Z-ANO - České vysoké učení technické v Praze

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE
FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŢENÝRSTVÍ
Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
2011
Michal Šindelář
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE
FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŢENÝRSTVÍ
Katedra biomedicínské techniky
Fluorescenční korelační spektroskopie a studium interakce biomolekul
část 1.
TÝMOVÝ PROJEKT
Vedoucí projektu:
Ing. Dalibor Pánek, Ph.D.
Konzultant:
Mgr. Radek Macháň
Student:
Michal Šindelář
prosinec 2011
II
Anotace
Cílem 1. části týmového projektu (Fluorescenční korelační spektroskopie a studium
interakce biomolekul) je seznámení se s problematikou fluorescenční korelační
spektroskopie na měřicím přístroji ConfoCor2 ®, jeho sestavením a realizací
zkušebního měření na předem připraveném vzorku.
Anotation
The aim of the first part of the team project (Fluorescence correlation spectroscopy
and the study of biomolecular interactions) is introduction with the problems of
fluorescence correlation spectroscopy on a measuring instrument ConfoCor2 ®, its
preparation and implementation of test measurement on pre-prepared sample.
III
Poděkování
Děkuji vedoucímu týmového projektu panu Ing. Daliboru Pánkovi, Ph.D. za vedení
mé práce, za důležité informace a za veškerý čas, který mi věnoval při sestavování
měřícího zařízení.
Dále bych chtěl poděkovat mému kolegovi Jaroslavu Královi, konzultantovi Mgr.
Radkovi Macháňovi a celému týmu z Fyziologického ústavu Jaroslava Heyrovského v
Praze za spolupráci při ověření správné činnosti celé měřicí aparatury.
IV
Prohlášení
Prohlašuji,
že
jsem
týmový
projekt
s
názvem
Fluorescenční
korelační
spektroskopie a studium interakce biomolekul část 1. vypracoval samostatně a využil
jsem k jeho realizaci pouze zdroje uvedené v celkovém výčtu pramenů uvedených na
konci mé práce.
Neexistuje závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona
č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o
změně některých zákonů (autorský zákon).
V Kladně dne
podpis
V
Obsah
Obsah
6
Úvod
7
1. Současné metody
8
1.1.
Principy získávání a zpracování dat
8
1.2.
Technická řešení optické aparatury
9
1.3.
Fluorescenční barviva
9
2. Experimentální realizace
2.1.
12
Popis měřící soustavy
12
2.1.1. Excitační jednotka
12
2.1.2. Objektiv
14
2.1.3. Štěrbina a detektor
16
2.2. Příprava vzorku
17
2.2.1. Používané techniky extruze
17
2.2.2. Lipozomy
18
3. Vlastní měření
20
3.1.
Sestavení a příprava aparatury
20
3.2.
Příprava roztoku lipozomů
21
3.2.1. Použité sloučeniny
22
3.2.2. Výpočet
24
3.3.
Výsledky měření
24
Závěr
27
4. Seznam použitých zkratek
28
5. Zdroje
29
5.1.
Seznam literatury
29
5.2.
Jiné zdroje
29
6. Seznam obrázků
31
7. Seznam grafů
31
VI
Úvod
Existuje mnoho pohledů na svět kolem nás, na jeho chápání a interpretaci různých
dějů, které se v něm odehrávají. Jak ale můžeme pochopit celek, když neznáme funkci
jeho stavebního dílku. Na to, abychom pochopily ráz věcí velkých, musíme se zaměřit
na ty malé. A proto v dnešní době probíhá mnoho měření na částicích s atomární
velikostí.
Cílem mého týmového projektu je seznámit se teoreticky a později i prakticky
s metodami, které jsou vhodné pro práci s fluorescenčním mikroskopem. Následně je
mým úkolem sestavit celý měřicí systém a otestovat jeho správnou funkčnost.
Poznatky, které získám realizací týmového projektu, dále využiji při tvorbě své
bakalářské práce.
Praktickou část týmového projektu jsem spolu s kolegou Jaroslavem Králem
realizoval ve Fyziologickém ústavu Jaroslava Heyrovského Akademie věd v Praze 8.
7
1. Současné metody
V dnešní době existuje mnoho metod získávání, zpracování a vyhodnocování dat
pořízených pomocí fluorescenčního mikroskopu. Kromě klasické metody Fluorescent
correlation spectroscopy (FCS) to jsou např. Fluorescent lifetime correlation
spectroscopy (FLCS) a Time correlated signal photon caunting (TCSPC).
1.1.
Principy získávání a zpracování dat
FCS je nejstarší a přesto i nadále velmi hojně využívanou metodou. Jednou
z nejlepších vlastností FCS je její neinvazivnost, která nám umožňuje provádět
měření uvnitř živých buněk, kde můžeme ve vysokém rozlišení provádět prostorové a
časové analýzy extrémně malých biomolekul v málo koncentrovaných vzorcích. FCS
využívá argonových, či argon-kryptonových laserů, pomocí nichž dodává do daného
prostoru tolik energie, kolik je potřeba na to, aby u jednotlivých částic došlo k excitaci
elektronu do vyšších energetických hladin pomocí dopadajících fotonů. Excitovaný
elektron ovšem nedokáže zůstat na vyšší energetické hladině trvale, a proto se navrací
zpět do původní hladiny vyzářením dodané energie. V závislosti na tomto principu
zaznamenává polohu registrovaného fotonu na kontinuální časové ose od začátku
experimentu (měřeno v ns) a vykresluje jeho korelační křivku.[2]
Přestože FLCS je obdobou předchozí metody, liší se jednou zásadní věcí. Zatímco u
FCS je vzorek excitován kontinuální vlnou (CW) laserového záření, u FLCS musí být
vzorek excitován pomocí pulzního buzení. Oproti FCS metodě navíc udává, jaká doba
uplynula mezi posledním laserovým pulsem a detekcí vyzářeného fotonu (měřeno
ps). V případě, že vzorek obsahuje, např. dva druhy difundujících fluoroforů je
výsledná autokorelační funkce (ACF) řešena na základě superpozice, nikoliv lineární
kombinací. Takto je možné zjistit, jakou měrou přispěly jednotlivé vzorky do celkové
intenzity vyzařování. Pro měření je důležité, aby se difúzní časy dvou různých částic
lišily nejméně o koeficient 1,6.
V praxi se užívají částice, u kterých má tento
koeficient hodnotu vyšší než 10.[1]
Měření a analýza úbytku fluorescence pomocí TCSPC je další zavedenou technikou
molekulární foto fyziky. Časově korelační počítání znamená opakované měření času
mezi laserovým excitačním pulsem a emisí fluorescenčního fotonu. Délka trvání je
8
řádové v nanosekundách. Realizace signálu je rekonstruována v histogramu.
Pokročilou verzí TCSPC je tzv. time-tag, time-resolved (TTTR) režim, který po částech
neredukuje naměřená data, ale kontinuálně je zaznamenává. S vyšším výkonem
počítačových sestav se opouští od hardwarového vyhodnocování a přechází se
k softwarovému vyhodnocování naměřených dat.[4]
1.2. Technická řešení optické aparatury
Hlavní součást fluorescenčního mikroskopu ConfoCor2® je optická a detekční
jednotka. Je používaná pro zaostření laserového paprsku, který je potřeba pro
excitaci elektronů ve vzorku. Tento objem je zkoumán na detektoru. Způsob zaostření
mikroskopu se nazývá infinity corrected, tedy zaostřeno na nekonečno. Princip
spočívá v tom, že je rovnoběžný světelný svazek pomocí čoček a dichroického zrcátka
zaostřen na nekonečno, jak do vzorku, tak směrem k detekční jednotce. Princip
ostření je na následujícím obrázku.
Obr 1: Schéma používané optické jednotky
1.3. Fluorescenční barviva
Mezi první testovaná barviva při měření FCS patřily fluorofory a laserové barvy,
které se již dříve osvědčili v mikroskopii a poté i ve fluorescenční spektroskopii.
9
Oproti klasickým metodám jsou požadavky kladené na fluorofory ve FCS mnohem
vyšší. Důležitou roli hraje kvantová účinnost fluoroforu, absorpční průřez a
fotostabilita, jelikož barvivo musí snést sílu laserového paprsku v řádu několika set
kilowattů na centimetr čtvereční. V praxi se velmi často užívají barvy Alexa, jejichž
Obr. 2: různé barvy fluoroforu Alexa. Od leva: Alexa350,
Alexa430, Alexa488, Alexa532, Alexa546, Alexa568,
Alexa633, Alexa700, Alexa750; převzato z [2]
absorpční rozsahy odpovídají vlnové délce od 350 nm do 750 nm. Mezi ostatní
vhodné barvy patří rhodaminy. Pro měření difúzních časů jednotlivých látek se
používají dvě různá barviva, avšak ne každá kombinace dvou různých barviv je
funkční. Barvivo, které se hodí pro snímání pouze jednoho druhu fotonů, se nemusí
hodit pro snímání dvou fotonů. Hlavní společnou nevýhodou všech syntetických
barviv spočívá v tom, že před provedením nějakého experimentu se musí konkrétně
označit biologický vzorek. Je to často obtížné a zdlouhavé, zvláště když je nutné dostat
bílkovinu po obarvení nazpět do buňky. Dnes se na to používají dva druhy
autofluorescenčních bílkovin, zelený fluorescenční protein (GFP) a DsRed. GFP se
vyrábí z medúzy Aequorea Victoria. A teprve nedávno byl objeven DsRed na korálu
Dictiosoma. Tyto proteiny se zavedou přímo do buňky a ta si posléze začne
produkovat vlastní fluoreskující molekuly. Tento postup významně zkracuje přípravu
celého měření. [1]
10
Pro barvení lipozomů jsou velmi vhodná barviva z karbokyanů (obr. 3) pro barvení
membrán. V lékařské praxi se používají při výzkumech neurální sítě. Tato barviva
jsou velmi stabilní při změnách teplot. Skladují se rozpuštěné v roztocích etanolu
s hustotou 1 mg/ml a nevystavují se vlivu slunečních paprsků.[8]
obr. 3: Vyzařování fluorescence u karbokyanových
barviv; převzato z [8]
11
2. Experimentální realizace
2.1. Popis měřící soustavy
Celá měřicí aparatura se skládá z několika základních komponent. Hlavní částí
celého systému je mikroskop ConfoCor2® od firmy Carl Zeiss, v níž jsou vzorky
buzeny pulzním laserem značky PicoQuant. Naměřená data jsou vyhodnocena v
počítači, jenž obsahuje kartu PicoHarp 300 TCSPC. Laser musí být umístěn, co
nejdále od monitoru, jelikož kolem sebe vytváří interferenční pole.
