Současné možnosti vakcinační prevence lymeské boreliózy

Současné možnosti vakcinační prevence lymeské boreliózy

Současné možnosti vakcinační
prevence lymeské boreliózy
Weigl, E., Křupka, M., Raška, M.
LF UP Olomouc, 2012
Lymeská borelióza je chronické
multisystémové infekční onemocnění
klinicky popisované pod různými
názvy již v druhé polovině 19. století
Příklad:
Garin-Boujadoux- Bannwarth syndrome
Počátkem padesátých let bylo
žjištěno, že klinický obraz chroby
může být ovlivněn antibiotiky
Borrelia burgdorferi byla objevena
v roce 1982 Williamem
Burgdorferem během
oligoarthritické epidemie ve městě
Lyma, Connecticut, USA
Člověk je koncový článek
vývoje bakterií – není
přirozený hostitel
U přirozených hostitelů probíhá infekce
většinou asymptomaticky
Teoretické možnosti jiných vektorů
?
Klinický průběh lymeské boreliózy
U 10-15% pacientů progreduje onemocněné bez ohledu na správně
aplikvanou atb terapii
Elektronová mikroskopie B.
burgdorferi
délka 20-30 µm, šířka 0.2-0.3 µm, bičíky 7-11
Barbour-Stonelovo-Kelyovo médium
Alternativní morfologické formy B.
burgdorferi
Druhový komplex Borrelia burgdorferi
Species
Patogenita pro člověka
Výskyt
B. burgdorferi sensu stricto
Potvrzená, USA i Evropa
USA a záp. Evropa
B. garinii
Potvrzená, Evropa
Evropa včetně ČR, část Asie
B. afzelii
Potvrzená, Evropa
Evropa včetně ČR, část Asie
B. japonica
???
Dálný východ, Japonsko
B. andersonii
???
Severní Amerika
B. tanukii
???
Asie
B. turdi
???
Asie
B. valaisiana
Potenciální
Irsko, Německo, Holandsko
B. lusitaniae
???
Portugalsko, Tunis, stř. Evropa
B. sinica
???
Čína
B. bissettii
Potenciální
Severní Amerika
Existuje kauzální souvislost mezi genospecies
borelií a klinických obrazem ?
B. burgdorferi s.s. – pojivová tkáně (artritidy)
B. garinii - neuroborelióza
B. afzelii – kožní symtom. (acrodermatitis
chronica)
Rozšíření lymeské boreliózy ve světě
Organizace genomu B. burgdorferi s. l.
Lineární chromozom (910.725 pb, 853 kódujících sekvencí)
cp9
lp5
lp17
cp26
lp21
lp25
lp28 (1 – 4 kopie)
lp36
Cirkulární plazmidy
Cp 32
(7 kopií)
Lineární plazmidy
lp38
lp49
lp56
Plazmidy celkem 430 kódujících sekvencí
Genom B. burgdorferi
Chromosom 5 x menší než u E.
coli
Lineární plasmidy nesplňují
obecně platná pravidla pro
pojem „plasmid“ – přesnější
by byl asi pojem
„minichromozom“
Horizontální přenos
Mechanismy variability
Relaps fenomenon
Týká se proteinů kontrolovaných z plazmidů
Antigenní variace jsou ovlivňovány selekčním
tlakem prostředí a mohou být reakcí nejen na
imunitní odpověď hostitele, ale též např. na
terapii, případně na změnu podmínek vnějšího
prostředí. Důsledkem této proměnlivosti je
skutečnost, že i v jedné přírodní lokalitě se
mohou nacházet kmeny různých serotypů. Tato
skutečnost se odráží nejen v průběhu onemocnění
u infikovaného jedince, ale může mít také
zásadní význam pro protektivní imunizaci.
Mlčící kazety
Exprese proteinu VlsE (Vmp-like sequence,
expressed) – gen se skládá z 15 neexprimovaných
genových kazet a jednoho expresního místa –
rekombinací mezi jednotlivými kazetami vzniká
funkční gen – zdroj antigenní variability.
Rekombinace nastává pouze in vivo.
Nutnost vyrovnat se s výrazně rozdílnými
podmínkami
- Trávící trakt klíštěte
- Adheze ke stěně trávicí trubice
- Přechod do slinných žláz a dále do organismu
obratlovce
- Krevní oběh a tkáně hostitel
- Mechanismy nespecifické imunity (komplement, fagocyty)
- Mechanismy specifické imunity (protilátky)
- Adheze a penetrace do tkání
Interakce s imunitním systémem
člověka
Mechanismy účastnící se adheze a penetrace do tkání
Průnik extracelulární matrix
• Exprese DbpA a DbpB (Decorin binding protein) – proteiny
vázající decorin – proteoglykan asociovaný s kolageními
vlákny v pojivové tkání
• Fibronectin binding protein (BBK 32) – protein schopný
vázat glykoprotein fibronectin vyskytující se v plasmě a
extracelulární matrix
• Borrelia glycosaminoglycans binding protein (Bgp) – protein
vázající se na glykosaminoglykany pojivové tkáně
Mechanismy úniku účinkům nespecifické imunity
• CRASP (complement regulator-acquiring surface proteins)
• Erp (Outer surface protein E/F related proteins).
Tyto proteiny interagují s faktorem H a H like proteinem
komplementové kaskády jako kofaktory degradace C3b –
borelie jsou tak chráněny před opsonizací a tvorbou „membrane
attacking complex“.
Schopnost přežívat v prostředí s nedostatkem iontů železa –
eliminace metaloproteinů připadně náhrada Fe → Mn
Mechanismy úniku účinkům specifické imunity
Protein Salp 15 ze slin klíštěte inhibuje
aktivaci CD 4+ lymfocytů blokací funkce
Lck kinázy v kaskádě přenosu signálu z
receptoru CD 4
První vakcína byla vyvinuta pro
psy v USA (1990). Vakcína je
celobuněčná, inaktivovaná
chemickou cestou. Tato vakcína
nebyla doporučena pro humánní
použití.
Veterinární vakcíny proti Lymeské borelióze
Vakcína
Stát
Složení
Merilym
Německo
Lyzát + adjuvans
Rekombitek
USA
rOspA
LymeVax
USA
Lyzát + adjuvans
GalaxyLyme
USA
Lyzát + adjuvans
ProLyme
USA
rOspA + adjuvans
Biocan B
Česká republika
Lyzát + adjuvans
Pro vývoj lidské vakcíny bylo
významné zjištění, že k protekci
organismu je dostatečná indukce
humorální imunitní odpovědi. Byla
tak naznačena možnost vývoje
subjednotkové vakcíny.
Lidská subjednotková
vakcína: povrchový
antigen OspA
1998 - 2002
LIMErix
Smith Kline Beecham
USA
Mechanismus účinku OspA vakcíny
vakcína OspA
krev
anti OspA
klíště ztrácí
infekciozitu
TROSPA receptor a SALP 15 protein
Hovius, J.W. 2007
Vnější povrchový antigen A (OSPA (B)) je
hlavím povrchovým antigenem, který je exprimován,
když je B. burgdorferi rezidentní v klíštěti.
V okamžiku, kdy klíště začne nasávat krev na
savcích, je syntéza tohoto antigenu reprimována.
Naopak je indukována syntéza antigenu OspC.
Takto se OspC stává hlavním antigenem vnější
povrchové membrány v časné fázi infekce.
Přesmyk povrchových antigenů během
sání klíštěte
24 °C >
> 24°C
změna teploty
OspA
OspC
Mohou mikrobiální mimikry indukovat
autoimunitní reakci?
Borélie
OspA 165 - 173 AMK
Člověk
Human Leukocyte Fusion Associated Protein 332 - 340 AMK
Outer surface protein C Borrelia sp.
- membránový lipoprotein, M. W. nativního proteinu 23 kDa
struktura z větší části helikální (čtyři dlouhé helikální úseky a jeden
kratší)
- v membráně Borrelií se vyskytuje ve formě dimeru, v membráně
kotven lipidovou částí
- jeden z hlavních povrchových antigenů, prokázána možnost indukce
protektivní odpovědi
- význam při kolonizaci savčího hostitele
-
Produkce OspA
Produkce OspC
Cesta přenosu
Molekulární struktura OspC
Skládaný list
α helix
Imunodominantní
epitopy
Lipidizační
sekvence
Kumaran D et al.(2002). The EMBO Journal 20 (5): 971 – 978 .
OspC protein je vysoce stabilní během
infekce, je však značně variabilní v
přirozené populaci borélií
Sekvenční diference OspC
Asociace s virulencí
< 2%
≤ 8%
>14 %
Celkem 21 alelických skupin (A-U).
