Rekombinantní alergeny

O alergenOVÉ
imunoterapii
Č. 26 – červen 2007
Rekombinantní alergeny:
důležité otázky v roce 2006
Klinická problematika
Sublinguální desenzibilizace
v pediatrii
Vážená paní doktorko, vážený pane doktore,
je mi potěšením předložit Vám 1. číslo vědecké revue Expressions v češtině.
Jak víte, přípravky STALLERGENES jsou
v České republice přítomny od roku 1997.
Během posledních 10 let jsme vytvořili silnou vazbu na alergologickou komunitu. Naším nepřetržitým záměrem vždy bylo
navrhovat Vám poslední inovace a přípravky nejvyšší kvality pro léčbu Vašich alergických pacientů.
Společnost STALLERGENES se též rozhodla posílit od ledna 2006 svou přítomnost
v České republice otevřením vlastní pobočky a propagací svých přípravků prostřednictvím vlastních obchodních zástupců. Naším
cílem je přiblížit se Vám a lépe pochopit Vaše
potřeby a praktické postupy. Tímto způsobem Vám chceme nabídnout veškeré informace a služby pro to, abyste mohli pro své
pacienty navrhnout nejvhodnější a dobře přizpůsobené způsoby léčby.
Obsah
­n Vědecká problematika
3
­n Klinická problematika
6
­n ­Přehled publikací 8
Rekombinantní alergeny:
důležité otázky v roce 2006
Sublinguální desenzibilizace v pediatrii Jako jeden z praktických výsledků Vám nabízíme Expressions ve Vašem jazyce. Víme, že
většina z Vás „Expressions“ dobře hodnotí a že byste ocenili možnost jejich čtení ve
vlastním jazyce. Nyní se to stává skutečností
a my jsme tomu velmi rádi. Neváhejte nám
poskytnout svou zpětnou vazbu a případně
navrhnout články pro další čísla.
Sébastien IVA
General Manager STALLERGENES
Česká republika
a Slovenská republika
Expres­sions Stallergènes, oddělení marketingu
Vedoucí vydání: Julie Badoche Šéfredaktoři: Michèle Lhéritier-Barrand,
Lise Lemonnier Zástupce šéfredaktora: Chantal Didiot Redakční rada: Victor Alvà,
Olivier de Beaumont, Riad Fadel, Franco Frati, José-Luis Justicia, Michèle Lhéritier-Barrand,
Philippe Moingeon, Paola Puccinelli, François Saint-Martin, Jochen Sieber, Thao Tran Xuan
Grafická úprava: Ektopic Adaptace a produkce: Signature s.r.o. Odpovědní redaktoři: Christiane
Mura, Arielle le Masne Sekretariát redakce: Catherine Huzer, Estelle Pasquier
Vydavatel: Stallergènes, 6 rue Alexis de Tocqueville – 92183 Antony Cedex, France
VùdeckÁ problematika
Rekombinantní alergeny:
důležité otázky v roce 2006
Díky metodám molekulární biologie (klonování a sekvenování) bylo do současné doby identifikováno a charakterizováno více než 500 alergenů. Následkem toho lze přírodní biologické
extrakty používané v diagnostice a terapii nahradit rekombinantními alergeny získanými metodami genetického inženýrství.
Od přirozených extraktů
k rekombinantním vakcínám
­ vorba rekombinantních alergeT
nů biotechnologickými metodami otevírá cestu k novým způsobům desenzibilizační léčby.
S
pecifická alergenová imunoterapie (SAIT) je jediným kauzálním
způsobem léčby chorob vznikajících na základě IgE mediované
přecitlivělosti (tj. I. typu alergické reakce).
Účinnost SAIT byla prokázána zejména
v léčbě alergické rinitidy, mírného až středně těžkého astmatu a přecitlivělosti na jed
blanokřídlého hmyzu.
Přirozené extrakty jsou složité
proteinové směsi
V současné době spočívá SAIT v subkutánním nebo sublinguálním podávání
rozpustných extraktů připravených z přirozeného zdroje alergenů (zdroje: kultury
roztočů domácího prachu, pyly, plísně,
buňky živočišného epitelu atd.). Tyto
alergenové extrakty jsou ve skutečnosti
složité proteinové směsi obsahující kromě hlavních a vedlejších alergenů také
celou řadu biologicky neúčinných složek,
jako jsou další nealergenní proteiny, glykoproteiny a sacharidy. Heterogenita
alergenových extraktů získaných z přírodních zdrojů vyžaduje provedení specifických standardizačních postupů pro
zajištění jednotnosti mezi jednotlivými
šaržemi.
