Sborník - orion - Masarykova univerzita

Masarykova univerzita v Brně – Přírodovědecká fakulta
a
Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii
pod záštitou
rektora Masarykovy univerzity prof. PhDr. Petra Fialy, Ph.D.
děkana Přírodovědecké fakulty MU doc. RNDr. Milana Gelnara, CSc.
IX. Pracovní setkání biochemiků
a molekulárních biologů
Sborník příspěvků
9. – 10. února 2005
Konferenční centrum ÚSKM Vinařská v Brně
PŘEDEŠLÁ PRACOVNÍ SETKÁNÍ BIOCHEMIKŮ
A MOLEKULÁRNÍCH BIOLOGŮ V BRNĚ
14. července 1997 ; 21. ledna 1998; 3. února 1999; 9. února 2000;
14. února 2001; 7. února 2002; 29. ledna 2003, 3. – 4. února 2004
http://orion.chemi.muni.cz/Setkani/index.htm
Vážení přátelé,
dovolujeme si Vás přivítat již na devátém Setkání biochemiků a molekulárních biologů
v Brně.
Těší nás Váš vzrůstající zájem o naše pravidelná setkání, na jehož základě jsme přesunuli jeho
pořádání do větších prostor kongresového centra ÚSKM na ulici Vinařská a již druhým rokem
se jedná o akci dvoudenní.
Doufáme, že se nám společně podařilo vytvořit program, ve kterém si každý z nás najde
spoustu nových a zajímavých informací z ostatních zúčastněných pracovišť.
Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii a organizující Katedra biochemie
PřF Masarykovy univerzity v Brně budou již tradičně oceňovat nejlepší prezentace
v anglickém jazyce v Sekci mladých. Tímto jim přejeme hodně sil a entusiasmu nejen při
prezentacích výsledků své práce, ale samozřejmě i při vlastním badatelském úsilí.
Taktéž vyhlašujeme veřejnou hlasovací soutěž o nejhezčí/nejlépe prezentované postery
na Setkání, jejichž autory oceníme malým dárkem. Doufáme, že se opět aktivně zapojíte do
hlasování a pomůžete vybrat postery, které dokáží oslovit širokou vědeckou komunitu.
Přejeme Vám, abyste z Brna odjížděli spokojeni a my Vás opět mohli přivítat při
následujících příležitostech.
V neposlední řadě bychom chtěli poděkovat také firmám, bez jejichž účasti bychom nemohli
takové setkání uskutečnit a které do značné míry umožňují námi prezentované výsledky
realizovat.
Vaši organizátoři
Michaela Wimmerová, Libuše Trnková, Petr Beneš a Petr Zbořil
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta
Kotlářská 2, 611 37 Brno
Tel: 549498166, Fax: 549492690
E-mail: [email protected];
http://orion.chemi.muni.cz/Setkani/index.htm
Obsah sborníku
Přednášky
Sekce mladých
Postery
Autorský rejstřík
Prezentace firem
3 – 19
20 – 36
37 – 79
82 – 83
84 – 106
2
PŘEDNÁŠKY
BIOLOGICKÉ VLASTNOSTI NAFTOCHINONŮ A STUDIUM JEJICH VLIV
NA TABÁKOVÉ BUŇKY BY-2
Petr Babula1, Jan Víteček2, Dagmar Buchtová2, Radka Mikelová2, David Potěšil2, Vojtěch
Adam2, René Kizek2, Ladislav Havel3, Zdeněk Sladký1
1
Ústav přírodních léčiv, FaF VFU Brno, Palackého 1/3, 612 46 Brno
2
Ústav chemie a biochemie a 3Ústav botaniky a fyziologie rostlin AF MZLU v Brně,
Zemědělská 1, 613 00 Brno
Úvod: Naftochinony jsou látky přírodního původu vyskytující se v celé řadě rostlinných
druhů a rovněž u hub a mikroorganismů. V buňkách jsou uloženy ve vakuolách, kde jsou
většinou ve formě glykosidů.Vznikají celou řadou biochemických reakcí, kde kyselina
šikimová, L-alanin, p-hydroxybenzoová kyselina a C10 izoprenová jednotka jsou výchozím
substrátem pro biosyntézu juglonu, droseronu, plumbaginu a 7-methyljuglonu. Naftochinony
jsou vysoce cytotoxické a byly pozorovány výrazné antimikrobní, antifungální, antivirální a
antiparazitální efekty. V tradičních medicínách, zejména v oblasti Asie (Čína) a Jižní
Ameriky mají rostliny s obsahem naftochinonů široké uplatnění především v léčbě různých
nádorových onemocnění. V univerzitní medicíně je využíváno listů ořešáku (juglans folium)
pro své adstringentní účinky a listy masožravé drosery (droserae herba) proti suchému
dráždivému kašli.
Materiály a metody: Suspenzní kultura tabáku linie BY-2 byla udržována v kapalném
modifikovaném Murashige-Skoog mediu. Suspenze (20 ml) v 50 ml Erlenmeyerových
baňkách byla umístěna na třepačce ve tmě, teplotě 27±1°C a 135 ot.min-1. Subkultivace byla
prováděna po 3 nebo 4 dnech. Pro experimenty byla použita 3 dny stará kultura. MTT test -Do
vzorku buněčné suspenze (0,5 ml) byl ihned po jeho odebrání přidán MTT do výsledné
koncentrace 0,5 mg.ml-1. Směs byla inkubována 1 h na třepačce (120 ot.min-1) při teplotě
25 °C. Po centrifugaci (360 g, 25 °C, 5 min) byl odstraněn veškerý supernatant. Formazan
vzniklý redukcí MTT byl z peletu extrahován 1,5 ml isopropanolu po dobu 0,5 h za
neustálého promíchávání směsi (třepačka, 120 ot.min-1). Po skončení extrakce byl centrifugací
(10000 g, 25 °C, 10 min.) získán čirý roztok formazanu. Jeho absorbance byla
spektrofotometricky detekována při 570 nm.
Výsledky a diskuse: Byl studován vliv naftochinonů na buněčnou suspenzi tabáku BY-2.
K tři dny staré kultuře BY-2 buněk byly přidány následující koncentrace naftochinonu: 0;
0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3 a 6 µM. Pouze koncentrace 3 a 6 µM způsobily růstovou depresi
buněčné suspenze. Podobným způsobem byla ovlivněna také životnost BY-2 buněk určená
barvením FDA/PI, která se snižovala při koncentraci naftochinonů 3 a 6 µM. Zjistili jsme
tedy, že pro rostlinné buňky BY-2 jsou toxické pouze vyšší koncentrace naftochinonů, což
může souviset s jejich endogenním výskytem.V případě, že byla sledována oxido-reduktázová
aktivita BY-2 buněk pomocí MTT testu, tak bylo zjištěno, že nižší koncentrace přidaného
naftochinonu pravděpodobně vedou ke stimulaci redoxních procesů v buňkách. Pouze u
nejvyšší koncentrace byl pozorován pokles oxido-reduktázové aktivity, který souvisí
s pozorovanou toxicitou aplikovaného naftochinonu.
Závěr: Ze získaných výsledků vyplývá, že vyšší koncentrace naftochinonů (3 a 6 µM) snižují
viabilitu a způsobují růstovou depresi. Zatímco nižší koncentrace stimulují oxidoreduktázovou aktivitu.
3
Literatura
BABULA, P., KIZEK, R., HAVEL, L., STRNAD, M. & SLADKÝ, Z. (2004). VIII. Pracovní setkání
biochemiků a molekulárních biologů, pp. 10. Masarykova univerzita v Brně, Brno.
BABULA, P. et al.: Naftochinony - výskyt v přírodě, biologické vlastnosti a jejich
chromatografické stanovení v rostlinách. (2005) Chem. Listy, odesláno
Poděkování: Příspěvek vznikl za podpory IGA FaF VFU IG342012, IGA MZLU 3/2004 a
GAČR č. 525/04/P132.
DETEKCE POŠKOZENÍ BAZÍ V DNA POMOCÍ SPECIFICKÝCH NUKLEÁZ
A ELEKTROCHEMICKÉ ANALÝZY
Kateřina Cahová, Miroslav Fojta, Tomáš Mozga, Emil Paleček
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno, email: [email protected]
Elektrochemická měření na rtuťových nebo pevných amalgamových elektrodách jsou
velmi citlivou metodou k detekci zlomů v molekule DNA [1-4]. Přímá elektrochemická
detekce poškození jednotlivých bazí v DNA je však obvykle citlivá méně [3, 4]. V této práci
jsme navrhli novou voltametrickou metodu detekce poškození bazí v DNA, založenou na
rozpoznání poškozených míst specifickými endonukleázami a následné elektrochemické
analýze. Prostřednictvím „reparačních“ enzymů dochází v místech poškozených bazí ke
vzniku zlomů, které je možno elektrochemicky stanovit s vysokou citlivostí [1-4]. Tuto
metodu jsme testovali u dvou komerčně dostupných enzymů – T4 endonukleázy V
(rozpoznává pyrimidinové dimery v DNA poškozené UV zářením a vytváří jednořetězcové
zlomy [5]) a E. coli exonukleázy III (štěpí DNA v místech chybějící báze a následně
odbourává jeden řetězec, čímž vzniká jednořetězcový úsek v DNA [6]). Zlomy nebo
jednořetězcové úseky byly následně detekovány adsorptivní přenosovou rozpouštěcí AC
voltametrií na rtuťové elektrodě. Tento způsob byl dále využit k detekci poškození bazí
vyvolanému v živých bakteriálních buňkách.
Práce byla financována grantem GAČR č. 203/04/1325 a účelovou dotací MPO projektu č.
1H-PK/42.
Literatura:
1. Fojta, M., Paleček, E. (1997) Supercoiled DNA modified mercury electrode: A highly
sensitive tool for the detection of DNA damage, Anal. Chim. Acta. 342, 1-12.
2. Fojta, M., Havran, L., Paleček, E. (1997) Chronopotentiometric detection of DNA strand
breaks with mercury electrodes modified with supercoiled DNA, Electroanalysis. 9, 10331034.
3. Fojta, M. (2002) Electrochemical Sensors for DNA Interactions and Damage, Electroanal.
14, 1449-63.
4. Fojta, M. (2004) Mercury Electrodes in Nucleic Acid Electrochemistry: Sensitive
Analytical Tools and Probes of DNA Structure, Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 715-747.
5. Schrock, R. D., 3rd, Lloyd, R. S. (1993) Site-directed mutagenesis of the NH2 terminus of
T4 endonuclease V. The position of the alpha NH2 moiety affects catalytic activity, J. Biol.
Chem. 268, 880-6.
6. Rogers, S. G., Weiss, B. (1980) Exonuclease III of Escherichia coli K-12, an AP
endonuclease in Methods in Enzymology (Grosmann, L. & Moldave, K., eds) pp. 201-211,
Academic Press, New York.
4
IDENTIFIKACE REGULÁTORŮ GENOVÉ EXPRESE U TREPONEMA PALLIDUM
Čejková Darina, Šmajs David
Biologický ústav , Lékařská fakulta MU, Tomešova 12, 602 00 Brno, Česká Republika
Metodou real-time RT PCR jsme vyšetřili regulační funkci treponemálních genů rpoN
(kódujícího sigma-54 faktor) a fhlA (kódujícího domnělý transkripční faktor). Tyto geny byly
naklonovány do expresních plazmidů pBAD/HisB kompatibilních s replikačním systémem
BAC. Exprese klonovaných genů byla regulována koncentrací arabinózy v kultivačním
mediu. Vzniklé konstrukty obsahovaly izolovaně naklonované geny i plazmidy obsahující oba
geny současně. Vyšetřili jsme růstovou křivku kmene DH10B s rekombinantními plazmidy za
aerobních a semianaerobních podmínek Za neindukovaných aerobních podmínek roste kmen
nesoucí konstrukt s oběma geny rpoN a fhlA výrazně pomaleji než ostatní vzorky. Po indukci
arabinózou pozorujeme pomalejší růst u všech kmenů E. coli nesoucí geny rpoN a fhlA a také
u kmene nesoucího konstrukt s oběma geny rpoN a fhlA. Protože T. pallidum nelze kultivovat
v podmínkách in vitro, expresi treponemálních genů jsme monitorovali v 19 klonech BAC
knihovny T. pallidum v E. coli DH10B. Konstrukty s geny rpoN a fhlA byly transformovány
do E. coli DH10B s kosmidy DSTP147 a DSTP085. Z těchto kmenů byla izolována RNA 60
a 120 minut po indukci arabinózou a hladina transkriptů vyšetřena kvantitativní RT PCR.
Nejvíce jsou regulovány geny TP 9 (tprA), TP 28 (předpovězený gen pro hemolysin), TP 30
(groEL), TP 1037 (hlyIII) a TP 1038 (TpF1). Regulační proteiny RpoN a FhlA přitom
spolupracují na pozitivní regulaci transkripce těchto genů.
p53 PROTEIN FAMILY; p 73 AND p 53 COOPERATION
Češková P., Vojtěšek B.
Department of experimental oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7,
656 53 Brno, Czech republic; E-mail: [email protected] , tel.: +420-5-43 13 33 05
The p53 is well known tumour suppressor protein, which is involved in control of the
cell cycle, apoptosis and senescence. The realisation that p53 in fact belongs to a family of
related genes came in 1997 when Kaghad et all. (1) discovered cDNA that is encoding the p73
protein. The TP73 gene maps to the chromosome region 1p36.2-3 known for a long time as a
part of the chromosome where some of tumour suppressor genes are localised.
Contrary to expectation the p73 protein is not a classic Knudson-type tumour
suppressor gene like p53 and its role in tumorigenesis is still unclear. The p73 protein is an
important component of the cellular response to DNA damage, and may play a critical role in
tumour suppression and chemosensitivity.
Different splicing of TP73 gene is responsible for formation of many p73 C- and Nterminal isoforms. Each of the p73 isoforms has different potential for protein–protein and
DNA–protein interactions, even has been shown that N-terminally truncated, transactivationdeficient DN-p73 isoforms possess oncogenic activity.
Our studies are focused on the comparison of ability of p73 α, β, γ and δ isoforms (i)
to bind DNA in vitro, (ii) to transactivate target genes ex vivo and (iii) to induce apoptosis.
Our experimental work is also focused to study functional cooperation between protein p53
and p73 isoforms.
5
This work was supported by the grant 301/04/P023 and 301/05/0416 from the Grant Agency
of the Czech Republic.
References:
Kaghad M. et all. 1997, Cell 90, 809-819.
EFFECT OF CHEMOPREVENTIVE COMPOUNDS ON INTESTINAL
CYTOCHROME P450 SYSTEM IN RELATION TO
PROCESS OF CARCINOGENESIS
Petr Hodek, Kateřina Fridrichová, Marie Stiborová
Charles University in Prague, Faculty of Nature Science, Department of Biochemistry,
Hlavova 2030, 128 43 Prague 2
One of the nowadays threats consists in an increasing incidence of a colorectal cancer,
accounting for almost 1/10 of cancer deaths worldwide. Although the colon tissue belongs to
highly exposed tissues to foreign compounds (xenobiotics), the research on the chemical
carcinogenesis in this organ is inadequate. In the colon tissue, most likely, cytochromes P450,
non-specific inducible monooxygenases, play a key role in the process of carcinogen
activation and/or xenobiotic toxification. While cytochromes P450 are considered to catalyze
the metabolism of xenobiotics leading towards their detoxication and excretion from the body,
in some cases cytochromes P450 cause a formation of ultimate carcinogens covalently
binding to DNA and potentially causing a cancer cell conversion. To prevent colorectal
cancer various natural chemopreventive compounds are used, however, their effect is usually
hardly detectable.
Currently, there is a considerable amount of interest in dietary antioxidants as
bioactive components of food. The physiological role of some of these, such as vitamin E and
vitamin C, is well established. The interest in flavonoids has increased in recent years because
of their ubiquitous presence as antioxidants in food. It has been found that flavonoids and
other phenolic compounds possess anti-tumoral, anti-allergic, anti-platelet, anti-ischemic, and
anti-inflammatory activities. Epidemiological evidence for the importance of flavonoids in
reducing mortality from coronary heart disease was provided by several studies. The role of
dietary phenolic antioxidants in vivo, protecting against cancer, has also been underlined by
some epidemiological studies. In these studies, flavonoids and other dietary compounds have
been mentioned as statistically beneficial and protective against carcinogenesis.
Compounds of expected chemopreventive action are frequently applied in high doses,
as food additives. They might, on the other hand, induce carcinogen activation in the colon
via stimulation of xenobiotic metabolizing enzymes, namely cytochromes P450. The battery
of carcinogen activating cytochromes P450 e.g. 1A1, 1A2, 1B1, is commonly referred to as
the Ah-gene upregulation. The Ah-receptor (AHR) is a ligand-activated transcription factor
which activation occurs in response to binding receptor agonist. There is an accumulating
evidence that some flavonoids (e.g. quercetin, chrysin, diosmin) are AHR agonists. Thus,
although the human experimental and epidemiological evidence is generally supportive of the
benefcial nature of a diet rich in foodstuffs containing flavonoids, concerns have been
expressed over the potential for flavonoids to cause adverse effects in interaction with food
carcinogens.
That is why, our research is aimed to elucidate the interaction of chemopreventive
agents used in human diet with the cytochrome P450 system and assess a potential health risk
6
of the simultaneous (or time shifted) exposition of an experimental organism to tested
flavonoids and common food carcinogens. 32P-postlabeling technique is used as a method to
follow carcinogen activation and a consequent DNA-adduct formation in the colon tissue.
MOLEKULÁRNÍ INTERAKCE MEZI KOLICINEM U A JEHO IMUNITNÍM
PROTEINEM
Magda Janalíková, David Šmajs
Masarykova univerzita v Brně, Lékařská fakulta, Biologický ústav, Tomešova 12, 602 00 Brno
Koliciny jsou specifické toxické exoproteiny produkované bakteriemi čeledi
Enterobacteriaceae účinné proti blízce příbuzným bakteriím stejného druhu. Producent se
proti syntetizovanému kolicinu brání tvorbou tzv. imunitního proteinu, který je integrován
do cytoplazmatické membrány. Pro studium interakce kolicinu U s jeho imunitním proteinem
bylo využito vysoké sekvenční příbuznosti kolicinu U s kolicinem Y. Producent kolicinu U
nevykazuje zkříženou imunitu s kolicinem Y. Významná interakční oblast kolicinu U je
určena hydrofobní aminokyselinovou sekvencí A571-A600, která se nachází v letální Ckoncové doméně. Pomocí cílené mutageneze byly připraveny bodové mutace v genu pro
kolicin U (v místech kódujících rozdílnou aminokyselinovou sekvenci mezi koliciny U a Y)
ve smyslu sekvence kolicinu Y. Takto bylo připraveno 20 konstruktů hybridních kolicinových
genů U/Y. Koliciny s většinou bodových mutací nevykazovaly žádnou změnu letálního
účinku od původních kolicinů. Odpovídaly jim aminokyselinové zbytky 586LA, 590LAV,
L594 a 596GLV. Koliciny s bodovými mutacemi G580V a F576Y prokázaly jednoznačný
význam aminokyselinových zbytků G580 a F576. Slabé interakční místo také leží v oblasti
605N-V-K, která leží mimo hydrofobní oblast. Pro kolicin Y jsou v interakci s jeho imunitním
proteinem významné aminokyseliny rozdílné, i když jedna z nich, Y586, leží na místě
analogickém F576 u kolicinu U.
Tato práce byla sponzorována grantem: GAČR 310/03/1091.
VYUŽITÍ KOMPLEXŮ OXIDU OSMIČELÉHO JAKO ELEKTROAKTIVNÍCH
ZNAČEK PRO DNA
Pavel Kostečka, Luděk Havran, Kateřina Cahová, Miroslav Fojta
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
Nukleové kyseliny (NA) mají zásadní význam v řadě biologických procesů, mezi něž
patří udržování, přenos a exprese genetické informace. Mutace v DNA mohou mít za následek
vážné poškození organismu jako vznik rakoviny, zrychlené stárnutí nebo predispozici k
civilizačním chorobám. Je zřejmé, že potřeba analýzy různých sekvencí DNA zasahuje takřka
do všech medicínských oborů i mimo ně. Byla vyvinuta celá řada technik pro studium DNA
(např. optické, radiologické, enzymové), a zvláště v posledních letech k ním přibyly
elektrochemické techniky, které mohou nabídnout rychlé laboratorní zpracování a finanční
nenáročnost. DNA je elektroaktivní molekula poskytující redoxní a tensametrické signály
vhodné pro studium poškození DNA, jejích interakcí s dalšími molekulami apod. Kromě
měření vlastních signálů nukleových kyselin se v elektrochemické analýze DNA uplatňují
různé elektroaktivní značky. Komplexy oxidu osmičelého s dusíkatými ligandy (Os,L) se
kovalentně vážou na pyrimidinové baze (preferenčně na thymin). Vzniklé adukty poskytují
7
vysoce citlivý katalytický signál na rtuťových elektrodách [1] a faradaické signály na
rtuťových i uhlíkových elektrodách [2]. Zatímco katalytický signál umožňuje stanovení
osmiem značené DNA s velmi vysokou citlivostí, potenciál specifického signálu aduktu na
uhlíkových elektrodách je závislý na použitém ligandu a umožňuje odlišit modifikovanou
DNA od nezreagovaného činidla.
K měření katalytického signálu DNA značené Os,L jsme využili rtuťovou filmovou
elektrodu (MFE), která je jednou z možných alternativ ke klasickým elektrodám pracujícím
s kapalnou rtutí [3]. Jako substrát pro MFE jsme použili uhlíkovou, zlatou, platinovou a
stříbrnou elektrodu. Značení cílových DNA nebo signálních sond Os,L bylo využito v tzv.
dvoupovrchových metodách elektrochemické detekce hybridizace DNA. Tyto techniky byly
úspěšně aplikovány např. pro stanovení délky trinukleotidových opakovaných sekvencí [4, 5].
Značení signálních hybridizačních sond Os,L s různými ligandy umožňuje současnou detekci
více cílových sekvencí. Vedle detekce hybridizace DNA je možno díky selektivní reaktivitě
některých Os,L s jednořetězcovou nebo konformačně distortovanou dvouřetězcovou DNA
[2] využít také pro detekci poškození DNA a jejích interakcí s interkalátory.
Práce byla financována grantem GAAV ČR A4004402 a účelovou dotací MPO projektu č.
1H-PK/42.
Literatura:
1.
2.
3.
4.
5.
Havran, L., M. Fojta, and E. Palecek, Voltammetric behavior of DNA modified with osmium
tetroxide 2,2 '-bipyridine at mercury electrodes. Bioelectrochemistry, 2004. 63(1-2): p. 239243.
Fojta, M., et al., Voltammetric microanalysis of DNA adducts with osmium tetroxide,2,2 'bipyridine using a pyrolytic graphite electrode. Talanta, 2002. 56(5): p. 867-874.
Kostecka, P., et al., Voltammetry of osmium-modified DNA at a mercury film electrode
application in detecting DNA hybridization. Bioelectrochemistry, 2004. 63(1-2): p. 245-248.
Fojta, M., et al., Multiply Osmium-Labeled Reporter Probes for Electrochemical DNA
Hybridization Assays. Detection of Trinucleotide Repeats. Biosens. Bioelectron., 2004. 20: p.
985-994.
Fojta, M., et al., Electrochemical Detection of DNA Triplet Repeat Expansion. J. Am. Chem.
Soc., 2004. 126: p. 6532-6533.
STRUCTURE –FUNCTION STUDIES OF RALSTONIA SOLANACEARUM
FUCOSE-BINDING LECTIN
Nikola Kostlánová1, Edward P. Mitchell2, Nechama Gilboa-Garber3, Stefan Oscarson4,
Anne Imberty5 & Michaela Wimmerová1,6
1
National Centre for Biomolecular Research and 6Department of Biochemistry,
Masaryk University, Kotlářska 2, 61137 Brno, Czech Republic
2
E.S.R.F. Experiments Division, BP 220, F-38043, Grenoble Cedex, France
3
Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, Ramat-Gan 52900, Israel
4
Department of Organic Chemistry, Arrhenius Laboratory, Stockholm University, S-106 91
Stockholm, Sweden
5
CERMAV-CNRS, BP 53, F-38041, Grenoble, Cedex 09, France
Lectins are proteins of non immune and non catalytic origin which specifically bind
carbohydrates. The glycorecognition system of lectins is important in the mediation of
numerous physiological processes including fertilization, pathogen-cell adhesion and
recognition, inflammatory response and others. A number of pathogen microorganisms utilize
8
lectin-carbohydrate interaction to recognize and infect host organisms. The comprehension of
the molecular mechanisms which gives a pathogenic bacterium the ability to invade, colonize
and reorient the physiopathology of its host is a goal of primary importance and such studies
may direct the conception of new strategies to fight against these pathogenic agents.
Ralstonia solanacearum is a soil-born bacterium, which belongs to the group of betaproteobacteria. It is responsible for bacterial wilts on more than 200 plant species from
50 botanical families including potato, tomato, banana and other economically important
corps [1]. R. solanacearum, which is capable of living for prolonged periods in the soil,
infects its hosts beginning with the root system and presents a very strong tropism for the
xylem vessels. Its extensive multiplication in the water-conducting system leads to a systemic
infection of the plant.
This contribution structurally and functionally describes RSL, a 9.9 kDa lectin from
R. solanacearum. This fucose-binding lectin has been discovered in the bacterium extract
using mannose affinity chromatography and shows sequence similarities with fungal Aleuria
aurantia lectin AAL [2]. Recombinant RSL produced in E. coli was crystallized by hanging
drop vapor diffusion method and the diffraction data at 1.70Å resolution were collected under
cryogenic conditions (100K), at ESRF, Grenoble, France. Structure was solved using the
complex with selenio-methyl fucoside. The RSL/fucose crystal contains one monomer of
90 amino acids and two fucose residues per asymmetric unit. Each monomer consists of two
4-stranded β-sheets. Three monomers associate to form a six-bladed β-propeller, therefore
representing a quaternary arrangement that has never been observed before. The overall
β-propeller and the fucose-binding mode are very similar to those observed in AAL structure
[3]. Affinity constants of the two sites have been determined by ITC microcalorimetry.
Further functional studies using surface plasmon resonance allowed to define the fine
specificity to fucosylated oligosaccharides present in plant cell walls, that may be a target for
the lectin in soil.
References:
[1]Salanoubat, M., Genin, S., A. et coll. and Boucher, C.A. (2002) Nature. 415, 497-502
[2] Sudakevitz, D. Imberty A.& Gilboa-Garber N. (2002) J. Biochem.132, 353-358.
[3] Wimmerová M, Mitchell E, Sanchez JF, Gautier C, Imberty A. (2003) J. Biol. Chem.. 278,
27059-67.
RAPD TYPIZACE BIFODOBAKTERIÍ
Jana Křížová, Alena Španová, Bohuslav Rittich
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie,
Tvrdého 14, 602 00 Brno
Zástupci rodu Bifidobacterium tvoří významnou součást fyziologické střevní
mikroflóry člověka a spolu s dalšími bakteriemi mléčného kvašení jsou považovány za
organismy s pozitivními účinky na zdraví člověka. V poslední době se setkáváme
s přidáváním bifidobakterií do mléčných výrobků a potravinových doplňků. Používané kmeny
je nutné charakterizovat a správně identifikovat. Klasické metody založené na fenotypových
vlastnostech většinou neposkytují správné výsledky. Proto jsou vyhledávány nové a
spolehlivé molekulárně-biologické metody. Jednou z možných metod je RAPD (random
amplified polymorphic DNA) typizace, která umožňuje identifikaci vzorků na úroveň druhů,
popř. kmenů. V této práci byla metoda RAPD použita pro charakterizaci 16 referenčních a
9
typových kmenů bifidobakterií ze sbírek CCM, ATCC, CCUG, DSMZ a 7 kmenů ze sbírky
mlékařských kultur Laktoflóra. Pro typizaci bylo zvoleno 7 RAPD primerů. Na základě
srovnání profilů 16 typových a referenčních kmenů se 7 studovanými kmeny ze sbírky
Laktoflóra bylo možné studované kmeny zařadit do druhů B. lactis (6 kmenů) a B.
adolescentis (1 kmen). Použití všech sedmi RAPD primerů umožnilo diferenciaci mezi
jednotlivými druhy.
MECHANISMUS BAKTERIÁLNÍ OXIDACE PYRITU, DOPADY V EKOLOGII A
BIOHYDROMETALURGII
1
Mandl M., 1Helánová Š., 1Bartáková I., 2Zeman J.
1
Katedra biochemie a 2Ústav geologických věd, Přírodovědecká fakulta Masarykovy
univerzity, 611 37 Brno ([email protected])
Biooxidace pyritu a dalších sulfidů kovů vede ke kontaminaci prostředí kyselinou
sírovou a migraci toxických kovů. V biohydrometalurgii však jde o fundamentální proces ve
získávání kovů z chudých sulfidových rud a koncentrátů. Mechanismus biodegradace je
v posledních letech prezentován jako tzv. nepřímý proces. Pyrit je oxidován ionty Fe(III)
za tvorby thiosíranu, který je dále oxidován na síran během cyklické degradace pyritu [1].
V tomto procesu je postulována řada sirných meziproduktů. Cílem této práce je demonstrovat
tvorbu síranového iontu jako primárního produktu biodegradace pyritu za podmínek vysoké
oxidační aktivity bakterií.
Molekula pyritu uvolnila během biooxidace pyritové elektrody bakterií Acidithiobacillus
ferrooxidans téměř 14 elektronů, což svědčí pro úplnou oxidaci pyritu na síranové ionty. Bez
přítomnosti bakterií byly uvolněny 2 až 3 elektrony, což svědčí pro tvorbu síry.
Pyritová elektroda deteguje elektrony související s oxidací pyritového povrchu. Tvorba
síranových iontů proto neodpovídá případným sekundárním reakcím v roztoku, kde vznik
sirných meziproduktů představuje pouze minoritní proces. Pro průběh reakce je rozhodující
vysoká hladina redoxního potenciálu, která je udržovaná oxidační aktivitou bakterií
reoxidujících Fe(II). Snižující se bakteriální aktivita vede ke snižování redoxního potenciálu
a možnosti neúplné oxidace pyritu za tvorby sirných meziproduktů, z nichž nejstabilnější je
síra. Ta je oxidována na kyselinu sírovou jak adsorbovanými, tak zejména volnými bakteriemi
[2]. Oxidace pyritu ionty Fe(III) ve fázi vysoké aktivity bakterií reoxidujících Fe(II) však
vytváří kyselinu sírovou přímo, což odpovídá souhrnným reakcím:
FeS2 + 7 Fe2(SO4)3 + 8 H2O = 15 FeSO4 + 8 H2SO4
4 FeSO4 + O2 + 2 H2SO4 = 2 Fe2(SO4)3 + 2 H2O (bakterie)
Podporováno grantem GA ČR č. 525/04/1309.
Literatura
[1] Schippers A., Jozsa P.G., Sand W., Appl. Environ. Microbiol.: 62, 3424 (1996).
[2] Ceskova P., Mandl M., Helanova S., Kasparovska J., Biotechnol. Bioeng.: 78, 24 (2002).
10
STUDIUM GENOVÉ EXPRESE U T. PALLIDUM
Petra Matějková1, David Šmajs1, Steven J. Norris2 a George M. Weinstock3
1
Biologický ústav LF MU v Brně, Tomešova 12, Brno 602 00, Česká republika
2
Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas, Houston Medical
School, 6431 Fannin Street, Houston TX 77030, USA
3
Human Genome Sequencing Centre, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Alkek
N1519, Houston, TX 77030, USA
Spirocheta Treponema pallidum subsp. pallidum je původcem venerické syfilis,
vysoce invazivního onemocnění postihujícího v pozdním stadiu systémově celý organismus.
Nemožnost kontinuální kultivace v in vitro podmínkách vyžaduje užití genomických přístupů
pro výzkum tohoto neobvyklého patogenu. Byla připravena BAC knihovna chromozomální
DNA T. pallidum v E. coli. 19 klonů této knihovny představuje minimální set obsahující
99,8 % předpovězených genů (ORF). Byla stanovena exprese genů T. pallidum v E. coli.
Expresní profil genů v BAC knihovně představuje první krok pro studium regulace genové
exprese genů T. pallidum.
5 treponemálních genů kódujících proteiny s domnělou regulační funkcí bylo
naklonováno do expresních vektorů pBAD kompatibilních s replikačním systémem BAC.
V expresním vektoru pBAD jsou tyto geny pod kontrolou arabinózového promotoru, který
umožňuje regulovat jejich expresi pomocí hladiny arabinózy v kultivačním mediu. Tyto
vektory byly transformovány do minimální sady BAC knihovny. Celková RNA celé sady
transformované vektorem s domnělým transkripčním regulátorem byla porovnána s relevantní
kontrolou s vektorem bez inzertu metodami DNA microarray hybridizace na čipu T. pallidum
a kvantitativní PCR.
Byly vyšetřeny geny rpoN, fhlA, hisK, soj a troR. Proteiny RpoN, FhlA a HisK byly
potvrzeny jako pozitivní regulátory a produkt genu soj jako negativní regulátor. U genu troR
nebyla potvrzena jeho negativní regulační funkce.
Byla také vyšetřena RNA izolovaná z časově omezené kultivace treponem na
tkáňových kulturách králičích epiteliálních buněk a z experimentálních lézí na králičí kůži.
RNA z takto získaných organismů byla podrobena expresní analýze metodou kvantitativní
PCR a výsledky byly porovnány s expresním profilem treponem izolovaných z králičích
testes.
Podporováno granty IGA MZ ČR č. NF NI/7351-3, GAČR 310/04/0021 a FRVŠ 451/2004.
RECEPTORY OBRANNÝCH REAKCÍ ROSTLIN
Vladimír Mikeš
Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Kotlářská 2,
61137 Brno
Signální dráhy aktivované elicitory obranných reakcí rostlin zahrnují intracelulární a
membránové receptory, látky typu druhého posla, enzymy se signální a regulační funkcí (jako
jsou fosfolipasy, proteinkinasy), enzymy syntetizující sekundární metabolity a fytoalexiny. O
struktuře rostlinných receptorů interagujících s elicitory nebo rostlinnými hormony je ve
srovnání s oblastí prokaryotů či živočišné biochemie známo jen velmi málo, i když se ukazuje
že jejich struktura i funkce je založena na podobných principech. Tyto receptory jsou buď
11
iontové kanály, nebo jsou spojeny s G-proteiny anebo mají proteinkinasovou aktivitu.
Přednáška shrnuje nové poznatky o těchto receptorech i metody jejich výzkumu. Aplikuje tyto
metody na výzkum receptorů tabáku interagujících s tzv. elicitiny, což jsou proteinové
elicitory produkované houbami Phytophthora a Pythium.
CHARAKTERIZACE KULTURY RANÝCH SOMATICKÝCH EMBRYÍ SMRKU
ZTEPILÉHO JAKO MODELOVÉHO ORGANISMU
Jiří Petřek1, Helena Vlašínová1, Ladislav Havel1, Vojtěch Adam2, Petr Babula3, Jan Víteček1,
Karel Bartůšek4, David Potěšil 2, René Kizek2
1
Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2Ústav chemie a biochemie, AF MZLU v Brně,
Zemědělská 1, 613 00 Brno;
3
Ústav přírodních léčiv, FaF VFU Brno, Palackého 1/3, 612 46 Brno
4
Ústav přístrojové techniky, AV ČR, Královopolská , 620 00 Brno, E-mail:[email protected]
Úvod: Byla prokázána značná podobnost mezi vývojem a strukturou raných somatických
embryí (RSE) a raných zygotických embryí, proto je možné použít kultury RSE jako
odvozené modelové kultury. Pro stanovení růstu kultur je využíváno vážení čerstvé hmotnosti
shluků RSE (SRSE) nebo analýza obrazu (IA – image analysis). Pro stanovení životnosti
buněk se využívá tzv. „test dvojitého barvení“, založený na selektivní permeabilitě
cytoplazmatické membrány, a dále aktivita intracelulárních esteras. Při studiu struktury SRSE
je možné využít nukleární magnetickou resonanci (NMR). RSE smrku ztepilého kultivovaná
v podmínkách in vitro jsou schopna organizace a tvorby struktur, které nemají v přirozených
podmínkách obdoby. Kulturu lze využít např. ke sledování vlivu těžkých kovů na růst,
životnost a tvorbu specifických proteinů (např. fytochelatiny) u RSE.
Materiály a metody: K analýze obrazu byla využita CCD-kamera (charge-coupled device) a
počítačové programy GRAB-IT a Image-Pro[3]. Aktivita intracelulárních esteras byla
změřena fluorimetricky. Sledování struktury shluku bylo umožněno pomocí NMR
zobrazování, kdy byly snímány obrazy vážené koncentrací jader 1H. Ve zvoleném místě
SRSE byla excitována 2 mm tloušťka řezu a snímán obraz o velikosti 30 x 30 mm (256 x 256
obrazových bodů) s rozlišením 0.117 mm/obrazový bod.
Výsledky a diskuse: Růstové křivky získané vážením a pomocí IA byly velmi podobné, proto
lze IA využít ke sledování růstu SRSE smrku v podmínkách in vitro. Růst shluků raných
somatických embryí (SRSE) je ovlivněn procesem pasážování. Pomocí metody analýzy
obrazu bylo zjištěno, že přírůstek plochy SRSE po pasážování je závislý na jeho počáteční
velikosti a také na prostorové orientaci embryí. Při nedodržení původní orientace byl přírůstek
plochy SRSE menší. Se stářím kultury vliv orientace SRSE na jeho růst roste. Starší SRSE
vytvářejí odlišné oblasti na povrchu a uvnitř shluku, které se od sebe odlišují životností RSE i
schopností jejich dalšího růstu. Na základě tohoto zjištění byla stanovena životnost embryí
v jednotlivých částech SRSE fluorescenčními barvivy a 1% roztokem 2,3,5- trifenyltetrazolia
chloridu (TTC). Životnost embryí byla větší ve vnějších částech shluku. Rovněž další růst
RSE z jednotlivých částí shluku byl různý. Přírůstek plochy SRSE (pomocí IA) pocházejících
z vnějších částí byl větší než přírůstek SRSE z vnitřních částí. Pomocí NMR zobrazování byl
zjištěn vyšší obsah vody ve vnějších částech SRSE než v jeho vnitřních částech.
Závěr: Na základě našich výše zmíněných výsledků byla potvrzena tvorba vnitřní struktury
SRSE, která se projevuje např. větší životností vnějších částí SRSE oproti vnitřním.
12
Literatura:
[1] Arnold S., 1987: Improved effeciency os somatic embryogenesis in mature embryos of Picea abies
(L.) Karst. Journal of Plant Physiology, 128: 233-234.
[2] Havel L., Durzan D.J., 1996: Apoptosis during diploid parthenogenesis and early somatic
embryogenesis of Norway spruce. International Journal of Plant Sciences, 157 (1): 8-16.
[3] Petřek J., Vacek J., Víteček J., Vlašínová H., Kizek R., Havel L., 2004: Application of computer
image analysis for study of lead (Pb-EDTA) effect on growth and viability of early somatic
embryos of the Norway spruce (Picea abies /L./ Karst.). Anal. Bioanal. Chem., submitted.
Poděkování:
Příspěvek vznikl za podpory IGA MZLU 3/2004, IGA FaF VFU IG342012, GAČR č.
525/04/P132.
ÚLOHA SUPERHELICITY DNA V REGULACI FUNKCE NÁDOROVÉHO
SUPRESORU PROTEINU p53
Hana Pivoňková, Václav Brázda, Marie Brázdová, Eva Jagelská-Brázdová,
Kateřina Němcová, Bořivoj Vojtěšek, Emil Paleček, Miroslav Fojta
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno; [email protected]
Protein p53 chrání buňku před maligní transformací regulací odpovědí na různé
genotoxické vlivy1. Nezastupitelnou roli má v kontrole oprav DNA, buněčné proliferace,
diferenciace a apoptózy. Ve stresových podmínkách působí jako transkripční faktor velkého
množství různých genů. Biologická aktivita proteinu p53 je úzce spjata s jeho interakcemi s
DNA. V promotorech genů, jejichž transkripce je proteinem p53 aktivována, se nacházejí
specifické sekvence, na něž se p53 váže (tzv. konsensní sekvence – p53CON). Schopnost p53
účinně interagovat s p53CON prostřednictvím své centrální domény (CD) je regulována na
úrovni posttranslačních modifikací v jeho C-terminální doméně (CTD). Fosforylace, acetylace
nebo vazba nekovalentních efektorů k určité oblasti v CTD p53 aktivuje jeho sekvenčně
specifickou vazbu1, 2. Tato oblast se překrývá s místem, jehož prostřednictvím p53 interaguje
s DNA sekvenčně nespecificky. Vedle sekvenčně specifické vazby má protein p53 schopnost
v DNA selektivně rozpoznávat určité konformační motivy. Kromě míst poškozené DNA3 jsou
to tzv. „non-B“ struktury, úseky v DNA, které se svou konformací liší od pravidelné
dvoušroubovice. Mnohé z těchto struktur jsou specifické pro nadšroubovicovou (sc) DNA4.
Schopnost proteinu selektivně interagovat s scDNA bez ohledu na přítomnost p53CON (SCS
vazba p53 k DNA) byla před časem objevena v naší laboratoři5. Experimenty s delečními
mutanty proteinu6 a s modulací aktivity jeho CD a CTD pomocí redox činidel a
monoklonálních protilátek7 ukázaly, že pro tento typ interakce je klíčová CTD p53. Naše
nedávné výsledky ukazují, že SCS vazba může interferovat s mechanismem aktivace (a
„latence“) proteinu p53 a hrát roli při procesech rekombinace6, 7. Kromě toho se ukázalo, že
superhelicita DNA je důležitým faktorem ovlivňujícím sekvenčně specifickou vazbu p53,
zejména v těch případech, kdy p53CON v scDNA může zaujmout non-B strukturu (např.
křížovou formu)8. Spolu se zjištěními, že strukturně selektivní interakce mutantních p53
s některými chromatinovými elementy je zodpovědná za jejich onkogenní vlastnosti 9, tyto
výsledky naznačují, že topologie DNA může mít zásadní význam pro regulaci biologických
funkcí proteinu p53 in vivo.
Práce byla financována granty IGA MZ NC/7574–3, GAČR 301/05/0416 a GAAV ČR
B500040502 a A500040513.
13
Literatura:
(1)
Appella, E.; Anderson, C. W. Eur J Biochem 2001, 268, 2764-2772.
(2)
Jayaraman, L.; Prives, C. Cell Mol Life Sci 1999, 55, 76-87.
(3)
Fojta, M.; Pivonkova, H.; Brazdova, M.; Kovarova, L.; Palecek, E.; Pospisilova, S.;
Vojtesek, B.; Kasparkova, J.; Brabec, V. Biochem Pharmacol 2003, 65, 1305-1316.
(4)
Palecek, E. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991, 26, 151-226.
(5)
Palecek, E.; Vlk, D.; Stankova, V.; Brazda, V.; Vojtesek, B.; Hupp, T. R.; Schaper, A.;
Jovin, T. M. Oncogene 1997, 15, 2201-2209.
(6)
Brazdova, M.; Palecek, J.; Cherny, D. I.; Billova, S.; Fojta, M.; Pecinka, P.; Vojtesek,
B.; Jovin, T. M.; Palecek, E. Nucleic Acids Res 2002, 30, 4966-4974.
(7)
Fojta, M.; Pivonkova, H.; Brazdova, M.; Nemcova, K.; Palecek, J.; Vojtesek, B. Eur J
Biochem 2004, 271, 3865-3876.
(8)
Palecek, E.; Brazda, V.; Jagelska, E.; Pecinka, P.; Karlovska, L.; Brazdova, M.
Oncogene 2004, 23, 2119-2127.
(9)
Koga, H.; Deppert, W. Oncogene 2000, 19, 4178-4183.
METABOLICKÉ ZMĚNY V ROSTLINÁCH TABÁKU VYVOLANÉ
VIROVOU INFEKCÍ
Helena Ryšlavá1, Helena Synková2, Noemi Čeřovská2
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 2030,
128 00 Praha 2
2
Ústav experimentální botaniky, Akademie věd České republiky, Na Karlovce 1a, 160 00
Praha 6
1
Rostliny vystavené biotickému stresu se brání pomocí mnoha reakcí, např. tvorbou
aktivních forem kyslíku, programovanou buněčnou smrtí, syntézou specifických obranných
látek a syntézou obranných proteinů. Vedle těchto reakcí má biotický stres vliv i na primární
metabolismus rostliny. Dráhy, které jsou za fyziologických podmínek využívány méně,
mohou v době stresu nabývat většího významu.
Centrálním metabolitem je fosfoenolpyruvát, který je přeměňován několika cestami.
V rostlinách je vedle glykolytické dráhy rovněž karboxylován fosfoenolpyruvátkarboxylasou
(PEPC) na oxalacetát. Oxalacetát pak může doplňovat intermediáty citrátového cyklu a
poskytovat uhlíkatý skelet pro aminokyseliny, PEPC je tedy enzymem propojujícím
metabolismus sacharidů a proteinů. Fosfoenolpyruvát může vznikat reakcí katalyzovanou
pyruvát,fosfátdikinasou (PPDK). Malát, jako další intermediát mnoha metabolických drah,
může být dekarboxylován NADP-dependentní malátdehydrogenasou dekarboxylační (NADPME, malic enzyme) za vzniku pyruvátu. Přínosem této reakce je vznik redukovaného
koenzymu NADPH využitelného pro syntézy dalších látek, v případě biotického stresu
specifických obranných sloučenin. NADPH je rovněž substrátem pro antioxidační enzymy,
které chrání buněčné struktury před poškozením.
PEPC, NADP-ME i PPDK, důležité enzymy pro přizpůsobení rostliny na suché a horké
prostředí s vysokými světelnými intenzitami, jsou klíčovými enzymy tzv. C4 a CAM
fotosyntézy.
V pokusech sledujících vliv biotického stresu na rostlinný metabolismus prováděné
v naší laboratoři je stresorem Y virus bramboru, kmen NTN (PVYNTN), modelová rostlina
tabák (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1). Sledovaná část rostlinného metabolismu
byla stresem ovlivněna významně. V listech infikovaných rostlin tabáku byla zjištěna 3 až 4
14
krát zvýšená aktivita PEPC oproti kontrolním rostlinám. Rovněž aktivita NADP-ME je vyšší
v listech infikovaných rostlin tabáku. Specifickou detekcí enzymové aktivity v tenkých řezech
bylo zjištěno, že NADP-ME je v listech tabáku lokalizován v chloroplastech. Důležitou roli
v regulaci aktivity NADP-ME v rostlinné buňce má vedle dostupnosti substrátu i přítomnost
kofaktoru – dvojmocných iontů kovů (Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+).
Vztah virové infekce ke sledovaným enzymům není pravděpodobně zcela obecný.
V rostlinách Nicotiana benthamiana se totiž NADP-ME vyskytuje ve dvou isoformách , které
mohou být stresem ovlivněny rozdílně.
Poděkování: Tato práce je podporována granty: GA UK 428/2004, GA ČR 206/03/0310
MASS SPECTROMETRIC ANALYSIS OF COPPER/TOPAQUINONECONTAINING METHYLAMINE OXIDASE FROM ASPERGILLUS NIGER
1
Marek Šebela1, René Lenobel2 and Ivo Frébort1
Department of Biochemistry and 2Laboratory of Growth Regulators, Faculty of Science
Palacký University, Šlechtitelů 11, CZ-783 71 Olomouc, Czechia
The fungus Aspergillus niger represents a microorganism of significant biotechnological
importance. In Asia, it is widely used in the manufacture of fermented foods and beverages.
However, the primary use of A. niger resides in production of enzymes and organic acids by
fermentation [1]. A. niger is able of growing upon a wide variety of substrates including
amines. Just 40 years ago, amine oxidase activity was detected in crude extracts of various A.
niger strains after induction with n-butylamine. The enzyme was purified and crystallized, in
that time as the first example of amine oxidase produced by microorganisms [2]. Later on,
two different copper/topaquinone-containing amine oxidases (CAOs), named AO-I and AOII, were isolated from the strain AKU 3302 using the same induction [3]. The complete amino
acid sequence of AO-I (EMBL/GenBank protein accession code AAK51081) was deduced
from both cDNA and gene cloning and the protein 3-D structure was modeled [4]. A. niger
strains can produce CAOs of different molecular properties and substrate specificity upon
induction by adding different amines into culture media [4].
Surprisingly, A. niger AKU 3302 does not grow on methylamine as the sole carbon and
nitrogen source. However, when the mycelia are incubated with methylamine, a CAO is
induced, which differs from the above AO-I and AO-II [5]. This methylamine oxidase
(MeAO) was also purified and characterized. Northern blot analysis and sequencing of several
internal peptides indicated that MeAO structure largely differs from that of AO-I [5]. Peptide
mapping using MALDI-TOF-MS and peptide sequencing using LC-ESI-MS and MS/MS
were performed in this study. MeAO sample (15 pmol) was first resolved by SDS-PAGE and
then subjected to in-gel digestion by trypsin. MALDI-TOF-MS revealed a clear peptide map,
which however did not provide any relevant hit when searched against the nonredundant
MSBD database using the program Mascot. In addition, this map showed no partial agreement
with that of AO-I. Fortunately, MS/MS allowed unambiguous reading of two peptide
sequences, FNAVT(I/L) and WQNWXVHVGF, which were used for MS BLAST homology
searching. We found identities between MeAO and a hypothetical protein from Aspergillus
nidulans (EMBL/GenBank protein accession code XP_411778) comprising both the
consensus cofactor sequence NY(D/E)Y and copper-binding motif HQH characteristic for all
known CAOs. It is interesting that A. nidulans may produce five other putative CAOs, one of
15
them (EMBL/GenBank protein accession code XP_406669) shows a large homology to A.
niger AO-I (82% identity, 92% similarity).
[1] Abarca, M.L., Accensi, F., Cano, J. and Cabañes, F.J. (2004) Antonie van Leuwenhoek 86, 33-49.
[2] Yamada, H., Adachi, O. and Ogata, K. (1965) Agric. Biol. Chem. 29, 649-654.
[3] Frébort, I., Tamaki, H., Ishida, H., Peč, P., Luhová, L., Tsuno, H., Halata, M., Asano, Y., Kato, Y.,
Matsushita, K., Toyama, H., Kumagai, H. and Adachi, O. (1996) Eur. J. Biochem. 237, 255-265.
[4] Frébort, I., Šebela, M., Hirota, S., Yamada, M., Tamaki, H., Kumagai, H., Adachi, O. and Peč, P.
(2003) Biol. Chem. 384, 1451-1461.
[5] Frébort, I., Matsushita, K., Toyama, H., Lemr, K., Yamada, M. and Adachi, O. (1999) Biosci.
Biotechnol. Biochem. 63, 125-134.
INHIBICE PCR JAKO METODA PRO STANOVENÍ VLASTNOSTÍ
MAGNETICKÝCH NOSIČŮ
A. Španováa, B. Ritticha, E. Soudkováa, K. Petrováa, D. Horákb, M. J. Benešb
a
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie,
Tvrdého 14, 602 00 Brno
b
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Heyrovského nám. 2, 162 00 Praha
Výskyt falešně negativních výsledků je závažným problémem při analýze reálných
vzorků. V případě polymerázové řetězové reakce (PCR), která se používá pro identifikaci
cílových buněk, falešně negativní výsledky mohou být způsobeny přítomností intracelulárních
a extracelulárních inhibitorů PCR. Eliminaci vlivu extracelulárních inhibitorů lze docílit
vhodným zpracováním vzorku před analýzou, např. separací nespecificky adsorbované
genomové DNA na magnetických částicích. Tento postup umožňuje robotizaci a miniaturizaci
procesu izolace a manipulace s DNA při zpracovávání vzorků. Předpokladem pro použití
magnetických nosičů je jejich neinterference v PCR. Bylo totiž zjištěno, že ionty Fe3+
inhibují aktivitu polymerázy. Byl vypracován postup, který umožňuje testovat interferenci
syntetizovaných částic s průběhem PCR. Jako modelový systém byly použity bakterie rodu
Bifidobacterium. Byl studován vliv komponent, použitých při syntéze částic a částic
připravených různými postupy, na stanovení citlivosti PCR. Navržená metoda umožňuje
nepřímé ověření inkorporace magnetických jadérek a dokonalost jejich pokrytí polymerem
v průběhu syntézy.
Práce byla podpořena grantem NAZV QF3169 a GAČR 203/05/2256.
ACTIVATION OF CARCINOGENIC O-ANISIDINE BY HUMAN CYTOCHROMES
P450 IN VITRO LEADS TO FORMATION OF DNA ADDUCTS FOUND IN RATS
TREATED WITH THIS CHEMICAL
Marie Stiborová1, Markéta Mikšanová1, Helena Rýdlová1, Eva Frei2, Heinz H. Schmeiser2
1
Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2,
2
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
2-Methoxyaniline (o-anisidine) is an industrial and environmental pollutant and a
bladder carcinogen for rodents. Determining the capability of humans to metabolize this
carcinogen, understanding which human enzymes are involved in its activation and
16
determining the mechanism of its carcinogenicity are important in the assessment of
individual susceptibility to this industrial and environmental contaminant found in ambient air
pollution.
The mechanism of o-anisidine carcinogenicity was investigated with two independent
methods, 32P-postlabeling and 14C-labeled o-anisidine, to show that o-anisidine binds
covalently to DNA in vitro after its activation by human hepatic microsomes. We also
investigated the capacity of o-anisidine to form DNA adducts in vivo. Rats were treated i.p.
with o-anisidine (0.15 mg/kg daily for 5 days) and DNA from several organs was analyzed by
32
P-postlabeling. Two o-anisidine-DNA adducts, identical to those found in DNA incubated
with o-anisidine and human microsomes in vitro, were detected in urinary bladder (4.1
adducts per 107 nucleotides), the target organ, and to a lesser extent, in liver, kidney and
spleen. These DNA adducts were identified as deoxyguanosine adducts derived from a
metabolite of o-anisidine, N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine. This metabolite was
identified in incubations with human microsomes.
With nine human hepatic microsomal preparations we identified the specific CYP
catalyzing the formation of the o-anisidine metabolites by correlation studies and by
examining the effects of CYP inhibitors. On the basis of these analyses, oxidation of oanisidine was attributed mainly to CYP2E1. Using recombinant human CYP (in
SupersomesTM) and purified CYPs, the participation of CYP2E1 in o-anisidine oxidation was
confirmed. In SupersomesTM, CYP1A2 was even more efficient in oxidizing o-anisidine than
CYP2E1, followed by CYP2B6, 1A1, 2A6, 2D6 and 3A4.
The results, the report on the potential of the human microsomal CYP enzymes to
activate o-anisidine, strongly suggest a carcinogenic potential of this rodent carcinogen for
humans.
Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/03/0283).
MAPOVÁNÍ GENOMŮ PATOGENNÍCH SPIROCHET
Michal Strouhal, David Šmajs
Masarykova univerzita v Brně, Lékařská fakulta, Biologický ústav, Tomešova 12, Brno 602 00
V této práci jsme se soustředili na kompletní restrikční mapování genomů pěti
příbuzných treponemálních kmenů zahrnující T. pallidum subsp. pallidum Nichols, T.
pallidum subsp. pallidum SS14, T. pallidum subsp. pertenue Samoan D, T. pallidum subsp.
pertenue Gauthier a T. paraluiscuniculi metodou DNA fingerprintingu. Lze předpokládat, že
různá míra invazivity a patogenity těchto spirochet se bude odrážet v rozdílech jejich
genomů. Genom T. pallidum subsp. pallidum Nichols byl rozdělen do 87 překrývajících se
oblastí (TPI intervaly) a pro každou oblast byla navržena kombinace příslušných primerů.
Každý z těchto intervalů byl amplifikován u všech studovaných kmenů pomocí XL PCR a
PCR produkty byly štěpeny restrikčními enzymy BamH I, EcoR I, Hind III nebo jejich
kombinacemi. Takto získaný restrikční profil byl použit k determinaci heterologních úseků
DNA jednotlivých treponemálních kmenů.
Odlišná cílová restrikční místa byla u T. paraluiscuniculi nalezena na 34 místech (16 pro
BamH I, 5 pro EcoR I a 13 pro Hind III), z toho 21 nově vzniklých restrikčních míst a 13
zaniklých; u kmene Samoan D bylo nalezeno 8 odlišných cílových restrikčních míst (1 pro
BamH I, 2 pro EcoR I a 5 pro Hind III), z toho 5 nově vzniklých a 3 zaniklá. U kmenů
Gauthier a SS14 bylo nalezeno 1 místo s odlišným restrikčním profilem pro Hind III.
17
U T. paraluiscuniculi bylo nalezeno sedm delecí v oblastech TPI8, TPI12, TPI13,
TPI34, TPI41, TPI48 a TPI66 a 3 inzerce u TPI2, TPI32B a TPI78. U kmenů Samoan D,
Gauthier a SS14 byly nalezeny dvě delece v oblastech TPI13 a TPI34 a jedna inzerce v oblasti
TPI12; u kmene Samoan D byla navíc nalezena delece v oblasti TPI78. Delece v TPI12 o
velikosti 1,8 kb zahrnuje geny o neznáme funkci a nachází se v oblasti genu tprD (TP0131).
Delece v TPI48 je velká 1,7 kb a zahrnuje geny tprI (TP0620), tprJ (TP0621) a geny kódující
proteiny o neznámé funkci (TP0617 - TP0619). Delece v TPI77 u kmene Samoan D je
přibližně 350 bp velká a nachází se v oblasti genu tprL (TP1031). Inzerce v oblasti TPI12 je
velká přibližně 1300 bp a nachází se v oblasti genů TP0126 - TP0130; u T. paraluiscuniculi
jsou inzerce velké přibližně 150 bp a nebyly zatím charakterizovány.
Výsledky naznačují vysokou míru sekvenční homologie mezi vyšetřenými kmeny.
Ačkoliv je patogenita studovaných kmenů různá, nebyly zjištěny zásadní rozdíly mezi
srovnávanými oblastmi genomů. Ukazuje to na možnost, že rozdílná virulence
treponemálních kmenů je podmíněna relativně malými odlišnostmi v příslušných genomech.
Identifikované nukleotidové záměny (jež jsou podstatou odlišností v cílových restrikčních
místech) lze využít při molekulární identifikaci treponemálních kmenů.
Práce byla podpořena granty IGA MZ ČR č. NF NI/7351-3 a GAČR č. 310/04/0021.
CHARAKTERIZACE BUNĚČNÉ SMRTI INDUKOVANÉ SOUČASNOU
SYNTÉZOU OXIDU DUSNATÉHO A PEROXIDU VODÍKU
Jan Víteček1, Lucia Obálová2, René Kizek2, Ladislav Havel1
1
Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta,
Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno
Úvod: Oxid dusnatý (NO) představuje významnou a svými vlastnostmi (plyn, radikál)
jedinečnou signální molekulu v živočišných systémech. V poslední době se ukazuje, že NO
figuruje jako signální molekula i u rostlin. Podílí se na regulaci některých procesů v rámci
růstu a vývoje rostliny. Klíčovou roli hraje při biotickém stresu. Souhra jeho syntézy
se syntézou reaktivních forem kyslíku (ROS) může vyvolat buněčnou smrt.
Materiál a Metody: Suspenzní kultura tabáku linie BY-2 byla udržována v modifikovaném
kapalném Murashige-Skoog mediu. Buněčná smrt byla indukována 0,5 mM nitroprussidem
sodným (SNP, donor NO, uvolňování NO bylo ověřeno pomocí fluorescenční sondy diaminofluoresceinu) a 0,5 mM glukosou s 0,5 IU.ml-1 glukosaoxidasou (GGO, donor H2O2,
syntéza H2O2 byla ověřena pomocí chromogenního substrátu - tetramethylbenzidinu). Jako
neaktivní analog SNP byl použit ferrikyanid draselný (PFC). Viabilita suspenze byla
vyhodnocena na základě dvojitého barvení fluoresceindiacetátem (FDA) a propidiumjodidem
(PI). V suspenzi byla stanovena aktivita oxidoreduktas (MTT test). Štěpení DNA bylo
vyhodnoceno na základě standardní elektroforézy na agarosovém gelu. Pomocí
fluorescenčních sond byla detekována přítomnost organel s nízkým vnitřním pH a změny
morfologie buněčných jader. Morfologie buněk byla pozorována v režimu fluorescence
(barvení FDA), fázového kontrastu a světlého pole.
Výsledky a diskuse: Alikvoty (20 ml) buněčné suspenze tabáku byly vystaveny působení
SNP, PFC, GGO a dále spolupůsobení GGO s SNP nebo PFC. Pouze kombinace SNP a GGO
vyvolávala buněčnou smrt BY-2 buněk. SNP působil specificky prostřednictvím NO, ačkoli
MTT test prokázal, že ferrikyanid sám o sobě ovlivňuje experimentální systém. Při vymírání
buněk působením SNP a GGO docházelo ke kondenzaci chromatinu jader, zatímco DNA byla
18
jen slabě a pravděpodobně nespecificky štěpena. Po šesti hodinovém působení SNP a GGO
byly v buňkách detekovány organely s nízkým vnitřním pH. Navíc byl pozorován snížený
počet vakuol a v cytoplazmě se objevovaly drobné měchýřky pozitivně nebo negativně
barvitelné FDA.
Závěr:Studium vlivu NO na rostliny není doposud uspokojivě vysvětlena a zcela jistě je
velmi zajímavé, že pouze kombinace SNP a GGO vyvolává buněčnou smrt buněk BY-2.
Literatura:
Delledonne, M. et al.: Plant Physiol. Biochem. 40, 605-610 (2002).
de Pinto, M. C., Tommasi, F. & De Gara, L.: Plant Physiol. 130, 698–708 (2002).
Leshem, Y. Y. Nitric Oxide in Plants Occurence, Function and Use (Kluwer Academic Publisehrs,
Dortrecht, 2000).
Víteček, J. et al.: Plant. Cell Tis. Org. Cultur. 79, 195-201 (2004)
Víteček, J. et al.: Chem. Listy v tisku (2005)
Víteček, J. et al.: Anal Biochem. odesláno (2005)
Příspěvek vznikl za podpory FRVŠ 180/2004, IGA MZLU 3/2004 a GAČR č. 525/04/P132
19
SEKCE MLADÝCH
INDUCIBILITY OF STAT1/SOCS3 TRANSCRIPTS AND PROTEIN BY
INTERFERON ALPHA/GAMMA IN HUMAN MELANOMA CELL LINES
Adámková Lenka*, Boudný Vladimír*, Kovařík Aleš**, Fojtová Miloslava**, Kovařík Jan*
* Department of Experimental Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Žlutý kopec 7,
656 53 Brno, Czech Republic; [email protected] or [email protected]
** Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135,
612 65 Brno, Czech Pepublic
Background: STAT (signal transducers and activators of transcription) and SOCS
(suppressors of cytokine signaling) cytoplasmic proteins play a key role in cytokine signal
transduction and modulation of gene transcription. Perturbances in some of these proteins
may serve as promising targets for cancer therapy. Moreover, cancer-related defective
JAK/STAT/SOCS pathways might negatively affect responses to interferons (IFNs) and other
cytokine-based immunotherapeutical interventions.
Purpose: To correlate the induction of SOCS 3 by IFNs on the mRNA and protein levels with
the STAT1 phosphorylation at serine 727 (S727) and tyrosine 701 (Y701) aminoacid residues
in human malignant melanoma cell lines.
Material and Methods: In this study we used a unique collection of 18 established malignant
melanoma cell lines and 3 normal skin keratinocytes. STAT1 expression and inducibility of
its activated phosphoforms were examined by Western blots using immunoprecipitation and
specific anti-STAT1 antibodies. SOCS3 protein level were determined by immunoblots using
polyclonal anti-SOCS3 commercial antibody. STAT1 and SOCS3 mRNA levels were
analyzed by Northern blot.
Results: In malignant melanoma cell lines, the SOCS3 has been induced by IFN gamma in
83% cases at both protein and mRNA levels; induction by IFN alpha was observed in 17% at
the protein level and in 0% at the mRNA level. IFN gamma but not IFN alpha stimulated
SOCS3 expression in normal keratinocytes (100%). IFN gamma induced phosphorylation of
STAT1 at S727 (39% cases) and Y701 (89% cases); transcripts expressed as the
STAT1/GAPDH ratio were reduced 2-3 fold in melanoma cell lines compared to normal
keratinocytes.
Conclusions: (I.) IFN gamma seems to be much more powerful inductor of SOCS3 than IFN
alpha, on both protein and mRNAlevels.
(II.) There does not seem to be simple correlation between SOCS3 induction and STAT1
protein phosphorylation.
(III.) Melanoma cell lines possessed significantly reduced levels of STAT1 mRNA than
normal keratinocytes suggesting silencing of STAT1 expression in tumor cells.
Acknowledgements: Supported by grants NC/7139-3 from the Internal Grant Agency of the
Czech Ministry of Health, 301/03/0370 from the Grant Agency of the Czech Republic and by
Institutional Project No. MZ 00020980501.
20
PROTEIN STRUCTURE SOLUTION BY NMR SPECTROSCOPY
Josef Chmelík, Monika Nálezková, Lukáš Žídek, Vladimír Sklenář
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Národní centrum pro výzkum
biomolekul, Kotlářská 2, 611 37 Brno
High-field NMR spectroscopy represents a method that can be used to determine threedimensional structure of proteins. Unlike diffraction techniques, NMR spectroscopy can
provide information on selected structural details and dynamics in solution.
Chemical shifts, scalar and dipolar couplings, and dipolar relaxation are sensitive to
molecular conformation. Quantification of these parameters permits structural analysis by
NMR spectroscopy. However, it is not possible to determine precise structure of biomolecules
directly from NMR data because we are not able to assign all measurable atoms in molecule,
determine all interatomic distances, torsion angles, and dipolar data necessary to "fold up" the
molecule. As a result, computational methods such as restrained molecular dynamics are used
for the precise structure determination based on the incomplete data. Examples of this
approach will be presented.
This work is supported by the following research grant: Ministry of Education, Youth and
Sports of the Czech Republic (LN00A016)
COMPUTATIONAL MODELING OF THE DEGRADATION OF SULPHUR
MUSTARD BY HALOALKANE DEHALOGENASES
1
Petr Jeřábek1, Zbyněk Prokop1, František Opluštil2 and Jiří Damborský1
National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk Univerzity,
Kotlářská 2, 611 37, Brno
2
Military Technical Institute of Protection, Brno, PS547, 602 00 Brno
Bis(2-chloroethyl)sulphide is halogenated organic compound also known as sulphur
mustard or yperite. This substance can be used as warfare alkylating agent. A development of
novel technology for its degradation is important for environmental decontamination. We
have proposed method for sulphur mustard degradation based on enzymatic dehalogenation
by microbial enzymes haloalkane dehalogenases. Microorganisms use haloalkane
dehalogenases for obtaining energy and carbon from degradation of halogenated organic
compounds. The molecular modeling methods were used for testing the enzyme ability to
degrade sulphur mustard. An enzyme-substrate complex was modeled by molecular docking,
subsequently an activation barrier for the first dehalogenation step (SN2) was estimated by
semiempirical quantum-mechanics method. The same calculation was calculated for analogue
bis(2-chloroethyl)ether which is known good substrate for haloalkane dehalogenases. The
differences between activation barriers of both reactions suggested suitability of haloalkane
dehalogenase for sulphur mustard degradation. This assumption was confirmed by laboratory
experiments.
21
Figure 1. Reactive position of sulphur mustard in the active site of enzyme LinB obtained
from molecular docking. Important catalytic residues of the enzyme active site including the
nucleophile (D108), catalytic base (H272) and halide-stabilizing residues (W109 a N38) are
shown together with bis(2-chloroethyl)sulphide molecule. Dotted line indicates nucleophilic
attack.
STUDY OF FIBRINOGEN USING MATRIX – ASSISTED LASER
DESORPTION/IONISATION TIME OF FLIGHT MASS SPECTROSCOPY
Roman Kotlín1, Jan E. Dyr1, Jiří Šantrůček2
Institute of hematology and blood transfusion, U nemocnice 1, 128 20 Prague 2
2
Department of biochemistry and microbiology, Institute of chemical technology Prague,
Technická 5, 166 28 Prague 6
1
Fibrinogen is a 340 kDa glycoprotein. It is synthetized in liver and circulates in blood
plasma. Fibrinogen is comprised of two symmetric half – molecules, each having 3 different
polypeptides, designated Aα (610 aminoacid residues), Bβ (461 aminoacid residues) and γ
chain (411 aminoacid residues).
During coagulation, thrombin cleaves the amino-termini of the Aα and Bβ chains of
fibrinogen, releasing fibrinopeptides A and B, and corverting fibrinogen to fibrin monomers.
The spontaneus polymerization of the fibrin monomers initiates fibrin clotting with the
formation of fibrin clot.
We studied tryptic and α-chymotryptic digests of the fibrinogen molecules from
healthy donors after isolation of fibrinogen from blood and SDS – PAGE electrophoresis in
reducing conditions. Fibrinogen was isolated from human plasma either by precipitation with
saturated 25% ammonium sulfate or by forming the clot which was rinsed in buffer. Isolated
fibrinogen was reduced with 2-mercaptoethanol. Isolated fibrinogen chains were obtained by
SDS – PAGE electrophoresis.
Tryptic and α-chymotryptic digests were studied by matrix – assisted laser
desorption/ionisation time of flight mass spectroscopy. We obtained peptide mass maps and
searched against the database of tryptic/α-chymotryptic digests. We found almost all
estimated peptides with 1 Da tolerance. Coverage of fibrinogen Aα chain, using trypsin, was
22
about 95,0 %, coverage of fibrinogen Bβ chain, using trypsin, was about 89,7 % and coverage
of fibrinogen γ chain, using trypsin, was about 74,7 %. Using α-chymotrypsin we obtained
less peaks and minor coverage of all fibrinogen chains.
Using MALDI-TOF mass spectroscopy, we found digests corresponding to αE chain.
αE chain is extended form of Aα chain rising by alternative splicing of RNA. It comprises the
unique 236 – residue C – terminal extension. This extened Aα chain variant amounts to 1 –
3% of predominat form. We found 7 digests corresponding to this chain, namely residues αE
721 – 725, αE 855 – 859, αE 848 – 854, αE 679 – 687, αE 726 – 743, αE 658 – 678 and αE
652 – 678.
Acknowledgement: This work was supported by GAČR č. 303/03/0249.
MOLECULAR SYSTEMATIC INVESTIGATION OF THE LEMANEACEAE
(RHODOPHYTA, FLORIDEOPHYCIDAE) BASED ON 18S RIBOSOMAL DNA
SEQUENCE DATA
Pavel Kučera1, Thomas Kerstan2, Wolfgang Gross2
1
Department of Botany, Masaryk University Brno, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech Republic
2
Institut für Biologie, Freie Universität Berlin, Königin-Luise-Strasse 12-16a, 14195 Berlin,
Germany
All freshwater representatives of red algae with uniaxial cartilagineous and
pseudoparenchymatous thalli are included in the broad genus Lemanea in traditional
classifications of Rhodophyta. Two subgenera of this genus were distinguished, Lemanea and
Paralemanea. The recently proposed elevation of these subgenera to the generic level seems
to be fully justified. The 18S rDNA (SSU) sequences from 10 populations of Lemanea and
Paralemanea species in the Czech Republic were used to construct phylogenetic hypotheses.
The results show Lemaneaceae as a monophyletic group among the other rhodophytes. Our
molecular systematic features correspond with classical morphological features and validate
the separation of the two genera, Lemanea and Paralemanea.
However, the increasing data from natural populations shows that not all the traditional
diacritical features are reliable for distinguishing species. Of the four species Lemanea
fluviatilis and L. torulosa appear to be well-defined, but there are no clear differences between
Paralemanea annulata and P. catenata. Our investigation found no differences between P.
catenata and P. annulata. On the other hand, Lemanea fluviatilis and L. torulosa appear to be
morphologically well-defined species, but our results do not support this interpretation.
This work was supported by a research grant FRVŠ G4551.
23
ANALYSIS OF p53 PROTEIN IN PATIENTS WITH B-CELL CHRONIC
LYMPHOCYTIC LEUKEMIA
Jitka Malčíková1,4, Martin Trbušek1,4, Jana Šmardová2, Soňa Bukovská1,4, Miluše Svitáková2,
Dita Mentzlová3, Vlasta Linková3, Petr Kuglík3, Michael Doubek4, Yvona Brychtová4, Šárka
Pospíšilová1,4 and Jiří Mayer4
1 – Center of Molecular Biology and Gene Therapy, Department of Internal Medicine –
Hematooncology, UH (University Hospital) Brno, 2 – Institute of Pathological Anatomy, UH
Brno, 3 – Department of Medical Genetics, UH Brno 4 – Department of Internal Medicine –
Hematooncology, UH Brno.
B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most frequent leukemia in Western
world. Inactivation of p53 gene occurs in 10-17% cases of B-CLL and significantly correlates
with bad prognosis - aggressive disease, inferior survival and resistance to therapy. P53
protein, called “the guardian of the genome”, is the short-lived transcription factor, which
plays a key role in cell cycle regulation and triggers cell cycle arrest or apoptosis. The level of
wild-type protein is mostly undetectable in normal cells and protein stabilization and
functional activation via phosphorylation (e.g. using ATM kinase) occurs in response to DNA
damage. Mutant p53 protein accumulates in the cell due to its restricted degradation and
therefore the overexpression of the protein is considered as a marker of bad prognosis in most
human cancers.
We analyzed the status of both alleles of p53 gene and ATM gene and p53 protein
expression in 120 B-CLL patients. The p53 and ATM genes status were determined by
cytogenetics (using FISH probes detecting 17p13.1 locus coding for p53 gene and 11q22-23
locus coding for ATM). Functional capability of the p53 protein to induce transcription was
determined by yeast functional assay (FASAY) and the level of p53 protein expression was
detected by Western blot analysis. In addition, all detected p53 mutants were confirmed by
DNA sequencing. We found that almost one half of patients disrupted ATM/p53 pathway due
to the deletion and/or mutation of p53 or ATM genes, but none patient exhibited inactivation
of both genes simultaneously. Most samples with mutated p53 gene expressed high level of
the protein detected in Western blotting. Lower, but clearly detectable level of p53 protein
occurred also in almost half of patients with wild-type p53 alleles. We can conclude, that
single nucleotide substitutions and short deletions within the critical regions of the p53 protein
were present in B-CLL patients and significantly influenced the transcriptional activity and
the expression level of p53.
The work was supported by grant MŠMT 1K04017 and grant NF Elpida - Nukleus.
24
DISTRIBUTION OF GRAM-POSITIVE COAGULASE-NEGATIVE CATALASEPOSITIVE COCCI ISOLATED FROM HOSPITAL MATERIAL.
Libuše Malíková
Regional Public Health Institute, Masná 3c. 602 00 Brno
In this study I investigated 200 strains of copagulase-negative staphylococci isolated
from hospital material from standard hospital departments.
The strains were identified by using sets STAPHYtest and APIStaph. This sets will be
completed with several convenctional tests (coagulase, pigment, catalase, oxidase, betaglukosidase). There was also tested the sensibility to antibiotics (novobiocin, bacitracin S and
furazolidon).
There were found 7 different species and subspecies of coagulase-negative
staphylococci.
There were identified the strains, which produce slime and delta hemolysin, which
belong to two important factors of virulence.
In conclusion there was valorized the importance of classical fenotype analysis.
Key words : coagulase-negative staphylococci – virulence factors – antibiotics
- fenotype analysis
TELOMERE SHORTENING BY ACYCLIC NUCLEOSIDE PHOSPHONATES
M. Hájek, N. Matulová, I. Votruba and A. Holý
Insitute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic,
Flemingovo n. 2, 166 10 Prague 6
Telomeres are located at the end of eukaryotic chromosomes and consist of small,
tandemly repeated noncoding sequences of nucleotides ((TTAGGG)n in all vertebrates).
Telomeres play an essential role in stabilizing chromosomal end integrity and replicative
senescence. Telomere shortening is prevented by enzyme telomerase which adds telomeric
sequences to the ends of chromosomes. To inhibit telomerase activity followed by telomeric
shortening we used acyclic nucleoside phosphonates 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]guanine
(PMEG) and 2,6-diamino-9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]purine (PMEDAP), because their
diphosphates (analogues of dNTPs) act as competitive substrate/inhibitors of telomerase. We
performed our investigation in vivo on the model of T-cell spontaneous lymphoma of
Sprague-Dawley inbred rat and in vitro on the cell cultures (CCRF-CEM, HL-60). Terminal
restriction fragments (TRF) were measured by the method of Southern blotting of genomic
DNA digested with restriction enzyme followed by hybridization. Both nucleotide analogues
(PMEDAP, PMEG) affected telomere length. The most notable change in the telomere length
was found in cell culture CCRF-CEM, which was grown in the presence of 7 µM PMEDAP
and 1 µM PMEG. The loss of telomeres was more than 2,5 kbp after 5-weeks treatment. No
change in telomere length of T-cell lymphoma was detected.
25
p53 TUMOR SUPPRESSOR INHIBITS PROLIFERATION AND INDUCES
DIFFERENTIATION OF V-MYB-TRANSFORMED MONOBLASTS
Jarmila Navrátilová1, Viktor Horváth2, Antonín Lojek2, Bořivoj Vojtěšek3, Jan Šmarda1
1
Department of Genetics and Molecular Biology, Masaryk University, Faculty of Science,
Kotlarska 2, 611 37 Brno
2
Institute of Biophysics, Kralovopolska 135, 612 65 Brno
3
Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7, Masarykova ctvrt, 656 53 Brno
c-myb proto-oncogene codes for transcription factor that is essential for hematopoiesis
in vertebrates. c-myb expression is high in immature hematopoietic cells and declines as cells
differentiate to terminal stages. There is a truncated form of the c-myb, the v-myb oncogene,
that has been transduced by two acutely transforming chicken retroviruses. One of them is
avian myeloblastosis virus (AMV) that transforms monoblastic cells thus causing acute
monoblastic leukemia in infected chickens. The AMV v-myb can also transform monoblastic
cells in vitro. The line of AMV v-myb-transformed chicken monoblasts BM2 was obtained
from bone marrow of chicken embryos injected with immature myeloid cells that had been
infected with AMV. Presence of constitutively expressed v-myb interferes with terminal
differentiation steps of BM2 monoblasts into macrophages.
p53 is a well-known tumor suppressor protein that is up-regulated in cells suffering from
stress, DNA damage or oncogene activation. The p53 protein also acts as transcription factor
controlling expression of multiple genes. The set of p53-target genes includes the genes
coding for proteins that participate in cell cycle regulation, such as p21WAF1/Cip1 capable of
arresting the cell cycle in G1- phase, and 14-3-3σ and GADD45 that can arrest cell cycle
progression in G2-phase. In addition, the list of p53 target genes includes regulators of
programmed cell death, such as the bax gene. The cells undergoing apoptosis induced by Bax
usually exit the cell cycle in G1-phase. In contrast, the cells exiting the cell cycle in G2-phase
undergo rather differentiation than programmed cell death.
The aim of this study was to investigate whether human p53 protein can suppress
transforming activity of the v-Myb oncoprotein in BM2 cells. Therefore, we transfected BM2
monoblasts with cDNA coding for human p53 and evaluated phenotype of p53-expressing
BM2 cells of several independent clones of stable transfectants. Increased p53 level caused
growth arrest of BM2p53 cells in G2-phase of the cell cycle. At the same time, the p53
protein resumed terminal differentiation capability of BM2 cells as documented by increased
adherence, phagocytic activity, production of reactive oxygen species and α-naphtyl acetate
esterase activity. These results show that p53 tumor suppressor protein can suppress
transformation the v-myb oncogene in leukemic cells.
This work was supported by the grant MSM0021622415 of the Ministry of Education, Youth
and Sports of the Czech Republic.
26
CHARACTERIZATION OF PRESUMPTIVE STAPHYLOCOCCUS XYLOSUS
STRAINS BY SDS-PAGE PROTEIN PROFILES
Dana Nováková1), Vlastimil Štětina1), Ivo Sedláček1) and Petr Petráš2)
1)
Czech Collection of Microorganisms, Brno
2)
Public Health Institute, Prague
Coagulase negative staphylococci are common members of human and animal
microflora. Although they are generally considered as non-virulent flora of skin, skin glands
and mucous membranes, certain staphylococci were found as important pathogens.
Staphylococcus xylosus and Staphylococcus equorum are two biochemically and
phylogenetically close species. Although S.xylosus is usually only transient on humans and is
primarily acquired from domestic animals and their products, it has been isolated also from
human clinical specimen, mainly from urinary tract infections. S.equorum has never been
isolated from human clinical material in the Czech Republic yet. Lack of the biochemical key
tests makes differentiating of these species difficult. It is very important to find another
reliable approach to distinguish S.xylosus and S.equorum species.
A group of 18 presumptive S.xylosus strains isolated from human clinical sources were
analysed by biochemical tests and ribotyping. SDS-PAGE protein analysis was performed to
confirm the results of the ribotyping.
Biochemical properties were tested by API Staph and ID 32 STAPH commercial kits as
well as by the conventional tests. The ribotyping was done with EcoRI and HindIII
restriction enzymes and a probe complementary to 16S-23S rRNA. Electrophoresis of the
proteins was performed using a 5% polyacrylamide stacking gel and 12% separating gel
containing 0.1% SDS. Evaluation of ribotyping and SDS-PAGE was done by GelCompar II
software.
The biochemical tests identified 17 S.xylosus strains and a one intermediate
S.xylosus/S.equorum strain. Some reactions atypical for S.xylosus species description
occurred. The ribotyping in contrast to the biotyping clearly recognized 4 strains as
S.equorum and a one strain that shows high similarity to Staphylococcus nepalensis reference
strains. Ribotyping profiles of the tested strains were very heterogeneous. The results of
SDS-PAGE were in a good agreement with the ribotyping data. Protein analysis divided
tested strains into four groups. The biggest group belongs to the S.xylosus strains, the second
group includes four S.equorum strains, the third group probably contains one S.nepalensis
strain. The last well separated group doesn´t show higher similarity to used reference strains
and to tested isolates on the base of protein analysis.
Our data indicate that SDS-PAGE as well as ribotyping have got a higher
discriminative power than biotyping to distinguish S.xylosus and S.equorum strains and they
are able to identify them.
This is the first occurrence of S. equorum in human clinical material in the Czech
Republic.
27
APPLICATION OF THE PCR AND SSCP METHODS IN MUTATION SCREENING
OF GENES ASSOCIATED WITH THE LONG QT SYNDROME
Ivo Papoušek, Martina Raudenská, Kateřina Kozubíková, Karel Chroust
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
The congenital long QT syndrome (LQTS) is a serious cardiac disorder caused by
mutations in at least seven different genes. Six of them (KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1,
KCNE2 and KCNJ2) encode various structural and regulative subunits of cardiac ion
channels, the seventh (ANK2) encodes small regulatory protein associating with ion channels.
The LQTS is characteristic by prolongation of QT interval on electrocardiograms, which is a
known risk for ventricullar fibrilation, seizures, syncope and potentially sudden death.
Molecular-genetic diagnostics based on polymerase chain reaction (PCR) and subsequent
methods such as single-strand conformation polymorphism (SSCP) can be of great
importance because the basic criterion for clinical diagnostics, the length of the QT interval,
can vary depending on age, sex etc. Mutation screening using the SSCP method can be very
fast and reliable.
The aim of our long-term project was to implementate mutation screening by means of
PCR and SSCP in three genes associated with LQTS: SCN5A (27 coding exons divided into
34 parts, KCNE2 (1 exon) and KCNJ2 (1 exon divided into 6 parts). Firstly, we suggested
primers covering whole coding regions of these genes. After subsequent optimalization of
PCR conditions for all studied fragments we used this methodics for amplification of DNA of
66 patients. PCR fragments were then analyzed by SSCP. Samples showing some irregular
pattern of bands on SSCP analysis were purified and sequenced. Total amount of 1961
samples (combined with previous projects) was analyzed so far.
In exon 28 of the SCN5A we found a single-nucleotide polymorphism C5607T. In total
of 65 analyzed samples, 40 samples displayed T/T genotype, 22 samples were of C/T
genotype and three samples represented C/C genotype. This would indicate allele frequency
of 0,785 (T allele). This observation shows great difference in comparison with other
population in which this SNP was previously observed (American – 0,123; Japanese – 0,46;
Chinese 0,413).
None mutation directly causing LQTS was found so far.
This work was supported by FRVŠ 554/2004 and NA/8063-3.
A COMBINED BIOSENSOR FOR DETERMINATION OF TOTAL AND GLYCATED
HEMOGLOBIN CONTENT IN BLOOD SAMPLES
Jan Přibyl, Petr Skládal
Masaryk University Brno, Faculty of Science, Department of Biochemistry, Kotlářská 2,
CZ-611 37 Brno
Glycated hemoglobin (GHb) is a stable minor Hb variant, containing glycated Nterminal β-chains, formed in vivo by posttranslational modification in the presence of glucose.
The ratio of glycated to nonglycated hemoglobin provides important information on diabetic
patient glycemic control over the previous 3-4 months. Development and testing of novel
GHb assays seems to be quite promising, as consensus on the reference method1 was found
28
only 4 years ago. Moreover, any common wide-spread method was not still established on the
market. In this contribution, a novel biosensor assay for GHb was proposed. Piezoelectric
biosensors represent sensitive and robust analytical instruments suitable for monitoring of
affinity interactions in real time. This transducer was combined with boronic acid, which is
able to bind compounds containing diol moieties with high affinity trough the reversible ester
formation. In this way, boronic acid derivatives are used as affinity ligands for separation of
molecules containing vicinal diol group – such as sugars, glycated proteins and nucleotides.
Two different approaches in immobilization of affinity ligand were employed during
GHb biosensor development, either the self-assembled monolayers of phenylboronic acid
(APBA) conjugates with various thiocompounds or incorporation of APBA into the matrix
structure. Comparative measurements realized with the constant concentration of glycated
hemoglobin demonstrated as the most feasible the biosensors with the immobilized monolayer
of APBA. This type of sensor exhibited specific response to various concentrations of
glycated hemoglobin in blood samples. The effect of pH on the biosensors response was
studied, pH 9.0 was determined as optimal for the interaction between immobilized APBA
and both sugar molecules and glycosylated hemoglobin. Furthermore, other effects (buffer
type, flow rate, etc.) affecting biosensor assay were studied.
The optimized piezoelectric biosensor, employing modified Drabkin reagent2 as the
carrier buffer, was online combined with the photometric assay of total hemoglobin content.
A Z-type absorption flow cell was used for this purpose, total Hb content was monitored at
540 nm.
To validate the biosensor assay, the levels of glycated Hb in blood samples of diabetic
patients obtained from the standard clinical analyzer were compared to the results of the
proposed method.
The presented biosensor is able to perform up to 40 assays without any loose of
sensitivity. Incorporation of the biosensor unit into the flow injection analyzer FIAlab allowed
fully automated measurements.
Further possibilities in the assay optimization and adaptations to fulfil the commercial
market demands will be discussed.
Keywords: quartz crystal microbalance, m-aminophenylboronic acid, glycated hemoglobin
[1] American Diabetes Association: Clinical Practice Recommendations, 24, S1, 2001.
[2] International Committee for standardization in haematology, Brit. J. Haemat., 13, 71, 1967
THE ASSOCIATION OF IL-6 GENE POLYMORPHISM WITH ADHD IN
CHILDREN
Radim Štaif1, Renáta Pitelová1, Pavel Theiner2, Ivana Drtílková2, Omar Šerý1
Masaryk University in Brno, Faculty of Science, Department of Comparative Animal
Physiology and General Zoology, Laboratory of Neurobiology and Molecular Psychiatry,
Kotlářská 2, 611 37 Brno
2
Masaryk University in Brno, Faculty of Medicine, Psychiatry Clinic, FN Brno Bohunice
1
Attention-deficit hyperactivity disorder (ADHD) is a common neurodevelopmental
polygenetic heritable disorder that includes inattention, excessive motor activity, impulsivity
and distractibility. In the past few years, interest in the molecular genetics of ADHD has
grown enormously, with many groups searching for susceptibility genes. Dopaminergic genes
29
have been prime candidates in the search for the genetic factors underlying novelty seeking
because of the central role that dopamine plays in the brain's reward system. However, the
findings are not conclusive and other new polymorphisms in different gene backgrounds are
investigated.
We have investigated whether there is an association between genes involving nervous
system - cytokines, including IL-2, IL-6, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). It is
known that proinflammatory pleiotropic cytokines such as interleukin-6 (IL-6) are expressed
in the central nervous system (CNS) during disease conditions and affect several brain
functions including memory and learning. Genetic variation in the promoter region of the
gene encoding the cytokine IL-6; -174 C/C polymorphism may encode enhanced production
of IL-6. Our objective was to determine whether the CC genotype is associated with ADHD.
In our association study, we studied the difference in genotype and allelic frequencies –174
polymorphism of IL-6 gene between hyperkinetic boys and boys in control group. We
isolated genomic DNA from buccal tissue or blood sample collected from each individual.
DNA was extracted by commercial kits UltraClean Tissue DNA or BloodSpin kit (Mobio,
USA). Polymerase Chain Reaction (PCR) was used for determination of genotypes. PCR
products were digested with restriction enzyme Taq I (MBI Fermentas) and subsequent
electrophoresed on 2% agarose gel (Eliphore). The X2 test and Fischer-exact test were
performed to assess the significance or non-significance association between studied groups
of boys. We found the association between –174 polymorphism of IL-6 gene and ADHD. The
allele C was observed frequently in ADHD group than in control group. These findings
highlight the need for further investigations of cytokines genes, in additional independent
ADHD samples, in the future.
This study was supported by the grant no. NF 6520-5/2001 of the Internal Grant Agency of
the Ministry of Health of the Czech Republic (IGA MZ CR).
GENE SPECIFIC SILENCING USING siRNA IN CANCER CELLS
Soňa Štruncová, Branislav Kusenda, Romana Borská, Boris Tichý, Jana Kotašková, Jiří
Mayer a Šárka Pospíšilová
Center of Molecular Biology and Gene Therapy, Department of Internal MedicineHematooncology, University Hospital Brno, Černopolní 9, Brno
RNA interference (RNAi) is a mechanism of sequence-specific gene silencing at the
post-transcriptional level. The introduction of double-stranded RNA (dsRNA) into a variety
of organisms and cell types leads to a degradation of the complementary mRNA. In
mammalian cells, introduction of long dsRNA initiates potent interferon antiviral response,
causing inhibition of protein synthesis and RNA degradation. siRNAs are short doublestranded molecules produced by cleavage of long dsRNA by DICER enzyme. Consequently
the siRNAs assemble into the RNA induced silencing complex (RISC), which recognizes and
cleaves target mRNA, complementary to the siRNA antisense strand. This mechanism can
induce selective recognition and specific degradation of mutant mRNA molecules. Short
synthetic siRNA molecules that do not activate cytotoxic response molecules in mammalian
cells can be used as a therapeutic approach to knock-down expression of oncogenes and
mutant variants of antioncogenes (e.g. p53).
30
Efficient down-regulation of the point-mutated p53 gene expression by transfection
siRNAs into cancer cells is a powerful tool for potential gene therapy. The anti p53-siRNA
expression vector is co-transfected to the tumour cells with pEGFP for selection of positive
transfectants using nucleofector technology (Amaxa Biosystems). Nucleofection is a special
highly efficient type of electroporation that combines unique electrical parameters and celltype specific nucleofection solutions and due to the direct transfer of vector DNA into the
nucleus can effectively transfect even almost none-transfectable cell lines. GFP positive cells
separated by cell sorting (FACS - Fluorescence Assisted Cell Sorting) are analysed for the
efficiency of siRNA silencing. The effect of siRNA is monitored using real-time PCR and
microarrays on RNA level and using Western-blotting on protein level. Our results suggest
that, specific siRNA silencing provides an efficient tool for p53 functional studies and
represents promising technology for cancer intervention.
The project was supported by grant MŠMT 1K04017 and grant NF Elpida – Nukleus.
PROTECTIVE EFFECT OF PLANT PHENOLICS ON UVA-INDUCED DAMAGE
IN HUMAN KERATINOCYTES
Alena Svobodová*, Jitka Psotová, Adéla Zdařilová, Daniela Walterová
Institute of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine, Palacký University,
Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic; *[email protected]
UV radiation (200 – 400 nm) is well known to exert a variety of deleterious effects on
human skin. UV skin exposure induces direct and indirect oxidative damage. This could result
in disturbed cell metabolism, morphological and ultrastructural changes, attack on the
regulation pathways, alterations in the differentiation, proliferation and apoptosis of skin cells.
Chronic UV exposure is connected with formation of erythema, edema, sunburn cell
formation, immune supression and DNA damage and increases the risk of photoageing and
skin cancer development. The use of active photoprotectives is one approach to protect
humans from harmful UV-induced effects. In last two decades herbal compounds have gained
considerable attention as UV-protectives1-3. The aim of this study was to investigate
protective effects of silymarin (SM), an extract from Silybum marianum (L.), and its
polyphenolic components silybin (SB) and dehydrosilybin (DS) on UVA-induced (320 –
400 nm) damage in human keratinocytes.
Compounds were tested for their radical scavenging activities and inhibition of
microsomal lipid peroxidation. Depletion in cell viability and cell membrane damage were
evaluted by neutral red assay and assessment of LDH leakage, respectively. UVA-induced
changes in cell proliferation were determined using immunodetection of bromo-deoxyuridine
incorporated into cellular DNA. The comet assay was employed to detect DNA single strand
breakage. Caspase-3 activation was determined using SDS-PAGE and immunoblot analysis.
Both flavonolignans and SM scavenged DPPH and superoxide radicals and was found to
be efficient inhibitors of lipid peroxidation of rat liver microsomal membranes. DS appeared
the best of all in the test parameters. Increasing cell viability and BrdU incorporation into
DNA, and reduced LDH leakage were obvious in UVA-irradiated cells treated with test
compounds. Furthermore UVA irradiation was found to induce HaCaT DNA damage as
analysed by comet assay. Treatment with SB, DS and SM reduced the level of DNA damage.
UVA (20 Jcm-2) also induced caspase-3 activation in HaCaT. The test compounds themselves
did not affected caspase-3 activity. After treatment of irradiated cells with DS and SM (4 h)
31
decrease in capase-3 activation at the concentration 25 µM was observed. In the case of SB no
protective effect was found.
In conclusion, this study reveals a protective role of both SM and flavonolignans (SB
and DS) against UVA-induced damage and cell death in cultured human keratinocytes. The
protection seems to be related to radical scavenging and antioxidant potency of the studied
compounds.
This work was supported by GA ČR grant No. 303/02/1097and FRVŠ grant No. 22/G3/2004.
REFERENCES
1. Svobodová A, Psotová J, Walterová D (2003) Biomed Papers 147: 137-145.
2. Pinnell RS (2003) Cutaneous photodamage, oxidative stress, and topical antioxidant
protection. J Am Acad Dermatol 48:1-19.
3. F'guyer S, Afaq F, Mukhtar H. (2003) Photochemoprevention of skin cancer by botanical
agents. Photodermatol Photoimmunol Photomed 19: 56-72.
VERSATILITY OF PROTEOM DURING TERMINAL DIFFERENTIATION
OF V-MYB TRANSFORMED MONOBLASTS
Petr Váňa1, Eva Zahradníčková1, Karolína Povolná1, Hana Konečná, Zbyněk Zdráhal, Jan
Šmarda1
1
Department of Genetics and Molecular Biology, 2 Laboratory of Functional Genomics and
Proteomics, Masaryk University, Faculty of Science, Kotlarska 2, 611 37 Brno
The v-myb oncogene of avian myeloblastosis virus causes acute monoblastis leukemia
in infected chickens and transforms myelomonocytic cells in vitro. The v-myb is a doubly
truncated version of c-myb protooncogene that is essential for hematopoiesis in vertebrates. cmyb knock-out mice are not viable and die in utero from failure of erythropoiesis. The c-myb
expression is high in immature hematopoietic cells and declines as cell differentiate to
terminal stages. High constitutive c-myb expression blocks these terminal differentiation
steps. Transforming effect of the AMV v-myb oncogene also results from its ability to
interfere with hematopoietic differentiation. Specifically, it blocks maturing of monoblasts to
monocytes and macrophages. There is a cell line of v-myb-transformed chicken monoblasts
(BM2) that is useful for studies of transformation by the v-myb oncogene. BM2 cells actively
proliferate in suspension but they can be induced to differentiate to adherent macrophages
using various inducers, such as phorbol ester TPA and histon deacetylase inhibitor trichostatin
A (TSA). In addition, BM2 monoblasts with induced expression of retinoic acid (RA)
receptors can also resume terminal differentiation pathway upon treatment with RA. Although
these differentiation inducers are widely used in various leukemic cell lines, molecular
mechanisms of their effects are not known completely. In order to investigate the versatility of
proteom of leukemic cells undergoing terminal differentiation, we performed twodimensional electrophoresis of proteins extracted from BM2 cells induced with TPA and TSA
for various time periods and compared it with two-dimensional electrophoretogram of
untreated control cells. Similar analyses were performed with BM2RAR cells upon induction
with RA. Some of the spots of differentially expressed proteins were digested with trypsin and
identified by MALDI-TOF mass spectrometry as heat shock protein 70, protein-glutamine
glutamyltransferase 4, prostaglandin-D-synthase, EMS1, nucleobindin 2 precursor (DNAbinding protein NEFA), actin, ARP2/3 protein complex subunit 3 and chaperonin Hsp60.
32
Biological significance of versatility of these proteins in differentiating BM2 cells is currently
investigated.
This work was supported by the grant 301/03/1055 of the Grant Agency of the Czech
Republic.
THREE CASE REPORTS OF DYSFIBRINOGENEMIA – A METHODOLOGICAL
APPROACH
Martina Vaníčková, Jiří Suttnar, Jan Evangelista Dyr, Peter Salaj
Institute of Haematology and Blood Transfusion, U Nemocnice 1, 128020 Prague 2
Fibrinogen is a soluble plasma protein (340 kD) which plays a crucial role in mediating
clot formation, cellular and matrix interactions, fibrinolysis, inflammation and wound healing.
Blood coagulation proceeds through a cascade of proteins activations that ultimately lead to
the catalytic cleavage of fibrinogen by thrombin to yield fibrin. The release of fibrinopeptides
A and B by thrombin exposes polymerization sites. Subsequently, fibrin gel is formed.
Dysfibrinogenemia is a hereditary disorder caused by the presence of abnormal fibrinogen
molecules and can result in coagulation malfunctions of different consequences.
Plasma obtained from three patients with coagulation disorders and bleeding was
studied in order to determine whether the patients suffer from dysfibrinogenemia. Kinetic
measurements of fibrinopeptide A and B release were performed. Diluted plasma was
incubated with thrombin, reactions were stopped at various time intervals by addition of
trichloroacetic acid, centrifuged twice and the content of fibrinopeptides in the supernatant
was determined by RP-HPLC method. Fibrin polymerization curves were obtained by
turbidity measurements. Diluted plasma was treated with thrombin and the increasing
turbidity caused by the clot formation was measured at 365 nm. The influence of patient
plasma on platelet adhesion was also studied. The platelets obtained from the blood of healthy
donors were isolated by differential centrifugation, resuspended in plasmas of patients and
adhered to fibrin(ogen) surfaces under static condition. All experiments were compared with
the control samples.
Fibrinopeptide release in plasma of all three patients differed from the control. The
differences in clot turbidity measurement were found. The plasma of two patients did not
form a rigid clot and one patient plasma formed a clot with a lower final turbidity than in the
case of the control. No influence of patients plasmas on platelet adhesion to fibrin(ogen)
surfaces was found. Our results showed that the patients suffer from dysfibrinogenemia of
different types. However, all were primarily caused by impaired fibrinopeptide release by
thrombin. The methods that investigate functional properties of fibrinogen can be useful for
detection of different malfunctions and can contribute to better diagnosis and treatment of
coagulation disorders.
The support of IGA MZ ČR NA-7616-3 and GAČR 303/03/0249 is acknowledged.
33
COMPLEX MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF PATIENTS WITH SPINAL
MUSCULAR ATROPHY
Eva Zapletalová, Lenka Fajkusová, Jana Jedličková
Center of Molecular Biology and Gene Therapy University Hospital Brno
Spinal Muscular Atrophy (SMA) is an autosomal recessive neuromuscular disease,
characterised by degeneration of the anterior horn cells of the spinal cord. SMA is in 95%
cases caused by homozygous loss of the survival motor neurone gene (SMN1). However all
patients have one or more copies of the SMN2 gene, nearly identical to SMN1. Both genes
encode the SMN protein but the level produced by SMN2 is insufficient to protect from
disease. Similarity of both SMN genes, within the SMA region in 5q13, makes the full
diagnostics of SMA difficult. Homozygous deletion of SMN1 is possible to identify with
simple PCR and digestion, but for identification of 5% patients with compound deletion (with
the subtle mutation on the second allele), as well as identification of carriers of SMA (1/60 –
1/40), more sophisticated methods are required. Also the number of SMN2 copies is
important to know, not only for genotype-phenotype correlation, but also for future SMA
therapy based on the increased expression of SMN protein from SMN2 gene (for example
treatment with Phenylbutyrate). We use Real-Time PCR with external standard for detection
of copy number of SMN1 and SMN2 genes. For identification of subtle mutations we are
going to introduce Methods of Long-Range PCR and nested PCR with DHPLC and
sequencing.
EFFECT OF ISOQUINOLINE ALKALOIDS ON CYTOCHROME P450 1A1
ACTIVITY.
Adéla Zdařilová*, Radim Vrzal, Zdeněk Dvořák
Institute of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine, Palacký University,
Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic.* E-mail: [email protected]
Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids sanguinarine (SA) and chelerythrine
(CHE) are a group of isoquinoline alkaloids that have phenylalanine as their precursor. They
are isolated from plant species Chelidonium majus, Macleaya cordata, and Sanguinaria
Canadensis 1. These alkaloids exert wide spectrum of biological activities, e.g. antimicrobial,
anti-inflammatory, adrenolytic, sympatholytic and local anesthetic, including cytotoxicity
against various normal human cells and cancer cell lines 2. They interact in vitro with
proteins, many enzymes, and DNA through the addition of nucleophilic groups to an imine
bond, by ionic interaction, or by DNA intercalation. Due to antiplaque and anti-inflammatory
activities they are used in dental care products (toothpaste and mouthwash) 3. However,
epidemiological studies have shown an association between SA use and oral premalignant
lesions 4. When compared with known carcinogens, such as polycyclic aromatic hydrocarbons
(PAHs), the adverse effect of alkaloids may be caused by their metabolic activation with the
involvement of cytochrome P450 (CYP1A) 5. Previous in vivo study demonstrated that
pretreatement of mice with 3-methylcholanthrene (3-MC) an inducer of P450 enzymes,
promote detoxification of SA 6. Similarly, recent in vitro study also demonstrated that other
CYP1A inducers, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) and β-naphtoflavone (β-NF)
attenuate SA toxicity in primary rat hepatocytes and HEPG2 cells 7.
34
Since it is known that CYP1A isoform expression is controlled by aryl hydrocarbon
receptor (AhR), the aim of our work was to study the effect of SA and CHE on AhR driven
gene expression. AhR transcriptional activity was assessed by: i) measurement of specific
CYP1A1 enzyme activity in human hepatoma cell line (HepG2) as 7-ethoxyresorufine-Odeethylase activity (EROD), ii) determination of CYP1A1 protein level (western blot) in
HepG2 cells, iii) chemical-activated luciferase expression (CALUX) assay in rat hepatoma
cell line stably transfected with DRE-LUC vector (H4IIE.Luc). The comparison of the data
from all models used will be presented.
Acknowledgments:
This work was supported by grants FRVŠ 25/G3/2004 and GAČR 303/04/P074.
References:
1. Šimánek, V., 1985. Benzophenanthridine alkaloids. p. 185-240. In: A. Brossi (ed.),
The alkaloids, Vol. 26, Academic Press, New York.
2. Šimánek V., In „Chemical probes in biology“ Kluwer Academic Publisher, 245-254,
2003.
3. Walterová, D., Ulrichová, J., Válka, I., Vičar, J., Vavrečková, C., Táborská, E.,
Harkrader, R.J., Mezer, D.L., Černá, H., Šimánek, V. Acta Univ. Palacki. Olomouc
(Olomouc), Fac. Med. 139, 7-16, 1995.
4. Eversole, L.R., Eversole, G.M., Kopčik, J. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral
Radiol. Endot. 89, 455-464, 2000.
5. Peeples, A., Dalvi, R.R.. J. Appl. Toxicol. 2, 300-302, 1982.
6. Williams, M.K., Dalvi, S., Dalvi, R.R. Vet. Hum. Toxicol. 42, 196-198, 2000.
7. Vrba, J., Kosina, P., Ulrichová, J., Modrianský, M. Toxicol. Lett. 151, 375-387, 2004.
THE COMPARISON OF FE-REDUCING BACTERIA USING BIOCHEMICAL AND
MOLECULAR METHODS-PHYLOGENETIC STUDY
1
Aleksandra Ziembinska1, Andrzej Woznica2, Sylwia Labuzek2
Silesian University of Technology, Environmental Biotechnology Department, Akademicka 2,
44-101 Gliwice, Poland, Phone: +48322372855, fax:+48322372946,
e-mail: [email protected]
2
University of Silesia, Department of Biochemistry, Jagiellońska 28; 40-032 Katowice,
Poland, Phone: +48 32 255 20 98, Fax: + 48 32 255 58 73
Phylogenetic studies must be preceded by precise identification of bacterial strains
taken into study. Phenotypical tests (such as biochemical) could be the solution in family,
genus and strain typing. However the biochemical features of the particular group of bacteria
are variable and in effect could lead to false conclusions. The solution for phenotypical
analysis’ difficulties are molecular tests, widely used in identification and genotypes
comparison not only in microbial studies. Obtainment of credible identification needs several
organism’s features analysis, based on strictly mathematical methods. Usage of information
coded in DNA, RNA and proteins helped to eliminate necessity of analysing wide range of
features.
The purpose of this study was the identification of six strains Fe-reducing bacteria
(Iron Reducing Bacteria – IRB) isolated from stagnant water. Identification was carried out
on biochemical tests and 16S rDNA analysis, due to comparison of effectiveness and
compatibility of both types of tests. All strains belonged to the family of Enterobacteriaceae,
35
potential patogenic microorganisms received from environmental samples. All strains were
facultative anaerobic.
The phylogenetic analysis based on 16S rDNA comparision using Clustal W
programme was undertaken. Except 16S rDNA sequences of six IRB identyfied previously,
42 other Fe-reducing bacteria genes were taken into consideration. The sequences were
received from NCBI Gene Bank. The analysis let to outline the phylogenetic relationships in
the group of IRB bacteria.
36
POSTERY
STUDIUM INTERAKCÍ MOLEKUL SACHARIDŮ S PROTEINY
POMOCÍ METOD MOLEKULOVÉHO MODELOVÁNÍ
Jan Adam1, Zdeněk Kříž1, Anne Imberty2, Jaroslav Koča1, Michaela Wimmerová1,3
1
Národní centrum pro výzkum biomolekul a 3Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta,
Masarykova universita, Kotlářská 2, 611 37 Brno
2
CERMAV-CNRS, BP 53, F-38041, Grenoble, Cedex 09, France
Detailní znalost interakcí mezi malými molekulami a proteiny vede k vysvětlení mnoha
specifických vazeb těchto molekul a také k návrhu účinějších a selektivnějších léčiv.
K tomuto popisu lze v současné době využít počítačové modelování a zejména programy pro
hledání nejvhodnějšího umístění substrátu do molekuly hostitele, dokování, v kombinaci
s molekulově dynamickými simulacemi.
Sacharidy jsou látky důležité pro život, nejen jako zásobárna energie či strukturní
komponenty, ale i jako látky napomáhající stabilizaci, rozpoznávání a komunikaci. Široká
variabilita jejich funkcí je důsledkem stability a stereochemické diverzity glykosidických
vazeb.
Lektiny jsou proteiny neimunní povahy (nejde tedy o protilátky) získávané z rostlin,
živočichů či mikroorganismů. Lektiny jsou schopny selektivně rozpoznávat a vázat terminální
mono- a oligosacharidové řetězce glykoproteinů, glykopeptidů a glykolipidů, a to s vysokou
vazebnou specifitou obdobnou reakci antigen-protilátka.
V tomto případě jsou studovány lektiny bakteriální, jmenovitě lektin PA-IIL pocházející
z bakterie Pseudomonas aeruginosa. Tento podmíněný lidský patogen je zodpovědný za
vysokou morbiditu a mortalitu pacientů s cystickou fibrózou a taktéž napomáhá kolonizaci
plicních alveol tímto patogenem.
V případě PA-IIL se jedná se o tetramerní makromolekulu obsahující ionty Ca2+, vyznačující
se neobvykle vysokou afinitou k L-fukose a oligosacharidům tuto obsahující.
Pozornost je zaměřena na počítačové modelování interakce lektinu s mono- a oligosacharidy
metodami molekulového dokování, s budoucím výhledem na počítačové modelování
důsledků mutací ve vazebném místě na vlastnosti lektinu. Studium mutovaných struktur bude
provedeno metodami molekulového dokování (program Autodock 3.0) s následným studiem
vybraných struktur pomocí molekulové dynamiky (programový komplet AMBER-8.0).
Studovaná struktura lektinu PA-IIL byla získána z proteinové databáze PDB (PDB kód
1
GZT).
Reference:
[1] Imberty, A., Wimmerová, M., Mitchell E. P. and Gilboa-Garber, N.: Structures of the lectins from
Pseudomonas aeruginosa: insights into the molecular basis for host glycan recognition. Microbes and Infection 6
(2004) p. 221-228.
37
[2] Morris, G. M., Goodsell, D. S., Halliday, R.S., Huey, R., Hart, W. E., Belew, R. K. and Olson, A. J.:
Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and and Empirical Binding Free Energy Function.
J. Computational Chemistry,19 (1998) p.1639-1662.
[3] D.A. Case, T.A. Darden, T.E. Cheatham, III, C.L. Simmerling, J. Wang, R.E. Duke, R. Luo, K.M. Merz, B.
Wang, D.A. Pearlman, M. Crowley, S. Brozell, V. Tsui, H. Gohlke, J. Mongan, V. Hornak, G. Cui, P. Beroza, C.
Schafmeister, J.W. Caldwell, W.S. Ross, and P.A. Kollman (2004), AMBER 8, University of California, San
Francisco.
METALOTHIONEINEM MODIFIKOVANÝ POVRCH VISÍCÍ RTUŤOVÉ
KAPKOVÉ ELEKTRODY JAKO CITLIVÝ BISOENZOR TĚŽKÝCH KOVŮ
Vojtěch Adam1,2, Jitka Petrlová1, David Potěšil1,2, Josef Zehnálek1, Bernd Sures3,
Libuše Trnková4, René Kizek1
1)
Ústav chemie a biochemie, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno
2)
Katedra analytické chemie, MU, PřF Kotlářská 2, 611 37 Brno
3)
Univ Karlsruhe, Zool Inst Okol Parasitol 1, Karlsruhe, D-76128, Německo
4)
Katedra teoretické a fyzikální chemie MU, PřF Kotlářská 2, 611 37 Brno
ÚVOD: Rozvoj průmyslové výroby přináší produkci celé řady škodlivých sloučenin –
pesticidů, toxických organických látek a také těžkých kovů. Koncentrace těžkých kovů
v životním prostředí je závažným problémem v ochraně lidského zdraví a produkci potravin
v řadě zemí. A proto snadná a rychlá detekce těžkých kovů ve velmi nízkých koncentracích je
nezbytná pro zajištění opatření proti akutní intoxikaci, a především, proti dlouhodobé
expozici, která může vést ke vzniku mnoha onemocnění, popřípadě ke smrti. Nedávno bylo
publikováno několik prací popisujících stanovení těžkých kovů pomocí biosenzorů
založených na interakci těžkého kovu s DNA, enzymem (především ureasou), bakterií a
proteinem. Cílem této práce bylo navrhnout biosenzor těžkých kovů založený na interakci
kovu (kadmium a zinek) s metalothioneinem. Dále jsme navržený biosenzor aplikovali pro
detekci těžkých kovů v lidských tělních tekutinách (lidská krev a moč).
MATERIÁLY A METODY: Elektrochemické měření bylo prováděno na AUTOLABu
(EcoChemie, Holandsko) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). Metalothionein
byl detekován pomocí AdTS DPV. Vzorky obsahující metalothionein byly před každým
měřením redukovány pomocí přídavku 1 mM tris(2-karboxyethyl)fosfinu (TCEP). Základním
elektrolytem byl 0,5 M chlorid sodný, pH 6,4. DPV parametry byly následující: počáteční
potenciál –1,2 V, konečný potenciál –0,3 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s,
potenciálový krok 1,05 mV/s, modulační amplituda 25 mV.
VÝSLEDKY A DISKUSE: Nejprve jsme studovali elektrochemické chování
metalothioneinu na povrchu rtuťové visící kapkové elektrody pomocí AdTS DPV. Dokonalé
pokrytí elektrodového povrchu bylo dosaženo po akumulaci přibližně 240 s při koncentraci
MT 10 µM. Detekční limity pro kadmium a zinek, které byly analyzovány v prostředí
základního elektrolytu – 0,5 M NaCl (pH 6,4), byly 250 fmolů respektive 2,5 pmolů v 5 µl
kapce. Dále jsme navržený biosensor aplikovali na analýzu těžkých kovů v lidských tělních
tekutinách (krevní sérum a moč.
ZÁVĚR: V naší práci byl navržen jednoduchý senzor pro stanovení Cd(II) a Zn(II)
využívající modifikace povrchu visící kapkové rtuťové elektrody metalothioneinem. Získané
výsledky ukazují na možné využití této technologie pro snadnou, rychlou a levnou detekci
38
těžkých kovů přítomných v životním prostředí, potravinářských produktech či biologických
vzorcích.
LITERATURA
[1]
R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova, B. Klejdus, V. Kuban, Chem. Listy 97 (2003) 1003.
[2]
J.H.R. Kägi, A. Schäffer, Biochemistry 27 (1988) 8509–8515.
[3]
S.S. Babkina, N.A. Ulakhovich, Bioelectrochemistry 63 (2004) 261.
Poděkování
Příspěvek vznikl za podpory IGA MZLU 3/2004 a GAČR 525/04/P132.
STAT1 PHOSPHORYLATION INDUCED BY INTERFERONS IN HUMAN
MALIGNANT MELANOMA
*
Boudný Vladimír*, Adámková Lenka*, Lauerová Ludmila*, Kocák Ivo**, Kovařík Jan*
Department of Experimental Oncology,** Clinic of Complex Oncological Care; Masaryk
Memorial Cancer Institute, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno, Czech Republic.
Background: STAT 1 belongs to a multigene family of Signal Transducers and Activators of
Transcription (STATs), latent cytoplasmic proteins, which mediate various biological effects
of cytokines. STAT 1 activation requires both tyrosine 701 (Y701) and serine 727 (S727)
phosphorylation. Defects in its expression and/or phosphorylation induced by interferons
(IFNs) were observed in some human malignancies.
Purpose: To examine potential abnormalities in IFN-induced STAT 1 activation in human
malignant melanoma cells.
Material and Methods: STAT 1 levels and inducibility of its activated phosphoforms were
examined by Western blots using immunoprecipitation and specific anti-STAT 1 antibodies.
21 established melanoma cell lines as well as 59 primary cultures derived from metastatic
melanoma patients were used.
Results:
a) Deficient IFN-induced STAT 1 phosphorylation in established melanoma cell lines:
More than two thirds of melanoma cell lines were resistant to IFN-induced activation on
S727. Less pronounced were defects in phosphorylation on Y701, with the absence of
activation in 5 cell lines after IFN-α and in 2 lines treated with IFN-γ . One cell line showed
no phosphorylation on either S 727 or Y 701 induced by any IFN. Two lines exhibited
physiological STAT 1 activation response at both amino acid residues induced by either IFN.
b) IFN-induced STAT 1 activation in metastatic melanoma patients: Approximately three
quarters of melanoma patients treated in vitro with either IFN were lacking phosphorylation
on S727. The absence of Y701 activation after IFN-α occurred in 45 samples and after IFN-γ
in 14 cases. Some patients exhibited response to one type of IFN only. Nine samples did not
show any response to both IFNs. STAT 1 phosphorylation on both Y 701 and S 727 induced
by IFN-α was noted in 5 cases.
Conclusions: The study provides a clear demonstration of STAT 1 functional abnormalities
pertinent to human malignant melanoma. The STAT 1 alterations occurred in a prevailing
number of established melanoma cell lines as well as in primary cultures derived from
melanoma patients.
Acknowledgements: Supported by grants NC/7139-3 from the Internal Grant Agency of the
Czech Ministry of Health and 301/03/0370 from the Grant Agency of the Czech Republic.
39
ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE GENERATES THE COVALENT DNAADDUCTS IN RATS IN VIVO
Dagmar Aimová1, Eva Frei2, Marie Stiborová1
1
Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2
2
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
Ellipticine is a potent antineoplastic agent, whose mode of action is considered to be
based mainly on DNA intercalation and/or inhibition of topoisomerase II. Recently, we found
that ellipticine also forms covalent DNA adducts in vitro and in vivo and that the formation of
the major adduct is dependent on the activation of ellipticine by cytochromes P450 (CYP) [14]. Here, we investigated the details of formation of ellipticine-derived DNA adducts in vivo.
Male and female Wistar rats were treated with different doses of ellipticine (0.4, 4.0,
40.0 and 80.0 mg ellipticine per kg of body weight) and DNA from various organs was
analyzed by 32P-postlabeling. Ellipticine-specific DNA adduct patterns, similar to those found
in vitro, were detected in most test organs (liver, kidney, lung, spleen, heart and brain), being
concentration-dependent. Only DNA of testes was free of the ellipticine-DNA adducts. The
highest level of DNA adducts was found in liver, followed by spleen, lung, kidney, heart and
brain.
One major and one minor ellipticine-DNA adducts were found in DNA of all these
organs of both genders of rats exposed to ellipticine. Besides these, two or three additional
adducts were detected in DNA of liver, kidney, lung and heart. Two predominant adducts
formed in rat tissues in vivo were identical to the deoxyguanosine adduct generated in DNA
by two ellipticine metabolites formed by CYPs, 13-hydroxyellipticine and the N2-oxide of
ellipticine, in vitro as shown by cochromatography in two independent systems. Correlation
studies showed that the formation of the major DNA adduct in vivo (adduct generated by 13hydroxyellipticine) is mediated by CYP3A1- and CYP1A-dependent reactions. The adducts
generated by ellipticine in all rat tissues analyzed in the study are not persistent adducts. Biphase kinetics of their repairing was found in rat tissues tested in our work.
The results presented here are the first report showing the dose-dependent formation of
CYP-mediated covalent DNA adducts by ellipticine in vivo and studying their persistence in
the rat animal experimental model.
References
1) Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675 (2001).
2) Stiborová M., Stiborová-Rupertová M., Bořek-Dohalská L., Wiessler M., Frei E.: Chem.
Res. Toxicol., 16, 38-47 (2003).
3) Stiborová M., Breuer A., Aimová D., Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.: Int.
J. Cancer, 107, 885-890 (2003).
4) Stiborová M., Sejbal J., Bořek-Dohalská L., Aimová D., Poljaková J., Forsterová K.,
Rupertová M., Wiesner J, Hudeček J., Wiessler M., Frei E.: Cancer Res., 64, 8374-8380
(2004).
Supported by the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM0021620808).
40
METALOTHIONEIN – MARKER NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNÍ?
Ondřej Blaštík1, Jitka Petrlová1, Vojtěch Adam1,2, David Potěšil1,2, Richard Průša3,
Marie Stiborová4, Bořivoj Vojtěšek5, Libuše Trnková6, František Jelen7, René Kizek 1
1
Ústav chemie a biochemie, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno; 2Katedra
analytické chemie a 6Teoretické a fyzikální chemie, PřF MU v Brně, Kotlářská 2, 611 37
Brno; 3Ústav klinické biochemie a pathobiochemie, 2.LF KU a FN Motol, V úvalu 84, 150
18, Praha; 4Katedra biochemie, PřF KU, Hlavova 8, 128 40 Praha; 5Základna
experimentální onkologie, MOÚ Brno, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno; 7Biofyzikální ústav AV
ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
Úvod: Metalothioneiny (MT) patří do skupiny intracelulárních, nízkomolekulárních (6-10
kDa) na cystein velmi bohatých proteinů (až 30 %), vyskytující se v těchto repeticích: Cys-XCys, Cys-Cys-X-Cys-Cys, Cys-X-Cys-Cys, kde X představuje jinou aminokyselinu než cys1,2.
MT se skládají ze dvou vazebných domén α, β, které jsou složeny z cysteinových klastrů. βdoména má tři a α-doména čtyři vazebná místa pro dvojmocné ionty. Nedávno se podařilo
prokázat, že hladina MT výrazně vzrůstá u celé skupiny maligních nádorů (karcinom prsu,
kůže a pankreatu atd.). Z doposud získaných výsledků vyplývá, že změny v expresi MT by
mohly být novým prognostickým markerem u nádorových onemocnění. Množství MT je
významně ovlivňováno průběhem terapie především cytostatiky na bázi platiny3. Díky těmto
významným vlastnostem se hledají nové metody pro snadnou a rychlou detekci MT, které by
bylo možné využít i mimo specializované laboratoře4.
Materiál a metody: Analýza byla provedena na AUTOLAB analyzátoru napojeném na VAStand 663 v tří elektrodovém zapojení: a) pracovní elektroda – visící rtuťová kapková
elektroda (HMDE) b) referentní elektroda – Ag/AgCl/3M KCl a c) pomocná elektroda –
uhlíková. Všechna elektrochemická měření byla uskutečněna v 0,2 M borátovém pufru o pH
= 8. Vzorky tělních tekutin (lidské krevní sérum a moč) byly před vlastní analýzou upraveny
denaturací při teplotě 99 °C po dobu 10 min. Upravené vzorky byly 15 min. centrifugovány,
14 000 g. Získaný supernatant byl přefiltrován přes teflonový diskový filtr.
Výsledky a diskuse: V naší práci jsme se zabývali stanovením MT pomocí adsorptivní
přenosové rozpouštěcí (AdTS) chronopotentiometrické rozpouštěcí analýzy (CPSA). Více jak
70 let je známo, že proteiny jsou schopny katalyzovat vylučování vodíku (pík H) ze
základního elektrolytu. Této vlastnosti lze využít pro jejich kvalitativní, ale také kvantitativní
stanovení 5-9. V námi modifikované technice AdTS-CPSA byl ultrasenzitivně detekován MT.
Při analýze velmi malého množství MT (10 – 320 amol v 5 µl kapce) byla získána lineární
koncentrační závislost y = 54,884x + 18567; R2 = 0,9937 s limitem detekce 11 zmol (3 S/N).
Dále byl studován vliv iontové síly na sledovaný katalytický signál MT. Metodika byla dále
upravena a použita pro analýzu MT v lidské moči a krevním séru.
Závěr: Je zřejmé, že katalytické signály vylučování vodíku umožňují velmi senzitivní
analýzu MT a je možné jí aplikovat pro analýzu reálných vzorků.
Literatura:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Kägi J. H. R., Schäffer A.: Biochemistry, 27, 8509–8515 (1988).
Studničková M. et al.: J. Electroanal. Chem., 421, 25–37 (1997).
Zelená J. et al.: Klinická onkologie, 17, 190 (2004).
Kizek R., Vacek J., Adam V., Vojtesek B.: Klin. Biochem. Metab., 13, 72 (2004).
Trnkova L., Kizek R., Vacek J.: Bioelectrochemistry, 56, 57 (2002).
Kizek R., Trnkova L., Palecek E.: Anal. Chem., 73, 4801 (2001).
Strouhal M., Kizek R., Vacek J., Trnková L., Němec M.: Bioelectrochemistry, 60, 29–36 (2003).
Masarik M. et al.: Electroanalysis, 16, 1172 (2004).
41
9. Prusa R., Kizek R., Vacek J., Trnkova L., Zehnalek J.: Clin. Chem., 50, A28 (2004).
Poděkování
Příspěvek vznikl za podpory grantů GA ČR 525/04/P132 a RASO 2005.
INTERACTION OF MUTANT p53 WITH GENOMIC DNA IN THE CHROMATINCONTEXT OF GLIOBLATOMAS
Marie Brázdová1,2, Korden Walter2, Gabriele Warnecke2, Genrich Tolstonong2, Jakub
Dvořák1, Emil Paleček1, Miroslav Fojta1 and Wolfgang Deppert2
1
Institute of Biophysics Academy of Sciences, Brno, Královopolská 135, 612 65, Czech
Republic
2
Heinrich-Pette-Institute, Hamburg, Martinistr. 52, 202 51, Germany
Glioblastoma, the most frequent primary brain tumor, represents the ultimate and the
most malignant state of astrocytoma progression with mutation of p53 gene as one of the most
important genetic alteration [1]. Mutation in the tumor suppressor gene p53 generally leads to
inactivation of transactivation that destroys tumor-suppressing function [2]. Furthermore,
some mutants are known to exhibit some oncogenic properties attributable to gain of function
[3]. Chromatin immunoprecipitation method (ChIP) was used to analyzed interaction of
mutant p53 (mutp53) with genomic DNA in two glioblastoma cell lines with the 273 codon
mutation: Onda (Arg->Cys]) and U251 (Arg->His) cells.
We identified about 150 genomic DNA fragments bound by two different mutp53s in
vivo. Sequence analysis of the mutp53-bound DNA revealed that significative part of obtained
genomic DNA fragments contain human repetitive elements and elements with high MAR
potential. The latter motifs have already been identified as specific targets for mutp53 in vitro
[4]. Even about 50 sequences of genes that are directly connected with cancer, such as
suppressor proteins, drug transporters, oncogenes, signaling proteins and chromatin
remodeling factors were identified. In addition, the identified genes are expressed in
glioblastoma, pointing out the specificity of the ChIP-assay. Using siRNA and RT-PCR
technologies, we found that mutp53 exerts a strong influence on the expression several of
these newly founded genes. Identification of these genes increase the family of the genes
upregulated by mutp53 [3] up to now founded only in mutp53 transfected p53-null cell lines.
We suppose that defining the DNA structure/sequence requirement for mutp53 in vivo
DNA binding contribute to understanding the molecular basic of the mutp53 “gain of
function” activities.
References:
[1] Konopka G, Bonni A. (2003), Signaling pathways regulating gliomagenesis. Curr Mol
Med.;3(1):73-84.
[2] Soussi,T.,Legros, Y., Lubin, R.,Ory, K., & