vz_zprava2009 - Průběžná zpráva za rok 2009

vz_zprava2009 - Průběžná zpráva za rok 2009

VÝROČNÍ ZPRÁVA VZMSM 21620820 ZA ROK 2009
ŘEŠITELSKÁ SKUPINA VI
LÉKAŘSKÁ FARMAKOLOGIE
1. ČÁST KLINICKÁ
1. skupina Doc.ing. Jaroslava Chládka, PhD
Vývoj a validace optimalizované metody HPLC na stanovení polyglutamátů
metotrexátu v erytrocytech nemocných s idiopatickou revmatoidní artritidou
Hroch M2, Tuková J1, Doležalová P1, Chládek J2
1 Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze a
Všeobecná fakultní nemocnice v Praze
2 Ústav farmakologie, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové
Při farmakoterapii psoriázy a juvenilní idiopatické artritidy (JIA) má důležité místo metotrexát
(MTX) podávaný v monoterapii nebo v kombinaci s jinými léčivy. Imunosupresivní účinek
MTX se rozvíjí v důsledku: A) inhibice enzymů folátového cyklu dihydrofolát reduktázy a
metylentetrahydrofolát reduktázy (MTHFR), B) thymidylát syntetázy, C) 5-aminoimidazol-4karboxamid ribonukleotid transformylázy a D/ kompetice s foláty o přenašeče redukovaných
folátů (RFC). Zásadní význam má intracelulární kumulace MTX ve formě polyglutamátů
(PGMTX) a vzájemný vztah koncentrací polyglutamátů folátů a MTX v buňce. Studie
provedené u dospělých nemocných s revmatoidní artritidou prokázaly vliv genového
polymorfizmu MTHFR na účinek a nežádoucí účinky MTX. Upozorňují také na přínos zjištění
genového polymorfizmu MTHFR a koncentrací PGMTX v erytrocytech.
Cíl práce. V našich dřívějších studiích jsme stanovovali PGMTX v erytrocytech (ERY)
enzymaticky na spektrofotometru (7). Principem enzymatické metody je inhibice DHFR, která
se projevuje sníženou rychlostí redukce dihydrofolátu na tetrahydrofolát a oxidace NADPH
na NADP+ (optický test). In vitro inhibiční aktivita PGMTX v ERY zjištěná touto metodou těsně
koreluje se změnami PASI (Psoriasis Area and Severity Index) u nemocných s psoriázou .
Cílem první práce bylo zavést a ověřit dokonalejší postup s využitím metody HPLC, popsané
v recentní práci a využívané v klinických studiích zatím jediného pracoviště. Důvod pro
zavedení nové metody byl i fakt, že enzym DHFR přestal být v ČR dostupný.
Metody. PGMTX obsažené v hemolyzátu erytrocytů, jsou štěpeny gama-glutamyl hydrolázou
v lidské plazmě, která je ke vzorku přidávána. Po šestihodinové inkubaci při 37°C je vzorek
deproteinován kyselinou trichloroctovou a vzniklý MTX je stanoven metodou HPLC
s fluorimetrickou detekcí. Chromatografická separace probíhá izokraticky na koloně s reverzní
fází C18 (Phenomenex Gemini 110A) v systému acetonitril-acetátový pufr (11:89, v/v, pH=5.5)
s přídavkem peroxidu vodíku (0,25 ml/l). Po eluci je MTX postkolonově derivatizován UV
světlem ve fotochemickém reaktoru a fotolytický produkt je detekován fluorescenčním
detektorem (excitace 375 nm / emise 463 nm). Kalibrace je prováděna v rozmezí koncentrací
12.5 - 100 nmol.l-1 na triglutamát.
Výsledky a závěr. Ukázkové chromatogramy kalibračních standardů jsou uvedeny na obrázku 1.
Selektivitu metody dokumentuje chromatogram vzorku hemolyzátu erytrocytů po přídavku řady
léčiv používaných k léčbě reumatoidní artritidy (obrázek 2). Metoda byla rozsáhle validována a
1
je vhodná pro monitorování koncentrací PGMTX v erytrocytech nemocných s revmatoidní
artritidou.
Výsledky byly publikovány v časopise Biopharm Drug Dispos 2009;30:138-48 s výhradní
dedikací projektu MSM 0021620820.
Obrázek 1. Ukázkové chromatogramy extraktů hemolyzátů erytrocytů po enzymatické
konverzi polyglutamátů MTX na monoglutamát. A/ blank, B/ blank s přídavkem triglutamátu
MTX 200 nmol/l, C/ blank s přídavky triglutamátu mTX o koncentracích 50 až 400 nmol/l, D/
vzorek získaný od nemocného léčeného MTX.
2
Obrázek 2. Chromatogram extraktu hemolyzátu erytrocytů s přídavkem diklofenaku,
ibuprofenu, ketoprofenu, nimesulidu, sulfasalazinu, naproxenu, prednisonu a prednisolonu
(koncentrace 1 mikromol/l).
Vliv genetického polymorfizmu methylentetrahydrofolát reduktázy (C677T and A1298C) a
koncentrací metotrexátu a folátů v erytrocytech na terapeutický účinek a nežádoucí účinky
MTX u dětí s idiopatickou reumatoidní artritidou.
Jana Tuková1, Jaroslav Chládek2, Miloš Hroch2, Dana Němcová1, Jozef Hoza1, Pavla
Doležalová1
1 Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze a
Všeobecná fakultní nemocnice v Praze
2 Ústav farmakologie, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové
Úvod. Byla provedena klinická studie zaměřená na vliv genetického polymorfizmu
metylentetrahydrofolát reduktázy (C677T and A1298C) a koncentrací metotrexátu a folátů
v erytrocytech na terapeutický účinek a nežádoucí účinky MTX u dětí s idiopatickou
revmatoidní artritidou.
Metody. Studie se zúčastnilo celkem 69 dětí, adolescentů a mladých dospělých osob (věkové
rozmezí 2,5-19 let). Nemocní byli léčeni MTX podávaným per os nebo s.c., jehož dávka byla
postupně zvyšována s cílem dosáhnout ústupu aktivity onemocnění. Na konci studie byli
vybráni nemocní, u nichž byla JIA zcela potlačena (n=18) a naopak nemocní s nedostatečnou
odpovědí na léčbu (n=51), s menším než 30 % zlepšením kriteria ACR30 při podávání ≥ 15
mg/m2/týden MTX s.c. po dobu 3 měsíce nebo delší).
DNA byla extrahována z leukocytů periferní krve a SNP A1298C and C677T genu pro
MTHFR byly detekovány metodou PCR – RFLP. Polyglutamáty MTX v erytrocytech byly
stanoveny metodou popsanou v naší publikaci (Biopharm Drug Dispos 2009;30:138-48).
Výsledky. Prevalenci genotypů MTHFR u nemocných s JIA a údaje o dávkování MTX uvádí
Tabulka 1. Nebyla nalezena souvislost mezi polymorfizmem MTHFR a účinkem MTX.
Nemocní, u nichž onemocnění nereagovalo na léčbu (skupina NR), byli léčeni vyšší dávkou
MTX (medián 17,2 vs 12,6 mg/m2/týden, P<0,005) a měli vyšší koncentrace PGMTX a folátů
v erytrocytech ve srovnání s těmi, u nichž došlo k remisi onemocnění (skupina R) (PGMTX:
217 nmol/L vs 106 nmol/L, P<0,02, foláty: 763 nmol/L vs 592 nmol/L, P=0.052) (Obrázek 3).
Četnost výskytu nežádoucích účinků (nauzea, zvracení, bolest břicha, alopecie) byla u obou
skupin nemocných srovnatelná (R: 29,4 %, NR: 33,3 %, P=0,77).
U nemocných s nežádoucími účinky byla nalezena vyšší frekvence alely 677T (52,4 % vs
20,9%, OR=3,88; 95% CI: 1,8–8,6; p<0,002). U nemocných s genotypem 677TT bylo riziko
výskytu nežádoucích účinků mnohonásobně zvýšené ve srovnání s genotypem 677CC
(OR=55,5; 95-% CI: 2,9–1080; p<0,001).
Závěr. Klinická studie provedená u nemocných s idiopatickou artritidou nalezla 3,9-krát vyšší
riziko nežádoucích účinků MTX u nosičů alely C677T genu pro MTHFR. Oproti
referenčnímu genotypu 677CC bylo riziko zvýšené 55-krát u homozygotů pro T alelu, tj. u
genotypu 677TT, který se téměř výhradně kombinuje s genotypem 1298AA. Stanovení
genotypu C677T umožňuje předpovědět riziko nežádoucích účinků MTX u nemocných s JIA.
3
Odesláno do Journal of Rheumatology s dedikací MSM 0021620820 a současně IGA
NE6681-3 (grant spolupracujícího pracoviště).
4
Tabulka 1. Prevalence genotypů MTHFR u nemocných s JIA a údaje o dávkování MTX
Genotypy
dávka MTX &
mg/m2/týden
12.7 (10.4-16.0)
cesta podání
p.o./s.c.