Standardizace je založena
především na stanovení
celkové vazebné kapacity extraktu na IgE (tj. na
celkové alergenní aktivitě).
K upřesnění profilu proteinů přítomných v extraktu jsou v současné době
používány nové technologie (SELDITOF, 2D gelová
elektroforéza a PF2D). Uvedené metody nejsou kvantitativní, a proto nemohou
sloužit za základ kalibrace
nebo kontroly kvality farmaceutických šarží [1].
­ lavní charakteristiH
ka rekombinantních
alergenů
­g ­Perspektivy
budoucího využití
rekombinantních alergenů v terapii
Evropská multicentrická studie s použitím subkutánního podání poprvé ukázala, že rekombinantní alergeny
(a zejména Bet v 1) jsou stejně účinné jako přirozené
alergeny [2]. Nyní probíhají klinické studie sublinguálních tablet Bet v 1. Optimalizace volby adjuvans
a úprava formy alergenu by měla přinést další výrazné
zlepšení léčby respiračních alergií. Na tomto základě
jsou vyvíjeny „alergeny se zvýšenou účinností“, s cílem
definovat prototyp rekombinantní sublinguální léčby.
Vlastnosti
Rekombinantní
alergeny mají ve srovnání s alergenními
extrakty četné výhody [1]:
-precizní charakteristika na molekulární
a imunochemické úrovni;
- vysoký stupeň purifikace;
- snadná standardizace;
- umožnění přesnější diagnostiky a léčby.
Přírodní nebo hypoalergenní?
Rekombinantní alergeny známé jako „alergeny přírodního typu“ se připravují tak, aby
ve všech svých detailech napodobovaly přirozené alergeny. Alergeny „hypoalergenní“
jsou na rozdíl od nich pozměněny přímou
Hlavní výhodou
užití rekombinantních
alergenů je
jejich čistota,
reprodukovatelnost, sledovatelnost
a výtěžek.
3
VùdeckÁ problematika
­Strategie SLIT
je založena na
použití nativní
konformace
rekombinantních alergenů,
která umožňuje
jejich rozpoznání a vychytávání
dendritickými
buňkami
Langerhansova
typu přítomnými v ústní
sliznici.
mutagenezí či modifikací jejich trojrozměrné
struktury tak, aby se snížila jejich vazebná
kapacita na IgE.
Užití hypoalergenních forem alergenů by
teoreticky mělo vést ke zvýšení bezpečnosti léčby podávané subkutánně. Možnost jejich užití v sublinguální terapii není
zatím jednoznačně potvrzena. Při SLIT se
zdá být výhodnější prezentace rekombinantních alergenů v přirozené konfiguraci,
vzhledem k tomu, že na úrovni sublinguální sliznice je na jedné straně přítomno
málo mastocytů a na druhé straně rozpoznání alergenů prostřednictvím IgE molekul umožňuje využití Langerhansových
dendritických buněk typu FcεRI+, schopných tvorby TGF-ß a IL-10 [3].
Způsoby přípravy rekombinantních alergenů
Z výchozího zdroje alergenů je izolována
informační RNA (mRNA), která je použita jako templát pro odpovídající syntézu
komplementární DNA (cDNA) (obrázek 1).
Dalším krokem je PCR (polymerasová řetězová reakce) amplifikace genového kódování pro identifikovaný alergen (seznam je
k dispozici na www.allergome.org). Daný
gen se poté vloží do příslušného vektoru, obecně plasmidu, pro umožnění jeho
exprese v hostiteli.
Různé hostitelské systémy
4
purifikuje s použitím vhodných chromatografických metod.
Míra specifikace a standardizace rekombinantních alergenů je teoreticky mnohem vyšší než u alergenních extraktů.
Týká se homologie, čistoty, koncentrace
alergenové aktivity a potencionální hladiny kontaminace.
Adjuvantní a galenické přípravky
Vysoce purifikované nebo rekombinantní
proteiny jsou málo imunogenní. Přídatný
signál (ko-signál) pro imunitní buňky, nutný k vyvolání příslušné imunitní odpovědi,
zabezpečíme doplněním vhodného adjuvans [1, 4].
Latinské ‘adjuvare’ znamená „pomáhat“;
adjuvantní prostředek lze proto definovat
jako jakoukoliv biologickou či syntetickou
molekulu, která je v kombinaci s antigenem
schopna modulovat imunitní odpověď.
