o identifikaci dárcovských T lymfocytů vyvolávajících reakci
štěpu proti nádoru (graft-versus-tumor; GVT). Pomocí smíšené leukocytární kultury,
průtokové cytometrie a molekulární detekce T lymfocytárního receptoru beta bylo
možno identifikovat individuální klony GVHD-specifických (Michálek et al. Lancet
2003, 361: 1183-5) a GVT-specifických T lymfocytů in vitro před samotnou
transplantací a sledovat jednotlivé klony kvantitativně in vivo po transplantaci
(Michálek et al. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 1180-4). Tento nový přístup lze
aplikovat pro identifikaci a kvantitativní monitorování individuálních klonů T lymfocytů
v alogenní i autologní situaci a využít jej při sestavování klinických studií
využívajících adoptivní specifické imunoterapie nádorově-specifickými klony T
lymfocytů.
Částečně sponzorováno z grantu Leukemia Association of North Texas.
P – X. TRANSPLANTACE – postery
P57. MOBILIZÁCIA PERIFÉRNYCH KMEŇOVÝCH BUNIEK(PKB)
CYKLOFOSFAMIDOM 5g/m2+G-CSF. ZHODNOTENIE EFEKTIVITY
A KOMPLIKÁCIÍ U 38 PACIENTOV
Markuljak I.1, Baňáková J.1,Hudec J.2, Králiková E.1, Rudolfová I.2, Olvecká S.1,
Wildová B.1,Wild A.1, Mociková K.1, Žarnovičanová M.1
l
Hematologické oddelenie NsP FDR B.Bystrica, 2Oddelenie klinickej transfuziológie
NsP FDR B.Bystrica
Mobilizácia PKB cyklofosfamidom /CFA/ v kombinácii s rastovým faktorom /RF/ sa
stala štandardnou v získavaní transplantátu pri autológnych transplantáciách PKB.
Rôzni autori udávajú v mobilizačných režimoch rôzne dávky CFA /1,5 - 7g/m2/. Hoci
so zvýšením dávky CFA stúpa aj výťažnosť zvyšuje sa aj toxicita podanej
chemoterapie.
Autori prezentujú v súbore 38 pacientov výťažnosť vo veľkoobjemových aferézach po
režime CFA 5g/m2+G-CSF a komplikácie súvisiace s chemoterapiou / 32 pac.
s plazmocytómom, 5 pac. s B-NHL, l s M.Hodgkin/.
U 38 pacientov bolo vykonané celkovo 50 veľkoobjemových aferéz, ktoré boli
zahájené 8.-18. /medián 12./deň od aplikácie CFA, ako RF bol použitý G-CSF
/Neupogen alebo Granocyte 34/. Na l pacienta bolo nazbierané priemerne 4,329
x108/kg mononukleárnych buniek /MNC/, medián 3,98 /1,00-10,5/ x108/kg a
CD34+buniek 10,64x10 6/kg, medián 6,24 /0,54-46,66/ x 106/kg. Na l pacienta boli
vykonané l až 3 aferézy (medián l), pri l aferéze bolo nazbierané v priemere
8,08x106/kg/CD34+ bb., medián 5,13 / 0,36-46,66/ x 106/kg a MNC 3,28x108/kg,
medián 2,85 /0,56-10,5/ x108/kg. Cieľovú hodnotu na 1 transplantáciu 2,0x106/kg
CD34+buniek
sme nazbierali u 36 pacientov 94,7%. Komplikácie súvisiace
s chemoterapiou sa vyskytli u 12 pacientov /31,6%/, najčastejšie febrility-5 pac.,
hnačky-4 pac, infekt HDC-3 pac., prechodne arytmie u 1 pac. Celkovo hodnotíme
mobilizácie popísaným režimom efektívne s akceptovateľnou toxicitou.
P58. MAGNETICKÁ BUNĚČNÁ SEPARACE A CHIMÉRISMUS T-LYMFOCYTÁRNÍ
POPULACE PO ALOGENNÍ TRANSPLA-NTACI HEMATOPOETICKÝCH
KMENOVÝCH BUNĚK PO NEMYELOABLATIVNÍCH PŘÍPRAVNÝCH REŽIMECH
(NST)
Heczko M., Skoumalová I., Raida L., Faber E., Jarošová M., Pikalová Z., Vlachová
Š., Koupilová M., Lakomá I.
HOK FN Olomouc
Soubor pacientů a metody: U 9 pacientů po NST byl vyšetřován chimé-rismus
periferní T-buněčné populace metodami molekulární biologie a molekulární
cytogenetiky.
Byla prováděna detekce mikroalelických vyso-ce variabilních
polymorfismů -variable number of tandem repeats –metodou jednokolové PCR VNTR
lokusů (YNZ22 17p13.3, D1S111 1q23, D1S80 1p35-p36, ApoB 2p23-p24) páru
příjemce-dárce před transplantací a po transplantaci kmenových buněk. V případě
rozdílného pohlaví dárce a příjemce byla použita fluorescenční in situ hybridizaceFISH (detekce SRY). Imunomagnetická izolace T-lymfocytů byla získána jako
negativní depleční frakce použitím panT-cell isolation kit (kokteil paramagneticky
značených protilátek anti CD11b, CD16, CD19, CD36 a CD56) na přístroji MIDI
MACS.
Výsledky: Bylo provedeno 17 separací T-lymfocytů z periferní krve. Průměrná
celková čistota produktu představovala 66,8% u CD3 pozitivních buněk a 73,3% u
CD2 pozitivních buněk (medián 80%, resp. 90%, směrodatné odchylky 26%,
korelační koeficient 0,928 v Pearsonově testu). Produkt imunomagnetické separace
byl použit k vyšetření
chimérismu, u 4 pacientů metodou FISH (smíšený
chimérismus u 1 pacienta a kompletní chimérismus u 3 pacientů). U dalších 5
pacientů byly srovnávány genotypy VNTR (chimérismus smíšený u 2 pacientů a
kompletní chimérismus u 3 pacientů).
Práce byla podpořena výzkumným záměrem MŠ č. MSN 15110004 a interním
grantovým projektem LF UP v Olomouci č.12331102.
P59. ANALÝZA CHIMERISMU KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU
S FLUORESCENČNÍ DETEKCÍ U PACIENTŮ PO ALOGENNÍ TRANSPLANTACI
HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK
Horký O., Freiberger T., Mayer J.
Centrum molekulární biologie a genové terapie, IHOK, FN Brno
Vyšetřování chimerismu se stalo nedílnou součástí sledování pacientů, kteří
podstoupili alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk. Jako takové
vyžaduje použití spolehlivé, přesné, citlivé, a zároveň poměrně rychlé metody
detekce. Tyto nároky plně splňuje fragmentační analýza fluorescenčně značených
PCR produktů.
Metoda je založena na amplifikaci vysoce polymorfních úseků genomové DNA (STR
- short tandem repeats, respektive VNTR - variable number of tandem repeats), jež
jsou analyzovány a kvantifikovány s využitím kapilárního elektroforetického přístroje
(v našem případě ABI PRISM 310, Applied Biosystems). V rámci sledovaného
informativního polymorfismu je stupeň smíšeného chimerismu určován poměrem
plochy píku jedinečného pro příjemce a plochy píku(ů) dárce, a to na základě
kalibrační křivky sestrojené z několika různých ředění předtransplantační
příjemcovské DNA v DNA dárce.
V období od září 2002 do konce března 2003, kdy se metoda fragmentační analýzy
stala jedinou používanou k detekci chimerismu na našem pracovišti, bylo s použitím
polymorfismů VNTR (PKU-HindIII, D1S80, ApoB-100, YNZ-22, HVR-Ig) a STR (TH,
CSF1R, PLA2A, AR) vyšetřeno celkem 462 vzorků od 67 pacientů. Hlavní výhodou
oproti původně používané elektroforéze na agarózovém gelu je především vyšší
citlivost, přesnost a současně jednoduchost provedení. Jistá omezení mohou působit
arteficiální píky a je potřeba počítat s vyššími náklady.
V současné době probíhají v několika evropských laboratořích práce na uvedení
kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí jako standardní metody pro analýzu
chimerismu.
Práce je podporovaná VZ MZ č. 00065269705.
P60. SEKVENACE HLA-DRB1 GENU: PRVNÍ ZKUŠENOSTI SE ZAVEDENÍM
METODY DO RUTINNÍ PRAXE
Karvunidis T., Jindra P., Koza V.