13/18
677CC
prevalence
n (%)
31 (48.4)
677CT
25 (39.1)
13.8 (11.1-15.4)
8/17
677TT
8 (12.5)
15.7a (15.3-19.0)
1/7
1298AA
29 (45.3)
14.7 (12.4-16.6)
8/21
1298AC
29 (45.3)
12.8 (10.3-15.2)
11/18
1298CC
6 (9.4)
9.9 (9.2-10.4)
3/3
677CC/1298CC
6 (9.4)
9.9 (9.2-15.3)
3/3
677TT/1298AA
8 (12.5)
15.7 (15.3-19.0)
1/7
677CT/1298AC
10 (15.6)
12.8 (10.2-15.2)
3/7
677CT/1298AA
15 (23.4)
14.1 (11.9-16.1)
5/10
677CC/1298AC
19 (29.7)
13.2 (10.5-16.9)
8/11
677CC/1298AA
6 (9.4)
12.5 (11.8-15.6)
2/4
&
a
medián (25. - 75. percentil ) při výstupním hodnocení
p<0.05 vs 677CC
500
P<0.02
1500
Folatesery (nmol/L)
EMTX (nM)
400
300
200
100
1000
0
Responders
P=0.052
500
0
Nonresponders
Responders
Nonresponders
Obrázek 3. Koncentrace polyglutamátů MTX v erytrocytech (vlevo) a folátů v erytrocytech
(vpravo) u nemocných, u nichž došlo k úplné remisi JIA (n=18, responders) a u nemocných
s nedostatečnou odpovědí na léčbu (n=51, nontresponders), tj. s menším než 30 % zlepšením
kriteria ACR30 při podávání ≥ 15 mg/m2/týden MTX s.c. po dobu 3 měsíce nebo delší.
2. skupina Doc.MUDr. Ondřeje Slanaře, PhD
Teprve nedávno byl objasněn mechanismus působení fibrátů používaných v léčbě
dyslipidemií. Hlavním místem jejich zásahu jsou nitrobuněčné struktury obsahující řadu
enzymů – peroxisomy- které řídí metabolismus lipidů a glycidů v jaterním parenchymu.
5
Aktivita peroxisomů je regulována nukleárními genovými receptory označovanými jako
PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors).
Fibráty zvyšují aktivitu těchto receptorů a tím i katabolismus mastných kyselin. Usnadňují
jejich vychytávání ve tkáních, což se následně projevuje snížením aterogenních LDL,
zvýšením HDL-cholesterolu a poklesem triglyceridů. Cílem naší práce bylo zjistit endogenní
bioindikátory PPARα aktivace, vyvolané fenofibrátem u 10 zdravých dobrovolníků bez
genetické příbuznosti.
Fenofibrát jsem podávali v dávce 200 mg/den po dobu 14 dnů. Na spolupracujícím
zahraničním pracovišti (Laboratory of Metabolism, National Cancer Institute, National
Institute of Health, Bethesda, MD) se u všech jedinců realizovala metabolomická analýza
pomocí UPLC-QTOFMS (Ultraperformance Liquid Chromatography Coupled with
Electrospray Ionization Quadrupole time-of-flight Mass Spectrometry) před a po posledním
podání léčiva. PPAR aktivace, se projevila zvýšenou oxidací mastných kyselin. Po aplikaci
léčiva došlo k signifikantnímu snížení kyseliny pantotenové a acetylkarnitinu v moči, které
lze proto považovat za užitečné bioindikátory PPARα vyvolané oxidace mastných kyselin u
člověka (Tab. 1, Obr.1)
Tab1: Přehled důležitých biomarkerů.
Obr. 1 Přehled důležitých biomarkerů po 7 a 14 dnech podávání fenofibrátu ve srovnání
s výchozí hodnotou (0).
6
Po podání fenofibrátu jsme pozorovali také pokles sérového cholesterolu, triglyceridů a
kyseliny močové. Obdobný trend se projevil i u dalších derivátů karnitinu v moči.
Práce ilustruje vhodnost použití farmakometabolomické analýzy při studiu účinků
hypolipidemické léčby fibráty u člověka.
Srovnání s preklinickým modelem s ohledem na biomarkery kyselinu pantotenovou (A,B) a
acylkarnitin (C, D) je uvedeno na Obr. 2
Obr. 2: Srovnání s preklinickým in vivo modelem PPAR-null mouse.
Úplný text práce byl uveřejněn včetně dedikace záměru v časopise J Proteome Res. 2009
Sep;8(9):4293-300.
Human urinary metabolomic profile of PPARalpha induced fatty acid beta-oxidation.
Patterson AD, Slanar O, Krausz KW, Li F, Höfer CC, Perlík F, Gonzalez FJ, Idle JR.
(IF 5.7)
Na začátku roku 2009 jsme odeslali k recenznímu řízení rukopis shrnující výsledky
z předchozího období řešení VZ (za rok 2008) týkající se infračervené pupilometrie jako
neinvazivního biomarkeru aktivity CYP2D6 (Matoušková et al., J Clin Pharm Ther).
V recenzním řízení.
7
3. Skupina doc ing Jana Kremláčka, PhD
Elektrofyziologické hodnocení vlivu farmakoterapie na CNS
skupina při Ústavu patologické fyziologie
projekty:
„Objektivizace účinku léku Ebixa pomocí zrakově vyvolaných kognitivních
potenciálů u pacientů s Alzheimerovou chorobou“:
Celkově bylo vyšetřeno 17 pacientů s Alzheimerovou nemocí. Během šestiměsíčního
sledování
pacientů
nedošlo
k signifikantní
změně
v psychologických
ani
elektrofyziologických testech -ERP. Z toho vyplývá, že Ebixa zpomaluje obvyklou
progresi Alzheimerovy choroby a že její účinek lze hodnotit pomocí ERP. Výsledky byly
prezentovány na konferenci ISCEV (International Society for Clinical Electrophysiology
of Vision) v Itálii a je připravována publikace na toto téma.
„Efekt dlouhodobého užívání metamfetaminu na zpracování zrakové informace“
V roce 2009 bylo pokračováno v pilotním pokusu a soubor byl rozšířen na 35
registrovaných pacientů (19-36 let; 9 žen) s průměrnou dobou intravenózního podávání
metamfetaminu 5.1 (1,5-13) roku. Současně byly také vyšetřeny věkem a pohlavím
spárované kontrolní osoby. V minulém roce jsme v rámci tohoto VZ publikovali pilotní
studie na 17 a 23 pacientech a popsali zpomalení a zmenšení neurálních reakcí na zrakové
podněty ve srovnání se skupinou kontrolní (Kremláček J et al. Doc Ophthalmol, 2008;117:
245-55 a Hosák L et al. ANeEx, 2008; 68: 97-102). Cílem dalšího náboru je ověřit pilotní
pozorování na rozsáhlejším vzorku a umožnit prověření možné vazby mezi
elektrofyziologickými parametry a genem kódujícím enzymatickou aktivitu katechol-ometyltransferázy. Výsledky budeme publikovat v tomto roce.
II. ČÁST PREKLINICKÁ
1. Skupina Doc MUDr Stanislava Mičudy, PhD
Dílčí cíle na rok 2009
Výzkum byl zaměřen na dokončení/provedení třech okruhů prací:
a) změny exprese lékových transportních proteinů v játrech a ledvinách potkanů během
endotoxémie a její modulace dexametazonem nebo anakinrou (antagonista IL-1
receptorů),
b) změny exprese a funkce jaterních a ledvinných transportních proteinů podmíněné
biliární cirhózou – vliv resveratrolu,
c) vliv pravastatinu na jaterní poškození indukované chronickou cholestázou
8
Výsledky řešení projektu
Ad A) Endotoxémie, dexametazon, anakinra a transportní proteiny
Pomocí metodiky kvantitativní RT-PCR byly zhodnoceny změny exprese hlavních
jaterních (Obr. 1) i ledvinných (Obr. 2) lékových transportérů.
Podání endotoxinu vedlo k poklesu jaterní exprese mRNA u Ntcp, Bsep, Oatp1a4,
Mrp2 a Mdr2, tj. všech hlavních transportérů pro žlučové kyseliny a léčiva typu organických
aniontů. Výrazně zvýšená byla naproti tomu exprese indukovatelné formy P-glykoproteinu,
Mdr1b. Zatímco podání anakinry nevedlo k modulaci těchto změn, aplikace dexametazonu
příznivě ovlivnila zejména hlavní transportéry žlučových kyselin, Bsep a Ntcp. Současně byly
dexametazonem normalizovány exprese Mdr2 a Mdr1b.
Exprese mRNA transportérů v ledvinách je dokumentována Obr. 2. Endotoxémie byla
spojena se vzestupem exprese Mdr1b, Mrp2, Mrp4 a Oat3 transportních proteinů. Pokles byl
zaznamenán u Oat1 a Oat2 transportérů. Dexametazon i anakinra tyto změny příznivě
modulovaly.
Azitromycin je modelovým substrátem Oatp1a4, Mrp2 a Mdr1 transportérů, což z něj
činí optimální látku pro testování aktivity těchto základních lékových transportních proteinů
v játrech a ledvinách. Zvířatům byl podán 12 hodin po podání LPS resp. vehikula (kontrolní
skupina). Průběh plazmatických koncentrací, tok žluče a moče a kumulativní eliminaci
farmaka do žluče a moče nabízí Obr. 3 a 4. Analýza farmakokinetických parametrů je
sumarizována v Tab. 1. Podání endotoxinu bylo spojeno s poklesem žlučové i močové
eliminace azitromycinu, což se projevilo poklesem celkové clearance léčiva. Dexametazon
nezlepšil žlučovou eliminaci, ale výrazně zlepšil močovou eliminaci léčiva, celková clearance
azitromycinu však zůstala snížená. Tento fakt patrně souvisí s výrazným poklesem
distribučního objemu léčiva, pravděpodobně v důsledku hemodynamických změn v portálním
řečišti a alterací dostupnosti léčiva v játrech. Vliv anakinry na kinetiku azitromycinu během
endotoxémie byl příznivý pro eliminaci léčiva v játrech i ledvinách.
V reakci na přítomnost endotoxinu dochází ke stimulaci tvorby dvou mediátorů, které
zprostředkují řadu funkcí – NO (oxid dusnatý) a CO (oxid uhelnatý). První je produkován NO
syntázamy, během endotoxémie především jejich indukovatelnou formou – iNOS. CO je
vytvářen činností hemoxygenázy 1 (HO-1). V patofyziologii endotoxémie se obě formy
enzymů vzájemně ovlivňují. NO zprostředkuje mimo jiné výrazné změny v cirkulaci, zejména
vazodilataci a vzestup permeability. HO-1 je indukována mimo jiné přítomností NO a
inhibuje expresi iNOS a tím i tvorbu NO, čímž se podílí na omezení orgánového poškození
v důsledku jeho excesivní tvorby (např. poškození ledvin v důsledku hypotenze). Výsledky
analýzy iNOS a HO-1 nabízí Obr. 5. Podání LPS vedlo k výrazné indukci obou enzymů.
Protizánětlivá modulace se projevila zejména po podání dexametazonu, kdy došlo zejména
k poklesu iNOS v ledvinách, což koresponduje s lepší oběhovou stabilizací.
Obr. 1. Změny exprese jaterních lékových transportérů. Vyjádřeno v % hodnot zjištěných u
kontrolních zvířat. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 - signifikantní změna v porovnání
s kontrolou; ‡p<0,05; ‡‡p<0,01; ‡‡‡p<0,001 - signifikantní změna v porovnání s LPS skupinou.
9
Obr. 2. Změny exprese ledvinných lékových transportérů. Vyjádřeno v % hodnot zjištěných u
kontrolních zvířat. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 - signifikantní změna v porovnání
s kontrolou; ‡p<0,05; ‡‡p<0,01; ‡‡‡p<0,001 - signifikantní změna v porovnání s LPS skupinou.
10
Obr. 3. Profily plazmatických koncentrací azitromycinu u kontrolních a LPS zvířat.
Obr. 4. Tok žluče (A) a moče (B) a kumulativní žlučová (C) a močová (D) exkrece
azitromycinu u jednotlivých experimentálních skupin.
11
Tab. 1. Farmakokinetické parametry nitrožilně podaného azitromycinu (20 mg/kg) u
kontrolních a endotoxemických (LPS) potkanů.
Ctrl
LPS
Dex-LPS
Ana-LPS
Cmax (mg/L)
8.8 ± 2.3
12 ± 2
14 ± 1.6
7.2 ± 0.5
210 ± 70
310 ± 81
120 ± 25
89 ± 13‡
t1/2α (min)
‡
Vdz (L/kg)
16 ± 2.5
15 ± 2.5
7.4 ± 1.6*
10 ± 1.8
Vdss (L/kg)
9.4 ± 1.7
6.9 ± 1
3.8 ± 0.7*‡
6.2 ±1.1
XBile (mg/240 min)
0.15 ± 0.01
0.08 ± 0.01* 0.11 ± 0.01
0.1 ± 0.01
XUrine (mg/240 min)
1.1 ± 0.1
0.6 ± 0.1*
1.2 ± 0.1‡‡
0.9 ± 0.1
CLTotal (ml/min)
21 ± 0.04
14 ± 1.8*
13 ± 1.5*
20 ± 2.8
CLBile (ml/min)
0.4 ± 0.04
0.2 ± 0.03*
0.2 ± 0.03*
0.4 ± 0.1
‡
CLR (ml/min)
3.1 ± 0.5
1 ± 0.4**
2.2 ± 0.2
2.5 ± 0.5‡
CLCR (ml/min)
1.5 ± 0.1
0.9 ± 0.1**
1.4 ± 0.1‡
1.7 ± 0.2‡
‡
CLR/CLCR
2.1 ± 0.3
1.2 ± 0.3*
1.6 ± 0.2
1.5 ± 0.3‡
Signifikantní rozdíl proti kontrolní skupině (*P < 0.05, **P < 0.01).
Signifikantní rozdíl proti LPS skupině (‡P < 0.05, ‡‡P < 0.01).
Obr. 5. Exprese iNOS a HO-1 v ledvinách
12
Ad B) Změny exprese a funkce jaterních a ledvinných transportních proteinů
podmíněné biliární cirhózou – vliv resveratrolu
Pomocí metodiky qRT-PCR byly zhodnoceny změny exprese hlavních transportních
pro žlučové kyseliny a azitromycin během biliární cirhózy (podvaz žlučovodu v trvání 28
dnů; BDO28) u potkanů. Současně byl sledován vliv resveratrolu na změny exprese těchto
transportérů.
mRNA exprese bazolaterálních transportních proteinů pro vychytávání organických
aniontů do hepatocytů během biliární cirhózy (Obr. 6) – Ntcp, Oatp1a1, Oatp1a4 a Oat2 byla
snížená, mRNA exprese Oct1 pro přenos organických kationtů byla zvýšená. Naproti tomu
vedla biliární cirhóza ke zvýšení mRNA exprese bazolaterálních efluxních transportérů (Obr.
6) – Mrp3 a Mrp4, což představuje kompenzační mechanizmus pro exkreci v játrech se
kumulujících látek. Biliární cirhóza vedla ke snížení exprese kanalikulárního Mrp2
transportéru na úrovni mRNA, ale zvýšení exprese Mdr1b, Bcrp a Mdr2 transportérů (Obr. 7).
Exprese Bsep nebyla patologickým stavem ovlivněna. Resveratrol vedl u všech biliární
cirhózou navozených změn exprese transportérů na úrovni mRNA k normalizaci hodnot na
úroveň kontrolních skupin (sham-operace v trvání 28 dnů).
13
Obr. 6. Změny mRNA exprese bazolaterálních transportérů v játrech. Vyjádřeno v % hodnot
zjištěných u kontrolních zvířat. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 - signifikantní změna
v porovnání s kontrolou; #p<0,05; ##p<0,01; ###p<0,001 - signifikantní změna v porovnání
s BDO28 skupinou.
14
Obr. 7. Změny mRNA exprese kanalikulárních transportérů v játrech. Vyjádřeno v % hodnot
zjištěných u kontrolních zvířat. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 - signifikantní změna
v porovnání s kontrolou; #p<0,05; ##p<0,01; ###p<0,001 - signifikantní změna v porovnání
s BDO28 skupinou.
15
Ad C) Vliv pravastatinu na jaterní poškození indukované chronickou cholestázou
V rámci tohoto úkolu bylo provedeno:
• Analýzy exprese markerů oxidačního stresu HO-1, eNOS a iNOS na úrovni proteinu
(Obr. 8). Exprese HO-1 byla zvýšena u BDO, BDO-P5 a BDO-P1 na 114%, 129% a
109% v porovnání s Sh. Exprese eNOS byla u BDO, BDO-P5 zvýšena na 150%, 142%
v porovnání s Sh. Exprese iNOS byla u BDO, BDO-P5 a BDO-P1 zvýšena na 123%,
116% a 112% v porovnání s Sh.
• Analýzy exprese transportních proteinů v játrech na úrovni mRNA metodou RT-PCR
(Obr. 9). Ve skupině BDO byla snížena exprese Ntcp, Oatp1a1 a Oatp1a4 na 48%, 52% a
71% v porovnání s Sh. Exprese Mrp3 byla zvýšena u BDO na 1156% v porovnání s Sh.
U BDO byla snížena exprese kanalikulárních transportérů Mrp2 a Bsep na 87% a 75%
v porovnání s Sh. Naopak exprese Mdr1b a Mdr2 byla zvýšena na 3353% a 176%
v porovnání s Sh. U BDO-P1 byla v porovnání s BDO exprese většiny transportérů (s
výjimkou dalšího snížení exprese Mrp2 a Mrp4 na 63% a 36%) nezměněna. Ve skupině
BDO-P5 byla exprese Oatp1a1, Oatp1a4, Mrp2, Bsep a Mrp4 snížena na 55%, 45%,
53%, 72% a 37% v porovnání s BDO.
• Analýzy exprese enzymů (Cyp7a1 a Cyp8b1) nezbytných pro syntézu žlučových kyselin
na úrovni mRNA (Obr. 9). Exprese Cyp7a1 byla zvýšena na 769% v porovnání
s kontrolní skupinou. Naopak exprese tohoto enzymu byla snížena ve skupinách BDO-P5
a BDO-P1 na 47% a 51% v porovnání s Sh. Exprese Cyp8b1 klesla ve skupinách BDO,
BDO-P5 a BDO-P1 na 15%, 14% a 8% v porovnání s Sh.
• Analýzy exprese proteinů zapojených do regulace homeostázy cholesterolu (Sr-b1,
Abca1, LDL-rec. a Abcg5/Abcg8) na úrovni mRNA (Tab. 2). Exprese Sr-b1 a Abca1 se
v experimentálních skupinách nelišily od skupiny kontrolní. Exprese LDL-rec.byla u
BDO zvýšena na 137% v porovnání s Sh, u BDO-P5 a BDO-P1 byla snížena na 40% a
41% v porovnání s BDO. Exprese Abcg5/Abcg8 byla snížena u BDO na 8% a 6%
v porovnání s Sh, obdobně tomu bylo i ve skupinách BDO-P5 a BDO-P1.
Obr. 8: Exprese regulačních molekul eNOS, iNOS a HO-1 na úrovni proteinu. Signifikantní
změna v porovnání s kontrolou (* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001). Signifikantní změna v
porovnání s BDO skupinou(+ P < 0,05, ++ P < 0,01, +++ P < 0,001).
16
beta-actin
17
D
O
D
O
-P
1
-P
5
B
D
B
D
O
-P
1
O
-P
5
150
B
B
Sh
-P
5
0
O
50
B
D
100
Exprese proteinu
(% kontroly)
150
D
O
Sh
-P
1
-P
5
200
Sh
-P
5
B
Sh
Exprese proteinu
(% kontroly)
B
D
O
B
D
O
Sh
-P
5
B
D
O
Sh
Exprese proteinu
(% kontroly)
eNOS
HO-1
**
100
50
0
200
iNOS
150
100
50
0
200
0
18
1
400
-P
#
0
150
Cyp8b1
800
100
50
0
***
O
-P
1
#
D
100
B
1
-P
D
O
5
5
-P
D
O
50
B
Mrp4
O
-P
5
150
-P
0
D
B
#
P5
Oatp1a1
Sh
**
D
O
P5
O
B
D
B
D
O
-P
1
O
-P
5
Sh
-P
5
B
D
Sh
-P
1
D
O
-P
5
D
O
mRNA exprese
(% kontroly)
Bsep
Sh
-
##
B
150
O
B
B
0
D
1
-P
D
O
5
-P
D
O
50
B
100
mRNA exprese
(% kontroly)
B
B
Sh
-
##
Sh
1
-P
D
O
5
-P
D
O
5
-P
D
O
100
mRNA exprese
(% kontroly)
B
B
Sh
B
Sh
mRNA exprese
(% kontroly)
150
Sh
1
-P
5
-P
D
O
B
B
50
D
O
Cyp7a1
-P
5
***
D
O
0
50
B
B
500
D
O
Mrp3
B
0
5
***
-P
50
Sh
Ntcp
5
150
-P
200
Sh
2000
500
400
300
200
100
0
D
O
Mdr1b
5
B
6000
D
O
8000
-P
B
***
mRNA exprese
(% kontroly)
O
-P
1
O
-P
5
0
D
O
Sh
1
-P
D
O
B
D
B
D
Mrp2
Sh
B
100
mRNA exprese
(% kontroly)
B
5
5
-P
-P
D
O
O
Sh
-P
5
B
D
##
D
O
#
Sh
1
-P
D
O
B
D
O
50
B
1000
mRNA exprese
(% kontroly)
B
5
5
-P
D
O
Sh
B
#
Sh
O
-P
1
O
-P
5
B
-P
D
O
Sh
mRNA exprese
(% kontroly)
100
mRNA exprese
(% kontroly)
B
D
B
D
Sh
B
Sh
mRNA exprese
(% kontroly)
150
Sh
O
-P
1
O
-P
5
600
B
D
B
D
O
2000
Sh
-P
5
B
D
Sh
mRNA exprese
(% kontroly)
4000
Sh
-P
5
1000
O
Sh
mRNA exprese
(% kontroly)
1500
B
D
Sh
mRNA exprese
(% kontroly)
Obr. 9: Exprese transportních proteinů v játrech na úrovni mRNA. Signifikantní změna v
porovnání s kontrolou (* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001). Signifikantní změna v
porovnání s BDO skupinou(+ P < 0,05, ++ P < 0,01, +++ P < 0,001).
150
Mdr1a
100
50
0
250
Mdr2
**
150
100
50
0
150
Oatp1a4
100
#
0
200
FXR
***
150
100
50
##
##
0
Tab. 2: Exprese molekul zapojených do regulace homeostázy cholesterolu. Signifikantní
změna v porovnání s kontrolou (* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001). Signifikantní změna v
porovnání s BDO skupinou(+ P < 0,05, ++ P < 0,01, +++ P < 0,001).
Sh
Ldlr
Sr-b1
Abca1
Abcg5
Abcg8
HMG-CoAr
BDO
Sh-P5
BDO-P5
BDO-P1
103,6 ± 26,5
141,9 ± 27,9 *
105,2 ± 38,9
57,5 ± 16,2
**+++
58,6 ± 20,4
**+++
110,8 ± 44,6
101,0 ± 43,4
102,8 ± 26,6
75,7 ± 19,1
88,7 ± 24,2
113,8 ± 66,8
63,7 ± 58,9
89,2 ± 6,6
52,7 ± 21,3
61,3 ± 7,1
121,5 ± 84,6
9,5 ± 4,1 **
123,4 ± 92,2
14,2 ± 13,3 ** 12,8 ± 7,4 **
142,3 ± 136,3
9,1 ± 3,1 *
139,2 ± 133,3
13,5 ± 11,0 *
9,1 ± 6,5 *
100,4 ± 57,7
102,7 ± 47,5
85,1 ± 31,9
67,6 ± 41,4
69,4 ± 11,9
19
2. Skupina Prof. MUDr Jiřiny Martínkové, CSc
Capillary leak syndrome a jeho význam pro kinetiku a dynamiku
modelových léčiv COST OC09071 a MŠMT 0021620820
Příprava publikace autorů: Studená Š., Martínková J, Slížová D, Záhora J, Krs
O., Chládek J.
1.Úvod
Sepse je systémová zánětlivá reakce organismu na přítomnost mikroorganismů. Je
charakterizována mnoha patofyziologickými mechanismy a ději, které mohou významně
zasahovat do kinetiky léčiv, jak je popsáno u aminoglykosidů, nebo morfinu (1). Kinetika
těchto antibiotik, jejichž účinek koreluje více s plazmatickými koncentracemi nežli s dávkou,
je dána distribucí do extracelulární tekutiny a rychlostí eliminace glomerulární filtrací. Oba
tyto kinetické děje jsou během sepse snadno ovlivnitelné různými faktory - kovariátami.
Zvýšení distribučního extracelulárního objemu (1) v důsledku tvorby edémů (2) nebo
penetrace aminoglykosidů do peritoneální tekutiny, kde dosahují baktericidní koncentrace (3)
se může nežádoucím způsobem promítat do hodnoty vrcholové koncentrace (Cpeak) a
ovlivnit rychlost eliminace glomerulární filtrací. Změna průtoku krve glomeruly navozená
např. vazokonstrikcí při hyperdynamické formě sepse může signifikantně změnit rychlost
eliminace antibiotika. Důsledkem je značná interindividuální variabilita ve farmakokinetice i
baktericidním účinku, event. toxicitě (ototoxicita a nefrotoxicita) těchto antibiotik
zaměřených zejména proti gramnegativním mikroorganismům. Jejich klinický účinek je pak
považován za nejistý až nepredikovatelný (4).
Cílem této práce je vypracovat model CLS u potkanů a vyhodnotit význam CLS jako
kovariáty pro farmakokinetiku GE. Z obecného hlediska se kovariáty rozlišují na dvě
skupiny: první skupina – maturační, zejména vliv gestačního věku, byla v minulých letech
poměrně dobře popsána. Druhá skupina – patofyziologická s proměnlivou genezí,
polymorfním vlivem a obtížnou predikcí je známa poměrně málo, ačkoliv má značný
praktický význam.
2. Metody a pokusná zvířata
Byli použiti samci laboratorního potkana SPF chovu outbredního kmene Wistar, hmotnost
240-400 g, Biotest s.r.o. Konárovice. Potkani bylo krmeni peletizovanou krmnou směsí - ST1,
Velaz, Praha s.r.o., napájecí voda ad libitum. V celkové anestesii (i.p.Pentobarbital 50
mg/kg.ml-1) byla kanylována trachea pro napojení spirometru (Adinstruments, GMbH,
PowerLab 8/30 - spirometer, software LabChart v7.03). Kanylace a. femoralis sloužila pro
odběry krve, kanylace v. jugularis k zavedení infúze pro doplňování krystaloidů a další infúzi
gentamicinu do v. cava inferior. Od začátku experimentu jsme zaznamenávali EKG, srdeční
frekvence byla vyhodnocena pomocí instrumentace a softwaru fy. ADInstruments, GmbH.
Naměřená data jsme hodnotili jako průměry – 60-ti vteřinový záznam každých dvacet minut.
Rychlost infúze byla vypočtena tak, aby vyhovovala doplnění tekutin podle objemu odebrané
krve (tj. 2,4 – 3,2 ml) v průběhu 6-ti hod experimentu. V případě krevní ztráty byla krev
doplněna jednorázově fyziologickým roztokem i.v. Jako poslední byl kanylován močový
měchýř k odběru moče. Punkcí přes stěnu měchýře byl odebrán kontrolní vzorek moče –
označení PRE. Moč byla odebrána celkem 3 x - před experimentem a v intervalu 180 minut.
K navození leaku byl podán 1 mg/kg LPS (endotoxin Pseudomonas aeruginosa var. 10) a
15 ug/kg IL-2 (myší, rekombinantní z E.coli) - skupina LPSIL-2. Intaktní skupině byl podán
i.v. fyziologický roztok.
20
Vybrané skupině kontrol a LPSIL-2 potkanů byl podán 15 minut před ukončením
experimentu i.v. Cardiogreen (ICG, Indocyanine green) 0,25 mg/kg.ml-1 k průkazu
plazmatických proteinů prosáklých při CLS do tkání.
Gentamicin byl podáván ve formě sulfátu i.v. infúzí (30 minut – podáno ve 200 ul) 0,8
mg/kg nebo 1,6 mg/kg při rychlosti perfusoru 0,4 ml/hod.
Biochemické vyšetření : arteriální krev na vyšetření ABR a krevních plynů, moč ke
stanovení urey a kreatininu, plazma ke stanovení urey, kreatininu, aktivity transamináz,
laktátu a albuminu (ÚKBD, FN HK). Vzorky byly uchovávány při teplotě 4ºC a analyzovány
v den odběru, ABR a krevní plyny max. do 2 hodin po odběru!
Změny ve hmotnosti orgánů (Tab. 1) registrované na konci pokusu zaznamenaly místní
stázu krve ve slezině, významný rozdíl byl také v hmotnostech ledvin a plic .
Potkani
játra
ledviny
plíce
srdce
slezina
lpsil-2
průměr [g]
343 g
10,9233
2,6378
2,7514
1,104286
0,829
s.d.
Intaktní potkani
průměr [g]
334 g
s.d.
p
1,32862
0,264544
0,283428
0,124575
0,114177
11,3396
2,413
2,4242
1,05
0,681778
1,068431
0,362379
0,287375
0,153451
0,105016
0,26
0,04
0,01
0,61
0,02
Tab. 1. Průměrné vlhké hmotnosti orgánů ve skupinách potkanů s nevýznamným
rozdílem hmotností (p=0,42).
Hematologické vyšetření se provádělo u skupiny LPSIL-2 potkanů ve srovnání s kontrolami,
a to na Poliklinice I, laboratoří VISLAB, a.s. v HK.
Histologické vyšetření: stanovení a lokalizace ICG v orgánech bylo prováděno pracovníky
Ústavu anatomie LFUK v HK. Hodnocení a fotografování bylo zabezpečeno pomocí
světelného mikroskopu Olympus BH-2 s použitím vestavěné mikrokamery, mikrofotografie
byly archivovány pomocí počítačového programu Olympus MicroPhoto v2.2.
Na histologických řezech plic byly vyšetřeny preparáty centrálních a periferních partií
horního, středního a dolního plicního laloku. Hodnocení úrovně poškození bylo prováděno
podle Murakamiho metody, založené na popisu patologických změn podle čtyř kritérií, a to:
překrvení nebo městnání krve, edém, zánětlivý infiltrát, krvácení nebo krevní výrony.
Po dokončení experimentu byla provedena bronchoalveolární laváž (BAL).
Prostřednictvím endotracheální kanyly byly dýchací cesty propláchnuty 2x3 ml a 1x4 ml
fyziologického roztoku vychlazeného na 4ºC. Tekutina byla centrifugována 10 min při
3000 g, supernatant byl použit ke stanovení proteinu setem BCA Pierce. Vzorky byly
uchovávány při - 20ºC. Ve zkumavce byl ponechán 1 ml supernatantu, peleta byla
resuspendována, aby poskytla buněčné elementy pro differenční mikroskopické vyšetření
(barveno Giemsou –Romanowskim, G-R, po fixaci metanolem). Pro nízký počet buněčných
elementů byly nátěry hodnoceny jako počet buněk na celém sklíčku nebo na 100 buněk leukocytů.
Nátěry byly zhotovovány také z nesrážlivé krve na začátku a konci experimentu (5 min
fixace metanolem a barvení G-R, ředěným 9:1). Sloužily k určení diferenciálního rozpočtu
leukocytů na 100 buněk.
Stanovení proteinu bylo prováděno spektrofotometricky. Bílkoviny po reakci s činidly
A a B (BCA Pierce protein assay reagents, ThermoFischer Scientific) v poměru 50:1 dávají
zabarvení, které se kvantifikovalo při λ=576 nm.
21
Kinetika gentamicinu byla hodnocena pomocí softwaru Kinetica v4.4 – kinetické parametry
GE, Excel 2003 – p-hodnota párovým T-testem a korelační koeficienty, ostatní data
softwarem Statistica (v9.0) – dr Jiří Záhora, PhD.
Vzorce pro softwarové výpočty
22
3. Výsledky
Spirometrické vyšetření: v průběhu pokusu u potkanů LPSIL-2m dechový objem ve srovnání
s intaktními zvířaty klesal (obr. 1a),
Dechový objem u Km a LPSIL-2m
Km
LPSIL-2m
3,5
dechový objem [ml]
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
420
450
minuty
Obr. 1a.
Pokles dechového objemu u LPSIL-2m potkanů.
zatímco dechová frekvence stoupala (částečně nasazením spirometru na tracheální kanylu
částečně vyrovnáváním laktátové acidózy) - hyperventilace (obr. 1b).
Dechová frekvence u Km a LPSIL-2m
Km
LPSIL-2m
160
počet dechů - průměr za 20'
140
120
100
80
LPSIL-2m
pre:180´ p<0,001
pre:360´ p<0,0001
60
40
20
0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
minuty
Obr. 1b. Dechová frekvence u Km a LPSIL-2m potkanů – hyperventilace
23
420
450
Bronchoalveolární laváž neprokázala signifikantní rozdíly mezi potkany LPSIL-2m a
intaktními, ale pokračujeme ve stanovení proteinů a buněčnosti s upraveným metodickým
postupem (centrifugace změna na 1200 g, použité suspenze místo fyziologického roztoku).
Srdeční frekvence se u potkanů LPSIL-2m zvyšovala až ke konci pokusu (obr. 2),
Srdeční frekvence u Km a LPSIL-2m
Km
LPSIL-2m
600
500
tepy za minutu
400
300
200
100
0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
420
450
minuty
Obr. 2. Srdeční frekvence u LPSIL-2m byla zvýšená na konci experimentu významnější
arytmie nebyly zaznamenány
.
U potkanů LPSL-2m se koncentrace sérového albuminu postupně snižovala (obr. 3),
Obr. 3. S – albumin u LPSIL-2m je na konci experimentu významně nižší než u intaktních
S - albumin u Km a LPSIL-2m
Km
LPSIL=2m
40
Km:LPSIL-2m 360'
p < 0,0001
35
albumin [g/l]
30
25
20
15
10
5
0
pre
180´
čas [min]
24
360´
Hematokrit se významně snížil ke konci experimentu (obr. 4) a byl spojován s hemolýzou
krve a změnami ve slezině.
Obr. 4. Hematokrit u LPSIL-2m – významný pokles na konci experimentu
Hematokrit u Km a LPSIL-2m
Km
LPSIL-2m
Km:LPSIL-2m
p = 0,006
0,55
0,45
HCT
0,35
0,25
0,15
0,05
pre
-0,05
180'
360'
čas [min]
Koncentrace sérového kreatininu u potkanů LPSIL-2m nabývala vyšších hodnot mezi 180.360. minutou (obr. 5).
S - kreatinin u Km a LPSIL-2m
Km
120
100
Km pre:360'
p = 0,001
LPSIL-2m
LPSIL-2m pre / 180'
p < 0,0001
pre / 360'
kreatinin [umol/l]
p < 0,0001
80
Km:LPSILm 360'
p = 0,0002
180' / 360'
p = 0,022
60
40
20
0
pre
180´
čas [min]
Obr. 5. S – kreatinin u Km a LPSIL-2m
25
360´
Clearance kreatininu u kontrol se během experimentu významně neměnila, v průměru se
pohybovala v
průměr ± s.d.
GFR kreatininu
(clearance v ml/min)
LPSIL-2m
ve 180'
v 360'
1,914 ± 0,782
2,382 ± 1,999
Km
2,761 ± 1,767
3,581 ± 1,895
Tab. 2. Hodnota glomerulární filtrace kreatininu U-kr x V moče/P-kr v ml/min.
Koncentrace sérové urey u potkanů LPSIL-2m významně narůstala mezi 180.-360 min
experimentu, změny v moči měly opačný trend - významný pokles. Aktivita transamináz a
její nárůst během pokusu svědčí pro nepříznivé ovlivnění hepatocytů.
Nárůst koncentrace laktátu (obr. 6) je odrazem funkčních multiorgánových změn tkáňové hypoxie a snížené utilizace laktátu v játrech.
Obr.6. Serový laktát u Km a LPSIL-2m
S - laktát u Km a LPSIL-2m
8
7
LPSIL-2m – pre:180‘
p < 0,0001
pre: 360‘
p = 0,001
Km
LPSILm
Km : LPSIL-2m v 360‘
p = 0,04
laktát [mmol/l]
6
5
4
3
2
1
0
pre
180
čas [min]
26
360
Vyšetření krevních plynů a pH krve. U potkanů LPSIL-2m pCO2 během pokusu významně
klesal (obr. 7a),
Obr. 7a. Hodnoty pCO2 u Km a LPSIL-2m – hypokapnická respirační alkalóza
pCO2 [kPa]
pCO2 u Km a LPSIL-2m
7,5
7,2
6,9
6,6
6,3
6
5,7
5,4
5,1
4,8
4,5
4,2
3,9
3,6
3,3
3
2,7
2,4
2,1
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
0
Km pre:360'
p = 0,0014
Km
LPSIL-2m
LPSIL-2m pre:360' p < 0,0001
360' Km:LPSIL-2m
p < 0,0001
pre vz
180'
360'
čas [min]
hodnota aktuální BE (base excess) významně klesala (obr. 7b) - metabolická laktátová
acidóza, nevýrazná v podmínkých hyperventilace,
Obr. 7b. Hodnoty aktuálního BE charakteristické pro vývoj metabolické (laktátové) acidózy
Aktuální BE u Km a LPSIL-2m
Km
LPSIL-2m
6
4
akt. BE
2
0
pre
180'
-2
-4
-6
minuty
27
360'
avšak hodnota pH krve se postupně zvyšovala – převládá obraz respirační hypokapnické
alkalózy (obr. 7c).
Obr. 7c pH krve u Km a LPSIL-2m
pH
pH krve u Km a LPSIL-2m
7,55
7,54
7,53
7,52
7,51
7,5
7,49
7,48
7,47
7,46
7,45
7,44
7,43
7,42
7,41
7,4
7,39
7,38
7,37
7,36
7,35
7,34
7,33
7,32
7,31
7,3
Km
Km -
pre:360´ p=0,003
LPSIL-2m
LPSIL-2m - pre:360´ p=0,001
pre vz
180'
360'
čas [min]
Bez signifikatních změn zůstal u obou skupin pO2.
Hematologické vyšetření: (Tab. 3) Prokázalo pokles ve všech sledovaných parametrech,
zejména trombocytopenii. U kontrolních potkanů se počet WBC zvyšuje jako reakce na
operační postup a infekci vlivem kanylace a trombocyty zůstávají nezměněny (náhrada
krevních buněk z poolů!).
Tab. 3. Stanovení krevního obrazu u K a LPSIL-2 (n = 3)
WBC
RBC
HGB
HCT
PLT
pre
360' LPSIL-2
LPSIL-2
5,42 ± 1,14
3,13 ± 1,31
8,1 ± 0,72
7,05 ± 0,4
172 ± 14,7
151 ± 5,2
0,45 ± 0,04 0,39 ± 0,02
710 ± 90,41 318 ± 130,4
p
pre kontroly
0,007
0,01
0,007
0,003
0,0009
4,03 ± 0,64
8,23 ± 0,87
168 ± 15,31
0,44 ± 0,04
850 ± 84,1
360'
kontroly
9,59 ± 0,25
7,67 ± 0,5
159 ± 14,14
0,42 ± 0,03
768 ± 4,24
p
0,001
0,48
0,54
0,36
0,1
Kinetika GE (Tab. 4) – Data byla stanovena populační dvoukompartmentovou metodou pro
i.v.infúzi a byly vypočítány mikrokonstanty α, β v softwaru Kinetica v4.4. Distribuční objem
(Vd) u LPSIL-2 skupiny byl větší, clearance (CL) GE vyšší, biologický poločas eliminace
(T ½) kratší.
28
Tab. 4. Kinetika gentamicinu (GE)
Průměr±s.d.
Vd
L/kg
CL
mL/min/kg
T1/2
min
K ge
(n=18)
0,068 ± 0,038
1,128±0,719
70,37 ± 23,13
LPSIL-2 ge
(n=19)
0,092 ± 0,035
2,594 ±1,542
51,13 ± 31,24
0,06
0,02
0,04
p
Morfologické změny zjištěné histologickým vyšetřením.
Ve všech případech byly nalezeny známky akutního postižení plicní tkáně v různém stupni
rozvoje. Horní laloky byly postiženy relativně nejméně, ložiskovitě. Okrajové části
vykazovaly normální strukturu alveolů s jemnými stěnami nebo mírný kompenzační
emfyzém. V hlubších partiích horních laloků byla rozšířená interalveolární septa infiltrovaná
zánětlivými elementy a větší množství aktivovaných makrofágů intraalveolárně a kolem
některých bronchiolů a tepen. Peribronchiální a periarteriální prostory se zánětlivým
infiltrátem.
Střední a dolní plicní laloky byly postiženy ve vyšší míře, a to opět v centrálních
partiích.Charakteristickým rysem byl ložiskový výskyt změn, části řezu zachycují normální
plicní tkáň bez patologických změn. V postižených úsecích byly zachyceny průřezy drobných
plicních tepen naplněné erytrocyty, perivaskulární a peribronchiální prostory edematózně
rozšířeny a zánětlivě infiltrovány, místy dilatované lymfatické cévy.V některých bronchiolech
se nacházely volné erytrocyty a leukocyty. Interalveolární septa byla významně rozšířena a
silně infiltrována leukocytárními zánětlivými elementy. Makrofágy a extravaskulární
erytrocyty signalizovaly hemorrhagický charakter intersticiálního edému. Barvení řezů
orceinem, prokazující vazivové elementy, neprokázalo zmnožení retikulárního nebo
elastického vaziva interalveolárních sept, pouze jejich prosáknutí edematózní tekutinou.
V alveolech bylo zvýšené množství volných makrofágů, jednotlivé erytrocyty a leukocyty,
místy hypertrofické pneumocyty typu II. Ojediněle při stěnách alveolů byly zachyceny mírně
eosinofilní hyalinní blanky (možný výsledek stázy sekretu a exudátu při edému bohatém na
proteiny). Viscerální pleura byla místy ztluštělá, ojediněle byla zachycena ložiska
subpleurálního zánětlivého infiltrátu.
U všech jedinců skupiny LPSIL-2m byl nalezen zjištěn obraz ložisek akutního plicního zánětu
(aktivovaného bakteriálním endotoxinem), který je charakterizován zvýšenou propustností
cév, edematózní, zánětlivou a hemorrhagickou infiltrací intersticia, perivaskulárních a
peribronchiálních prostorů, aktivací makrofágů a exudátem s buněčnými elementy
v alveolech.
Na konci experimentu byl potkanům podán ICG – Cardiogreen do v. jugularis i.v. v dávce 2,5
mg/kg/ml. U experimentálních potkanů byla světelnou mikroskopií sledována indocyaninová
zeleň prosáklá v pulpě sleziny a v plicích s perivaskulární a peribronchiální lokalizací (Obr.
A).
29
Obr. A – Normální nález plíce, horní lalok, zv. 40x (vlevo), LPSIL-2 nález - barvivo proniká v centrálních
patiích laloku do intersticia vlivem leaku a zabarvuje septa, viscerální pleura zvlněná subpleurálním zánětlivým
infiltrátem(vpravo), zv. 40x.
V modelu časné sepse je ve slezině počet erytrocytů významně zvýšen, erytrocyty přeplňují
červenou pulpu, místy infiltrují i lymfatické folikuly pulpy bílé. Nález je hodnocen jako obraz
aktivace sleziny s možným vztahem k procesu hemolýzy a porušené hemostázy (Obr. B).
Obr. B – Vlevo kontrolní slezina, světlejší marginální zóna ohraničuje lymfatické folikuly bílé pulpy, vpravo je
slezina přeplněná erytrocyty, pronikajícími i do bílé pulpy, zv. 100x
Použitými histologickými metodami nebyly prokázány žádné strukturální změny v ledvinách,
vnitřním uchu, mozku a srdci.
30
4. Diskuse
CLS v podstatě znamená zvýšenou permeabilitu krevních vlásečnic (zejména za sepse) s
následným významným únikem intravaskulární tekutiny, event. spolu s proteiny do
intersticia, orgánů i do lymfatických cest. Patogeneze změn endoteliálních buněk je
komplexní, zahrnuje jejich aktivaci a poškození. Důležitou roli hrají neutrofily, které adherují
k endotelu,vyvolávají lýzu buněk pomocí reaktivních kyslíkových radikálů (ROS), NO a
proteáz (5). Důležitou roli hraje uvolnění cytokinů a mediátorů zánětu, změny v adhezi a
cytoskeletu.