Výhody užívání adjuvantních
prostředků
Použití adjuvans má řadu cílů:
- zvýšit účinnost vakcíny;
- umožnit snížení dávek se zachováním účinnosti;
- zjednodušit způsob podávání.
Jaký adjuvantní prostředek je
vhodné zvolit?
Prokaryotní systémy exprese, jako jsou
bakterie (Escherichia coli), poskytují rekombinantní proteiny bez jakékoliv
posttranslační modifikace. Proto lze ve
většině případů levným, snadným a rychlým způsobem obdržet alergeny, jejichž
reaktivita je srovnatelná s reaktivitou
nativních alergenů.
V případech, kdy je požadována zvláštní prostorová konformace či posttranslační modifikace, jako je glykosylace, lze
použít eukaryotní systémy exprese, jako
jsou kvasinky (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), hmyzí Bakulovirus
a různé rostliny, jako je tabák (Nicotiana
tabacum) nebo ječmen. Tyto systémy
však nemusí vyvolávat glykosylaci identickou s nativním glykoproteinem. Volba
systému exprese tedy závisí na požadované povaze proteinu, který má být exprimován, a na jeho dalším použití.
Úloha regulačních T buněk a imunosupresivních cytokinů (IL-10 a TGF-ß) jako mediátorů normální imunitní odpovědi na alergen
i v průběhu SIT je dobře známa [5].
Vhodnými kandidáty na adjuvans jsou
proto látky schopné indukovat tolerogenní dendritické buňky a/nebo T regulační lymfocyty [1, 4]. Pro výběr kandidátů
adjuvantního prostředku byly vypracovány
humánní modely (společná kultivace dendritických buněk odvozených od monocytů a T lymfocytů) a živočišné modely
(myši Balb/C senzibilizované vaječným
albuminem) (obrázek 2). Výsledky naší
práce ukazují, že kombinace 1 a, 25-dihydroxyvitaminu D3 a dexamethasonu
nebo mléčných bakterií, jako je Lactobacillus plantarum, může indukovat intenzivní produkci IL-10 lidskými T buňkami
a zvýšit účinnost SLIT u senzibilizované
myši po současném podání vaječného
albuminu.
Purifikace
Galenické formy
Na konci procesu fermentace a indukce
genové exprese se rekombinantní protein
K prodloužení doby kontaktu alergenu se
sublinguální sliznicí a k usnadnění prů-
g Obrázek
­
1: ­Hlavní kroky při tvorbě rekombinantního alergenu
niku substance k lokálním dendritickým buňkám lze užít také inovované
galenické formy, jako jsou tablety,
biologické filmy nebo mukoadhesivní
prášky [1, 4]. Naše práce ukázala, že
mukoadhesivní formulace vaječného
albuminu zvyšuje účinnost SLIT u myši
senzibilizované vaječným albuminem.
Zdroje alergenu
Purifikace mRNA
Dr. L. Van Overtvelt
Antony (Francie)
Reverzní transkripce cDNA
Sonda = oligonukleotidový primer
­Závěr
Amplifikace daného genu PCR
Příprava rekombinantních alergenů
otevírá cestu k rozvoji diagnostických testů a nových způsobů
desenzibilizační léčby.
V současné době jsou k dispozici
rekombinantní alergeny užívané v in
vitro diagnostice. Jsou přínosné
zejména pro pacienty s mnohočetnou senzibilizací, u nichž umožňují
lepší identifikaci zkřížených alergií
a užití SIT. V budoucnosti se očekává také jejich využití v in vivo diagnostice kožními a provokačními
testy.
Vektory
Vložení vektoru (klonování)
Rekombinantní vektory
Hostitelská transformace
P. pastoris
E. coli
V nadcházejících letech budou
rekombinantní alergeny nepochybně reprezentovat nový způsob léčby
alergických chorob.
Produkce, selekce
a purifikace transformantu
Daný rekombinantní protein
g ­
Obrázek
2: Výběr kandidátů na adjuvantní prostředek
IL-12R
Humánní model in vitro
CD4+
Th1
Adjuvantní prostředky
iDC
1- Moingeon P. Sublingual immunotherapy: from biolo-
gical extracts to recombinant allergens. Allergy
2006; 61 (Suppl. 81): 15-9.
2- Pauli G, Mallin H, Rak S et al. Clinical efficacy of subcutaneous immunotherapy in birch pollen allergic patients: a randomized, double-blind, placebocon-
trolled study with recombinant Bet v 1 versus
natural Bet v 1 or standardized birch extract.
XXVe EAACI, Vienna, 10-14 june 2006 [Abstract 83].
3- Novak N. Targeting dendritic cells in allergen immu notherapy. Immunol Allergy Clin North Am
2006; 26: 307-19.
4- Mascarell L, Van Overtvelt L, Moingeon P. Novel ways for immune intervention in immunotherapy:
Mucosal allergy vaccines. Immunol Allergy Clin North
Am 2006; 26: 283-306.
5- Moingeon P, Batard T, Fadel R, Frati F, Sieber J, Van Overtvelt L. Immune mechanisms of allergenspecific sublingual immunotherapy. Allergy 2006; 61:
151-65.
+
DC
24 h
Tbet
IFN-γ
Přirozené
CD4+
7 dnů
Th0
CD4+
GATA 3
IL-4
Th2
ICOS
Nezralé
dendritické buňky
Modulované
dendritické buňky
CD4+
Treg
Analýza fenotypu
a produkce cytokinů
Foxp3
TGFβ
IL-10
Analýza genové exprese
Myší model in vivo
Analýza respirační
funkce, humorální
a buněčné odpovědi
a zánětu
0 14
21 22 23 24 25
OVA+Alum
interperitoneálně
Aerosol
OVA
Senzibilizace
28
88
93
Sublinguální léčba
Usmrcení
2x týdně po 2 měsíce
OVA +/- adjuvant nebo formulace
Desenzibilizace
5
Klinická problematika
Sublinguální desenzibilizace
v pediatrii:
­více než 10 let zkušeností
Sublinguální imunoterapie (SLIT) je způsob terapie, která
je vhodná pro pacienty s alergickou rinitidou a/nebo dobře
kontrolovaným mírným až středně těžkým bronchiálním
astmatem od 5 let věku.
V
­
edle subkutánní specifické imunoterapie (SCIT) byly od počátku jejího vývoje
testovány jiné neinjekční způsoby podávání alergenu, zejména perorální, které
by vedly k usnadnění a zlepšení léčby alergických pacientů. Sublinguální podávání se jeví
výhodnější než cesta perorální s polknutím alergenu, protože vykazuje lepší imunologickou
odpověď a vyšší účinnost. Při SLIT aplikujeme
několik kapek alergenu pod jazyk a zde je
podržíme po dobu 2 až 3 min, abychom umožnili absorpci ústní sliznicí. U dětí se sublinguální
imunoterapie používá po dobu zhruba 10 let.
­SLIT přispívá k obnovení rovnováhy
Th1/Th2
­V průběhu léčby
SLIT působí
alergen na dendritické buňky
ústní sliznice se
stimulací tvorby
Treg lymfocytů.
6
­SLIT umožňuje léčbu IgE mediovaných alergií.
Zvýšená tvorba IgE, s níž jsou tato onemocnění spojena, je způsobena relativní nerovnováhou v subpopulacích Th lymfocytů ve smyslu
převahy Th2 nad Th1. Regulace poměru Th1/
Th2 je prováděna prostřednictvím T regulačních lymfocytů (Treg), jejichž aktivita je u atopických osob snížená.
Léčba SLIT podporuje vychytávání alergenu
dendritickými buňkami sublinguální sliznice,
s následnou stimulací Treg lymfocytů. Tato
stimulace vede k multiplikaci Treg buněk
a zvýšené tvorbě cytokinů, jako je interleukin10 (IL-10). Výsledkem je zvýšená syntéza IgG4
a redukce tvorby IgE s relativním vzrůstem
populace Th1.
Všechny tyto děje přispívají k obnově rovnováhy Th1/Th2 [1].
Indikace SLIT a dlouhodobé účinky u dětí
V současné době je prokázána účinnost SLIT
v léčbě alergické rinokonjunktivity a mírného
až středně těžkého kontrolovaného astmatu
u dětí [2].
Údaje shromažďované více než deset let u astmatických dětí nebo u dětí alergických na roztoče
dokumentují účinnost SLIT, která se udržuje po
celé období léčby a přetrvává po jejím ukončení
[3]. Nezaslepené studie zároveň dokládají snížení
rizika prohloubení alergické choroby a zejména
snížení rizika senzibilizace vůči novým alergenům
po ukončení SLIT.