Asociace s virulencí: skupiny A,B, D,E a K jsou nejčastějšími patogeny člověka
Seinost et al.1999
Variabilita OspC antigenů
1. 21-23 alelických skupin nebo typů
2. Variabilita je koncentrována do
domén, které jsou současně významnými
antigenními epitopy
3. Epitopy jsou lineární
Variabilita hlavních proteinů
Species
Borrelia
burgdorferi s. s.
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
OspA types OspC types DbpA types
A, B, C, D, E,
F, G, H, I, J, K,
1
L, M, N, O, P,
I
Q, R, S, T, U,
72a, Szid
2
Pko, PLj7,
VS461, DK15,
HT25
II
3, 4, 5, 6, 7,
8
Smar, Pli,
H13, PFiM,
Pmit, Pki,
Pbes, HT22,
Phez, Pwa
III, IV
Rekombinantní OspC vakcinační
konstrukty
1. Tetravalentní vakcína - použity OspC z
alelických skupin A,B,K a D
(Earnhart,Ch.G., Marconi,R.T. Vaccine 2007)
2. Oktavalentní vakcína – rozšířena o skupiny
E,N,I a C
Earnhart,Ch.G., Marconi,R.T. Human Vaccine 2007
Variabilita hlavních proteinů
Species
Borrelia
burgdorferi s. s.
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
OspA types OspC types DbpA types
A, B, C, D, E,
F, G, H, I, J, K,
1
L, M, N, O, P,
I
Q, R, S, T, U,
72a, Szid
2
Pko, PLj7,
VS461, DK15,
HT25
II
3, 4, 5, 6, 7,
8
Smar, Pli,
H13, PFiM,
Pmit, Pki,
Pbes, HT22,
Phez, Pwa
III, IV
Naše experimenty s polyepitopovou OspC
vakcínou
Základní problémy:
1. Dostatečná exprese
2. Imunogenita
3. Nosiče
4. Adjuvans
Exprese nelipidované formy OspC
MKKNTLSAILMTLFLFIS CNNSGKDGNTSANSADE….
-
lipidizovaná forma obtížně
exprimovatelná v E.coli
- nelipidizovaná forma jen
slabě antigenní
O
H 2C
O
R
O
C
O
C
R
CH
S
MKKNTLSAILMTLFLFIS CNNSGKDGNTSANSADE….
O
O
R
C
H 2C
O
O
C
CH
S
R
C
O
NH
CNNSGKDGNTSANSADE….
R
Efektivita exprese po odstranění lipidizační sekvence
Exprese rekombinantního OspC
Připraveny dva genové konstrukty lišící se pozicí His-tagu, proteiny
byly exprimovány v E. coli, purifikovány metaloafinitní chromatografií a
zbaveny endotoxinu fázovou separací
OspC C-term (plasmid pET101)
OspC
ATG
His
OspC N-term (plasmid pET200)
ATG
His
OspC
Konstrukce vakcinačního antigenu s adjuvans
Lipidové spojky
H
N
O
O
O
O
O
H
OspC rekombinantní konstrukt
- vlastní antigen
O
O
O
H
N
O
O
O
O
H
O
O
H
N
O
O
O
O
O
H
O
O
Polyhistidinová kotva
Metalochelatační
zakončení
Lipozomový nosič - fosfolipidy
Muramyl dipeptid – molekulární adjuvans
Transmision electron microscope photographs of
A: liposome
B. Imunogold labeled OspC on the surface of liposome
Vakcinace OspC proteiny
Experimentální skupiny složeny z 5 myší Balb/c, vakcinace opakována po 14 dnech
14 dni po druhé dávce odebráno sérum
Skupina/použitá vakcína
ABCDE-
N-term volné OspC
N-term AlOH
N-term Montanid
N-term MT06 liposomy
N-term MPLA liposomy
12345-
C-term volné OspC
C-term AlOH
C-term Montanid
C-term MT06 liposomy
C-term MPLA liposomy
Kontrola – sérum myší vakcinovaných proteinem p24-Hsp70
MPLA – monofosforyl lipid A
MT06 – netoxický derivát muramyl dipeptidu
AlOH – Alum – adjuvans užívané v humánní medicíně
Montanid – komerční adjuvans
Hodnocení vakcinační účinnosti
1. ELISA test u myší
2. Westernblott
3. Imunofluorescenční potvrzení vazby
protilátek na buňky B. burgdorferi
Pozn. Mikrobicidní testy provedeny nebyly
Analýza anti-OspC IgG2a protilátek metodou ELISA
Děkuji za pozornost