Leak má význam zejména v rané sepsi. Symptomy vykazují značnou interindividuální
variabilitu v jeho závažnosti. Představují projevy retence tekutin - periferní edémy, pleurální a
perikardiální výpotky, ascites, anasarku, nárůst tělesné hmotnosti. V této práci byly
dokumentovány rozdíly ve vlhké hmotnosti (wet weight) orgánů ve skupině s minimálními
rozdíly v hmotnosti tělesné.
Postupně dochází k multiorgánovému selhání nejprve funkčnímu (MOS) (selhávání ledvin
a jater z důvodů snížené perfúze), zejména kardiovaskulárních a respiračních funkcí. (2).
Pokles CL kreatininu demonstruje snížení rychlosti průtoku glomeruly (2). Také zvýšení
plazmatické koncentrace urey (BUN) svědčí pro poruchu vylučování močoviny ledvinami funkční selhání ledvin při hypoperfúzi kůry ledvin nebo také vlivem dehydratace organismu.
K navození CLS jsme využili IL-2 a pseudomonádový endotoxin (2), IL-2 (6). IL-2
indukuje adherenci neutrofilů a destiček k endoteliálním buňkám, zvyšuje cévní permeabilitu
(5, 6, 7, 8). Trombocytopenie patří do symptomů CLS. Sepse je trombofilní stav, často se
projeví DIC vlivem aktivace endotelu (6).
Naše výsledky prokazující respirační hypokapnickou alkalózu souhlasí s literárními údaji
(9). Nejčastější příčinou je hyperventilace, kterou jsme rovněž prokázali. Tato noxa postihuje
kterýkoliv systém v těle. Vyvolává mnohočetné metabolické abnormality - počínaje změnami
koncentrace kalia, magnesia, fosforu a kalcia, po vývoj mírné laktátové acidózy (10). V akutní
fázi respirační alkalózy klesá hladina bikarbonátů, spotřebovávaných při titraci s protony,
přesunujícími se z intracelulárních proteinů extracelulárně a také endogenních organických
kyselin, včetně kyseliny mléčné, jejíž utilizace klesá (11, 12, 13). Mikropunktura a
mikroperfuze potvrdily potlačení proximální a distální acidifikace včetně redukce reabsorpce
bikarbonátů v proximálním tubulu a sníženou tvorbu amonia a titrovatelných kyselin (14, 15,
16).
V kardiovaskulárním systému literární údaje popisují pokles minutového objemu (17),
tachykardii a poruchy rytmu. Ve splanchnické oblasti dochází následně k redukci průtoku
krve jak cestou a. hepatica, tak v. portae (18). Nárůst aktivity transamináz signalizuje
orgánové poškození. Připisuje se T-buňkám a TNF-α produkovanému Kupfferovými
buňkami (19). V našich experimentech jsme popsali mírnou tachykardii ke konci
experimentu. Aktivita jaterní transaminázy se rovněž zvýšila.
Hyperventilace (hypokapnie) a vazodilatace v plicích podporuje prosáknutí tkáně až edém
námi rovněž prokázaný, protože hypokapnie potlačuje alveolární reabsorpci tekutiny a je
spojována s poklesem aktivity Na+,K+- ATPázy na bazolaterární membráně epiteliálních
alveolárních buněk (9). Plicní prosáknutí až edém je také výsledkem ovlivnění aktivního
transportu sodíku přes alveolární epitel. Za fyziologických podmínek sodík vstupuje do
alveolárních epiteliálních buněk apikálními sodíkovými kanály a je vypuzován bazolaterálně
uloženou sodíkovou pumpou. Hypokapnie aktivitu pumpy potlačuje (20, 21).
Zvýšená sérová kreatininémie může souviset s přímým poškozením (lýzou) myocytů
kosterního svalu vlivem LPS nebo nepřímým účinkem TNF-α, jehož množství při současném
edému stoupá (22, 23). Tento závěr podporuje i zvýšená aktivita kreatinfosfokinázy popsaná
v literatuře (23).
Celková anestezie pentobarbitalem snižuje dechovou frekvenci stejně jako prohlubuje
hypotenzi při CLS, ale zmírňuje vlivy na kardiální systém, což se vysvětluje inhibičním
vlivem na tvorbu volných radikálů, prozánětlivých cytokinů, nitrotyrosinu a iNOS (23).
31
Změny nalezené hematologickým vyšetřením odpovídají literárním údajům (32).
Aminoglykosidy a CLS
Kinetika gentamicinu závisí na dávce antibiotika a na trvání a závažnosti CLS (dávce
LPSIL-2) - časná/pozdní fáze.
Prodloužená endotoxémie vyvolaná nízkou dávkou LPS (1 mg/kg) má aditivní vliv na
nefrotoxicitu gentamicinu (25).
Tab. 4) Přehled literárních údajů o kinetice gentamicinu v podmínkách experimentální časné
sepse
LPS
Gentamicin
Interval mezi
Komentář
Ref.
[mg/kg]
[mg/kg]
LPS
srovnání LPS s
a GE [h]
kontrolami
0,5-5 mg/kg
potkan
3
6 hod i.v. infúze
0.25
5 mg/kg
potkan
3 mg/kg i.p.inj
24
0.25 mg/kg
potkan
10
i.v. 15-min infúze
3
35 ug/kg
králík
2 x 30 mg po
týdnu
35 ug/kg
30-60 min před
2.dávkou
CL ge nezměněna
Vd zvýšen
28, 29
0,113 ug/kg
30
i.v. bolus
3
Clearance nezměněna, Vd
redukován na 24%
Nefrotoxicita vysoké
dávky ge se sníženou
rychlostí GF?
28, 30
Kůň
Pokles CL ge a CLcr na
50%
Vd nezměněn, kumulace
ge v ledvinách
Nefrotoxicita dlouhodobě
vysoké Cpl se sníženou
rychlostí GF?
T1/2 prodloužen, AUC
zvýšeno, CLcr a CLge
redukce na 50% u
starších jedinců
Rozvinutý CLS
s multiorgánovým
selháním?
AUC beze změn, Vd
snížen na 23%
26
24
27, 28
Podle literárních údajů hodnota Vd GE u člověka závisí na závažnosti sepse a velikosti
srdečního minutového výdeje. U hyperdynamické sepse je významně vyšší nežli u kontrol,
významně koreluje se srdečním indexem ((r = 0,394 p < 0.01). U hypodynamické sepse je
tomu naopak. Eliminační konstanta GE koreluje s nebílkoviným dusíkem (BUN) (r = 0,565 p
< 0.01) a koncentrací sérového kreatininu (r = 0,563 p < 0.01) (31).
V této práci jsme prokázali u zvířat s CLS rychlejší únik gentamicinu ze systémové cirkulace
a zvýšenou hodnotu distribučního objemu. Příčinou by mohl být únik antibiotika do třetího
prostoru, např. peritoneální tekutiny (32). Naše výsledky odpovídají experimentálním i
klinickým výstupům u méně závažné formy CLS a časné sepse.
32
5. Závěr
Byl vypracován model kapilárního leaku (CLS) při časné fázi sepse.
Leak byl vyvolán i.v. noxou představovanou LPS 1 mg/kg a IL-2 15 μg/kg.
Z funkčních změn byly zaznamenány hyperventilace a hypokapnická respirační alkalóza
(vzestup pH, pokles pCO2), snížená glomerulární filtrace (pokles kreatininu, urey v moči),
snížená jaterní funkce - vzestup laktátu snížením utilizace (např. glukoneogeneze) v játrech a
ledvinách, vzestup aktivity transamináz, hypoperfúze a ischemie splanchnické oblasti –
snížená funkce jater a ledvin (vzestup laktátu, pokles hodnoty BE v hodnocení ABR).
Leak se projevuje morfologicky v plicích peribronchiálním a periarteriálním zánětlivým
infiltrátem a edémem, místy dilatované lymfatické cévy, leak ICG s proteiny plazmy do
perivaskulárních a peribronchiálních prostor. Interalveolární septa byla významně rozšířena a
silně infiltrována makrofágy. Viscerální pleura byla zánětlivě infiltrována. Slezina jeví
známky prosáknutí erytrocytů do červené pulpu, místy infiltrují i lymfatické folikuly pulpy
bílé, která je redukována vyplavením leukocytů (aktivace imunitního systému). Nález je
hodnocen jako obraz aktivace sleziny s možným vztahem k procesu hemolýzy a
hemokoagulace. Ostatní orgány nevykazují změny hodnotitelné optickým mikroskopem.
Kinetika gentamicinu (Tab. 3) byla v podmínkách CLS modifikována následovně:
Srovnání jedinců intaktních vs. LPSIL-2 - distribuční objem se zvětšil (0,068±0,038 vs. 0,092
± 0,035 v litrech; p=0,055), plazmatická clearance zvýšila (1,128±0,719 vs. 2,594±1,542
v ml/min.;p=0,02) a T1/2 zkrátil (70,37±23,13vs.51,13±31,24 v minutách;p=0,041).
33
Reference:
1.
