LM DNA Kit Product Insert

Immucor Transplant Diagnostics, Inc.
550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké
Tel: +1 (203) 328-9500 nebo volání bez poplatku ve Spojených státech amerických, Kanadě a Portoriku (888) 329-0255,
Fax: +1 (203) 328-9599
WWW.IMMUCOR.COM
Dokumentace a další jazykové verze jsou k dispozici na: www.Immucor.com
PŘÍLOHA
K PRODUKTU
TYPIZAČNÍ SOUPRAVY LIFECODES HLA-Nulová alela - kompatibilní s technologií Luminex®
Test pro diagnostiku in vitro
OBSAH
Definice symbolů ………………...………….
Činidla podle katalogového čísla...….…
1
2
Návod k pouţití…………………………………..
A. Purifikujte genomovou DNA.……………….
3
3
Úrčené pouţití………………………………… 2
B. Amplifikace DNA (PCR)….…………..........
4
Shrnutí a vysvětlení……….…………...….… 2
Postup………………………..………….…….. 2
Činidla….………………………………….……
A. Identifikace…………...………….……….
B. Varování a upozornění..………………...
C. Pokyny pro uskladnění …………………
D. Purifikace a aplikace……………..……..
E. Indikace nestability………………………
2
2
2
3
3
3
Poţadavky na nástroje ….………………….
Odběr a příprava vzorků……………….……
Postup………………………..………………..
A. Dodávané materiály……………………..
B. Požadované, ale nedodávané
materiály, Činidla a vybavení……………
3
3
3
3
3
C. Hybridizace..…………………………………
D. Proveďte analýzu vzorku
pomocí nástroje Luminex ….………………….
Výsledky ……………………………….………….
Kontrola kvality ...……………………………..…
Omezení postupu …………..…………………...
Řešení problémů ………………………………...
Očekávané hodnoty …………………………….
Specifické funkční charakteristiky …………..
4
Literatura ………………………………………….
Omezená licence ………………….…………….
Pouţité obchodní značky …………..………….
Příloha A……………………..…………………….
Gelová elektroforéza …………………..………
Interpretace gelu …….…………………………
6
7
7
7
7
7
5
5
5
6
6
6
6
DEFINICE SYMBOLŮ (Označení výrobku a doplňující dokumentace)
Číslo sady
Katalogové
číslo
Teplotní
omezení
Horní teplotní
hranice
Použitelnost
do
Chraňte
před
světlem
Množství pro X
testů
Nezmrazovat
Varování viz návod k
použití
Viz návod k
použití
Výrobce
Zástupce pro
Evropu
Strana 1 z 7
EC REP
LC1287CECS.3 (02/14)
ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA.
LC-N Typizační sada LIFECODES HLA-Nulová alela kompatibilní s technologií Luminex
Činidlo
Číslo výrobku
Plnicí objem
Výrobek č. 629100-50
50
Uskladnění
LIFECODES Nulová alela třídy 1
629001
870 µL
2 až 8 °C
Master Mix
Množství pro 50 testů
LIFECODES Nulová alela třídy 2
MX-N2
629002
870 µL
2 až 8 °C
Master Mix
LIFECODES Probe Mix Nulová
2 až 8 °C
BM-N
629003
810 µLx 2
alela ‡
Chraňte před světlem
DS
Ředící roztok
628515
19.7 mL
18 až 30 ºC
‡
Směsi Probe Mix jsou citlivé na světlo: zajistěte jejich minimální vystavení světlu. VAROVÁNÍ: Jednotlivé součásti sady nepoužívejte po překročení data exspirace.
MX-N1
URČENÉ POUŢITÍ
Typizace DNA u alel I. a II. třídy pomocí typizačních sad LIFECODES HLA SSO.
SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ
Typizace HLA na základě amplifikace DNA pomocí metody PCR je běžný laboratorní postup. Metoda amplifikace (množení) DNA pomocí polymerázové
řetězové reakce (PCR) je používána k rozšíření zvolené oblasti DNA. V rámci typizace HLA je proveden následný rozbor, jehož cílem je stanovit vlastnosti
zmnožené DNA. Pro účely typizace HLA je možné použít několik typů technologií, jako je SSP (1), SSOP (2), RFLP (3) a reverse dot blot (4). Stejně jako
metody SSOP a reverse dot blot využívají typizační soupravy LIFECODES HLA-SSO k identifikaci alel HLA přítomných ve vzorku po amplifikaci PCR sekvenčně
specifické oligonukleotidové sondy (SSO). Schopnost rozlišení různých alel přítomných v amplifikovaném vzorku PCR je dána sadou použitých SSO, nikoli
uplatněnou metodou. Zatímco metody reverse dot blot a SSOP používají enzymy a kolorimetrické substráty vyžadující vytváření subsekvencí, metoda
LIFECODES představuje homogenní systém umožňující mnohonásobný rozbor. To znamená, že všechny SSO jsou analyzovány zároveň a celý test probíhá v
jediné reakční nádobě pomocí jediného reakčního činidla.
POSTUP
Proces typizace LIFECODES HLA-SSO je založen na hybridizaci jednovláknového specifického PCR produktu se sondou SSO. Amplifikace DNA pomocí PCR
využívá ekvimolární dávky obou primerů (forward a reverse primer) k vytvoření dvouvláknové DNA. Pokud však dávka jednoho z primerů převýší druhý, bude
výsledkem reakce kromě dvouvláknových produktů také několik jednovláknových DNA. Během prvních cyklů amplifikace LIFECODES je vytvořena
dvouvláknová DNA. Jakmile dojde k vyčerpání limitujícího primeru, použije druhý primer dvouvláknový produkt jako templát pro vytvoření jednovláknové DNA.
Touto metodou dojde k vytvoření dvou i jednovláknových produktů, které se po denaturaci budou společně podílet na hybridizační reakci.
Každá ze sond může být homologická s amplifikovanou DNA, která je jedinečná pro alelu nebo skupinu alel. Jinými slovy jsou tyto sondy vytvořeny tak, aby
každá z nich hybridizovala s upřednostňovanou komplementární oblastí, která může a nemusí být přítomna v amplifikované DNA. K tomu navíc amplifikovaná
DNA hybridizuje s jednou nebo více sondami odpovídajícími sekvencím přítomným ve všech alelách lokusu. Typizace SSO může být ovlivněna typem
biologického materiálu, metodou purifikace a množstvím a integritou genomové DNA. Z toho důvodu může signál získaný pomocí sondy sloužit jako ukazatel
úspěšnosti procesu amplifikace a hybridizace. Signál získaný pomocí konvenční sondy může být také použit k normalizaci signálu alelových sond a k úpravě
odchylek v množství amplifikovaného produktu v rámci hybridizační reakce. Rozbor výsledků získaných typizací SSO lze použít k určení přítomnosti či
nepřítomnosti konkrétních sekvencí DNA v amplifikované DNA a k identifikaci možných alel ve vzorku.
V případě typizace LIFECODES HLA-SSO jsou sondy vázány na mikrokuličky Luminex určené k použití s nástrojem Luminex. Je možné smíchat a pomocí
nástroje Luminex provést rozbor až 100 různých populací mikrokuliček, neboť jednotlivé populace mikrokuliček se od sebe liší pro každou populaci jedinečným
fluorescenčním znakem nebo barvou. Na různé barvy mikrokuliček lze navázat různé sondy SSO. Jednotlivé promíchané sondy lze tedy od sebe odlišit na
základě jejich spojení s konkrétní barvou mikrokuliček. Nástroj Luminex je také schopen určit množství produktů PCR hybridizujících s mikrokuličkami Luminex.
Z toho důvodu je možné použít signál získaný pomocí sond SSO během rozboru LIFECODES, stejně jako s jinými metodami SSOP, k označení sond s kladnou
nebo zápornou reaktivitou se vzorkem amplifikované DNA (viz Oddíl Výsledky). Budou tak získány informace potřebné k určení HLA-fenotypu vzorku.
Test „Nula 1“ slouží jako doplňující test určený k lepšímu rozlišení mezi analýzami LIFECODES HLA-A, HLA-B a HLA-C, a vyřešení alelické dvojznačnosti mezi
A*24:02/24:09N, B*51:01/51:11N a C*04:01/04:09N. „Nula 2“ slouží jako doplňující test určený k lepšímu odlišení analýzy LIFECODES HLA-DRB3,4,5, a
vyřešení alelické dvojznačnosti mezi DRB4* 01:03/DRB4* 01:03:01:02N a DRB5*01:02/DRB5*01:02/DRB5*01:08N
Sloučení informací získaných z analýz „Nula 1“ nebo „Nula 2“ s výsledky získanými pomocí odpovídajících lokus-specifických typizačních sad LIFECODES SSO
s cílem vytvořit doporučenou typizaci vzorku, je možné provést prostřednictvím ruční nebo softwarové analýzy. V případě ruční analýzy označuje informace
získaná z testu „Nula 1“ nebo „Nula 2“ přítomnost či nepřítomnost specifických nulových alel. Výsledek testu provedeného pomocí odpovídajících lokusspecifických typizačních sad LIFECODES SSO může být nejednoznačný z důvodu těchto nulových alel (např. A*24:02/24:09N, B*51:01/51:11N,
C*04:01/04:09N, DRB4* 01:03/DRB4* 01:03:01:02N či DRB5*01:02/DRB5*01:02/DRB5*01:08N). Pokud je nulová alela přítomna ve výsledku „Nula“, všechny
kombinace alel, které nezahrnují nulovou alelu, mohou být z výsledků získaných pomocí příslušné lokus-specifické typizační sady LIFECODES SSO vyřazeny.
V případě, že je alela ve výsledku „Nula“ nepřítomna, všechny kombinace alel, které zahrnují nulovou alelu, mohou být z výsledků získaných pomocí příslušné
lokus-specifické typizační sady LIFECODES SSO vyřazeny. V příbalovém letáku produktu a v softwaru je tento proces kombinování výsledků dvou produktů
označen jako slučování výsledků.
