Johnsons levá

MS - historie a současnost
Příprava předmětu byla podpořena
projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Spřažené metody pro analýzu léčiv
N 402062
GC MS
Pavel Zachař
Hmotnostní spektrometrie
• Vývoj hmotnostní spektrometrie – instrumentace
• EI spektra – vznik, principy
• Interpretace EI spekter
Doporučená literatura
• • H.C.Hill: Introduction to Mass Spectrometry, Heyden & Son
Ltd, London 1972
• • Spektroskopická společnost JMM: Organická hmotnostní
spektrometrie, studijní materiál 4. školy hmotnostní
spektrometrie, Praha 1996
• • Fred W. McLafferty, František Tureček: Interpretation of
Mass Spectra, University Science Books, California 1993
Fourth Edition
• • Terrence A. Lee: A Beginner´s Guide to Mass Spectral
Interpretation, John Wiley & Sons, Chichester1998 Reprinted 2003
Doporučená literatura - pokračování
• Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant: Mass
Spectrometry, Principles and Applications, John Wiley &
Sons, Chichester, Second edition 1999,
Reprinted 2002
• Budzikiewiczh., Djerassi C., William D.H.:Interpretation of
Mass Spectra of Organic Compounds - ruský překlad,
ústav 342
• McLafferty F.W.: Interpretation of Mass Spectra
(N.Y.1967) – ústav 342
• Bohm S., Smrčková – Voltrová S.: Strukturní analýza
organických sloučenin, VŠCHT
Hmotnostní spektrometrie
Vývoj MS, instrumentace
Základy pro vznik MS
Druhá polovina 19. století:
•intenzivní studium elektřiny a magnetismu
•studium elektrických výbojů ve zředěných plynech
•mechanické vývěvy Sprenglerovy a Töplerovy (10-3 Torr)
•1858 – objev katodových paprsků (1897: jsou to elektrony)
•1883 – thermoemise – tepelná emise elektronů a iontů
•1886 – anodové („kanálové“) paprsky – kladně nabité
částice (E. Goldstein při studiu výbojů v plynech)
Počátky MS
1898 Wilhelm Wien, NP 1911
Emil Wiechert
zakřivení dráhy anodových (kanálových) paprsků, tj.
urychlených kladných částic – iontů, v elektrickém a
magnetickém poli:
Wienův filtr – vzájemně zkřížená pole (B,E) napříč k pohybu
nabité částice umožní zachování přímé dráhy jen iontu
určité hmotnosti
při změnách elektrického pole zachovají přímý směr
částice různé hmotnosti
Vlastnosti příčného magnetického pole
Lorentzova síla F = q . (v x B)
Flemingovo pravidlo levé ruky
Rovnováha odstředivé síly
(částice m, rychlosti v) a síly
dostředivé (Lorentzovy)
způsobí kruhový pohyb (r)
m v2/ r = q.v.B
r = m.v / ze . B
Dispersní vlastnosti magnetického pole
Dispersní vlastnosti optického hranolu
Fokusační vlastnosti magnetického pole
Fokusační vlastnosti spojné čočky
Joseph John Thomson
1910 - parabolový spektrograf - záznam na foto. desku
vzájemně rovnoběžná pole B a E, příčná k pohybu iontu
„Thomsonovy paraboly“ – částice mající stejný
specifický náboj a různou rychlost
1913 – důkaz existence izotopů 20Ne, 22Ne –
první důkaz existence izotopů neradioaktivních prvků
Joseph John Thomson - „otec MS“
Benjamin Thompson, hrabě Rumford:
1753 - 1814, termodynamika
Thomas Thomson:
1773 - 1852, Skot, lékař a chemik – pedagog
William Thomson, lord Kelvin,
1824 - 1907, Skot, kalorimetrie - absolutní teplota, JouleThomsonův jev, zrcátkový galvanoměr, transatlantický kabel
Joseph John Thomson, Sir:
1856 - 1940, objev elektronu, částicová fyzika, NP 1906
Cavendishova laboratoř (Cambridge), Aston, Záviška
Georg Paget Thomson, Sir:
1892 – 1975, syn J.J., difrakce elektronů, NP 1937
B a E rovnoběžné
Joseph John Thomson
1912 - parabolový spektrometr - Faradayova klícka, elektrometr,
postupná registrace iontů
zjištění existence „fragmentových iontů“ – význam až za 50let!
