BOT_OBMSB_1_cast - isb

CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE
LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB
Vyučující:
Zuzana Trojanová (24.-26.2.2012)
Michaela Sedlářová (9.-11.3.2012)
Barbora Mieslerová (23.-25.3.2012)
+ Anna Zedková (laborantka)
Podmínky k udělení zápočtu:
Protokoly
Zápočtový test
– termíny dle domluvy s vyučujícími
Mikrobiologické předměty a
vybavení mikrobiologické laboratoře
Katedry botaniky PřF UP v Olomouci
jsou inovovány v rámci projektu
OPVK
„Zvyšování konkurenceschopnosti
studentů oboru botanika a učitelství
biologie“
CZ.1.07/2.2.00/15.0316
http://isb-up.cz
Pátek
Hodnocení
Očkování biotrofních
mikroorganismů
Anaerobní kultivace
Mikrobiologický rozbor pitné
vody
Mikroorganismy ve vzduchu
Průkaz MO v ústní dutině
a na povrchu kůže člověka
Příprava izolátů plísní
Neděle
Přeočkování sobota, neděle
Hodnocení neděle
Neděle
Sobota
Neděle
Biotrofní mikromycety
a houbám podobné
organismy
BIOTROFNÍ PARAZITÉ
parazit a hostitel žijí pohromadě po delší dobu
parazit závisí na živém pletivu
většina biotrofních hub jsou obligátní parazité
neprodukují velké množství extracelulárních enzymů narušujících
buněčné stěny rostlin nebo toxinů - po penetraci nenásleduje rychlé
odumření napadené buňky
mají omezený hostitelský okruh (hostitelská a orgánová specificita)
přežívají pouze omezeně v saprofytické fázi; speciálně vývoj
rozmnožovacích struktur závisí na přítomnosti hostitele
kultivace vegetativního stadia těchto hub na umělých médiích je velmi
málo časté
Extracelulární biotrofové
Peronosporální houby (Peronosporales)
Padlí (Erysiphales)
Rzi (Uredinales) a Sněti (Ustilaginales)
Taphrinales
Intracelulární biotrofové
Plasmodiophora brassicae, Spongospora subterranea
(Plasmodiophoromycota)
Olpidium sp. (Chytridiomycota)
PERONOSPORÁLNÍ HOUBY
OOMYCOTA
biotrofní parazité s vysokou hostitelskou specificitou
většinou mají intercelulární mycelia a haustoria v napadených buňkách
na povrchu hostitelských pletiv produkují sporangiofory nesoucí sporangia
(často obsahují zoospory)
mnoho parazitických oomycet napadá suchozemské rostliny a vykazují
adaptace na tento způsob života - sporangia jsou odlamována a jsou
přenášena celá, chovají se jako konidie, celá klíčí klíčním vláknem.
PERONOSPORALES
Plasmopara viticola
Plasmopara halstedii
Bremia lactucae
Pseudoperonospora cubensis
Peronospora destructor
Albugo candida
Vřetenatka révová
Plíseň slunečnicová
Plíseň salátová
Plíseň okurková
Plíseň cibulová
Plíseň bělostná
Plasmopara viticola
vřetenatka révová
Bremia lactucae
plíseň salátová
Pseudoperonospora cubensis
plíseň okurková
Peronospora destructor
plíseň cibulová
Plasmopara halstedii
plíseň slunečnicová
PADLÍ
ŘÁD ERYSIPHALES, ASCOMYCOTINA
jedná se o biotrofní parazity
většinou s bílým povrchovým myceliem, které penetruje hostitelské
buňky pomocí haustorií
na listovém povrchu tvoří konidiofory s konidiemi a za specifických
podmínek vytváří teleomorfní stádium - kleistothecia
PADLÍ
Konidiofory a povrchové
mycelium
Klíčící konidie
Apendixy u kleistotecií
Microsphaera
Uncinula
Kleistotecium s
jedním vřeckem
Padlí angreštové
Sphaerotheca mors-uvae
Blumeria graminis
Padlí travní
Sphaerotheca fusca
(Podosphaera xantii) –
Padlí tykvovitých
UREDINALES (RZI)
BASIDIOMYCOTINA
řád Uredinales zahrnuje okolo 4 000 druhů ve 100 rodech
jsou charakterizovány rezavě hnědavým zbarvením spor
rzi napadají krytosemenné i nahosemenné rostliny a dokonce kapraďorosty
Puccinia graminis je klasickým příkladem rzi, které střídají hostitele.
Haploidní (monokaryotické) mycelium roste na dřišťálu (Berberis) a
dikaryotické mycelium na různých travách (Poaceae) P. graminis je
charakterizována komplexním životním cyklem, kde postupně dochází k
produkci až 5 typů spor.
Cronartium ribicola – rez vejmutovková
Puccinia graminis – rez travní
1. ÚKOL (var. A): Očkování biotrofních mikroorganismů
Cíl úkolu:
Seznámit studenty s postupem inokulace a kultivace Plasmopara halstedii,
původce plísňovitosti slunečnice
Pomůcky:
Pinzeta, destilovaná voda, semenáčky slunečnice (Helianthus annuus),
zamražené kultury plísně slunečnicové (Plasmopara halstedii), třepačka,
plastové zkumavky, rozprašovač, květináče s perlitem, vzrostlé inokulované
semenáčky slunečnic, mikrotenové sáčky, špejle
Provedení:
Spory ze zamraženého inokula převedeme na třepačce do destilované vody a
do vzniklé suspenze ponoříme cca 3 denní semenáčky slunečnice.
Kultivujeme 3 hodiny zakryté tmavou fólií ve fytotronu při 10 – 15°C (12/12
den/noc), poté vyjmeme z inokula a přesadíme do perlitu. Kultivujeme
dalších 6 – 8 dní při 15 – 20 °C. Vzrostlé semenáčky navlhčíme pomocí
rozprašovače destilovanou vodou a uzavřeme do mikrotenového sáčku tak,
aby se stěny nedotýkaly rostlin (tím zajistíme vhodné podmínky pro
sporulaci – vysoká vzdušná vlhkost). Kultivujeme 2 – 3 dny při 10 – 15°C
nebo do té doby, než začne P. halstedii sporulovat.