Lingvall M, Reith D, Broadbent R. The effect of sepsis upon gentamicin
pharmacokinetics in neonates. Br J Clin Pharmacol. 2005;59(1):54-61.
2.
Baluna R, Vitetta ES. Vascular leak syndrome: a side effect of immunotherapy.
Immunopharmacology. 1997;37(2-3):117-32.
3.
Serour F, Dan M, Gorea A, Gilad A, Krispin M, Berger SA. Penetration of
aminoglycosides into human peritoneal tissue. Chemotherapy. 1990;36(4):251-3.
4.
De Paepe P, Belpaire FM, Buylaert WA: Pharmacokinetic and pharmacodynamic
considerations when treating patients with sepsis and septic shock. Clin
Pharmacokinet. 2002;41(14):1135-51.
5.
Edwards MJ, Miller FN, Sims DE, Abney DL, Schuschke DA, Corey TS. Interleukin 2
acutely induces platelet and neutrophil-endothelial adherence and macromolecular
leakage. Cancer Res. 1992;52(12):3425-31.
6.
Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Evidence for a structural motif in
toxins and interleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and
initiating vascular leak syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(7):3957-62.
7.
Assier E, Jullien V, Lefort J, Moreau JL, Di Santo JP, Vargaftig BB, Lapa e Silva JR,
Thèze J. NK cells and polymorphonuclear neutrophils are both critical for IL-2-induced
pulmonary vascular leak syndrome. J Immunol. 2004;172(12):7661-8.
8.
Ballmer-Weber BK, Dummer R, Küng E, Burg G, Ballmer PE. Interleukin 2-induced
increase of vascular permeability without decrease of the intravascular albumin pool. Br
J Cancer. 1995;71(1):78-82.
9.
Myrianthefs PM, Briva A, Lecuona E, Dumasius V, Rutschman DH, Ridge KM,
Baltopoulos GJ, Sznajder JI. Hypocapnic but not metabolic alkalosis impairs alveolar
fluid reabsorption. Am J Respir Crit Care Med. 2005;171(11):1267-71.
10.
Foster GT, Vaziri ND, Sassoon CS. Respiratory alkalosis. Respir Care. 2001;46(4):38491.
11.
Hood VL, Tannen RL. Protection of acid-base balance by pH regulation of acid
production. N Engl J Med. 1998;339(12):819-26.
12.
Madias NE, Cohen JJ, Adrogué HJ. Influence of acute and chronic respiratory alkalosis
on preexisting chronic metabolic alkalosis. Am J Physiol. 1990;258(3 Pt 2):F479-85.
13.
Korosi A, Kahn T, Kalb T, Uribarri J. Marked hyperlactatemia associated with severe
alkalemia in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Am J Kidney Dis.
2000;36(1):E6.
14.
Cogan MG. Effects of acute alterations in PCO2 on proximal HCO-3, Cl-, and H2O
reabsorption. Am J Physiol. 1984;246(1 Pt 2):F21-6.
15.
Bengele HH, McNamara ER, Schwartz JH, Alexander EA. Acidification adaptation
along the inner medullary collecting duct. Am J Physiol. 1988 Dec;255(6 Pt 2):F1155-9.
16.
Madias NE, Adrogué HJ. Cross-talk between two organs: how the kidney responds to
disruption of acid-base balance by the lung. Nephron Physiol. 2003;93(3):p61-6.
17.
Guzman JA, Kruse JA. Splanchnic hemodynamics and gut mucosal-arterial PCO(2)
gradient during systemic hypocapnia. J Appl Physiol. 1999;87(3):1102-6.
34
18.
Fujita Y, Sakai T, Ohsumi A, Takaori M. Effects of hypocapnia and hypercapnia on
splanchnic circulation and hepatic function in the beagle. Anesth Analg.
1989;69(2):152-7.
19.
Schümann J, Angermüller S, Bang R, Lohoff M, Tiegs G. Acute hepatotoxicity of
Pseudomonas aeruginosa exotoxin A in mice depends on T cells and TNF. J Immunol.
1998;161(10):5745-54.
20.
Lecuona E, Saldías F, Comellas A, Ridge K, Guerrero C, Sznajder JI. Ventilatorassociated lung injury decreases lung ability to clear edema in rats. Am J Respir Crit
Care Med. 1999;159(2):603-9.
21.
Azzam ZS, Dumasius V, Saldias FJ, Adir Y, Sznajder JI, Factor P. Na,K-ATPase
overexpression improves alveolar fluid clearance in a rat model of elevated left atrial
pressure. Circulation. 2002;105(4):497-501.
22.
Hauptmann S, Klosterhalfen B, Weis J, Mittermayer C, Kirkpatrick CJ. Skeletal muscle
oedema and muscle fibre necrosis during septic shock. Observations with a porcine
septic shock model. Virchows Arch. 1994;424(6):653-9.
23.
Kao SJ, Su CF, Liu DD, Chen HI. Endotoxin-induced acute lung injury and organ
dysfunction are attenuated by pentobarbital anaesthesia. Clin Exp Pharmacol Physiol.
2007;34(5-6):480-7.
24.
Tanira MO, Ali BH, Bashir AK. Effect of endotoxin on gentamicin pharmacokinetics in
old and young adult rats. Life Sci. 1997;60(6):413-24.
25.
Auclair P, Tardif D, Beauchamp D, Gourde P, Bergeron MG. Prolonged endotoxemia
enhances the renal injuries induced by gentamicin in rats. Antimicrob Agents
Chemother. 1990;34(5):889-95.
26.
Tardif D, Beauchamp D, Bergeron MG. Influence of endotoxin on the intracortical
accumulation kinetics of gentamicin in rats. Antimicrob Agents Chemother.
1990;34(4):576-80.
27.
Bergeron MG, Bergeron Y. Influence of endotoxin on the intrarenal distribution of
gentamicin, netilmicin, tobramycin, amikacin, and cephalothin. Antimicrob Agents
Chemother. 1986;29(1):7-12.
28.
Yang KH, Lee MG. Effects of endotoxin derived from Escherichia coli
lipopolysaccharide on the pharmacokinetics of drugs. Arch Pharm Res.
2008;31(9):1073-86.
29.
Halkin H, Lidji M, Rubinstein E. The influence of endotoxin-induced pyrexia on the
pharmacokinetics of gentamicin in the rabbit. J Pharmacol Exp Ther. 1981;216(2):4158.
30.
Wilson RC, Moore JN, Eakle N. Gentamicin pharmacokinetics in horses given small
doses of Escherichia coli endotoxin. Am J Vet Res. 1983;44(9):1746-9.
31.
Tang GJ, Tang JJ, Lin BS, Kong CW, Lee TY. Factors affecting gentamicin
pharmacokinetics in septic patients. Acta Anaesthesiol Scand. 1999;43(7):726-30.
32.
Lee RP, Wang D, Lin NT, Chen HI. Physiological and chemical indicators for early and
latestages of sepsis in conscious rats. J Biomed Sci. 2002; 9:613-621.
35
Publikace za rok 2009 dedikované VZ
•
Hroch M, Tukova J, Doležalova P, Chladek J. An Improved High-performance Liquid
Chromatography Method for Quantification of Methotrexate Polyglutamates in Red
Blood Cells of Children with Juvenile Idiopathic Arthritis
Biopharm Drug Dispos 2009;30:138-48 s výhradní dedikací projektu MS
0021620820.
•
Patterson AD, Slanař O, Krausz KW, Li F, Höfer CC, Perlík F, Gonzales FJ, Idle JR
(IF 5.7). Human urinary metabolomic profile of PPARalpha induced fatty acid betaoxidation. J Proteome Res,2009, 8(9):4293-300
• Kubová Z., Kremláček J., Szanyi J., Langrová J, Kuba M., Vališ M. VEPs and visual
ERPs in Alzheimer's disease: evaluation of Memantine medication. Documenta
Ophthalmologica, 119:63–64, 2009
•
Brcakova E, Fuksa L, Cermanova J, Kolouchova G, Hroch M, Hirsova P, Martinkova
J, Staud F, Micuda S (2009) Alteration of methotrexate biliary and renal elimination
during extrahepatic and intrahepatic cholestasis in rats. Biol Pharm Bull 32:1978-85.
IF = 1,765 – společná dedikace s COST2 č. 1P05OC062
2 publikace vyšly až v roce 2010 zatím nejsou v RIVu)
•
Cermanova J, Fuksa L, Brcakova E, Hroch M, Kucera O, Kolouchova G, Hirsova P,
Malakova J, Staud F, Martinkova J, Cervinkova Z and Micuda S (20092010) Upregulation of renal Mdr1 and Mrp2 transporters during amiodarone pretreatment in
rats. Pharmacol Res 61:129-135. IF = 3,287 – společná dedikace s COST1 č.
1P05OC061
•
Fuksa L, Brcakova E, Kolouchova G, Hirsova P, Hroch M, Cermanova J, Staud F,
Micuda S (20092010) Dexamethasone reduces methotrexate biliary elimination and
potentiates its hepatotoxicity in rats. Toxicology 267:165-171. IF = 2,836 – společná
dedikace s COST1 č. 1P05OC061
36