Alergeny užívané u SLIT
Při SLIT jsou nejčastěji užívanými alergeny
pyly a roztoči [4]. Imunoterapie musí být
prováděna pokud možno pouze jedním
alergenem nebo jednou skupinou alergenů;
terapeutický účinek závisí na podané dávce
(kumulativní terapeutické dávce). U potravinové alergie se SLIT používá v současné
době pouze ojediněle a není součástí standardní klinické praxe. Některé provedené
studie přinesly zajímavé výsledky [5], které
je však třeba potvrdit dalšími studiemi.
SLIT u astmatických dětí
Imunoterapie podávaná sublinguální nebo
subkutánní cestou je kompatibilní se základní léčbou astmatu. Současné podávání SLIT
spolu s inhalovanými kortikosteroidy, antihistaminiky nebo antagonisty leukotrienových receptorů je proto běžné. Ačkoli není
přesně známo, zda tyto léky nějak ovlivňují
účinnost SLIT, je jejich podávání v některých
případech nezbytnou podmínkou pro zahájení SLIT nebo SCIT, protože imunoterapii je
možno provádět pouze při zajištění stability
alergického onemocnění (např. astmatu).
Včasné zahájení IT
S přihlédnutím ke spontánnímu průběhu
alergického onemocnění je zahájení imunoterapie indikováno v časné fázi rozvoje alergie bez čekání na výskyt sekundárních symptomů a komplikací. Teoreticky lze použít
SLIT již u dětí v předškolním věku, přičemž
realizace léčby závisí především na jejím
dodržování dítětem a rodiči. Optimální dobu
je nutno stanovit individuálně, v závislosti na
závažnosti projevů a schopnosti dítěte a jeho
rodiny spolupracovat. V praxi se imunoterapie obvykle zahajuje jeden až dva roky po
prvních projevech choroby. Otázka zlepšení
terapeutických výsledků při včasném zahájení zůstává otevřená a měla by být předmětem dalších studií.
Důležitost údajů vztahujících
se k bezpečnosti
Vzhledem k tomu, že SLIT je prováděna
doma, bez jakéhokoliv lékařského dohledu,
je její naprostá bezpečnost nejvýše důležitá.
Četné dosud publikované studie ani zkušenosti vyplývající z klinické praxe nikdy neza-
chytily závažné vedlejší alergické reakce
(například anafylaktický šok) při SLIT prováděné výrobcem doporučenými dávkami [6].
Bezpečnost SLIT je v současné době doložena v léčbě dětí ve věku 5 a více let; klinické
údaje týkající se mladších dětí jsou zatím
nedostatečné.
Obecně je SLIT dobře snášena s výjimkou
obvyklých lokálních vedlejších účinků v místě aplikace. Celkové hodnocení SLIT rodinami i zdravotnickým personálem je všeobecně
velice pozitivní. Užití SLIT je velmi vhodné
zejména u dětí, které se vesměs obávají
injekcí a preferují léčbu v rodinném prostředí. Tato forma SIT je velmi nadějná za předpokladu, že je zajištěna potřebná edukace
a individuální přístup k pacientům.
­Prof. C.P. Bauer
Mnichov (Německo)
Imunoterapii je
třeba provádět po
získání kontroly
astmatu a v průběhu IT je nutno
trvale kontrolu
alergického onemocnění udržovat.
Důvěryhodný rozhovor, podrobné
vysvětlení problematiky a úplná a srozumitelná informovanost pacienta
jsou některé ze základních podmínek
úspěchu léčby.
1- Akdis CA, Barlan B, Bahceciler N, Akdis M. Immunological
mechanisms of sublingual immunotherapy. Allergy 2006; 61
(suppl. 81): 11-14.
2- Pham-Thi N, de Blic J, Scheinmann P. Sublingual immunothera-
py in the treatment of children. Allergy 2006; 61 (suppl. 81):
7-10.
3- Di Rienzo V, Marcucci F, Puccinelli P et al. Long-lasting effect of sublingual immunotherapy in children with asthma due to house dust mite: a 10-year prospective study. Clin Exp Allergy
2003; 33: 206-10.
4- Wilson DR, Torres Lima M, Durham SR. Sublingual immuno therapy for allergic rhinitis: systematic review and meta-analysis.
Allergy 2005; 60: 4-12.
5- Enrique E, Pineda F, Malek T et al. Sublingual immuno
therapy for hazelnut food allergy: a randomized, double-blind,
placebo-controlled study with a standardized hazelnut extract.