POSTUP PŘI PŘEOČKOVÁNÍ IZOLÁTU
PLÍSNĚ SLUNEČNICOVÉ:
1. dezinfekce osiva
2. naklíčení
3. příprava inokula
4. inokulace
5. výsev
6. kultivace
7. vytvoření podmínek pro sporulaci
8. sporulace
9. opětovné přeočkování/zamražení
1. ÚKOL (var. B): Očkování biotrofních mikroorganismů
Cíl úkolu:
Seznámit studenty s postupem inokulace a kultivace Oidium neolycopersici,
původce padlí rajčat
Pomůcky:
Pinzeta, kahan, odmaštěná podložní skla, semenáčky rajčete (Lycopersicon
esculentum), kultury padlí (Oidium neolycopersici)
Provedení:
Cca 7-9 týdenní semenáčky rajčete (Lycopersicon esculentum) inokulujeme
konidiemi padlí suchou cestou, tj. otiskem (nebo poprášením). Rostliny
označíme a kultivujeme pod plastovou klíckou ve fytotronu 20/18°C, 12/12h
den/noc. Zaznamenáme nárůst konidioforů Oidium neolycopersici.
ZUZI, napiš postup přeočkování padlí
kultivace padlí pod plastovými
klíckami ve fytotronu
Narůstání Oidium neolycopersici na
listu Lycopersicon esculentum
Anaerobní kultivace
Rozdělení bakterií podle vztahu ke kyslíku
Obligátně (přísně) anaerobní
nemohou se množit v přítomnosti
kyslíku
Clostridium
Fakultativně anaerobní
mohou se množit i za
nepřítomnosti kyslíku
rostou obvykle rychleji
za přítomnosti kyslíku
Saccharomyces, Escherichia coli
Mikroaerofilní
vyžadují malé množství kyslíku
(2 – 10%)
Helicobacter pylori
Aerotolerantní mikroorganismy
indiferentní ke kyslíku
Streptococcus pyogenes, Lactococcus
Obligátně (přísně) aerobní
k množení potřebují kyslík
Pseudomonas, Bacillus
mikroaerofilní
fakultativně anaerobní
obligátně aerobní
obligátně anaerobní
aerotolerantní
kyslík -
kyslík +
Kultivace anaerobů
= zabezpečení optimálních podmínek
pro růst
použití anaerobní nádoby (anaerostat)
obsahuje chemikálie produkující vodík
a katalyzátor, na kterém vodík reaguje
s volným kyslíkem na vodu
s některými přísně anaerobními
mikroorganismy je veškerá
manipulace nutná za anaerobních
podmínek - anaerobní komory
i krátkodobý kontakt s kyslíkem vede
ke smrti obligátně anaerobního
mikroorganismu
2. ÚKOL - Anaerobní kultivace mikroorganismů
Cíl: seznámit studenty se způsobem získávání čistých kultur
mikroorganismů a s metodou anaerobní kultivace bakterií
Pomůcky: bakteriologická klička, Petriho misky s živnou půdou (TSA),
lihový kahan, kultura E. coli, anaerostat s příslušenstvím
Postup:
Naočkujeme E. coli na TSA medium metodou křížového roztěru: z kolonie
vyrostlé na agaru odebereme bakteriologickou kličkou část populace a
rozetřeme do několika /3-4/ vodorovných čar po povrchu agarové plotny.
Kličku vyžíháme a po vychladnutí přiložíme na konec rozetřených čar a
znovu rozetřeme do několika čar. Tento postup opakujeme několikrát a
zakončíme vlnitou čarou. Misky narovnáme do anaerostatu, podle
návodu navlhčíme pohlcovač O2 a kultivujeme v inkubátoru při příslušné
teplotě (37°C).
Mikroorganismy ve vodě
BAKTERIE VE VODĚ
Voda v přírodě obsahuje určité množství mikroorganismů
Jejich kvalitativní i druhové zastoupení kolísá
Sterilní voda v přírodě není !
Sladká voda je jedním z přirozených stanovišť bakterií
Bakterie přítomné ve vodě můžeme rozdělit do tří základních skupin:
DRUHY BAKTERIÍ VE VODĚ:
1. Autochtonní bakterie
2. Bakterie z půdy
3. Bakterie ze střevního traktu lidí a zvířat
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
BAKTERIE
Z PŮDY
BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO
TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
G-
Chromobacterium violaceum
nefermentující tyčky
saprofytické bakterie
běžně v půdě, vodě nejčastěji v tropických a
subtropických oblastech
velmi zřídka může způsobovat humánní
choroby (často fatální).
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
G-
Flavobacterium
nepohyblivé, nefermentující, tyčinkovité bakterie
velmi běžný rod - v půdě, na rostlinných,
živočišných a potravinových zbytcích a téměř ve
všech vodních systémech.
Flavobacterium
psychrophilum
některé druhy mohou způsobovat choroby
sladkovodních ryb (Flavobacterium
psychrophilum)
Flavobacterium meningosepticum, bývá izolován
při dětských meningitidách
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
G-
Pseudomonas
pohyblivé, nefermentujcí, nesporulující
tyčinky
jeden z nejpočetnějších rodů, které
známe
saprofytické, fytopatogenní, nebo i
druhy patogenní pro člověka
důležitý podíl na rozkladu různých
skupin látek
Spirilly
zakřivené tyčinky s jedním nebo
dvěma závity
Spirillum – nacházíme v mnoha
místech se stojatou vodou
Pochvaté bakterie
schopné tvořit dlouhá, mnohobuněčná vlákna
uzavřené do těsně přiléhající pochvy :
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
G-
Sphaerotilus
Leptothrix
v tekoucích vodách a odpadních
vodách (s vysokým obsahem dusíku)
ve vodních prostředích s
dostatečným množstvím organické
hmoty
roste dobře v nízkých koncentracích
kyslíku
není známo, že by byla patogenní
pochva impregnována hydroxidem
železitým (oranžové útvary)
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
Bakterie čeledi Vibrionaceae
pohyblivé, mírně zakřivené tyčinky, chemoorganotrofní, anaerobní
G-
častý výskyt ve vodním prostředí
značná část má pro svou patogenitu epidemiologický význam
rody vyskytující se ve sladké vodě – Vibrio, Aeromonas
V. cholerae
původce cholery
další druhy jsou saprofytické
Aeromonas
v silně znečištěných vodách
Aeromonas hydrophila
Aeromonas hydrophila
původce onemocnění žab,
hadů, ryb
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
Fototrofní bakterie
uskutečňují fotosyntézu za anaerobních podmínek bez produkce
molekulárního kyslíku, barviva jsou bakteriochlorofyly a karotenoidy
V současné době 3 čeledi fototrofních bakterií:
1. Chromatiaceae, tj. purpurové sirné b.
r. Chromatium, Chromosystis
2. Chlorobiaceae, tj. zelené sirné b.
r. Chlorobium, Prosthecochloris
2. Rhodospirillaceae, tj. nesirné purpurové b.
r. Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium,
Rhodospirillum
Často v anaerobních vodních prostředích –
stoky, hluboká jezera, znečištěné řeky,
sirné prameny
Chromatium
G-
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
Klouzavé bakterie
Cytophaga
Beggiatoa
charakteristický způsobem pohybu - buňky nemají bičíky, pohybují se na
pevném podkladě vylučováním slizu
ve vodě jsou možnosti volného pohybu omezené,na pevném podkladu se
pohybují velmi čile
Řád Cytophagales – zástupci často ve vodním prostředí
Cytophaga, Sporocytophaga – rozklad celulózy,
Beggiatoa, Leucothrix – sulfurikační bakterie – oxidace sulfidů
G-
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
G+
Micrococcus luteus
okrouhlá, saprofytická bakterie
obligátní aerob, nachází se v půdě, prachu, vodě a vzduchu a je součástí
normální mikrobiální flóry na kůži savců
může kolonizovat lidská ústa, oropharynx (ústní část hltanu) a horní cesty
dýchací
Clostridia
Clostridium, Desulfotomaculum
sporulující, anaerobní tyčky
produkují řadu toxinů, některé z nich jsou smrtelné
G+
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
Clostridium
botulinum
často - v půdě, odpadních vodách, mořských usazeninách a vnitřních
orgánech lidí i zvířat
nebezpečné - Clostridium tetani, Clostridium botulinum
G+
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
Desulfotomaculum
acetoxidans
Desulfotomaculum
anaerobní bakterie, která redukuje sulfáty, sulfity a jiné sloučeniny
síry (desulfurikační)
okolo 20 druhů bylo objeveno v různých prostředích – v půdě, ve
vodě v geotermálních oblastech a ve vnitřních orgánech hmyzu a
žaludku teplokrevných živočichů
Mykobakterie
Mycobacterium – rod s cca 100 druhy
G +/rezistentní
AUTOCHTONNÍ
BAKTERIE
nepohyblivé a nesporulují, samostatná čeleď Mycobacteriaceae, řazeny k
aktinomycetám
komplexní buněčná stěna, předpona –myko odkazuje na fakt, že jejich
buněčná stěna obsahuje vosky
rostou obecně poměrně pomalu, jsou acidorezistentní („acid fast“), tzn.
zbarvení vyvolané činidly se nedá vymýt kyselinami
široce rozšířené organismy, typicky žijící ve vodě (i chlorované) a zdrojích
potravy
zástupci způsobují těžká onemocnění – obligátní patogeny
tuberkulóza – Mycobacterium tuberculosis
tuberkulóza skotu – M. bovis
lepra – Mycobacterium leprae
Mykobakterie nepatogenní :
Mycobacterium smegmatis, M.
phlei, M. butyricum
Bakterie z půdy se do vody se dostávají splavováním
osídlují pobřežní úseky vodní plochy, se vzrůstající vzdáleností
od břehu jejich počet klesá
BAKTERIE
Z PŮDY
aerobní bakterie – tj. výskyt ve vrchních vrstvách vody
Nejčastější rody: Bacillus, Corynebacterium, Clostridium, Micrococcus,
Streptomyces
G+
G+
Bacillus
rozsáhlý rod sporulujících bakterií
Corynebacterium
malé, obvykle nepohyblivé, nesporulující
široce rozšířen v půdě a prachu
(obvykle spory)
mnoho druhů izolováno z různých
stanovišť: půda, voda, krev a lidská kůže
často na mrtvém organickém
materiálu
patogenní kmeny mohou infikovat
rostliny, živočichy včetně člověka
zodpovědný za kažení potravin.
BAKTERIE
Z PŮDY
G+
G+
Micrococcus luteus
nacházen na různých
stanovištích: lidská kůže, voda,
prach a půda
Micrococcus není obecně
považován za nebezpečnou
bakterii
Streptomyces
zástupce skupiny Actinomycetes
obvykle osidluje půdu a je důležitý rozkladač
producenti antibiotik (Streptomyces griseus)
Bakterie ze střevního traktu především zástupci:
čeledi Enterobacteriaceae
BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO
TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT
rodů Streptococcus, Clostridium
za určitých podmínek můžeme izolovat i patogenní bakterie (Salmonella
typhi, Schigella dysenteriae), jejich výskyt je však krátkodobý, protože voda
pro ně není vhodným stanovištěm
bakterie v pitné vodě
pocházející ze střevního
traktu lidí a zvířat
neindikují
fekální znečištění
indikují
fekální znečištění
enterokoky
(fekální streptokoky)
čel. Enterococcaceae
Streptococcus
fecalis
enterobakterie
čel. Enterobacteriaceae
Salmonella
Shigella
Yersinia
koliformní b.
E. coli
Enterobacter
Klebsiella
Citrobacter
anaerobní
nesporulující b.
Clostridium
perfringens
ENTEROKOKY (FEKÁLNÍ STREPTOKOKY)
G+
streptokoky
BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO
TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT
nesporulující, fakultativně anaerobní, někdy jako diplokoky, někdy mohou být
pohyblivé
ve vodách se množí vzácně; původní prostředí – zažívací trakt člověka a
teplokrevných živočichů
mohou se stát původci některých nepříjemných onemocnění jiných tělesných
systémů (močových cest, žlučníku, podíl na meningitidách)
mnoho enterokoků je rezistentních vůči antibiotikům
značná odolnost vůči některým toxickým látkám; oproti koliformním bakteriím
snášejí vyšší koncentrace chlóru a indikují přiváděné fekální znečištění i v
případech, kdy doznívají účinky stříbra (Sagen), který zatím spolehlivě
potlačuje koliformní bakterie
teplotní nároky v širokém rozmezí (10-45°C, krátkodobě i 60°C)
snášejí vysoké koncentrace solí (obsah žluči) a vysoké hodnoty pH (kolem 9)
– využívá se při kultivaci, kdy se selektivní podmínky pro jejich růst zajišťují
přídavkem azidu sodného
za fekální streptokoky jsou počítány pouze kmeny hydrolyzující aeskulin s
negativním testem na přítomnost katalázy
G+
BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO
TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT
Streptococcus (dříve Enterococcus – např. S. faecalis)
běžní komensálové trávicího traktu živočichů (lidí). S. faecalis (90%), S.
