07. Obiloviny

Pokročilé biochemické a
biotechnologické metody
GENETICKÁ TRANSFORMACE
OBILOVIN
ÚVOD
• První transformace modelových rostlin od 80. let dvacátého
století.
• Cíl - vnesení požadované genetické informace (DNA) do genomu
rostliny infekcí bakterií Agrobacterium tumefaciens.
• Transformace obilovin Agrobacteriem - téměř 20 let neúspěšná,
bakterie infikuje pouze dvouděložné rostliny.
• Vývoj alternativních metod pro přímé vnesení genu (DGT) makroinjekce a mikroinjekce DNA, elektroporace, mikrovlákna
karbidu křemíku a transformace protoplastů.
• Potvrzení vnesení DNA do buněk - elektroporací, transformací
protoplastů a pomocí mikrovláken - transgenní rýže a kukuřice.
• Nevýhoda těchto metod - vysoká technická náročnost.
DGT metody
• Transformace pomocí polyethylenglykolu
- rostlinné protoplasty mohou být transformovány pomocí
polyethylenglykolu v přítomnosti Ca2+ a to destabilizací plazmatické
membrány, které umožní proniknutí požadované DNA do buňky.
Protoplasty mohou být izolovány ve velkých množstvích z řady
rostlinných druhů. Nevýhodou je obtížná práce s protoplasty a
problematická regenerace rostlin. Volná DNA používaná k transformaci
snadno degraduje.
• Elektroporace- transformace rostlinných buněk a protoplastů.
Rostlinný materiál je v přítomnosti DNA vystaven elektrickým pulsům
o vysokém napětí. V cytoplazmatické membráně se vytvoří póry,
kterými může DNA proniknout do buňky a integrovat se do genomu.
Množství DNA, které se dostane touto metodou do buněk je malé – po
regeneraci získáme transformanty s nízkým počtem integrací
požadované DNA. Účinnost elektroporace je srovnatelná s biolistickou
transformací, ale buňky nejsou poškozeny.
DGT metody
• Silikon karbidová vlákna
- jednoduchá metoda, která nevyžaduje specializované vybavení. K
suspenzi obsahující rostlinný materiál a DNA se přidají silikonkarbidová vlákna, která pronikají buněčnou stěnou a umožní vstup
DNA do buňky.
Nevýhodou této metody je nízká efektivita
transformace a poškození buněk, které negativně ovlivní jejich
regenerační schopnost.
• Mikroinjekce
- zavedení DNA do jádra nebo cytoplazmy prostřednictvím skleněné
mikrokapilární injekční pipety za užití mikromanipulátoru. Využití
pro transformaci rostlinných buněk je omezené, jelikož buněčná
stěna tvoří bariéru pro mikroinjekci. Mikroinjekce protoplastů po
odstranění vakuol (odstranění rizika uvolnění toxických látek) snižuje
schopnost regenerace.
BIOLISTICKÁ TRANSFORMACE
• Biolistická transformace umožňuje vnesení požadované DNA
do buněk, ze kterých je možné nejsnáze regenerovat celou
rostlinu -kalusové kultury nebo embryonální tkáň skutela.
• Uplatnění pro transformaci obilovin, u kterých jsou obtíže
s regenerací rostlin z buněčných suspenzí primárně využívaných
ostatními DGT metodami.
Využití:
• Příprava transgenních linií - vnesení požadované DNA do
embryonální tkáně skutela.
• Příprava transgenních linií s vyšším počtem kopií transgenu.
• Studium dočasné exprese různých genových konstruktů. Míra
exprese může být detekována stanovením enzymatické aktivity
nebo pomocí ko-exprese reportérového genu.
BIOLISTICKÁ TRANSFORMACE
•
•
•
•
•
•
Využití:
Studium dočasné exprese - důležitý nástroj pro optimalizaci
různých technických parametrů pro vnesení DNA do cílové tkáně a
nalezení vhodné sekvence promotoru (regulační úsek DNA
zajišťující transkripci genu) poskytující nejlepších výtěžků
exprimovaného proteinu.
Výhody:
menší nároky na vektor a genotyp cílové rostliny
Nevýhody:
Nižší efektivita transformace
Nestabilní exprese genu, častý výskyt umlčení genu.
Ztráta transgenu v potomstvu.