Obr. 4: Sestavená aparatura
2.1.1. Excitační jednotka
Excitační jednotka vyváří impulsy s trváním od 50 do 70 pikosekund s frekvencí až
80 MHz s maximálním kontinuálním výkonem do 1 W (závisí na vlnové délce).
Frekvence opakování je v rozmezí od 2,5 do 40 MHz a je řízena krystalovým
oscilátorem, který pomocí polovodičové fotodiody vytváří laserové pulzy. Je
kompatibilní TCSPC elektronikou.
12
Obr. 5: Zdroj laserového záření PicoQuant PDL
800B; převzato z [5]
Obr. 6: LDH – laser diode head; převzato z [10]
Zprovozňování měřicí jednotky spočívá ve správném usměrnění toku záření do
jedno-vidového optického kabelu. Pomocí Power metru, jenž snímá celkový výkon
laserového paprsku, se nalezne ideální hodnota výkonu laseru. Svazek laserového
záření je veden skrz jednomodové optické vlákno, protože tato vlákna mají největší
přenosovou kapacitu. Jejich tlumení je nízké, mají nulovou disperzi a velkou šířku
pásma, a také jejich přenos méně ovlivňuje magnetické pole. Toto světelné spojení je
výhodné, kvůli mechanickému oddělení od excitačního svazku z optické a detekční
jednotky. Pulzy přicházejí do LDH (obr. 6) vodičem, polovodičová dioda září, odtud
přes FC vstup, v kterém se snažíme o nastavení co možná největšího výkonu
vstupujícího do světelného vodiče do ACP výstupu ústícího do soustavy kolimátorů
(obr. 7). V kolimátoru se, za pomoci nastavitelných šroubků, usměrní paprsek tak,
aby jeho nejvyšší intenzita byla právě v předmětovém ohnisku. Spektrum laseru
odpovídá modré barvě, tj. vlnové délce okolo 500 nm. Laserový paprsek dodává
energii pro excitaci fluorescenčního barviva. Vlnová délka laseru a vlnová délka
absorbovaného záření fluoroforu by měly být téměř shodné.
13
Obr. 7: Vstup světelného vodiče do soustavy
kolimátorů
2.1.2. Objektiv
Objektiv je používán pro zaostření svazku záření do vzorku. Použitý objektiv
značky Zeiss C-APOCHROMAT 40x, 1,2 W, KORR UV-VIS-IC. Apochromatický
objektiv nám koriguje chromatickou vadu, tj. pro různé barvy bude existovat pouze
jedno ohnisko. Úhel lomu je funkcí vlnové délky, tudíž se pro různé barvy láme různě.
Objektiv má zvětšení 40x a numerickou aperturu 1,2. W znamená, že se jedná o vodní
objektiv, tudíž se mezi objektiv a sklíčko nanese kapka vody. Dále je korigován pro
ultrafialové, viditelné a infračervené světlo. [11]
Obr. 8: Zeiss C-APOCHROMAT 40x, 1,2 W, KORR
UV-VIS-IC; převzato z [11]
14
Všechny imerzní techniky slouží k realizaci maximální numerické apertury a ke
zvýšení rozlišovací schopnosti. Při snímání živých buněk jsou buňky ponořeny v
kultivačním médiu v kultivační misce. Oblast zájmu může být 50-200 mikronů
vzdálená od krycího skla. Objektivy s vysokou numerickou apreturou a s olejovou
imerzí nejsou ideální pro zobrazování ohniskových rovin, které nejsou v těsné
blízkosti krycího skla, protože aberace (hlavně sférická aberace, způsobená rozdíly v
indexu lomu podél optické osy) vzrůstá s hloubkou ponoření. Protože je nutné
pozorovat buňky hluboko ve tkáních, mají objektivy s vodní imerzí lepší výkon při
rozlišení a korekcích aberace, než objektivy s olejovou imerzí. Jsou-li použity
objektivy s vodní imerzí, je optická osa symetrická: světlo prochází z buňky (ve vodě)
do skla (krycí sklo), do vody (imerzní médium) a znovu do skla objektivu. Objektivy s
vodní imerzí mají mírně nižší numerickou aperturu ve srovnání s olejovou imerzí.
Jsou schopné vyššího rozlišení při průchodu vodními vrstvami tlustými přibližně 200
mikronů. Další výhodou objektivů s vodní imerzí je to, že na rozdíl od objektivů s
olejovou imerzí nevyžadují zvláštní postupy při čištění, není zde nebezpečí
kontaminace fyziologického média a voda nemá vlastní fluorescenci, která by mohla
komplikovat interpretaci obrazů. Objektivy s vodní imerzí jsou ideální pro zkoumání
buněčné dynamiky v živých buňkách, kde se důležité vlastnosti mohou vyskytovat
hluboko ve vzorku a daleko od krycího skla. Jsou korigovány pro viditelné záření, UVzáření i infračervené záření.
Objektiv vyrovnává rozdíly v tloušťce krycího skla v intervalu od 0,14 do 0,18 mm.
Jeho makro-pohyb se nastavuje mechanicky. Jemné ostření je prováděno skrze
počítač za pomoci motorické kontrolní jednotky.
15
Obr. 9: Schéma vodního imerzního objektivu
2.1.3. Štěrbina a detektor
Objektiv a přídavné optické součásti zaostřují záření vzorku, které má být
detekováno do určitého místa na optické ose. Motorická kontrolní jednotka rovněž
nastavuje polohu štěrbiny (pinhole) v souřadnicových osách X, Y a Z. Rozsah použité
štěrbiny je od 25 μm do 75 μm.
Optický signál je přeměněn na elektrický signál v lavinové foto diodě (SPAD).
SPAD je velmi citlivý polovodičový fotodetektor. Při použití bývá předpnuta vysokým
závěrným napětím řádu desítek až stovek voltů často těsně pod průrazným napětím,
což umožňuje dosáhnout zisku okolo 100 až 1000. V tomto režimu jsou elektrony a
díry excitované dopadem fotonů urychlovány silným vnitřním elektrickým polem a
podobně jako ve fotonásobičích generují další nosiče, vzniká lavinový jev. Používá se
v aplikacích, kde je třeba velké citlivosti. Lavinová fotodioda sestává ze čtyř vrstev:
N+, P, čistého polovodiče a P+. Okolo vrstev N+ a P, mezi nimiž vzniká lavinový jev,
se nachází ochranný prstenec z polovodiče typu N, který zvyšuje odolnost diody proti
povrchovému napěťovému průrazu. Dopadající světlo způsobí vznik páru elektron
díra, který je silným elektrickým polem transportován do "lavinové oblasti", zde je
urychlen na takovou rychlost, že kolize s krystalovou mřížkou způsobí vznik dalšího
páru elektron díra. Nový pár je rovněž urychlen silným elektrickým polem a postupně
jakoby v řetězové reakci vznikají další a další nové páry elektron díra, čímž dochází k
lavinovému efektu, proto lavinová fotodioda.
16
Intenzita použitého detektoru je udávána v počtu dopadajících fotonů na detektor,
tj. s-1. Četnost je udávána v kHz. Maximální saturace detektoru je 1 GHz. Nad 1 GHz
již není závislost lineární, což zkresluje výsledek.
2.2. Příprava vzorku
Vzorky rozpuštěných lipozomů jsou uchovávány v roztoku fluoroforu v chladu při
teplotách kolem bodu mrazu. Je totiž nezbytně nutné udržovat stálou teplotu, jelikož
by při přílišném snížení mohlo dojít k ruptuře stěny lipozomu. Z tohoto důvodu je
dovnitř vesiklu často vpravován pufr namísto vody. Jakmile se směs uvnitř zkumavky
rozmrazí, je s ní možné dále pracovat. Obvykle se daná směs o určité koncentraci
obarví a poté je smíchána s jedním či více obarvenými vzorky. Je také možné nejdříve
dva lipozomy smíchat a až poté tuto směs obarvit. Poté je nutné zbavit směs fluroforu.
Nejčastěji se fluorofor nechá odpařovat proudem dusíku. Je možné použít i jiné
plyny, jako jsou kyslík nebo oxid uhličitý, avšak dusík má pro tento účel nejlepší
vlastnosti. Celá procedura trvá přibližně dvacet minut. Poté se vloží vzorek
v uzavíratelné plastové zkumavce do třepačky. Výsledkem by mělo vzniknout mírné
zakalení. Obsah zkumavky se poté nasaje do mikropipety a přes extrudér, který
obsahuje karbonovou síť, se přefiltruje do druhé mikropipety. Tímto procesem se
přetrhají lipozomové řetězce na požadovanou velikost. Přefiltrování se několikrát po
sobě opakuje a to nejméně čtyřicetkrát. V některých publikacích se udává více než sto
filtrací. Odhady, zda je takové množství filtrací nutné, se různí. Po extruzi je vzorek
připraven pro následující měření.