Hematologicko-onkologické odd. FN Plzeň, Česká republika
Typizace HLA přímou sekvenací je považována za „zlatý standard“ a referenční
typizační metodu. Pouze takto lze totiž získat kompletní sekvenci nukleotidů daného
polymorfního genu. Metodika: Od 01/2003 je HLA-DRB1 gen v naší laboratoři
rutinně a obligátně typizován přímou sekvenací u všech pacientů zařazených do
programu nepříbuzenských transplantací a u jejich dárců. Do 03/2003 bylo takto
typizováno celkem 30 vzorků, z čehož 21 (70%) tvořili naši pacienti a 9 (30%) dárci.
K „all-alleles“ PCR amplifikaci exonu 2 DRB1 genu jsme užili komerčně dodávané
kity. Použití biotinylizovaného 3’primeru v každé PCR umožnilo následnou izolaci
ssDNA během vlastní sekvenační reakce prováděné pomocí T7 polymerázy
s interním sekvenačním primerem. K analýze sekvence bazí bylo využito PAGE (8%)
v automatickém sekvenátoru ALFexpress a příslušného softwaru. Výsledky: U všech
vzorků (100%) analýza sekvence bazí odpovídala výsledkům jejich PCR-SSP
typizace. 27 (90%) vzorků bylo heterozygotních a 3 (10%) homozygotní v DRB1
genu. V 10 příp. (33%) byl výsledek bez ambiguozit, u 20 (66%) s ambiguozitami
(mimo „silent substitution“). Ambiguozity se vyskytovaly 12x (60%, z toho 1x u
homozygota) pouze v 1 alele vyšetřovaného vzorku, 8x (40%) u obou typizovaných
alel v rámci 1 vzorku. Ambiguozity byly zjištěny u následujících alel: DRB1*11– 8x
(28,6% ze všech ambiguozit), DRB1*03– 8x (28,6%), DRB1*15 – 6x (21,4%),
DRB1*04 – 4x (14,3%), DRB1*01 –1x (3,6%), DRB1*14 – v 1x (3,6%). Tyto
ambiguozity nebylo možno stávajícím postupem rozlišit, polymorfismy v sekvenci
bazí se nacházely mimo amplifikovanou a analyzovanou oblast exonu 2 DRB1 genu
nebo kombinace alel heterozygotního vzorku znemožňovala jejich odlišení. Závěr:
Naše první zkušenosti se sekvenací DRB1 genu potvrzují přesnost této metody.
Nevýhodou je časová i finanční náročnost oproti základním DNA metodám. Do
budoucna počítáme s rozšířením i na další geny HLA.
P61. VARIANTY S HLA A KOMPLIKACE PO TRANSPLANTACI KOSTNÍ DŘENĚ
Matějková E., Suttnar J., Vítek A., Dyr J.E.
Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha
Zavedli jsme metody ke stanovení rozpustných molekul HLA I. třídy (sHLA-I) a jejich
hmotnostních variant v séru (testy ELISA a Western blot). Jednotlivé varianty sHLA
by mohly být časným indikátorem imunitních reakcí spojených s potransplantačními
komplikacemi jako jsou GVHD, rejekce štěpu nebo infekce. V séru se sHLA-I
molekuly vyskytují min. ve třech formách o molekulární váze 43, 39 a 35 kD.
V pilotní studii jsme sledovali hladiny sHLA-I a jejich hmotnostních variant u 32
hematologických nemocných (cca 300 krevních vzorků) po transplantaci kostní dřeně
(TKD).
Dynamika hladin sHLA a jejich variant po TKD měla individuální charakter závislý jak
na potransplantačních komplikacích, tak na způsobu léčby. Při rozvoji GVHD (8
nemocných) docházelo ke zvyšování hladin sHLA, a to zejména 43kD variant.
Hladiny 39, resp. 35kD variant v průběhu GVHD většinou poklesly (u 6 z 8
nemocných). Při infekčních komplikacích stoupaly koncentrace variant o nižší
molekulární hmotnosti (5/6 pacientů), zatímco v relapsu onemocnění docházelo
spíše k poklesu celkových hladin sHLA (3/4 nemocných).
Výsledky nasvědčují odlišné úloze, resp. zdrojích jednotlivých variant sHLA při
různých typech potransplantačních komplikací.
Poděkování: Projekt byl řešen s finanční podporou VZ ÚHKT č. 237360001. Za
technickou spolupráci děkujeme paní R. Kocingerové a paní O. Prouzové.