Získání vstupního materiálu trvá řadu měsíců až do fáze vývoje
nezralých semen.
BIOLISTICKÁ TRANSFORMACE
• r. 1989 - první transgenní rostlina kukuřice - významný krok na poli genetické
modifikace obilovin.
• Touto metodou také poprvé připraven transgenní ječmen a pšenice (Obr.1.)
Obrázek 1: Chronologické řazení transformací hlavních obilovin pomocí biolistických metod a Agrobacteria.
BIOLISTICKÁ TRANSFORMACE JEČMENE
PROVEDENÍ
• Biolistické metody jsou založeny na urychlení kovových částic (nejčastěji
zlatých) o průměru kolem 1 µm obalených požadovanou DNA pro přímé
vnesení do rostlinných buněk. Pro urychlení mikročástic se používá např.
genové dělo PDS 1000/He od firmy BioRad. Nejlepších výsledků (při
transformaci ječmene) při užití tohoto zařízení bylo dosaženo transformací
nezralých embryí jarní odrůdy ječmene kultivaru Golden Promise.
• Užití čtyř odlišných médií – kalus-indukční médium (dediferenciace buněk
působením auxinu dicamby), kalus-indukční médium s manitolem
(osmotické působení manitolu), tranzitní médium (indukce diferenciace
vlivem auxinu 2,4-D a cytokininu BAP) a regenerační médium bez
hormonů.
•
Transformační účinnost – do 10%.
BIOLISTICKÁ TRANSFORMACE
PROVEDENÍ
• Ideální tkání pro transformaci - nezralá embrya nebo skutelum
(největší schopnost regenerace) – pěstování donorové rostliny až
do fáze vývoje nezralých semen. Tímto způsobem získán první
transgenní ječmen a pšenice (Obr.2).
A
B
Obrázek 2: Izolace embryí pšenice A. Nezralé zrno pšenice, B. vyizolovaná skutela.
BIOLISTICKÁ TRANSFORMACE JEČMENE
PROVEDENÍ
• Vyizolovaná embrya ječmene jsou z kalus-indukujícího média
přemístěna na médium s vyšším osmotickým tlakem.
• Evakuace přístroje a puštění helia (1 100 psi) → praskne “rupture”
disk → náraz plynu do makronosiče s kovovými částicemi s
navázanou DNA → vystřelení částic, které vniknou do tkáně embrya.
BIOLISTICKÁ TRANSFORMACE JEČMENE
PROVEDENÍ
• Embrya po bombardování jsou kultivována dalších 16 hod na médiu
s manitolem při 25°C ve tmě.
• 6-ti týdenní kultivace embryí na kalus-indukujícím médiu se selekčním
tlakem při 25°C ve tmě → dvoutýdenní kultivace na tranzitním médium
v polotmě (dojde k podpoře růstu listů – zelenání kalusů na médiu
s rostlinnými hormony, Obr.3A) → regenerace při plném světle na médiu
bez hormonů (Obr.3B).
A
B
Obrázek 3: Regenerace obilovin. A. Diferenciace buněk na povrchu
kalusu, B. zregenerovaná rostlina
• Zregenerované rostliny jsou přesazeny do hlíny a pěstovány ve skleníku.
TRANSFORMACE OBILOVIN ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS
• Úprava rostliny vnesením cizorodé DNA – bakterie
rodu Agrobacterium → tumorové onemocnění
• Hostitelská tkáň - exprese genů kódujících auxiny,
cytokininy a enzymy, které řídí syntézu derivátů aminokyselin nebo cukrů >
vznik tumoru.
• Lze fyzicky oddělit T-DNA a ostatní složky → systémy binárních vektorů s
„odzbrojeným“ Ti-plasmidem a menšími (binárními) plasmidy nesoucími TDNA.