faecidum (5-10%)
některé druhy mohou být patogenní – močové cesty, osrdečník, meningitida
ENTEROBACTERIACEAE
BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO
TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT
G - běžně zvané enterobakterie
rodově i druhově početná čeleď, zahrnuje fakultativně anaerobní tyčinky, z
nichž většina žije ve trávicím traktu obratlovců jako přirozená součást
mikroflóry střeva
většina zástupců je nepatogenní, některé jsou podmíněně patogenní a
některé druhy jsou nebezpečnými původci vážných i smrtelných nemocí
(např. Salmonella, Shigella, Yersinia pestis, některé kmeny E. coli)
nevadí jim vysoká koncentrace žlučových solí, toho se využívá při přípravě
výběrově diagnostických půd.
většina saprofyti a mutualisté trávícího ústrojí, tvoří součást obligátní
mikroflóry střeva
vyskytují se také ve vodě, v půdě a na rostlinách
rody: Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter
tzv. koliformní bakterie, tedy Escherichia coli a další druhy štěpící laktózu,
jsou indikátorem fekálního znečištění pitné vody
Koliformní bakterie
BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO
TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT
G - nesporulující aerobní až fakultativně anaerobní tyčinky
zkvašují laktózu na plyny, kyseliny a aldehydy
patří do čeledi Enterobacteriaceae
jsou indikátorem fekálního znečištění pitné vody
r. Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter
r. Escherichia
chemoorganotrofní, fakultativně anaerobní, metabolismus aerobně
respirační a fermentativní
tvar tyčinek, petrichální bičíky/nepohyblivé, opouzdřené (kapsula, může
se rozpadat)
teplota 10-46 °C, opt. 37°C
zkvašuje sacharidy (včetně laktózy) – produkce plynu; produkce indolu
její přítomnost v čerstvé vodě indikuje fekální znečištění a vede k
vyloučení vody pro použití jakožto pitné vody
některé vzácnější kmeny E. coli jsou nebo za určitých okolností mohou
být patogenní - různé zánětlivé stavy (zánět močového měchýře)
ANAEROBNÍ SPORULUJÍCÍ BAKTERIE
hlavně rod Clostridium
BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO
TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT
anaerobní sporulující tyčinky, nepohyblivé, excentrické spory v místě tvorby
buňku mírně rozšiřují, některé druhy klostridií tvoří pouzdro
spory vydrží ve vodě dlouhou dobu
dobře se kultivují, rychle rostou a tvoří plyny
mnoho druhů je známých produkcí toxinů (C. botulinum ( z potravin), C. tetani
( z půdy)
při stanovení hodnocení fekálního znečištění je někdy používána kultivace
spor Clostridium perfringens - běžně přítomný ve stolici – ale ve značném
množství se vyskytuje i v půdě
z uvedených důvodů jeho nálezy ve vodě nelze považovat za jednoznačnou
indikaci fekálního znečištění
spory jsou velmi rezistentní k poměrně vysokým dávkám chloru, je možno
stanovení využít ke kontrole účinnosti provedené desinfekce
Mikrobiologický rozbor
pitné vody I.
Hlavní původci onemocnění z pitné vody
Vibrio cholerae je bakterie způsobující choleru, životu nebezpečné
onemocnění, které se projevuje těžkými vodnatými až krvavými průjmy.
Ročně se ve světě vyskytne okolo jedné miliardy případů cholery a více než
tři miliony úmrtí, především v Asii, Africe a Jižní Americe. I v ČR se dodnes
každoročně vyskytne několik ojedinělých případů importovaných
z exotických zemí.
Salmonella enterica typhi je bakterie způsobující břišní tyfus – nemoc, která
ještě před sto lety byla nejčastější příčinou vodních epidemií v průmyslově
rozvinutých zemích. Charakteristickým obrazem nemoci je náhlý atak
horečky, bolest břicha a hlavy, celková schvácenost, nevolnost a průjmy
vedoucí k vážné a život ohrožující dehydrataci nebo perforaci střeva.
Salmonella typhimurium a další druhy vyvolávají salmonelózy – akutní
průjmovitá onemocnění s krátkou inkubační dobou (8–10 hodin). Typické
jsou explozivní epidemie, při nichž v rozmezí několika hodin onemocní
většina osob exponovaných nákaze. Salmonelóza je nemoc, která je
v Evropě na vzestupu, i když pitná voda není hlavní cestou přenosu.
Shigella dysenteriae, S. flexneri a S. sonnei jsou bakterie způsobující
bacilární úplavici, vážné a vysoce nakažlivé průjmové horečnaté onemocnění
charakterizované až krvavými průjmy, k jehož vzniku stačí velmi nízká
infekční dávka. I když hlavní cesta přenosu je osobní kontakt („nemoc
špinavých rukou“), přenos pitnou vodou je také možný a dobře známý.
Escherichia coli je bakterie, která žije ve velkých počtech ve střevech lidí a
zvířat a je ve většině případů zcela neškodná. Existují však i patogenní kmeny
(např. Escherichia coli O157:H7), které byly příčinou řady epidemií z pitné
vody (viz příklady z Walkertonu nebo Caboolu) s velmi vážnými následky. U
lidí se kromě krvavých průjmů může vyvinout (ve 2 – 7 % případů) i
hemolyticko-uremický syndrom, který bývá často smrtelný. Postiženým (často
malým dětem) při něm selhává činnost ledvin.
Legionella je bakterie způsobující nemoc legionelózu, která může mít dvě
klinické formy: tzv. legionářskou nemoc, která se projevuje těžkým zápalem
plic, nebo tzv. pontiackou horečku, což je mírnější horečnaté onemocnění.
Byla objevena až v roce 1976 díky záhadné epidemii v USA, která postihla
účastníky sjezdu legionářů (odtud název) a která měla původ v hotelové
klimatizaci masivně kontaminované legionelou. Legionela se vyskytuje běžně
ve vodách, ale v teplé vodě nebo klimatizačních jednotkách se může pomnožit
do velmi vysokých počtů. Cesta přenosu infekce je především inhalační a
spočívá ve vdechnutí infikovaného aerosolu (kapének) například při
sprchování, ve vířivých koupelích nebo v klimatizovaných prostorách.
Popsána je ale i cesta aspirační, která spočívá ve vdechnutí kapky vody při
pití kontaminované vody.
Viry hepatitidy A, E a F jsou skupiny virů způsobující zánětlivé onemocnění
jater a přenášené fekálně-orální cestou. Vyskytují se po celém světě a i v ČR
byly v posledním desetiletí příčinou několika epidemií z pitné vody.
Rotaviry jsou hlavní virovou příčinou těžkých horečnatých průjmů u kojenců
a malých dětí v rozvinutých i rozvojových zemích. Byly objeveny teprve na
počátku 70. let dvacátého století. Vzhledem k obtížné diagnostice se
rotavirové infekce dostávají do statistik nejčastěji jako „akutní infekční
záněty trávicího traktu bez zjistitelného původce“. Přenos pitnou vodou je
možný, ale nevíme, jak je častý; rozhodujícím způsobem přenosu je však
osobní kontakt (fekálně-orální cesta).
Všeobecné zásady při odběru vzorků vody
1. Volba správného místa odběru – tak aby vzorek pro sledovaný zdroj
vody byl reprezentativní, tj. aby správně vystihoval podmínky existující
ve vodě
2. Odebíráme vodu do sterilních odběrových setů – autoklávované.
3. Respektovat, že při odběru vzorku pro komplexní analýzu se vzorek
určený pro mikrobiologický rozbor odebírá jako první. Do sterilních
lahví se zabroušenou zátkou nebo plastů bez toxických látek.
4. Pro většinu účelů stačí 300 ml. Vzorky mají zůstat neprodyšně uzavřené
do otevření v laboratoři. Pokud se provádí i chemická analýza odebírá
se 1 l.
5. Odběr -15-20 cm pod vodní hladinou – u tekoucích vod, ale nesmí se
odebírat ode dna.
6. Ideální je zpracovat vzorky do 2 až 6 h po odběru. Nejpozději je možno
vzorky zpracovat do 24 h po odběru, za předpokladu, že během
přepravy do laboratoře budou uchovávány při teplotě 4-6°C.
7. Přesné protokoly – místo, datum, hodina odběru, zdroj vody, jméno
osoby, která vzorek odebírala, datum analýzy, použitá metoda, způsob
manipulace se vzorkem, a výsledek analýzy.
Limity mikrobiologického rozboru pitné vody podle vyhlášky 252/2004Sb.
Test
Limit
Poznámka
Clostridium perfringens
Negativní / 100 ml
Stanovení se provádí u pitných vod
vyrobených z vod povrchových nebo z
vod jimi ovlivněných
Enterokoky
Negativní / 100 ml
Negativní / 250 ml
Escherichia coli
Negativní / 100 ml
Negativní / 250 ml
Koliformní bakterie
Psychrofilní bakterie
(22°C)
Mezofilní bakterie (36°C)
Pseudomonas aeruginosa
negativní = 0 CFU/ml
Platí pouze pro balenou pitnou vodu
Platí pouze pro balenou pitnou vodu
Negativní / 100 ml
200 CFU / ml
500 CFU / ml
Platí pro balenou pitnou vodu
500 CFU / ml
Platí pro vodu náhradního zásobování a
vodu z malých zdrojů ***
100 CFU / ml
20 CFU / ml
Platí pro balenou pitnou vodu
100 CFU / ml
Platí pro vodu náhradního zásobování a
vodu z malých zdrojů ***
Negativní / 250 ml
Platí pouze pro balenou pitnou vodu
CFU = KTJ
MIKROBIOLOGICKÝ
ROZBOR PITNÉ VODY
přenos 1 ml vody na
agarovou plotnu
filtrace 100 ml vody
přes membránový filtr
ENTEROKOKY
Slanetz-Bartley
agar 37°C
(44-48 hod)
KOLIFORMNÍ B.
a E. COLI
TTC agar s
tergitolem 7
36-37°C (24- 48 hod)
přeočkování
červenohnědých
kolonií
žluč-aeskulin-azidový
agar (BEA), 44°C 48 h
PSYCHROFILNÍ B.
MEZOFILNÍ B.
MasoPeptonový
Agar 22°C
(do 72 h)
MasoPeptonový
Agar
36-37°C
(24-48 h)
přeočkování
žlutých kolonií
TryptofanSojový Agar
36°C, až 24 h
oxidázový
test
průkaz E. coli
indol
Další testy mikrobiologického rozboru pitné vody podle vyhlášky
252/2004Sb.
Clostridium perfringens, C. pasteurianum - pokud je povrchová voda
upravená na pitnou
Pseudomonas aeruginosa
Mikroskopické hodnocení - počet všech a počet živých
mikroorganismů v 1 ml
ENTEROKOKY (FEKÁLNÍ STREPTOKOKY)
G+ (strepto)koky, žijící převážně v trávicím traktu živočichů
redukují 2,3,5 trifenyltetrazoliumchlorid na formazan a hydrolyzují
aeskulin
stanovení (intestinálních) enterokoků doplňuje průkaz koliformních
bakterií, neboť enterokoky jsou odolnější vůči nepříznivým účinkům
prostředí (včetně chlorování a jiných dezinfekčních zásahů) než
koliformní bakterie
přítomnost enterokoků v pitných vodách nepřímo indikuje i možnou
přítomnost patogenních virů, které jsou k chloraci rovněž odolnější
než koliformní bakterie
pro kultivaci enterokoků jsou používána živná média s obsahem
azidu sodného, který potlačuje růst G- bakterií. Nejpoužívanější
půdou je Slanetz-Bartleyův agar, na němž rostou enterokoky
v podobě červených nebo růžových koloniích s červeným středem.
Inkubace se provádí při 37°C 2 dny.