2.2.1. Pouţívané techniky extruze
Extruze lipidů přes filtry z polykarbonátu je jedním z nejspolehlivějších způsobů
přípravy lipozomů. Celý proces extruze probíhá v tzv. extrudéru, do kterého je z každé
strany nasazena mikro stříkačka. Tyto pomůcky nesmí obsahovat plasty, jelikož
používané chemikálie jsou polární, docházelo by k jejich rozpouštění. V lékařské
praxi, kde je nutné přefiltrovat mnohem větší objemy, se používají mechanické
přístroje, jelikož by člověk neměl dostatek sil ke stisku pístu. Jako filtr se obvykle
používají membrány z polykarbonátů PF- 2501 (100 nm) a PF-2502 (200 nm) o
průměru 25 mm. Extruze lipozomů vyšších mastných kyselin vyžaduje filtrování při
17
vyšších teplotách. To má vliv i na výběr kovů pro výrobu těchto extrudérů. Nejčastěji
se vyrábí ze silného hliníkového plechu nebo z kvalitní nerezové oceli.[6]
obr. 10: Extrudér s ohřívačem; převzato z [6]
2.2.2. Lipozomy
Uměle připravené uzavřené vezikuly tvořené lipidovou dvojvrstvou a vnitřním
izolovaným kompartmentem obsahující vodný roztok. Vznikají např. působením
ultrazvuku na vodní suspensi vhodných polárních lipidů; nejčastěji se pro tento účel
používá lecitin z vaječného žloutku. Lipozomy mají obvykle průměr 1 – 2 μm; mohou
být tvořeny i několika koncentrickými membránovými váčky. Pokud lipozom vzniká
ve vodném prostředí, obsahujícím rozpustné složky (soli, bílkoviny atd.), jsou tyto
složky uzavřeny do vnitřního prostředí váčku; toho se využívá pro transport
některých léčiv do buněk (intravenózní aplikace vhodných lipozomů, které pak
vnikají do buněk endocytózou). Lipozomy slouží též jako model pro studium
vlastností biologických membrán. [7]
18
Obr 1: Struktura membrány lipozómu; převzato z [7]
Lipidová dvojvrstva se skládá ze dvou vrstev lipidů (tuků) – převážně fosfolipidů
obrácených k sobě hydrofobními částmi tak, že polární konce, například fosfáty
(zbytky kyseliny fosforečné u fosfolipidů) jsou směrovány napovrch, směrem k
vodnímu okolí. Fosfolipidy a jiné lipidy s polárními konci mají tendenci k takovémuto
uspořádání. V přírodních biologických membránách jsou lipidy doplněny příměsí
bílkovin. [8]
Obr 2: Hydrofobní a hydrofilní uspořádání
lipozomů; převzato z [14]
19
3. Vlastní měření
3.1. Sestavení a příprava aparatury
Jakmile jsme se seznámili s možnostmi fluorescenčního mikroskopu, začal jsem
sestavovat celou měřicí aparaturu. K mikroskopu ConfoCor2® bylo nutné připevnit
CCD kameru (752 x 582 pixelů s citlivostí 10 luxů), soustavu kolimátorů, pulzní laser
a dichroické zrcátko s emisním filtrem. Po sestavení optické měřicí soustavy bylo
mým úkolem připojit detektor a motorickou jednotku k počítačům, do kterých jsem
měl nainstalovat programy, které ovládají mikroskop a zároveň vyhodnocují pořízená
data.
Nejdříve jsem začal se sestavováním optické jednotky. Připevnil jsem kameru,
která je zapotřebí při zaostření laseru. Následovalo dichroické zrcátko s emisním
filtrem, jenž má za úkol propustit pouze světlo v rozmezí od 490 do 540 nm. Důležité
bylo rovněž uvést do chodu pulzní laser značky PicoQuant. Jakmile byly propojeny
všechny části tohoto zařízení, bylo nutné nastavit jej na co možná největší výkon.
Jemným posunem šroubků na coupleru na výstupu z LDH a s použitím PowerMetru
(NOVA II OPhir laser measurment) bylo docíleno nejlepšího možného průchodu
paprsků do jedno-vidového optického vlákna. To bylo zavedeno do kolimátoru, který
obdobným způsobem jako tomu bylo u coupleru zaostří paprsek do ohniska ležícího
na optické ose objektivu.
K práci s mikroskopem slouží dva počítače. První z nich obsahuje software, kterým
se ovládají motory objektivu a motory pohybující štěrbinou (pinhole). Druhý
z počítačů zpracovává data zaznamenaná SPAD pomocí TCSPC karty. Musely být
použity dva počítače, protože program ovládající motory mikroskopu je zastaralý a je
funkční pouze v operačním systému Windows 95. Druhý program pro záznam měření
zase fungoval na platformě Windows XP, a proto byl používán na jiném počítači.
Výsledná uložená data byla ve formátu t3r, z kterého se později vykreslí autokorelační
křivka a histogram.