• Ztráta typického fenotypu transformantů
markerů pro detekci transfromantů
- vývoj nových selekčních
SELEKCE TRANSGENNÍCH ROSTLIN
OBILOVINA
Pšenice
Ječmen
Oves
SELEKČNÍ MARKER
SELEKČNÍ LÁTKA
bar (phosphinothricinacetyltransferasa)
hptII (hygromycinphosphotransferasa)
cah (cayanamidhydratasa)
nptII (neomycin phosphotransferasa)
manA (phosphomannosaisomerasa)
CP4 epsps (5-enolpyruvylshikimát-3-fosfatsynthasa)
codA (cytosindeaminasa)
pat (phosphinothricinacetyltransferasa)
bar
htp
manA
nptII
nptII
bar
htp
L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy)
Hygromycin B (ATB)
Cyanamid
Geneticin (aminoglykosidové ATB)
Manosa (alternativní zdroj uhlíku)
Glyfosát (herbicid)
5-fluorocytosin
L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy)
Agrobacterium
tumefaciens
Rostlinná buňka
Regenerace
rostlin
Pomocný
plazmid
Binární
plazmid
T- DNA
Vnášený
gen
1.
Vnesení
T-DNA s
požadovaným
genem do
genomu
rostlinných
buněk
2.
T-DNA
integrovaná
vT-DNA
rostlinném
chromozomu
Rostlina
se změněnou
genetickou
informací
TRANSFORMACE OBILOVIN ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS - VÝVOJ
• První úspěšné transformace ječmene - využitím biolistických technik.
• Nezralá embrya - cílové tkáně pro regenerace transgenních rostlin
ječmene infikovaných A. tumefaciens.
• Metody pro transformaci ječmene pomocí A. tumefaciens jsou
používány posledních 10 let.
• První pokusy transformace rostlin využívaly izolovaných Ti-plasmidů
vnášených přímo do buněk.
• První transgenní rostliny s rekombinantní T-DNA, byly připraveny v
roce 1984 (jednalo se o dvouděložné rostliny).
TRANSFORMACE OBILOVIN ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS - VÝVOJ
• O pět let později - 25 druhů transgenních rostlin.
• Jediná transgenní jednoděložní rostlina – chřest.
• Pro transformaci obilovin - nezbytná přítomnost vir genů,
přítomnost induktoru vir genů.
• V r. 1993 - transgenní rýže a r. 1996 transgenní kukuřice.
• Do roku 1995 - více než 20 transgenních jednoděložních rostlin.
• Desetiletí dalšího zlepšování → transformace rýže Japonica, Indica a
Javanica, jarní a zimní odrůdy pšenice a ječmene, hybridní kukuřice,
čiroku, žita a několika pícnin a travin.
TRANSFORMACE OBILOVIN ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS
• Důležitý výběr cílové tkáně a genotypu rostliny, kmene Agrobakteria
(AGL1 nebo AGL0, případně LBA 4404), ko-kultivačních podmínek,
selekčního markeru a systému pro regeneraci rostlin.
• Značné
množství binárních plasmidových
transformaci obilovin, např. vektory série pBract
konstruktů
pro
TRANSFORMACE OBILOVIN ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS
Výhody:
• Vysoké transformační účinnosti
• Nižší počet kopií transgenů
• Umlčení transgenů se vyskytuje v menší míře
• Stabilnější dědičnost transgenu
Využití:
• Produkce velkého množství nezávislých transgenních
linií schopných reprodukce - ideální pro studium funkce
genů v obilovinách.
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
1. PŘÍPRAVA VSTUPNÍ DNA PRO VNESENÍ DO GENOMU ROSTLINY
• Vnesení požadovaného genu do jednoduché plazmidové DNA
podporujicí nejlépe tzv. Gateway technologii klonování – přenos
požadovaného genu do cílového vektoru pomocí místně-specifické
rekombinace, což je rekombinace v krátkých specifických
nukleotidových sekvencích na obou rekombinujících molekulách ->
rozpoznávané místně specifickými rekombinačními enzymy.
• Často používané cílové binární vektory odvozené od pGreen
vektoru – malé, snadná manipulace v E. coli, obsahuje ori pSa pro
replikaci v agrobakteriu, ale pro uskutečnění replikace nutná
přítomnost pomocného vektoru pSoup (obsahuje replikázu RepA).
• Vnesení binárního vektoru s požadovaným genem do agrobakteria
(AGL1) spolu s vektorem pSoup pomocí elektroporace.
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
pSa-ORI
npt1
LB
colEI ori
RB
35S-Hyg-nos
Stu I ( 7154)
Sac I ( 67 52)
pBrac t2 14
nosterm 3' Rev erse primer
Sac I ( 2315)
9165 bp
nos terminator
XhoI ( 2653)
attR2
H indIII (267 4
ccdb
Sma I ( 6004)
XmaI ( 6002)
XhoI ( 3383)
Cm(R)
Ubi promoter
attR1
ApaI ( 37 42)
pAH U bi promD primer forward
Vstupní vektor
Rekombinace
Cílový vektor
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
•
•
•
2. TRANSFORMACE JEČMENE
Sterilizace zrn ječmene hypochloridem.