„Rays of Positive Electricity and Their Application to
Chemical Analysis“
butan
Francis William Aston
GB, 1877 – 1945, NP- chemie: 1922
1919 – hmotový spektrograf
zdroj iontů: výbojová trubice – rozptyl rychlosti částic
rychlostní fokusace – příčné elektrické pole
disperse a směrová fokusace– konstantní magnetické
pole
detekce – fotografická deska – „hmotové spektrum“
záznam všech dopadajících iontů najednou
Arthur Jeffrey Dempster
USA, 1886 – 1950
1918 – hmotový spektrometr
zdroj iontů: thermoionisace – malá rychlost iontů
podélné elektrostatické pole (proměnné)
uděluje stejnou rychlost iontům (původní
zanedbatelná)
magnetické pole (konstantní)
směrová fokusace rozbíhavého svazku iontů,
disperse iontů dle efektivní hmotnosti m/z.e
konstantní výstupní štěrbina – elektrometrická detekce závislost náboje (proudu) na parametrech B a E
Dempster – konstantní B, proměnné E
dnešní přístroje – konstantní E, proměnné B
Rovnice spektrometru
m / ze = r 2 . B2 / 2U
m/ze - efektivní hmotnost
jednotlivé body – dopad iontů při daných parametrech B a E
Vývoj a využití MS – 2. etapa
• 20. a 30. léta 20. století
stanoveny stabilní isotopy všech prvků
(MS jediná známá metoda stanovení izotopů
neradioaktivnívh prvků)
spektrografy – přesné stanovení hmotností
spektrometry – stanovení zastoupení isotopů
(společný název spektroskopie)
1935 – Aston: „MS se vyčerpala, nepřinese nic nového“
Další vývoj MS – 3. etapa
40. léta: fragmentace organických molekul
Fragmentové ionty charakteristické, slouží k identifikaci.
petrochemie - nízké ropné frakce (letecký benzin)
„fingerprint“ – porovnání bez porozumění spektru
typová analýza – skupinové zastoupení uhlovodíků
(alkany, alkeny, uhlovodíky větvené, aromatické,...)
naftařské koncerny – komerční přístroje (během 10 let
bylo vyrobeno 100 přístrojů)
3. etapa - pokračování
50. a 60. léta – MS organických látek - čisté látky!
ionizace EI, fragmentace molekul, teorie a mechanismus
reakcí iontů v plynné fázi, ionizační potenciály látek, teorie
fragmentace org. molekul, metastabilní ionty (J.Hipple
1947)
V předchozí etapě – fyzikové - konstruktéři
V této etapě nastupuje nová generace pracovníků - chemiků
spojení fyzikální + organické chemïe
Osobnosti organické hmotnostní spektrometrie
J. Beynon (ICI - Imperial Chemical Industries, GB)
K. Biemann (Massachussets Institute of Technology, USA)
H.Budzikiewicz (Universität zu Köln, BRD)
C.Djerassi (Stanford University, USA)
F.W.McLafferty (Cornell University, Ithaca, USA)
H.Kienicz, D.H.Williems, ....
Djerassi:
MS vývoj ukončen, aplikační možnosti vyčerpané !?!
Hmotnostní analyzátory
• jednofokusační MS – nízké rozlišení
Dempsterova konstrukce
rychlostní fokusace: podélné E – dnes konstantní
směrová fokusace a disperse: příčné B – dnes proměnné
rovnice spektrometru m/z.e = r2. (B2/2U) (m/z.e...efekt. hmot.)
m/z = (r2 /2U) . B2 = konst . B2
• dvoufokusační MS – vysoké rozlišení (elementární složení)
odstranění chromatické vady – filtr energií, příčné elstat. pole
konstrukce: 1934 Mattauch- Herzog – fokus. pro všechny m/z
1953 Nier – Johnson – fokusace pro jednu hmotu
další konstrukce: Matsuda a inversní uspořádání
Typy hmotnostních analyzátorů
Statické MS – stanoven 1 ion při konstantním magnetickém
(resp. i elektrostatickém poli)
Dynamické MS – k stanovení 1 iontu nutná proměnná
vysokofrekvenční eltr. pole (nemusí být magnetické pole)
1899 Wiechert, Kirchner – metoda dvou kondenzátorů –
první dynamický analyzátor hmot
Dynamické analyzátory - 1:
A. Selektivní urychlovače (a decelerátory- zpomalovače)
1. lineární - van de Graffův urychlovač aj.
2. lineární periodické – (kmitavý oscilační pohyb)- paletron aj.
3. rotační periodické: (+ příčné magnetické pole)- cyklotron aj.
B. Průletové analyzátory (TOF – time of flight)
1. lineární – nemagnetické
2. cyklické – magnetické (prostorová spirála)
Lineární průletový analyzátor
(TOF) s iontovým reflektorem
Dynamické analyzátory – 2:
C. Systémy se stabilní drahou (1 iontu - ostatní nestabilní):
1. W.R.Smythe, J.Mattauch (1932) – 1. nemagnetický MS
vysokofrekvenční filtr rychlostí (kondenzátor)
elektrostatický filtr energií (cylindr)
2. Kvadrupólový hmotnostní filtr
W.Paul, H.Steinwedel (1953)
W.Paul, H.P.Reinhard, U. von Zahn (1958)
4 souosé parabolické (kruhové) tyče
superpozice statické a vf. složky napětí U+Vo cos ωt
není citlivý na rozptyl počátečních energií
Kvadrupólový
hmotnostní filtr
Dynamické analyzátory – 3:
Systémy se stabilní drahou – pokračování
3. Iontová past – ITD – „trojrozměrný kvadrupól“
hyperboloidní prstenec, 2 hyperboloidy
W. Paul (1953) – počátky
iontově selektivní detekce (1953 – 1962)
selektivní uchovávání iontů (1968 – 1982)
selektivní vypuzování iontů (od r. 1984)
velká citlivost (pg, fg)
Iontová past
Hmotnostní analyzátory – využití
Jaderná fyzika – studium elementárních částic (CERN – 1954
Evropská laboratoř pro fyziku částic 6,5tis. vědců, 500
universit, 80 národností; urychlovač - kruh 27 km)
• selektivní urychlovače
• průletové analyzátory
Organická hmotnostní spektrometrie:
• statické hmotnostní spektrometry (magnetický sektor)
• kvadrupólový hmotnostní filtr
• iontová past
• TOF - lineární průletové analyzátory
Spojení GCMS – 4. etapa vývoje
J.C.Holmes, F.A.Morrel (1957)
podmínky spojení GC a MS:
• srovnatelné nároky na množství vzorku
• rychlost snímání MS srovnatelná s šířkou píku GC
limitující faktor GC – těkavost
limitující faktor MS – rychlost snímání a záznamu spektra
(sektor – kvadrupól)
GC – atmosférický tlak...x...MS – vakuum:
náplňové kolony – separátory
kapilární kolony – přímé spojení
Becker- Ryhageho
separátor
Spojení GC-MS
20 let (šedesátá až osmdesátá léta) jediné spojení
separačních metod a spektrální identifikace
využití – analýza bohatých přírodních i průmyslových
směsí organických látek, stopová znečištění
produktů - farmaceutický průmysl, toxikologie,
potravinářství
70. –80. léta
• spojení kvadrupólový hmotnostní filtr a GC
zrychlení analýzy (proti sektorovému MS) - výhodné
spojení s kapilární GC
zmenšení přístrojů, zlevnění – rozšíření do praxe
• ITD - iontová past
snížení požadavků na množství analytu – pg, fg
výhodné využití pro stopovou analýzu ve spojení GC MS –
analytika životního prostředí
Spojení HPLC-MS – 5. etapa
Hlavní podmínka spojení HPLC-MS:
nutnost redukce velkého objemu plynné fáze po odpaření
kapalné mobilní fáze (redukce tlaku pro MS bez ztráty
citlivosti přístroje)
Baldwin, McLafferty (1973)
McFadden a spol.(1976) – pohyblivý pás
Další vývoj vyžadoval nové ionizační techniky
Stávající ionizační techniky - přehled
Původní způsoby ionizace
EI v plynné fázi („tvrdá“ ionizační technika)
termoionizace
jiskra, oblouk
FD a FI – desorpce a ionizace polem
CI – chemická ionizace ( „měkká“ ionizační technika )
Munson, Field (1966)
Barber (1982) – FAB – Fast Atom Bombardment
Nové ionizační techniky pro HPLC-MS
Blakley, Vestal (1983) – thermosprej (TSI)
prudké odpaření vzorku, FD, CI/EI
Willoughby, Browner (1984) – „particle beam“
zmlžení mobilní fáze heliem, odpaření teplem, tryskový
separátor, odsátí mobilní fáze do vakua
Fenn (1984) – elektrosprej (ESI)
vysoké napětí mezi tryskou a pláštěm, kapky vystřikovány
proti proudu dusíku - není topeno
Využití:
analýza tepelně labilních látek a velkých molekul, které
nejsou spojením GC MS analyzovatelné
(cukry, peptidy) – expanze MS do biochemie, medicíny aj.
Další ionizační techniky – 6. etapa MS
MALDI - Hillenkamp, Karas (1989) ve spojení s TOF
Matrix Asisted Laser Desorption and Ionisation
UV (IČ) pulsní laser, molekuly analytu v matrici dostatečně
separovány, není intermolekulární působení, analýza velkých
(i termolabilních) molekul, možné spojení s TOF (velké
molekuly – delší doba letu)
Nové oblasti využití:
analýza biologických materiálů – polypeptidy, bílkoviny –
sekvence aminokyselin (DNA aj.)
Vývoj nových analyzátorů pokračuje
Analyzátory iontové mobility
•analyzátor iontové mobility umožňuje rozlišit ionty na základě
velikosti, tvaru, náboje a hmotnosti
•využívá rozdílů pohyblivosti iontů v oblasti s el. polem v
inertním plynu (asi 10-3 Pa)
Tandemová hmotnostní spektrometrie
(MS/MS a MSn analýza)
Pro MS/MS, tj. MS2 musíme mít za sebou tři kvadrupóly:
QqQ nebo QqTOF
•první kvadrupól (Q) – slouží jako filtr pro výběr určitého iontu
hmotnostního spektra získaného v iontovém zdroji rozpadem
ionizované molekuly
•druhý kvadrupól (q) – slouží jako kolizní cela pro srážky s
inertním kolizním plynem, čímž dojde k dalšímu definovanému
rozpadu tohoto iontu (na tento kvadrupól je zavedeno pouze
střídavé napětí a je naplněn kolizním plynem)
•třetí kvadrupól (Q) nebo TOF - slouží jako analyzátor pro záznam
hmotnostního spektra získaného rozpadem vybraného iontu
Qq
Q
QqTOF
GC-MS/MS TripleQ (QQQ)
Technika GC-MS/MS 3Q je určená pro analýzu stopových koncentrací nečistot
v komplikovaných matricích. Hlavní uplatnění proto nachází při analýze
stopových kontaminantů v potravinách, v analýze biologických vzorků, vzorků
extrahovaných z pevných matric apod. Pro analýzu těchto typů vzorků
předurčuje trojitý kvadrupol jeho schopnost vybrat z komplikované směsi
iontů pouze jeden zvolený iont a ten následně rozštěpit v kolizní cele
("druhém kvadrupolu") a výsledek této fragmentace analyzovat pomocí
třetího kvadrupolu. Tento proces dramaticky sniží šum základní linie a zvýší
tak poměr signál/šum (S/N=citlivost). Přestože absolutní úroveň signálu je ve
srovnání s jednoduchým kvadrupolem nižší (složitější dráha iontu do
detektoru), odstranění šumu je u komplikovaných vzorků tak významné, že
výsledná citlivost (S/N) je několikanásobně vyšší než u jednoduchého
kvadrupolu.
Základem kvalitního kvadrupolového analyzátoru jsou elektrodové tyče
hyperbolického průřezu. Výsledkem je stabilní RF pole, které umožňuje
vysokou propustnost iontů (positivně ovlivní citlivost) a stabilní trajektorii
iontů (zvýší rozlišení).
Využití MS
Minimalizace rozměrů – detektory netěsností, specifické
detektory (Ion Mobility Spectrometry)-armáda, kosmos
Maximalizace rozměrů – tandemové přístroje (MSn) – studium
fragmentace organických látek, nanosekundových dějů aj.
Oblasti využití MS a spojení MS a separačních technik:
fyzika elementárních částic, anorganická chemie, geologie,
speciační analýza prvků, organická chemie, farmacie,
potravinářská chemie, zemědělství, chemický průmysl,
petrochemie, odpadové hospodářství, stopová analýza,
analytika ŽP, zdravotnictví, biochemie, proteomika
Dnes nejužívanější techniky v chemii
• GC MS – EI/CI: běžné těkavé tepelně stálé organické látky
strukturní informace, srovnání s knihovními spektry
• HPLC MS – ESI/APCI: velké (nevypařitelné) a tepelně labilní
molekuly, šetrná ionizace – biochemie
• MALDI TOF: proteomika
• ICP MS: prvková analýza (spojení s GC/HPLC – speciace)
• GC /LC MS 3Q (QqTOF): ultrastopová, především
kvantitativní, analýza ve všech oborech (potraviny, léčiva,
biologické materiály, životní prostředí aj.), zejména při
zpracování vzorků z komplikovaných matric
Československá
hmotnostní spektrometrie
50. léta – nákladné přístroje ještě neovlivňovaly úroveň
1953 – první čs. MS vlastní konstrukce, srovnatelný se
světem (USA, GB aj.) – Ústav fyzikální chemie ČSAV
V.Čermák, V.Hanuš, Č.Jech, J.Cabicar;
později Z.Dolejšek, Z.Herman
V.Čermák – iontově molekulové reakce,
Peningovská ionizace
V.Hanuš – „nestor čs. MS“– organická MS
MS alkaloidů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR ÚFCH ČSAV (1954-1957)
První využití
- izotopická analýza 15N/14N biologických experimentů
- analýza vzácných plynů, čistota vzácných plynů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR ÚFCH ČSAV (1954-1959)
přístroj Nierova typu
R = 152 mm
m/∆m ≈°130-200
spektrum isotopů Hg
(prosinec 1953)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR DEMPSTEROVA TYPU
Zdeněk Dolejšek: diplomová práce 1956-57
- úhel odklonu 1800 v permanentním
magnetickém poli
- m/∆m ≈ 30
1973 JEOL JMS-D100
m/∆m > 10 000
VLADIMÍR HANUŠ
1973 - 87
František Tureček
1987 – 92
Martin Smrčina
1992 M. Polášek
Objasňování struktury organických a
bioorganických látek
chemie (K. Mach – organometal.komplexy)
biologie (přírodní produkty)
medicina (metabolity)
farmacie (syntéza léčiv)
toxikologie (klinické případy)
Československá
hmotnostní spektrometrie
1967 – 8x MCH 1303 (130, 1306), 2xAtlas, 1x Jeol
VŠCHT Praha MCH 1303 (SSSR)
LKB 9000 (Švédsko) – 1. GCMS v ČSR
ÚMCH ČSAV, FCHT VUT Bratislava – AEI MS 902
(dvoufokus.)
1978 – v ČSR 44 přístrojů
2000: 18th International Meeting on MS
(F.W. McLafferty-N.Y., F.Turecek – Washington)