ENTEROKOKY (FEKÁLNÍ STREPTOKOKY)
Slanetz-Bartleyův agar
jemně růžový
obsahuje azid sodný
diagnostická a selektivní půda pro střevní (fekální) enterokoky
kultivace při 37 °C (24-48 h)
Azid sodný
nejpoužívanější selektivní agens, většina médií jej obsahuje 0.2 – 0.5%.
inhibuje enzymatické systémy elektronového transportu, např. katalázy nebo
cytochromoxidázy c
hodnotíme počet (KTJ/ml)
červenohnědých kolonií
KOLIFORMNÍ BAKTERIE A ESCHERICHIA COLI
za koliformní bakterie označujeme několik druhů gramnegativních
bakterií z bohaté čeledi Enterobacteriaceae, které při kultivaci na
selektivně-diagnostických půdách rozkládají laktózu během 24-48
hodin
nejtypičtějším a nejrozšířenějším zástupcem koliformních bakterií je
druh Escherichia coli, který žije převážně v trávicím traktu
teplokrevných živočichů včetně člověka - ve vodě je indikátorem
fekálního znečištění a je schopna růstu i při teplotách 42-44°C
kromě Escherichia coli patří ke koliformním bakteriím i druhy rodů
Enterobacter, Citrobacter a Klebsiella, které se však kromě trávicího
traktu někdy vyskytují i jiných prostředích.
pro kultivaci koliformních bakterií se používá řada živných médií,
většinou s obsahem laktózy (Endova půda, půda s Tergitolem 7).
Druhy rozkládající laktózu na půdě s Tergitolem 7 vyrůstají ve žlutých
koloniích, Escherichia coli na Endově agaru je červená s kovově
zlatým leskem, zatímco bakterie nevyužívající laktózu vytváří kolonie
růžové nebo bezbarvé
KOLIFORMNÍ BAKTERIE A ESCHERICHIA COLI
TTC půda s tergitolem 7
zelená
obsahuje heptadecylsulfát sodný
diagnostická půda pro koliformní bakterie a E. coli
kultivace při teplotě 36+2°C (24 hod)
po kultivaci membránového filtru se jako laktóza pozitivní bakterie počítají
všechny charakteristické kolonie (bez ohledu na velikost), které vykazují
tvorbu žlutého zbarvení média po membránovým filtrem.
hodnotíme počet žlutých (okrových) kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar
PSYCHROFILNÍ A MEZOFILNÍ BAKTERIE
pod těmito pojmy se rozumí všechny bakterie schopné růstu na
organických látkách, a to při teplotě 22°C (psychrofilní) a 36°C (mezofilní)
kultivace se provádí 2-3 dny na univerzálních živných půdách s bohatým
obsahem organických živin, jako jsou kasein-sojový agar nebo
masopeptonový agar
MPA 1
kultivace při teplotě 36°C až 48 hodin
stanovení MEZOFILNÍCH BAKTERIÍ
MPA 2
kultivace při teplotě 26°C 48 až 72 hodin
stanovení PSYCHROFILNÍCH BAKTERIÍ
potvrzuje se přítomnost saprofytických
bakterií
Hodnotíme počet kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
G- aerobní tyčky, na vhodných diagnostických
modrozelené nebo žlutozelené exobarvivo
agarech
produkuje
schopnost růstu při teplotách 42°C
vyšetření přítomnosti této bakterie se provádí jen u balených pitných vod
Pseudomonas aeruginosa je
nejzávažnějším patogenním druhem
rodu Pseudomonas a může se
vyskytovat v některých typech
přírodních vod
jako potenciální patogen vyvolává řadu
onemocnění: zánět močových cest,
středního ucha či hnisání popálenin
většina kmenů vylučuje prudce toxický
toxin A
rezistence k antibiotikům
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
G+ anaerobní sporulující bakterie, původce akutních střevních onemocnění s
náhlým vznikem břišních kolik, nauzeou a průjmem
výskyt v půdách a ve střevním traktu některých živočichů
clostridiální typ spor, velmi odolné (více než enterokoky) a ve vodách může
přežívat dlouhou dobu
přítomnost v pitné vodě může indikovat přítomnost dalších patogenních
mikroorganismů (např. kryptosporidií)
kultivace C. perfringens se provádí
anaerobně na m-CP agaru při 44°C
po dobu 21 hodin, s následným
potvrzením kolonií pomocí par
amoniaku (žluté kolonie C.
perfringens se zbarví do růžova až
červena).
MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR VODY – RYCHLOTESTY
rychlotesty firmy Merck (Readycult Coliforms 100, Readycult Enterococci 100)
založeny na změně barvy substrátu po působení specifických enzymů
méně náročné na prostor a na vybavení laboratoře
100 ml vzorku + granule
kultivace 18 až 24 hodin při 35 – 37°C
Readycult Enterococci 100 – enterokoky (fekální streptokoky)
POZITIVNÍ REAKCE
enterokoky přítomny
NEGATIVNÍ REAKCE
enterokoky nepřítomny
Readycult Coliforms 100 – koliformní bakterie a E. coli
POZITIVNÍ
REAKCE
koliformní
b. přítomny
POZITIVNÍ REAKCE
E. coli přítomna
NEGATIVNÍ REAKCE
koliformní b. nepřítomny
3. ÚKOL - MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY
Cíl úkolu:
Prokázat přítomnost bakterií obecného a fekálního znečištění pitné vody
Pomůcky:
Různé vzorky pitných vod /podzemní studniční voda/, pipety na 1 ml, odměrný
válec, filtrační zařízení, membránové filtry /0,45 μm/, MPA, SB agar,
laktózový TTC agar /tergitol 7/
Provedení:
Ze vzorků pitných vod odebraných do sterilních lahví provedeme kultivační
vyšetření
1. Zfiltrujeme 100 ml vody přes membránový filtr a filtr přeneseme do středu
SB agaru, kultivace 37°C (44-48 hod)
2. Zfiltrujeme 100 ml vody přes membránový filtr a filtr přeneseme do středu
agaru s tergitolem 7, kultivace 36-37°C (24- 48 hod)
3. Na každou misku s MPA napipetujeme 1 ml vody a rozlijeme po celém
povrchu agaru – kultivace při 22°C (do 72 h) a 36-37°C (24-48 h)
Pracovní postup I. – filtrace vzorku vody
1. Sterilace předcházející zpracování každého vzorku
2. Umístění membránového filtru na filtrační stojan
3. Umístění nálevky na stojan, její stlačení a pevné zasazení na místo
Pracovní postup II. – filtrace vzorku vody
4. Nalití vzorku do nálevky s filtrem
5. Odstranění nálevky, zmáčknutí páčky, které umožní snadné odebrání
membrány ze stojanu
6. Umístění filtru do Petriho misky s živnou půdou
Provedení (pokračování):
Kultivujeme v bioinkubátoru:
MEZOFILNÍ BAKTERIE (MPA 1) - při teplotě 36°C až 48 h
PSYCHROFILNÍ BAKTERIE (MPA 2) - při teplotě 26°C až 72 h
ENTEROKOKY (Slanetz-Bartleyův agar) - při teplotě 37°C 44+4 h
narostlé kolonie na membránovém filtru přeočkujeme na žluč-aeskulinazidový agar /inkubujeme při teplotě 44°C a hodnotíme po 48 h/
KOLIFORMNÍ BAKTERIE a E. COLI (půda s tergitolem 7) - při teplotě
36+2°C 24 h
narostlé kolonie na membránovém filtru přeočkujeme na neselektivní
agar /inkubujeme při 36°C až 24 h/ a po této době provedeme
konfirmační testy - oxidázový test, a test na produkci indolu
Mikrobiologický rozbor
vzduchu
MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR VZDUCHU
vzduch není vlastním prostředím pro mikroorganismy, ale je jen jejich
dočasným přechovávačem a přenášečem
mikroorganismy se dostávají do vzduchu rozvířeným prachem z půdy,
drobnými kapkami vody z vodní hladiny, kapkami slin ze sliznic
počet mikroorganismů v ovzduší se liší podle místa – nejvíce je jich v
průmyslových aglomeracích a nejméně nad mořem, nad chudými půdami,
nad zalesněnými plochami
prachové částice – nosiče mikroorganismů jsou roznášeny až do výšky 10
km, běžné druhy se vyskytují do výšky 3000 m
prachové částečky mohou sedimentovat, nebo drobné částečky zůstávají v
ovzduší – aerosol
mikrobiologické vyšetření vzduchu se provádí nejčastěji v uzavřených
prostorách, přičemž se stanovuje celková koncentrace směsné populace
bakterií a celková koncentrace směsné populace plísní v ovzduší
v současné době 3 druhy metod, kterými lze mikroorganismy v ovzduší
sledovat
1. Aktivní nasávání vzduchu
1.A Impakční metody
využívají pro průchod vzduchu sací hlavu s otvory, mikroorganismy jsou
zachycovány na agarová média v Petriho miskách
nejčastěji krevní agary (pro humánní patogeny) a SA (pro vláknité houby)
a tomto principu fungují tzv. aeroskopy
Jsou používány pro měření
možného mikrobiálního
rizika kontaminace z
ventilačních a
klimatizačních systémů.
Nasávají úzkou štěrbinou
vzduch a vrhají ho směrem
k povrchu pomalu rotující
Petriho misky se sterilním
živným médiem, která se za
60 s otočí 360°.
Velikost štěrbiny je
měnitelná
Aeroskop
1.B Filtrační metody
zachycují mikroorganismy pomocí čerpadla nebo vývěvy na filtry, které
jsou vkládány na Petriho misky a agary
2. Sedimentační metoda
ve vyšetřovaném prostoru (místnosti, laboratoři..) se určitou dobu nechají
otevřené Petriho misky se živným médiem
do takto otevřených Petriho misek se nechají sedimentovat
mikroorganismy, ulpívající na prachových částečkách vzduchu, expozice
může trvat 10 min až 1 hodinu.
stanovuje se celková koncentrace směsné populace bakterií a celková
koncentrace směsné populace plísní v ovzduší
neměla by být používaná pro hodnocení prostor zdravotnických zařízení,
které využívají oběhový vzduch
SA – Sabouraudův agar
selektivní půda pro houby
obsahuje pepton, agar a cukry (glukozu nebo maltozu)
pH 5,0
kultivace při 26°C 72 h
MPA – Masopeptonový agar
obsahuje pouze výtažek z masa, pepton, sole a 2% agarovou řasu
základ pro další půdy
neselektivní
kultivace při 36-37°C 24-48 h
4. ÚKOL - Průkaz mikroorganismů v ovzduší
Cíl úkolu
Zjistit, zda v ovzduší laboratoře a jiných míst pracoviště /fytotrony, sterilní
boxy, skleník…/ se vyskytují mikroorganismy
Pomůcky:
Petriho misky s masopeptonovým agarem /MPA/ a Sabouraudovým
glukózovým agarem /SA/
Provedení
SEDIMENTAČNÍ METODA
Petriho misky odkryjeme na dobu 10 min v předem určeném prostoru. Pak
misky uzavřeme víčkem, popíšeme /datum, lokalita, jméno/ a vložíme dnem
vzhůru do bioinkubátoru. Mikroorganismy kultivujeme při teplotě 26°C /SA/, a
37°C /MPA/
Výsledek:
zapisujeme v neděli
vytvořit seznam míst, kde se nechávaly otevřené Petriho misky
počítáme veškeré vyrostlé kolonie na každé agarové misce zvlášť a
popisujeme morfologické vlastnosti jednotlivých kolonií
hodnoty v KTJ – kolonie tvořící jednotky - vztáhnout buď k času – přepočet
na 1 hodinu
makroskopicky rozlišíme kolonie vláknitých hub /jsou chmýřité, vláknité/ od
kolonií ostatních mikroorganismů /bakterií a kvasinek/
seřadíme odběrná místa podle intenzity kontaminace Petriho misek
Kontaminace povrchů Envirocheck® Contact TVC
5. ÚKOL - Průkaz bakterií v ústní dutině a na povrchu kůže člověka
A. Kultivační průkaz bakterií v ústní dutině člověka
Cíl úkolu:
Průkaz bakterií v ústní dutině
Pomůcky:
Sterilní vatový tampón na špejli, sterilní fyziologický roztok, Petriho miska s
MPA
Provedení:
Zvlhčeným tamponem setřeme sliznici ústní dutiny kolem zubů dolní čelisti.
Tampon rozetřeme na agarovou plotnu z inokula do několika
rovnoběžných čar. Inkubujeme při teplotě 37°C 24 hod.
Výsledek:
Na agarové plotně spočítáme počet vyrostlých kolonií a popíšeme jejich
morfologické vlastnosti. Z vybraných kolonií si připravíme nativní
preparát, který prohlédneme velkým zvětšením mikroskopu a popíšeme.
B. Kultivační průkaz bakterií na kůži
Cíl úkolu:
Průkaz bakterií ulpívajících na rukou
Pomůcky:
Petriho miska s MPA
Provedení:
Provedeme otisk několika prstů na agarovou plotnu. Po té si umyjeme
ruce, použijeme desinfekci, a znovu provedeme otisk prstů na
agarovou plotnu. Inkubujeme 24 hod při teplotě 37°C.
Výsledek:
Na agarové plotně spočítáme počet vyrostlých kolonií a popíšeme jejich
morfologické vlastnosti. Z vybraných kolonií si připravíme nativní
preparát, který prohlédneme velkým zvětšením mikroskopu a
popíšeme.
Očkování mikroorganismů
OČKOVÁNÍ BAKTERIÍ
Kolonie je populace buněk, která vzniká z jedné buňky. Mnohé druhy bakterií
rostou jako stejně vyhlížející kolonie. Různě vypadající kolonie jsou obvykle
jiné druhy. Kolonie umožňují zhodnocení čistoty kultury, výskyt více než
jednoho typu kolonie svědčí o kontaminaci kultury. Mikrobiální růst se v
tekutých médiích projeví zakalením.
Prvním krokem kultivace mikroorganismů je jejich přenesení z odebraného
vzorku nebo dříve vytvořené kultury do čerstvého živného prostředí. Tomuto
přenosu říkáme očkování (inokulace).
Očkování musí být provedeno tak, aby během přenosu nedošlo k zavedení
nechtěných mikroorganismů neboli kontaminaci ze vzduchu, rukou,
dýchacích cest nebo pracovní plochy.
Při očkování se užívá tzv. aseptická technika, což je sled kroků používaných
k zabránění kontaminace sterilních předmětů nebo mikrobiálních kultur
během manipulace.
A. Odběr kultury z tekutého média bakteriologickou kličkou
a. Očkovací kličku držte v jedné ruce a zkumavku s bakteriální kulturou
v druhé ruce. Sterilizujte kličku důkladným vyžíháním v nesvítivé časti
plamene (klička se rozžhaví do ruda). Kličku nechejte vychladnout (asi 30 s).
b. Malíkem ruky, která drží kličku, sejměte ze zkumavky víčko. (V případě
použití zkumavek se šroubovacím víčkem je vhodné víčko předem mírně
povolit). Vičko nepokládejte na podložku, ale stále ho držte.
c. Zkumavku držte mírně nakloněnou a ožehněte její hrdlo v plameni. Ponořte
sterilní kličku do bakteriální kultury a do očka naberte bakteriální suspensi.
d. Kličku vytáhněte ven, ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte na ni víčko.
Zkumavku umístěte do stojánku. Kličku stále držíte v ruce.
B. Očkování do tekutého média
Vezměte do ruky zkumavku se sterilním masopeptonovým bujónem,
odstraňte víčko a ožehněte hrdlo zkumavky. Ponořte kličku s
odebranou kulturou do bujónu a potom ji ze zkumavky vytáhněte.
Ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte víčko zpět. Zkumavku vraťte do
stojánku. Vyžíhejte kličku.
C. Očkování na šikmý agar
Postupujte obdobně jako u očkováni do bujónu, na šikmý agar
očkujte jemným pohybem plochou očka kličky po povrchu agaru
směrem ode dna nahoru, tak aby nedošlo k narušení agaru. Po
naočkování zkumavku ožehněte, uzavřete víčkem a postavte do
stojánku. Vyžíhejte kličku.
CHARAKTER RŮSTU NA ŠIKMÉM AGARU
Hodnotíme: rychlost růstu, tvar nátěru, průřez nátěru, povrch
nátěru, konzistenci, barvu
D. Očkování na agar v Petriho misce
Mírně odklopte víčko, vsuňte dovnitř kličku s odebranou kulturou a
lehkým pohybem „kreslete“ po povrchu agaru (čáry nebo vlnovku)
plochou očka kličky. Vytáhněte kličku, zavřete víčko a kličku
vyžíhejte.
Křížový roztěr
ředění vzorku mikroorganismů, cílem je získat jednotlivé KTJ
E. Očkování do hlubokého agaru očkovací jehlou
Kulturu odeberte očkovací jehlou stejně jako v bodě 1. Vezměte do
ruky zkumavku se sterilním masopeptonovým hlubokým agarem,
odstraňte víčko a ožehněte hrdlo zkumavky. Očkujte hluboký agar
zapíchnutím jehly do středu agaru. Jehlu opatrně vytáhněte, tak že ji
pohybujete ve stejné draze jako při vpichu. Ožehněte hrdlo zkumavky
a vraťte víčko zpět. Zkumavku vraťte do stojánku. Vyžíhejte jehlu.
Charakter růstu podél vpichu do agarové půdy (pouze u bakterií)
Vpichem se očkuje z 24 h staré kultury narostlé v bujónu, kultivace při
30-37°C
a) aerobní (v horní části vpichu), b) mikroaerofilní c) fakultativně anaerobní
(rostou po celé délce vpichu), d) anaerobní mikroorganismy (rostou na spodní
části vpichu)
F. očkování teplého
agaru – zřeďování
Ředění sterilními
pipetami, kultivace
podpovrchová
6. ÚKOL – Příprava izolátů plísní
Cíl úkolu:
Získat základní dovednosti při přípravě monokultur houbových
mikroorganismů
Pomůcky:
Petriho misky se Sabouraudovým glukózovým agarem, korkovrt, pinzeta,
směsné kultury plísní, kahan, podložní skla, krycí skla, vlhká komůrka,
bakteriologická klička, šikmý agar
Provedení:
Korkovrtem vysekneme z čisté misky s SA 1-3 disky.
Získané čisté disky s SA položíme na podložní sklo a bakteriologickou kličkou
přeneseme na jejich povrch kulturu spor plísní. Přikryjeme krycím sklem,
vložíme do vlhké komůrky a kultivujeme při 22-26°C 2-3 dny, pak uschováme v
ledničce. Pozorujeme pod mikroskopem. Na šikmý agar naočkujeme
bakteriologickou kličkou stejnou kulturu spor plísní, kultivujeme při 22-26°C 2-3
dny
Výsledek:
Pozorujeme růst kultur mikroorganismů, mikroskopujeme
Podložní sklo s agarovým diskem
Petriho miska s
vyseknutými agarovým
disky
Agarový disk s kulturou plísně