P62. REGRESE OSTEOMYELOSKLEROSY U NEMOCNÉHO
S MYELOFIBROSOU PO ALOGENNÍ TRANSPLANTACI PERIFERNÍCH
KMENOVÝCH BUNĚK
Skořepová M., Žák P., Benešová P., Voglová J., Kmoníček M., Jebavý L., Malý J.
Oddělení klinické hematologie, Fakultní nemocnice v Hradci Králové
Úvod: Primární myelofibrosa je charakterizována extrémní fibrosou kostní dřeně,
někdy i osteomyelosklerosou, splenomegalií a extramedulární hematopoesou.
Metody: Autoři popisují případ 50ti-letého nemocného sledovaného od r. 1981 pro
myelofibrosu. Z důvodů selhávání krvetvorby a progrese hepatosplenomegalie byla
v březnu r. 2002 provedena alogenní transplantace periferních kmenových buněk
(PKB). Jako přípravný režim byla zvolena kombinace busulfanu 3mg/kg D-7 až -4
s cyklofosfamidem 60mg/kg D-3 a -2. Dárcem PKB byl HLA-identický bratr.
Histologickým vyšetřením kostní dřeně před transplantací byla zjištěna velmi
výrazně zmnožená retikulární síť s významně redukovanou hematopoetickou tkání.
Nález byl hodnocen jako osteomyelosklerosa. Sedmý měsíc po transplantaci PKB
byla v histologickém vzorku nalezena jemná retikulární síť a obraz aktivace
hematopoesy. Současně došlo i k výraznému ústupu hepatosplenomegalie a
k takovému zlepšení celkového stavu pacienta, které umožnilo jeho částečný návrat
do práce. Toto zlepšení trvá doposud, tj. 13 měsíců po provedení transplantace.
Nemocný má známky limitované chronické formy GVHD při léčbě cyklosporinem.
Nebyl zaznamenán častější výskyt infekcí. Hodnoty krevního obrazu jsou uspokojivé
a pacient nepotřebuje hemosubstituci. V kostní dřeni trvá stoprocentní dárcovský
chimerismus.
Závěr: Případ dokumentuje reversibilitu těžké osteomyelosklerosy a následné
osídlení kostní dřeně funkční dárcovskou krvetvorbou. Ukazuje na možnost
provedení alogenní transplantace jako účinné metody k zlepšení kvality života
pacientů s touto chorobou.
P63. VÝSKYT SKUPINY ANTIGENŮ HLA-B70 U ČESKÝCH PACIENTŮ
S HEMATOLOGICKÝMI MALIGNITAMI
Vraná M.1, Matějková E.1, Dobrovolná M.1, Vítek A.1, Sedláček P.2, Loudová M.1
1
Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, 2II.dětská klinika 2. LF UK, Praha
V letech 1999-2002 byla na našem pracovišti testována skupina 568 pacientů
(většinou s hematologickými malignitami) potenciálně indikovaných k transplantaci
hematopoetických kmenových buněk (HSC). Sérotypizací byl u pěti z těchto pacientů
detekován antigen ze skupiny HLA-B70, která je jednou z málo běžných skupin
široké rodiny antigenů HLA-B15.
U čtyř z uvedených pacientů jsme provedli analýzu DNA. Užitím metody PCR-SSP
jsme určili alely B*1518 u tří z nich a u jednoho vzácnou alelu B*1529. Tyto výsledky
jsme jednoznačně potvrdili pomocí přímého sekvenování uvedených alel.
Alela HLA-B*1529 byla podle dostupných informací popsána pouze v jednom
případě, a to u jedince asijského původu. Studie prováděné na kavkazoidní populaci
výskyt této alely dosud neuváděly.
Alela HLA-B*1529 se od B*1518 liší v jednom páru bází v šedesátém sedmém
kodonu. To vede k záměně aminokyseliny v exprimovaném proteinu v pozici, která
je spoluodpovědná za vazbu peptidu. HLA-B*1518 se od nejběžnější B*1501 liší v
dalších jedenácti párech bazí.
Uvedené rozdíly mají vliv na rozlišovací schopnost imuno-kompetentních buněk.
Případná neshoda mezi pacientem a dárcem HSC, způsobená neurčením některé
neběžné alely u jednoho z nich, by mohla proto ovlivnit potransplantační průběh.