Izolace nezralých embryí (velikost embrya 1.5-2 mm) a oddělení osy
embrya pod stereoskopem ve sterilních podmínkách laminárního boxu.
Umístění embryí na kalus-indukční médium (CIM), kde dochází účinkem
auxinu dicamby k dediferenciaci buněk a růstu kalusů. Kultivační média
jsou složena ze tří základních složek a stužovací látky na bázy agaru:
1. esenciální prvky nebo minerální ionty (makroelementy, mikroelementy
a zdroj železa ).
2. organické látky (vitamíny a aminokyseliny).
3. zdroj vázaného uhlíku - jelikož pletivo kalusu nefotosyntetizuje, jako
zdroj uhlíku slouží 3% maltosa.
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
Makroelemety - uhlík, dusík, fosfor, draslík, hořčík, vápník a síra. Pro
svůj růst a vývoj je rostliny potřebují ve větším množství.
Mikroelementy jsou pro růst rostlin potřebné ve stopových množstvích
- mangan, jód, měď, kobalt, bór, molybden, železo a zinek. Všechny tyto
látky se do média obvykle přidávají ve formě komplexní, komerčně
dostupné směsi s názvem Murashige & Skoog médium.
Organické látky - za esenciální pro kultivaci buněk in vitro jsou
považovány pouze vitamíny thiamin a myoinositol. Přidávanou
aminokyselinou je prolin (CIM) a glutamin (tranzitní a regenerační
médium). Jako komplexní zdroj aminokyselin se dále přidává kaseinový
hydrolyzát.
•
Do 24 hodin po izolaci embryí následuje infekce agrobakteriem (A.
tumefaciens AGL1) nesoucím binární vektor s T-DNA (bude integrována
do genomu rostliny) v přítomnosti fenolické látky (acetosyringon) –
spuštění virulence (chromozomální geny chv a att a geny virulence
přítomné na Ti-plasmidu). Ko-kultivace s A. tumefaciens 3 dny.
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
epicotyl
radicle
Zrno ječmene
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
3. SELEKCE TRANSFORMOVANÝCH BUNĚK
• Po ko-kultivaci s agrobakteriem – přenos embryí/kalusů na nové CIM
obsahující antibiotikum pro vyléčení infekce (nejčastěji timentin) a
selekční látků (nejčastěji herbicid L-fosfinotricin nebo antibiotikum
hygromicin – v závislosti na požitém vektoru).
• Použití hygromicinu poskytuje 100% selekci transformantů, použití
herbicidu asi 10% selekci.
• Selekce probíhá 6 týdnu (každé dva týdny
přenos kalusů na čerstvé médium) ve tmě
při 24°C – světlo indukuje diferenciaci buněk.
Kalus se skládá z beztvaré masy volně
uspořádaných parenchymatických buněk.
Během tvorby kalusu se objevuje určitý stupeň
dediferenciace v morfologii a metabolismu.
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
4. REGENERACE ROSTLIN
• Po selekci jsou dobře vyvinuté kalusy přeneseny na tzv. tranzitní
médium, které podporuje diferenciaci buněk. Médium obsahuje
cytokinin BAP (benzyladenin) a auxin 2,4-D (2,4-dichlorofenoxyoctová
kyselina) v poměru umožňujícím indukci růstu prýtů. Diferenciace
probíhá ve slabém světle – nižší výskyt albínů.
• Po dvou týdnech přenos kalusů na regenerační médium bez hormonů
– růst prýtů a indukce růstu kořenů.
• Za 2-4 týdny přenos rostlin s 2-3 cm prýty na CIM bez hormonů, kde
rostliny rostou a zakořeňují 3-4 týdny. Poté přesazení do rašelinových
disků (asi na dva týdny) a přesazení do hlíny.
Diferenciace
buněk na povrchu
kalusu.
Regenerace
rostlin ječmene.