J Allergy Clin Immunol 2005; 116 : 1073-9.
6- Passalacqua G, Guerra L, Fumagalli F, Canonica GW.
Safety profile of sublingual immunotherapy.
Treat Respir Med 2006; 5: 225-34.
7
P¤ehled publikacÍ
A Fiocchi, G Pajno, S La Grutta et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2005; 95: 254-8.
SLIT je dobře tolerována dětmi
ve věku 3 až 7 let
S
ublinguální imunoterapie je stále častěji užívána zejména u malých dětí, i když v této
populaci chybí dostatek údajů o toleranci tohoto způsobu desenzibilizace. Autoři provedli v této souvislosti pilotní studii vyhodnocující toleranci
SLIT prováděné pro astma nebo rinokonjunktivitu
u dětí ve stáří 3 až 7 let. Hodnocení se provádělo
v průběhu 1 roku ve skupinách dětí mladších než
5 let a starších než 5 let.
Do této observační studie bylo zařazeno 65 dětí ve stáří 38 až 80 měsíců (průměrné stáří 60 měsíců).
Děti byly léčeny sublinguální imunoterapií
s 11denní indukční fází a udržovací dávkou 300 IR 3x týdně. Použitými alergeny byly extrakty prachových roztočů
u 42 pacientů, extrakty pylů bylin u 11
pacientů, extrakty pylů olivy u 5 pacientů, extrakty parietarie u 4 pacientů
a konečně extrakty cypřišových pylů
u dalších 3 pacientů.
Pacienti byli rozděleni do dvou pod-
skupin podle věku: 38 až 60 měsíců a 61 až 80 měsíců. Byly zaznamenávány veškeré vedlejší účinky
nebo změny v léčbě a srovnávány v obou podskupinách.
Kumulativní dávka SLIT byla v průměru 36 900 IR. Vedlejší účinky byly pozorovány u 11 pacientů, avšak žádný z nich nevyžadoval zastavení léčby. Šest vedlejších
účinků se vyskytlo ve věkové skupině méně než 60
měsíců a 7 ve věkové skupině více než 60 měsíců. Mezi
oběma skupinami nebyl pozorován žádný rozdíl. Celkově autoři uzavírají, že v nejmladší věkové skupině dětí
nezpůsobovala SLIT více vedlejších účinků.
Tato observační studie byla zaměřena na
snášenlivost a bezpečnost terapie, takže
nebylo možno vyhodnotit klinické účinky
v této populaci.
Vzhledem k tomu, že účinnost sublinguální imunoterapie v nejmladší věkové skupině dětí se jeví jako vyšší, je
nutné doplnit další kontrolované studie potvrzující také její dobrou snášenlivost v této věkové kategorii.
Rodriguez-Rajo FJ, Tedeschini E, Aira MJ, Jato V, Frenguelli G. Eur Ann Allergy Clin Immunol 2006;38:265.
Změny klimatu a tvorba pylu trav
ve Španělsku a Itálii
V
ýrazné změny v trvání pylových sezon pozorované v Evropě jsou vnímány jako důsledek
globálních klimatických změn. V posledních desetiletích zaznamenala severní polokoule podstatný
vzrůst atmosférické teploty, který vedl ke změnám
přítomnosti polétavých pylů přenášených větrem.
Meteorologické a pylové údaje o čeledích trav byly
analyzovány ve třech geografických sektorech: jeden v Itálii (Perugia v období 1982–2003) a další
dva ve Španělsku (Santiago de Compostela v období 1992–2003 a Vigo v období 1994–2003).
Průměrná roční teplota v Perugii a Santiagu de
Compostela v posledních letech vzrostla, zatímco
ve Vigu způsoboval vliv oceánu opačný jev. Datum
zahájení pylové sezony má tendenci se snižovat
v kontinentální oblasti, zatímco v nejteplejších
španělských sektorech lze pozorovat opačnou
tendenci. Následkem toho bylo v posledních
letech trvání pylové sezony kratší. Celkem mají
v nejchladnějších oblastech křivky tvorby pylu
vyšší hodnoty kurtózy (měření distribučního vrcholu) a šikmosti (asymetrie distribuce).
Tyto zaznamenané změny se primárně vztahují
k chronologii tvorby pylů, avšak rovněž ovlivňují
způsoby šíření pylů. V této studii, podobně jako
v mnoha dalších, se ukazuje, že kolísání teploty je
hlavním určujícím faktorem pozorovaných změn.