Před samotnou přípravou vzorku se musí fluorescenční mikroskop nejprve
zapnout a nastavit. Hodnota výkonu pulzního laseru se časem snižuje, tudíž byl
PowerMetrem znovu vyladěn. V programu v prvním počítači se nyní zadá pokyn
k inicializaci motorů, aby bylo možné posunout objektiv do takové vzdálenosti, aby se
na kameře objevil paprsek laseru. To znamená, že u dichroického zrcátka prozatím
20
není emisní filtr. Kdyby tam byl, nebylo by možné na kameře modrý laser vidět. Na
objektiv se kápne kapka destilované vody a přiloží se podložní sklíčko. Poté se zapne
kamera a Focus control, kde se upravuje vzdálenost objektivu od horní hrany
podložního sklíčka jednoduchým posuvem klávesami page up a page down.
Optimální hodnota se nachází ve vzdálenosti 3,83 mm. Když není intenzita
laserového paprsku směřována přímo na střed kamery, tedy později i do detektoru,
zapneme si na mikroskopu pro orientaci kříž a pomocí kolimátoru se upravuje pozice
a směr intenzity dopadajících paprsků. Vzorek ovšem nebude přesně na horní hraně
podložního sklíčka, nýbrž o něco výše, a proto se ohnisko posune o 100 mikrometrů.
Posledním prvkem, který se musí nakalibrovat, je pinhole o průměru 50 mikrometrů.
Je možné nastavit ji manuálně či automaticky. Při automatické kalibraci hledá
optimální pozici pomocí intenzity dopadajícího paprsku v kartézském souřadnicovém
systému. Nejdříve je vyhledána pozice pro osu X, poté pro osu Y a opět pro osu X.
Jakmile jsou plošné souřadnice v pořádku, začne se pinhole pohybovat i po ose Z. Je
velmi pravděpodobné, že se po nelezení nejlepší pozice na ose Z, opět začne
vyhledávání na osách X a Y. Program se ukončí, jakmile najde nejlepší možnou
umístění štěrbiny. Poté je možné znovu použít dichroické zrcátko s emisním filtrem.
SPAD detektor je možné zapnout jenom při měření, aby na lavinovou diodu
nedopadali jiné než fluorescenční paprsky. Jinak by mohlo dojít ke zničení foto diody
či devalvaci pořízených dat. Mikroskop je nyní připraven pro testovací měření.
3.2. Příprava roztoku lipozomů
Po rozmrazení lipozomů fosfatidylserinu (POPS) a fosfatidylcholinu (POPC)
rozpuštěných v roztoku s fluoroforem se tyto dva lipidy smíchaly v poměru jedna ku
čtyřem. Výpočet je uveden níže. Výsledný roztok měl objem 1 ml a molární
koncentraci 1 mmol/l. Následně se vzorek rozředil na koncentraci 0,01% v fluoroforu
DiO o koncentraci 1,34 mmol/l ve vodném roztoku. Poté se roztok nechal odpařit
proudem dusíku v digestoři. Asi po patnácti minutách, když už ve zkumavce zbyl
pouze suchý film lipidů, byl roztok přepipetován do plastové uzavíratelné zkumavky,
která se přiložila na třepačku. Roztok ve zkumavce se správně zakalil. Vzniklo tak
několik slupek lipidů. Tato směs byla následně nasáta do mikro injekční stříkačky,
která se nasadila na extrudér, ve kterém byl již umístěn karbonový filtr s velikostí
pórů 100 nm. Všechny součásti extrudéru včetně mikro injekčních stříkaček byl od
21
firmy Avestin. Extruze probíhala tímto způsobem: po každém protlačení přes filtr se
extrudér otočí kvůli snazší manipulaci a opět se roztok přefiltruje zpět do první mikro
injekční stříkačky. Tento postup se čtyřicetkrát opakoval. Po extruzi byla
přefiltrovaná směs opět přelita do uzavíratelné zkumavky. Zde byla zředěna v poměru
1:10 s fosfátovým pufrem, jenž měl koncentraci 10 mmol/l a pH 7,1. Poté byl vzorek
připraven k testovacímu měření.
Obr. 13: Proces extruze
3.2.1. Pouţité sloučeniny
Fosfatidylserin (POPS) není v cytoplazmatické membráně rovnoměrně rozložen po
obou jejích stranách. Vyskytuje se téměř výhradně ve vnitřním listu membrány.
Fosfatidylserin vzniká biosynteticky činností enzymu fosfatidyletanolaminserintransferázy a to z fosfatidyletanolaminu. Během této reakce je ethanolaminová
hlavička substituována hlavičkou serinovou. Když se fosfatidylserin objeví na vnějším
listu membrány, značí to probíhající programovanou buněčnou smrt. V testovacím
vzorku to byl záporně nabitý lipid s molární koncentrací 12,76mmol/l. [13]
22
Obr. 3: Fosfatidylserin; převzato z [13]
Fosfatidylcholin (POPC) je chemické označení pro lecitin. Dovoluje emulgovat
(smíchávat) tuky s vodou. Využívá se proto v kosmetickém průmyslu. Vyskytuje se
rovnoměrně na obou stranách buněčné membrány. V úloze jsme použily tento
neutrálně nabitý lipid o molární koncentraci 32,9mmol/l. [12]
Obr. 4: 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-fosfatidylcholin;
převzato z [12]
Jako barvivo byl použit zelené fluoreskující, lipofilní karbokyanin DiO v praxi
označovaným jako DiOC18(3). Chemický vzorec je chloristan 3,3´-dioktadecyloxakarbokyanin. Světélkuje ve vodě a je velmi foto stabilní. Má vysoký koeficient
excitace a krátký difúzní čas (1 ns). Po nanesení na buňku se šíří laterálně
v plasmatické membráně.[9]
Fosfátový pufr je jedním z nejpoužívanějších pudrových roztoků využívaných
v biologii, biochemii a medicíně. Používá se ke stabilizaci pH v neutrální a lehce
zásadité oblasti (zhruba pH 6-8,5).
Fluorescein se využívá jako adsorpční indikátor při argentometrickém stanovení
halogenidů a rhodamidů, fluorescenční indikátor a indikátor na stanovení bromidů.
23
3.2.2. Výpočet
K tomu, abych získal výsledný roztok o dané koncentraci, jsem musel postupovat
v několika krocích. Nejdříve bylo nutné zjistit objem POPC, který odpipetuji do
zkumavky, aby výsledný roztok objem 1 ml a koncentraci 1 mmol/l, když jsem věděl,
že POPC a POPS mají být v poměru 4:1. Vyšel jsem ze vztahu pro koncentraci:
(1)
Za předpokladu, že látkové množství původního roztoku POPC musí být shodný
s výsledným látkovým množstvím POPC, je jednoduché z jedné rovnice o jedné
neznámé vypočítat výsledný objem, který se napipetuje do uzavíratelné zkumavky.
Výsledný objem byl 0,024 ml POPC. Stejný postup byl použit i u POPS jež
k celkovému objemu přispěje 20%. Výsledný objem činil 0,015 ml. Také množství
barviva bylo nutné zjistit stejným způsobem. Jeho výsledný objem byl 0,075 ml.
3.3. Výsledky měření
Získaná data byla později zpracována v prostředí Matlab skriptem, který pomocí
dll knihoven načte data do matic, které funkcí vykreslí nejprve histogram a poté
korelační funkci. K tomu, abychom zjistili správnost zapojení přístroje, jsme nejprve
použili koncentrovaný karboxyfluorescein. Doba měření činila 120 sekund.
Graf. 1: Histogram karboxyfluorescein
24
Graf. 2: Křivka ACF pro karboxyfluoresceinu
Poté se karboxyfluorescein naředil další dávkou pufru tak, aby hodnota
koncentrace byla 100 nmol/l. Doba měření se tentokrát prodloužila na 900 sekund.
Třetím měřeným vzorkem byla směs POPC a POPS obarveným fluoroforem DiO.
Doba měření byla opět 900 sekund. V posledním měření se smíchal obarvený
lipozom se zředěným fluoroforem na dobu 900 sekund.
Graf. 3: Histogram pro směs lipozomů a zředěného
karboxyfluoresceinu
25
Graf. 4: Křivka ACF pro směs lipozomů a zředěného
karboxyfluoresceinu
26
Závěr
V moderní době dochází k renovaci pracovních postupů u starých výzkumných
principů. K využití moderních metod v biomedicínském výzkumu směřovalo také
zadání mého Týmového projektu, v jehož rámci jsem se zabýval fluorescenční
mikroskopií a principy, které využívá.
Mým úkolem v týmovém projektu bylo seznámení se s principy FCS, FLCS a
TCSPC používaných při detekci fotonů vyvolaných pulzním laserovým buzením. Dále
jsem měl sestavit měřící aparaturu, připravit vzorek a otestovat správnou činnost celé
měřicí soustavy.
Všechny zadané úkoly se mi v praktické části podařilo splnit a aktivně jsem se
podílel na interpretaci dosažených výsledků. Rovněž jsem se seznámil s přístrojovou
laboratorní technikou, kterou jsem se naučil používat k vyhodnocování naměřených
výsledků.
Poznatky, které jsem během tohoto semináře získal, budu i nadále doplňovat a
využiji je při psané bakalářské práce.
27
4. Seznam pouţitých zkratek
ACF
Autocorrelated function
CW
Continuous wave
CCD
charge-couplet device
DiO
chloristan 3,3'-dioktadecyloxakarbokyanin
DsRed
barvivo z korálu Dictiosoma
FCS
Fluorescent correlation spectroscopy
FLCS
Fluorescent lifetime correlation spectroscopy
GFP
zelený fluorescenční protein
LDH
laser diode head
NA
Numerická apertura
POPC
Fosfatidylcholin
POPS
Fosfatidylserin
SPAD
Single photon avalanche diod
TCSPC
Time correlated signal photon counting
TTTR
Time-tagged, time-resolved
28
5. Zdroje
5.1. Seznam odborné literatury
[1]
Kapusta, P.; Wahl, M.; Benda, A.; Hof, M.; Enderlein, J. FLCS - Fluorescence
lifetime
correlation
spectroscopy.
[Online]
2006,
1-7.
http://optonlaser.com/IMG/pdf/AppNote_FLCS.pdf (accessed Dec 28, 2011).
[2]
Schwille, P.; Haustein, E. Fluorescence Correlation Spectroscopy. An
Introduction to
its Concepts
and
Applications [Online]
2009, 1-33.
http://www.mendeley.com/research/fluorescence-correlation-spectroscopyintroduction-concepts-applications/ (accessed Dec 28, 2011).
[3]
WAHL, M. Time-Correlated Photon Counting Tech Note TCSPC 1.2. The
Principle of Time-Correlated Single Photon Counting [online]. 2000 [cited
2011-12-28], p. 1–4. Available from http://freedownloadebooks.info/timecorrelated-photon-counting-tech-note-tcspc-1-2.html
[4]
BENDA, A., HOF, M., WAHL, M., PATTING, M., ERDMANN, R., KAPUSTA, P.
TCSPC upgrade of a confocal FCS microscope. [online]. 2005 [cited 2011-1228], p. 1–4. Available from:
http://rsi.aip.org/resource/1/rsinak/v76/i3/p033106_s1?isAuthorized=no
5.2. Jiné zdroje
[5]
Lightsources [online]. updated 2011 [cited 28 Dec 2011]. Available from:
http://www.picoquant.com/_lightsources.htm.
[6]
(ed.). Liposome extruders [online]. updated 2011 [cited 28 Dec 2011]. Available
from: http://www.eastsci.com/Extruder.html.
[7]
Prof. RnDr. KODÍČEK, CsC., M. Liposomy [online]. Updated 2004 [cited 28 Dec
2011]. Available from: http://gvm.vm.cz/vyuka/bio_pojmy/hesla/liposomy.html.
[8]
INTERCHIM DiI, DiD, DiR, DiO, DiA [online]. updated 2009 [cited 28 Dec
2011]. Available from: http://www.interchim.fr/ft/4/46804A.pdf
29
[9]
lifetechnoligies.com
[online].
Updated
2011
Available
from:
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D275
[10] dwoptron.com
[online].
Updated
2011
Available
from:
http://www.dwoptron.com/korean/product/prod.list.asp?pageNo=4&code=12
3100100
[11] micro-shop.zeiss.com
[online].
Updated
2011
Available
from:
https://www.microshop.zeiss.com/index.php?s=528613984197dd&l=en&p=us&f=o&a=v&m=s&id
=421767-9970-000 (accessed Dec 28, 2011)
[12] Fosfatidylcholin. cs.wikipedia.org. 2011th ed. [online]. Available from:
http://cs.wikipedia.org/wiki/Fosfatidylcholin (accessed Dec 28, 2011).
[13] Fosfatidylserin,
cs.wikipedia.org,
2011th
ed.
[online];
Available
from:
http://cs.wikipedia.org/wiki/Fosfatidylserin (accessed Dec 28, 2011).
[14] Přenašeče glukózy, cukrovka-ocima-biochemie.blog.cz 2011th ed. [online];
http://cukrovka-ocima-biochemie.blog.cz/1009/prenasece-glukozy
Dec 28, 2011).
30
(accessed
6. Seznam obrázků
Obr. 1: Schéma používané optické jednotky
9
Obr. 2: Různé barvy fluoroforu Alexa [2]
10
Obr. 3: Vyzařování fluorescence u karbokyanových barviv [8]
11
Obr. 4: Sestavená aparatura
12
Obr. 5: Zdroj laserového záření PicoQuant PDL 800B [5]
13
Obr. 6: LDH – laser diode head [10]
13
Obr. 7: Vstup světelného vodiče do soustavy kolimátorů
14
Obr. 8: Zeiss C-APOCHROMAT 40x, 1,2 W, KORR UV-VIS-IC [11]
14
Obr. 9: Schéma vodního imerzního objektivu
16
Obr. 10: Extrudér s ohřívačem [6]
18
Obr. 11: Struktura membrány lipozomu [7]
19
Obr. 12: Hydrofobní a hydrofilní uspořádání lipozomů [14]
19
Obr. 13: Proces extruze
22
Obr. 14: Fosfatidylserin [13]
23
Obr. 15: 1-palmitoyl-2-oleyl-fosfatidylcholin [12]
23
7. Seznam grafů
Graf. 1: Histogram karboxyfluoresceinu
24
Graf. 2: Křivka ACF karboxyfluoresceinu
25
Graf. 3: Histogram pro směs lipozomů a zředěného karboxyfluoresceinu
25
Graf. 4: Křivka ACF pro směs lipozomů a zředěného karboxyfluoresceinu
26
31