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
Izolace a ko-kultivace
Osvětlení:
-
Selekce
Izolované skutelum
nezralých embryí
na kalus-indukujícím Ko-kultivace s A. tumefaciens,
přesun na kalus-indukujícím
médiu
médiu s antibiotikem
-
1. stupeň regenerace
50 μmol/m 2 /s
6-ti týdenní selekce
transformovaných
embryí/ kalusů
na antibiotiku
Regenerace
500 μmol/m 2 /s
Regenerace rostlin
na médiu bez
hormonů
2-týdenní
kultivace na
tranzitním médiu
s rostlinnými hormony
TRANSFORMACE JEČMENE ZPROSTŘEDKOVANÁ
A. TUMEFACIENS – PROVEDENÍ
Přesun rostlin
s 2-3 cm listy
Zregenerované rostliny
s listy a kořeny
Přesazení
do disků
se zeminou
Kultivace jednotlivých
rostlin na základním
médiu bez hormonů
Přesazení
do květináčů
se zeminou
Pěstování rostlin
v hlíně ve skleníku
PROMOTORY A TERMINÁTORY
Geny exprimované v transformovaných pletivech musí mít promotor funkční
v rostlinách (na 5´-konci) a také vhodný terminátor transkripce (na 3‘- konci).
Funkčnost příslušných regulačních úseků v dané rostlině je nutné nejdříve
otestovat (pokud není daná informace známa) pomocí tzv. reportérových genů.
Jako terminátor se nejčastěji používá nos (nopalin synthasa A. tumefaciens) nebo
CaMV 35S terminátor. Používané promotory jsou konstitutivní, tkáňově specifické
nebo inducibilní.
•
KONSTITUTIVNÍ PROMOTORY
Mezi nejčastěji používané konstitutivní promotory exprimované ve všech
pletivech patří CaMV 35S (35S RNA viru květákové mozaiky), který ale v u obilovin
poskytuje pouze nížší hladiny exprese. Promotory CmYLCV (cestrum yellow leaf
curling virus) a RTBV (rice tungro bacilliform virus) jsou další testované virové
promotory se silnou konstitutivní expresí v obilovinách. Promotory
jednoděložných rostlin jsou v obilovinách používány častěji než virové promotory.
Jedná se o promotory Ubi1 (kukuřičný ubiquitinový promotor a první intron
genu) a Act1 (rýžový promotor aktinu a první intron). Dále byly testovány
ubiquitinové promotory z cukrové třtiny (ubi4 a ubi9) a rýže (RUBQ2 a Rubi3),
které byly lepší nebo srovnatelné s Ubi1. Příklad další konstitutivních promotorů
pro obiloviny - H2B a Adh1 (z kukuřice), cytochrom- c promotor z rýže.
PROMOTORY
•
TKÁŇOVĚ SPECIFICKÉ PROMOTORY
Přirozená exprese většiny genů vykazuje určitý stupeň orgánové nebo pletivové
specificity v závislosti na fyziologické úloze daného produktu genu. Např.
pšeničné gluteninové promotery poskytují endospermově specifickou expresi, Ba D-hordeinové promotory - zrnově specifické (např. B-hordein umožňuje expresi
v aleuronové vrstvě a endospermu), globulin promotor – endosperm a
aleuronová vrstva. Příklady dalších testovaných zrnově specifických promotorů:
Em, asi, αamy1 a 2, puroindolin A a B.
•
INDUCIBILNÍ PROMOTORY
Schopnost spustit a vypnout expresy vneseného transgenu je velice důležitá.
Inducibilní promotory také poskytují pseudo-tkáňovou specificitu, jelikož je
aktivační stimul aplikován jen na určitou část rostliny. Inducibilní
protomory testované v obilovinách - alcR (indukce alkoholem), glutathion Stransferasa/In2-2 (indukce herbicidem safener), polygalacturonasu-inhibující
proteiny (indukce tepelným šokem), TetR (indukované tetracyklinem), tRA
(potlačení exprese tetracyklinem), EcR (indukované steroidním hormonem
hmyzu ekdysonem).
REPORTÉROVÉ GENY
Reportérové geny jsou široce používané v rostlinné molekulární biologii pro
hodnocení genové exprese i jako marker tranzientní a stabilní transformace.
Ideálně by měly být produkty reportérových genů netoxické, snadno a levně
analyzovatelné (v optimálním případě in vivo) a s malou nebo žádnou
endogenní aktivitu v transformovaných rostlinách. Nejběžněji se používá GUS,
GFP, LUC a C1 + R/B (akumulace antokyaninu)
• ß-glukuronidáza (GUS)
UidA je nejčastěji používaný reportérový gen
v rostlinných transformačních vektorech. ß-glukuronidáza (GUS) pocházející
z E. coli může být stanovena velmi citlivě při použití rychlých a jednoduchých
metod většinou v neživé, ale i v živé rostlině. Může být použita ke
kvantitativním (úroveň represe genu) i kvalitativním (lokalizace exprese genu)
analýzám. Má malou nebo žádnou endogenní aktivitu ve většině rostlinných
tkání. Pro zamezení exprese GUS v Agrobacteriu se často používají binární
vektory s intronem v genu pro GUS. Pro detekci GUS se využívá dvou přístupů
– histochemické metody nebo užití fluorogenního substrátu.
REPORTÉROVÉ GENY
• Fluorescenční proteiny
Jako reportérový marker se používá geneticky upravený GFP
medůzy (vznik žlutých a modrých fluorescenčních proteinů).
Fluorescence GFP nevyžaduje žádný substrát kromě kyslíku a
zdroje modrého světla. K detekci fluorescence v živých
buňkách je zapotřebí pouze zařízení pro detekci zeleného
světla (např. fluorescenční mikroskop, konfokální mikroskop),
čehož je využíváné zejména pro monitorování genové exprese
a proteinových interakcí in vivo. Fluorescenci je možné také v
buňkách kvantifikovat pomocí spektrofluorimetru na základě
fluorescence čistého fluorescenčního proteinu.
Z korálu Discosoma byl izolován červený
fluorescenční protein DsRed.
REPORTÉROVÉ GENY
•
Luciferázy
Enzymy podílející se na bioluminiscenci jsou známy jako luciferázy. Pro transformaci
rostlin se používá zejména luciferáza světlušky (LUC), která je geneticky
modifikovaná a produkuje jasnější světlo než přirozená forma enzymu. Dále se
používají luciferázy korálu Renilla (rluc) a bakteriální luciferázy (LUXA a LUXB z
Vibrio harvei).Měření bioluminiscence se provádí jednak v extraktech buněk
pomocí luminometru nebo scintilačního detektoru a dále je možné detekovat
bioluminiscenci in planta pomocí speciálního a nákladného zařízení (CCD system
zobrazování). Vzhledem k nároků ma vybavení (citlivé
detektory, práce ve tmě), je luciferáza využívána jako
reportérový marker méně než GUS a GFP. Používá se hlavně
při sledování dynamických změn genové exprese,při studiu
proteinových interakcí a tranzientní exprese jako součást
duálního reportérového systému spolu s GUS. Výhodou
bioluminescence je oproti fluorescenčním proteinům nízké
pozadí (nespecifická bioluminescence) v rostlinách.
REPORTÉROVÉ GENY
• Akumulace antokyaninu
Antokyaniny - ve vodě rozpustné flavonoidní pigmenty, které se
mohou ve velkém množství akumulovat ve vakuole buňky. Detekce
aktokyaninů probíhá bez přídavku substrátu pomocí vizuální
detekce a to zejména ke sledování tranzientní exprese. Detekce
antokyaninů - v rostlinách, u kterých byla narušena přirozená dráha
syntézy těchto pigmentů (nejsou pro rostlinu esenciální). Pro
akumulaci antokyaninů je nutná přítomnost dvou skupin
transkripčních faktorů - MYB a bHLH. Výhodou této metody je
možnost přímo spočítat individuální pozitivní buňky.
PŘÍKLADY VYUŽITÍ TRANSGENNÍCH OBILOVIN
• Produkce farmaceuticky účinných látek.
• Příprava rostlin s modifikovaným složením proteinů v zrnech.
• Příprava rostlin vyšší kvalitou škrobu v zrnech.
• Zlepšení sladovnické kvality ječmene – zvýšená exprese
transkripčního faktoru HvGAMYB.
• Zlepšená rezistenci rostlin vůči virům, plísním, hmyzím škůdcům.
• Zlepšená rezistenci rostlin vůči abiotickému stresu - sucho a zima.
• Zvýšení tolerance obilovin vůči herbicidům, zejména glyfosátu.