ČINIDLA
A. Identifikace
Úplný seznam katalogových čísel viz tabulky v části Činidla podle katalogového čísla.
B. Varování a upozornění
1.
2.
3.
4.
Test pro diagnostiku in vitro.
K manipulacím před PCR a po PCR použijte různé pipety.
Biologické riziko: Se všemi biologickými a krevními vzorky zacházejte jako s potenciálními zdroji infekce. Při manipulaci s takovými
vzorky se řiďte obecnými bezpečnostními opatřeními.
Ředící roztok, Probe mix, Taq polymeráza a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin obsahují zdraví nebezpečné složky. Zabraňte
kontaktu s kůží a s očima, likvidaci všech materiálů po použití provádějte v souladu s místními nařízeními a předpisy. Více informací
naleznete v Bezpečnostním listu (BL).
Strana 2 z 7
LC1287CECS.3 (02/14)
C. Pokyny pro uskladnění
1.
2.
3.
Vhodné skladovací teploty naleznete na štítcích umístěných na balení jednotlivých komponent.
Probe mix a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin jsou citlivé na světlo, CHRAŇTE JE PŘED SVĚTLEM a NEZMRAZUJTE.
Komponenty nepoužívejte po překročení data exspirace.
D. Purifikace a aplikace
Viz „Odběr a příprava vzorků“
E. Indikace nestability
1.
2.
Pokud se z roztoku během přepravy nebo uskladnění vysrážely soli, před použitím roztoku je znovu zcela rozpusťte pomocí spirálového
pohybu při pokojové teplotě (18 až 30 °C).
Nepoužívejte R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin, který během přepravy nebo uskladnění prošel bodem mrazu.
POŢADAVKY NA NÁSTROJE
1.
2.
Nástroj Luminex a platforma XY (Výrobky č. 888300 a 888310)
Termocykler vybavený vyhřívaným víkem, nastavitelnou dobou náběhu a doběhu, minimálním teplotním rozsahem od 2 °C do 100 °C a přesností alespoň
+/- 0,5 °C. Je možné, že podmínky pro termocyklery bude třeba změnit za účelem přizpůsobení konkrétnímu profilu. Teplotní profil získáte na telefonním
čísle technického servisu: +1 (203) 328-9500 nebo (888) 329-0255.
ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
Lidskou DNA lze purifikovat z plné krve, z buffy coat a z ústní sliznice pomocí schválených metod splňujících níže uvedená kritéria. DNA získaná z
krve uchované v EDTA a ACD (kyselina citrónová-citrát-dextróza) byla testována a prokázala vhodnost pro daný rozbor.
DNA získaná z krve a uchovaná v heparinu nemůže být pro tento rozbor použita. Další konzervační látky nebyly testovány.
Izolovaná DNA by měla být v 10 mM TRIS, pH 8,0 - 9,0, nebo ve vodě bez obsahu nukleázy. V případě přítomnosti chelatačního činidla jako je EDTA
nesmí konečná koncentrace chelatačního činidla překročit 0,5 mM
Přítomnost alkoholu, čistidel a solí může nepříznivě ovlivnit amplifikaci DNA.
Konečná koncentrace DNA by měla být 10 až 200 ng/µl.
Měření absorbance vzorku DNA při 260 a 280 nm by mělo dát poměr 1,65 až 2,0.
Vzorky DNA se mohou použít ihned po jejich izolaci nebo uskladnit až na 1 rok při teplotě –20 ºC. Vyhněte se opakovanému
zmrazování/rozmrazování, mohlo by dojít ke znehodnocení DNA.
POSTUP
A. Dodávané materiály (Více informací viz tabulky v části Činidla podle katalogového čísla).
•
•
Příslušná směs Master Mix (MX)
Příslušná směs/směsi Probe Mix (BM)
Ředící roztok (ŘR)
Tabulka prahových hodnot, tabulky výsledků detekce sondy (na
webové stránce)
•
•
B. Poţadované, ale nedodávané materiály, Činidla a vybavení (viz seznam nebo odpovídající typy)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
R-Phycoerythrin-konjugovaný streptavidin (SA-PE), 1mg/ml (kat. č.
628511 Lifecodes)
Luminex Sheath Fluid (1x číslo v katalogu Lifecodes: 628005)
Rekombinantní Taq polymeráza
Míchačka Vortex
Voda bez nukleázy, č. v katalogu Lifecodes: 757003, 20 ml)
PCR zkumavky a víčka (AB Gene® 0,2 ml Thermo Strip, č.
AB0451/G)
Termocykler (PCR), 96-jamkový systém (Costar® č. 6509)
Microseal™ filmu (Bio-Rad č. MSA-5001) nebo páska (Costar® č.
6524)
Termocykler (viz Požadavky na nástroje)
•
•
•
•
•
•
•
•
Sonikační lázeň (Fisher Scientific, č. FS15 nebo FS20)
Mikrocentrifuga
Špičky s filtrem
Kalibrační sady Luminex (kalibrační sada Luminex 100/200 a sada
pro ověření výsledku Luminex 100/200, katal. č. LIFECODES 628018
a 628019)
Pipetovací nástavce, vícekanálové pipety a špičky) (1-20 µl, 20-200 µl,
1000 µl))
Software umožňující zobrazení souborů s hodnotami oddělenými
čárkami (csv)
Topný blok (Fisher Scientific Standard Heatblock, č. 13259-030)
70% isopropanol nebo 20% bělidlo (čistící přípravek)
NÁVOD K POUŢITÍ
POZNÁMKY:
Probe mix a SA-PE jsou citlivé na světlo: chraňte před světlem a nezmrazujte.
Zahřívejte kuličky při 55 ºC až 60 ºC po dobu alespoň 5-10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily.
Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozpustily.
Při procesu rozpipetování dbejte zvýšené opatrnosti a používejte cejchované pipety. V opačném případě může dojít ke ztrátám
reakční směsi a zmaření vzorku.
Všechny teploty musí být přesně dodrženy a zachovány. I nízké výkyvy o např. +/- 0,5 °C mohou ovlivnit výsledek.
Ve stádiu hybridizace by neměly vzorky zůstávat v rozpuštěném stavu při 56 °C déle než 5 minut (viz oddíl Výsledky).
Doporučujeme provést rozbor amplifikovaných vzorků co nejrychleji. Pokud není možné zpracovat vzorky pomocí nástroje
Luminex v tentýž den, je možné uchovat amplifikovaný produkt před použitím po dobu až 3 dnů při teplotě 2-8 ºC. V
případě dlouhodobějšího uskladnění uchovávejte do okamžiku použití při teplotě –20 ºC po dobu až jednoho týdne.
Amplifikovaný produkt je možné zmrazit a rozmrazit pouze jedenkrát. Opakované zmrazování a rozmrazování způsobí
poškození amplifikovaných vzorků a v případě následného rozboru povede ke špatným výsledkům.
A. Purifikujte genomovou DNA pomocí zvolené metody; konečná koncentrace by měla být 10 až 200 ng/µl. V případě potřeby
doplňte vodou bez nukleázy. U všech vzorků udržujte podobnou koncentraci.
Strana 3 z 7
LC1287CECS.3 (02/14)
B. Amplifikace DNA (PCR)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Nechte Master Mix ohřát na pokojovou teplotu (18 °C až 30 °C).
Jemně míchejte spirálovým pohybem po dobu cca 10 vteřin. Bude tak zajištěna přítomnost solí v roztoku. Umístěte na krátkou dobu
(5 až 10 vteřin) na mikrocentrifugu, aby se obsah dostal na dno zkumavky.
Podle Tabulky 1 níže připravte komponenty k amplifikaci pro n+1 reakcí pomocí hodnot určených pro jednotlivé komponenty v rámci
reakce (kromě DNA). Pomocí vody bez nukleázy připravte konečný objem 50 µl na reakci. Jemně promíchejte spirálovým pohybem a
umístěte na led.
Pomocí pipety umístěte odpovídající množství genomové DNA (100 aţ 300 ng) do zkumavek PCR.
Pomocí pipety umístěte amplifikační směs do PCR zkumavek obsahujících genomovou DNA. (Celkový objem amplifikační směsi a
genomové DNA by měl být 50 µl na každou jednotlivou reakci.)
Zkumavky pevně uzavřete, aby nedošlo k úniku během PCR.
Umístěte vzorky do termocykleru a spusťte program, viz Tabulka 2
Tabulka 2.
Podmínky termocykleru pro účely amplifikace
Tabulka 1. Reakční komponenty pro amplifikaci
Sloţka
LIFECODES Master Mix
Genomová DNA
10-200 ng/µl
Taq polymeráza
Voda bez nukleázy
Mnoţství na reakci
PCR
15µl
Celkem ~200 ng
0,5µl (2,5U)
Až 50 µl konečného
objemu
Poznámka: Informace o amplifikaci vzorku naleznete v sekci Gelová elektroforéza produktu
(Příloha A).
95 ºC po dobu 5 min.
Počet cyklů: 1
95 ºC po dobu 30 vteřin
60 ºC po dobu 45 vteřin
72 ºC po dobu 45 vteřin
Počet cyklů: 8
95 ºC po dobu 30 vteřin
63 ºC po dobu 45 vteřin
72 ºC po dobu 45 vteřin
Počet cyklů: 32
72 ºC po dobu 15 min.
Počet cyklů: 1
C. Hybridizace
•
•
Ujistěte se, ţe sloţky hybridizačního pufru v LIFECODES probe mix jsou rozpuštěny, a ţe kuličky jsou důkladně rozpuštěny.
Zapněte nástroj Luminex a platformu XY a nechte je spuštěné po dobu 30 minut na zahřátí.
1.
Zahřívejte probe mix při 55 ºC až 60 ºC na termálním bloku po dobu alespoň 5 až 10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela
rozpustily.
Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozpustily.
Rozpipetujte 5 µl PCR pro konkrétní lokus do 96-jamkové destičky termocykleru (Costar® č. 6509).
Rozpipetujte 15 µl směsi do každé jamky. Jestliže rozpipetováváte směs do více než 10 jamek, jemně směs promíchejte spirálovým
pohybem po každých deseti jamkách. Destičku přelepte Microseal® filmu.
Proveďte hybridizaci vzorků za následujících inkubačních podmínek:
2.
3.
4.
5.
Tabulka 3. Podmínky termocykleru
pro hybridizaci
6.
7.
97 ºC po dobu 5 min.
47 ºC po dobu 30 min.
56 ºC po dobu 10 min.
56 ºC HOLD
Zatímco probíhá hybridizace vzorků, připravte směs SA-PE/ředícího roztoku v poměru 1:200. Smíchejte 170 µl ředícího roztoku (ŘR)
a 0,85 µl 1 mg/ml SA-PE na vzorek. Doporučujeme připravit dostatečné množství směsi ředícího roztoku pro n+1 vzorků pro případ
ztráty při pipetování. (Viz Tabulka 4)
Směs ředícího roztoku/SA-PE uchovávejte ve tmě při pokojové teplotě, SA-PE je citlivý na světlo! Ředící roztok je možné zahřívat na
teplotu 45 ºC po dobu 5 minut a promíchat spirálovým pohybem, aby byla zajištěna přítomnost všech komponent v roztoku. Před
vytvořením směsi musí mít ředící roztok pokojovou teplotu (18 až 30 °C). Připravte vše před pouţitím a zbývající dávku dejte
stranou.
Počet vzorků
Ředící roztok (ŘR)
SA-PE
1
170
µl
0,85 µl
Tabulka 4. Objemy pro přípravu
5
850
µl
4,25 µl
ředícího roztoku
10
1 700 µl
8,5 µl
20
3 400 µl
17 µl
50
8 500 µl
42,5 µl
Poznámka: NEPŘERUŠUJTE PROGRAM HYBRIDIZACE PŘED SEJMUTÍM DESTIČKY Z TERMOCYKLERU!
8. Při kroku 56 ºC HOLD, zatímco je destička na termocykleru, zřeďte každý vzorek pomocí 170 µl předem připravené směsi ředícího
roztoku/SA-PE. Všechny vzorky je třeba naředit během 5 minut (po 10 minut trvajícím kroku HOLD při 56 °C)
9. Sejměte destičku z termocykleru a umístěte ji do nástroje Luminex.
Strana 4 z 7
LC1287CECS.3 (02/14)
D. Proveďte analýzu vzorku pomocí nástroje Luminex*
Aby byly získané výsledky co nejlepší, rozbor vzorků pomocí nástroje Luminex proveďte ihned
1. Nástroj Luminex zapněte 30 minut až 4 hodiny před zahájením rozboru vzorků.
2. Před rozborem vzorků pomocí nástroje Luminex nastavte dávkovací běh (Batch Run) určený k rozboru vzorků.
a) Zvolte Create a New Batch (Vytvořit novou dávku) z nabídky File (Soubor).
•
Např. pokud provádíte rozbor Nula třídy I, přidejte dávku pro Nula třídy I.
•
Šablona dávky je k dispozici na webu a v tomto případě má název Nula1 xxxxxx (č. sady).
•
Upozornění: verze šablon jsou vytvořeny pro konkrétní čísla sad a odpovídají číslům sad probe mixu..
•
Podrobný postup vytváření dávek se objeví na obrazovce vytváření dávek.
•
Při vytváření názvu dávky nepouţívejte čárky, neboť informace následující po čárce zmizí při exportu dat.
•
Více informací o vytváření dávek a multi-dávek naleznete v uživatelské příručce Luminex
b) Klikněte na ikonu vysunutí, držák destičky se vysune. Umístěte 96-jamkovou destičku se vzorky určenou pro termocykler do
termálního bloku XYP umístěného na držáku destičky.
c) Klikněte na ikonu Zasunout. Vzorky jsou připraveny k rozboru. Před spuštěním cyklu je třeba provést napuštění.
d) Po vyjmutí vzorků z nástroje je třeba provést čištění nástroje pomocí 70% isopropanolu nebo 20% bělidla (čistícího přípravku pro
domácnost) s následným dvojím omytím. Pokud již nástroj nebudete toho dne používat, můžete jej nyní vypnout.
3. Po dokončení běhu budou data exportována v podobě hodnot oddělených čárkami (csv). Získané soubory mají název
‘OUTPUT.CSV’ a budou uloženy ve složce s názvem dávky. Data jsou poté k dispozici k provedení typizace, jak je popsáno níže.
*Informace o používání nástroje Luminex naleznete v uživatelské příručce Luminex, která obsahuje pokyny ke spuštění, kalibraci, údržbě a vypnutí.
VÝSLEDKY
Typizaci vzorků lze provést následujícím způsobem:
Otevřete vytvořené soubory CSV a získaná data zpracujte pomocí běžných tabulkových procesorů, jako jsou Microsoft Excel, Lotus 123, Corel
Quattro Pro apod. Rozbor probíhá v následujících krocích:
1) Zkontrolujte, zda je počet případů pro každý SSO v každém vzorku alespoň 60. Tuto informaci naleznete v DataType: oddíl Výpočet v
souboru CSV.
2) Určete, že hodnoty pro konvenční sondy pro jednotlivé vzorky se nacházejí nad minimální hodnotou jejich mediánu intenzity
fluorescence (MFI). Minimální prahové hodnoty se liší dle konkrétních sad a je možné je zjistit z tabulky prahových hodnot.
Upozornění:
•
Abyste získali spolehlivé výsledky, potřebujete zajistit dostatečné množství dat získaných pomocí nástroje Luminex.
•
Pro každý SSO získejte alespoň 60 případů.
3)
4)
Odečtěte kontrolní hodnotu pozadí pro jednotlivé sondy od hodnot vzorku a získejte tak soubor dat upravený na základě kontrolních
hodnot. Kontrolní hodnoty pozadí naleznete v tabulce prahových hodnot po jednotlivé sady. Hodnoty pozadí jsou průměrné hodnoty
MFI (mediánu intenzity fluorescence) pro jednotlivé kuličky, určené ke kompenzaci šumu pozadí způsobeného proměnlivostí kuliček.
Pro každý vzorek vydělte data upravená na základě pozadí pro jednotlivé sondy hodnotou upravenou na základě pozadí pro
odpovídající konvenční sondu a získejte normalizovanou sadu dat.
MFI (sonda) – MFI (kontrola pro sondu)
MFI (konvenční) – MFI (kontrola pro konvenční hodnotu)
5)
6)
Získané hodnoty pro jednotlivé sondy zaneste do pracovního listu v tabulce prahových hodnot.
Jakmile budou zaneseny všechny hodnoty, je možné porovnat vzorec výsledků detekce sondy (tj. kombinace všech kladných a
záporných zadání pro daný vzorek) s tabulkou (LC1024) obsahující detekované výsledky, která je k dispozici na webové stránce.
7)
Upozornění:
•
Pro každý lokus existuje zvláštní tabulka prahových hodnot.
•
Tabulky prahových hodnot jsou určeny pro konkrétní sady, ujistěte se, že číslo sady uvedené v tabulce prahových hodnot je
shodné s číslem typizační soupravy.
•
Pokud se stane, že normalizovaná hodnota pro konkrétní sondu stoupne nad maximální prahovou hodnotu v případě záporného zadání
a pod minimální hodnotu v případě kladného zadání, bude vzorek pro tuto sondu považován za neurčitý. Vzorky musejí být typizovány
tak, že se nejprve přijme záporná hodnota a poté kladná.
•
Více informací o prahových hodnotách naleznete v oddíle OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY.
KONTROLA KVALITY
Doporučujeme provést jednu zápornou a jednu kladnou kontrolu v rámci každého testu, jako je test pomocí vody a poté pomocí předem typizovaného vzorku.
Konvenční sondy SSO uvedené v tabulce prahových hodnot hybridizují s alelami příslušných lokusů. Hodnoty získané s konvenčními SSO z pozitivních kontrol
by měly mít vyšší než prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot.
Směsi Probe mix LIFECODES obsahují jednu nebo více konvenčních sond SSO identifikovaných v pracovních listech typizačních souprav. Tyto konvenční
sondy hybridizují se všemi alelami a chovají se jako interní kontroly sloužící k ověření amplifikace a potvrzení provedení hybridizací. Jestliže pro tyto SSO není
dosaženo minimální hodnoty, vzorek nemůže zajistit správnou typizaci a testování vzorku musí být provedeno znovu.
Rozbor je třeba provést podle doporučení uvedených v příbalovém letáku a dále pomocí jiných kontrolních postupů, které jsou v souladu s místními, státními a
federálními předpisy a/nebo předpisy institutu pro akreditaci.
Strana 5 z 7
LC1287CECS.3 (02/14)
OMEZENÍ POSTUPU
Podmínky PCR a popsané podmínky rozboru vyžadují přesné dodržení stanovených podmínek. Nedodržení těchto parametrů může mít za následek chybný
vzorek.
Všechny nástroje musejí být kalibrovány v souladu s doporučeními výrobce a předepsanými parametry.
1)
2)
3)
4)
5)
Před použitím je třeba kuličky předehřát a důkladně rozpustit. Tím je zajištěna přítomnost složek hybridizačního pufru v roztoku.
Inkubace při 47 ºC a 56 ºC vyžaduje vysoký stupeň přesnosti (+/- 0,5 ºC). Je třeba použít termocykler. Teplotu v 96 jamkách destičky
termocykleru je třeba kontrolovat pomocí termočlánku (např. Bio-Rad, Model VPT-0300 apod.). Rozdíl teplot v jamkách a mezi jednotlivými
jamkami by neměl překročit +/- 0,5 ºC.
Celková doba při 56 ºC nesmí překročit 15 minut. To zahrnuje 10-minutovou inkubaci a k tomu max. 5 minut určených k naředění všech vzorků
pomocí směsi ředícího roztoku/SA-PE.
Po rozpuštění je nutné provést rozbor vzorku během jedné hodiny (mimo dosah světla).
Nemíchejte komponenty z jiných souprav a sad.
Z důvodu složité povahy typizace HLA je nezbytné, aby kontrolu interpretace dat a typizaci provedl kvalifikovaný personál.
ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ
PROBLÉM
Nízký počet kuliček
MOŢNÁ PŘÍČINA
Směs Probe Mix nebyla důkladně rozpuštěna
Nástroj nefunguje
správně
ŘEŠENÍ
Probe mix předehřejte, sonikujte a spirálovým
pohybem promíchejte a zkoušku opakujte.
Proveďte kalibraci nástroje. (Viz uživatelská příručka
Luminex IS.)
Odstraňte a sonikujte jehlu. Proveďte zpětný proplach.
Pokud problém přetrvává, zavolejte Immucor
Transplant Diagnostics, Inc. na číslo:
(888) 329-0255
Zkontrolujte koncentraci a čistotu DNA.
Chybná kalibrace
Cesta toku vzorku je
zablokována.
Chyba prahových
hodnot CON
Amplifikace vzorku
neproběhla, nebo jen
slabě*
Nízký obsah DNA
Soli ve směsi Master Mix se
nerozpustily
Zahřívejte Master Mix při teplotě 37 ºC po dobu 5
minut, jemně promíchejte spirálovým pohybem a
nechte krátce ustát.
Používejte pouze rekombinantní Taq. Vyzkoušejte
Lifecodes č. 167075.
Spusťte tepelný profil na termocykleru a zkontrolujte,
zda parametry odpovídají předpisům.
Před použitím zahřívejte ředící roztok při 45 ºC po
dobu 5 minut a promíchejte spirálovým pohybem.
Skladujte při pokojové teplotě.
Vyměňte R-Phycoerythrin-konjugovaný streptavidin.
Slabá Taq polymeráza
Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry
Nízká hodnota střední intenzity fluorescence (MFI)
Množství špatných
SSO nebo vzorek
nesplňuje výsledek
typizace HLA
Amplifikace konkrétní
alely
Podmínky amplifikace nesplňují
dané parametry
Vzorek DNA byl kontaminován
DNA je částečně poškozena
Odpařování během hybridizace
Spusťte tepelný profil na termocykléru a zkontrolujte,
zda parametry odpovídají předpisům.
Znovu izolujte DNA z krevního vzorku.
Pokud nevyužíváte celou destičku, nechte jednu řadu
po každé straně vzorků prázdnou, aby bylo možné
destičku důkladně utěsnit.
*Amplifikaci PCR je moţné ověřit pomocí gelové elektroforézy (viz Příloha A).
OČEKÁVANÉ HODNOTY
Na každém lokusu je jedna sonda CON a dvě sondy SSO. Pokud vzorek obsahuje jeden z testovaných lokusů, sonda CON a alespoň jedna z obou SSO sond
pro daný lokus musejí být kladné. Hodnoty sond je možné označit za buďto kladné, nebo záporné. Ve vzácných případech se může hodnota nacházet mezi
hranicí pro kladný a záporný výsledek, a je pak považována za neurčitou. V případě, že vzorek obsahuje neurčité hodnoty pro konkrétní sondu SSO, je třeba
vzorek typizovat sondou jako záporný a poté jako kladný. Pokud jsou obě SSO sondy pro daný lokus neurčité, vzorek není možné typizovat a test musí být
proveden znovu.
•
Jak je uvedeno v oddíle Omezení postupu, je nezbytné přesně dodržovat protokol. Případné odchylky mohou mít za následek špatnou typizaci.
SPECIFICKÉ FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY
Pokud jsou typizační soupravy LIFECODES HLA SSO Nulová alela použity v souladu s postupem popsaným v příbalovém letáku, je možné stanovit typ HLA
třídy I a II ve vzorcích DNA. Výsledek testu HLA Nulové alely třídy I (Nula1) vykazuje 100% shodu (97,4% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus
A, 100% shodu (97,4% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus B a 100% shodu (97,4% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus C na
139 vyhodnocených vzorků ve srovnání s výsledky získanými obousměrným sekvenováním. Výsledek testu HLA-Nulové alely třídy II (Nula2) vykazuje 97,1%
shodu (92,7% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus DRB 4 a shodu 98,5% (94,8% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus DRB 5
na 137 vyhodnocených vzorků ve srovnání s výsledky získanými obousměrným sekvenováním.
LITERATURA
1.
2.
Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225
Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163
3.
4.
Strana 6 z 7
Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290
Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231
LC1287CECS.3 (02/14)
OMEZENÁ LICENCE
Tento výrobek není dodáván s Taq polymerázou a jeho součástí není ani licence k zahraničním patentům, kterou vlastní F. Hoffmann-La Roche Ltd. a Roche
Molecular Systems, Inc, umožňující provádění polymerázové řetězové reakce („PCR“ ) popsané v uvedených patentech. Pokud si přejete získat více informací o
potřebě získání licencí ve vaší zemi, kontaktujte F. Hoffmann-La Roche Ltd. nebo Roche Molecular Systems, Inc. Zakoupením tohoto výrobku získáte
omezenou nepřenosnou licenci zapsanou v USA pod patentovým číslem 5,981,180, nebo její zahraniční obdobu, která je majetkem Luminex Corporation, a
která vám umožní provádět vícenásobné rozbory klinických vzorků za účelem typizace HLA.
Výrobce: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké.
Tel.: +1 (203) 328-9599 nebo volání bez poplatku v USA, Kanadě a Portoriku 888-329-0255, Fax: +1.203.328.9599
Autorizovaný zástupce: Emergo Europe, Molenstraat 15, 2513 BH, Den Haag, Nizozemsko Tel.: +(31) (0) 70 345 8570,
Fax: +(31) (0) 70 346 7299
Technický servis pro Evropu: Tel: +32/3 385 4791
Poslední revize a vydání tohoto dokumentu: Rev. 3, 2014-02-19
POUŢITÉ OBCHODNÍ ZNAČKY
AB Gene®
Costar®
Microseal™
Luminex®
AB Gene House
Corning Incorporated
Bio-Rad Laboratories, Inc.
Luminex Corporation
IDNA® Agarose
GelStar®
LIFECODES®
Lonza Group, Ltd.
Lonza Group, Ltd.
Immucor Inc.
PŘÍLOHA A
Gelová elektroforéza
PCR reakce provedené prostřednictvím typizačních sad LIFECODES HLA-SSO jsou určeny k vytváření jak dvouvláknových, tak i jednovláknových produktů,
které představují dominantní produkty hybridizující s SSO. Za účelem zajištění dobré kvality či odstranění problémů může být nezbytné provést gelovou
elektroforézu s cílem ověření PCR reakce a přítomnosti amplifikované DNA.
Poţadované materiály (viz seznam nebo odpovídající výrobky)
•
•
•
Agaróza pro elektroforézu (Lonza Group, Ltd. IDNA® Agarose č.
50170)
Elektroforézní přístroj/zdroj energie
Gelový pufr - 1X (40xTAE, Promega č. V4281)
•
•
•
GelStar® Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. č. 50535)
UV transiluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. Model TM36)
Fotografický systém
Relativní migrace jednovláknových produktů závisí na koncentraci gelu a použitém pufru. Přibližné migrace pro jednotlivé amplifikace jsou uvedeny níže pro
vzorky v 2% agarovém gelu a pufru 1X TAE.
Podmínky elektroforézy
Vyjměte GelStar® Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. č. 50535) z mrazáku a nechte rozmrznout. Uchovávejte ve tmě.
Gel použitý pro tento postup musí být 2%, tj. na 200 ml gelu použijte 4 gramy agarózy a 200 ml 1X TAE (naředit z 40X TAE). Přidejte 10µl GelStar®
Nucleic Acid Stain, čímž agaróza získá tekutou podobu. Při rozlévání gelu je třeba nechat dostatek prostoru pro DNA (2,5 až 5 cm).
UPOZORNĚNÍ: GelStar ® je potenciální karcinogen.
POZNÁMKA: Místo GelStar® Nucleic Acid Stain je možné použít gely s 20 µl ethidium bromidu 10mg/ml. V gelech s ethidium bromidem bude výsledný produkt
zastoupen méně výrazně než v gelech s GelStar®. UPOZORNĚNÍ: Ethidium bromid je známý karcinogen.
3. Gely uložte na tmavé místo a nechte je ztuhnout.
4. Použijte směs 2,5 µl každého PCR produktu a 2,5 lL 2X pufru se zřejmým zbarvením na vzorek a na amplifikaci. Umístěte gel na tmavé místo při cca 160
voltech na 45 minut, nebo dokud nebude ve vzorku možné pozorovat oddělené pásky jedno a dvouvláknového produktu (modrý bromofenol nebo jiný
marker migruje 2,5 až 5 cm od jamek).
5. Vyfotografujte pomocí UV transiluminátoru za použití žlutého fotografického filtru GelStar® (Lonza Group, Ltd. č. 50536).
UPOZORNĚNÍ: Při práci s GelStar® Nucleic Acid Stain nebo ethidium bromidem a při fotografování gelu pomocí UV transiluminátoru pouţívejte
ochranné pomůcky.
6. Rozbor gelu
1.
2.
Nula třída
1
~210,
~280
~150,~180
Dvě vlákna (bp)
Jedno vlákno (bp)
Nula třída
2
~180,
~280
~140,~180
Interpretace gelu
Amplifikace proběhla
Amplifikace neproběhla
Jamka
Dvouvláknová DNA
Jednovláknová DNA
------- (jasný výsledek)
------- ( méně jasný výsledek)
Pásmo primeru
Strana 7 z 7
LC1287CECS.3 (02/14)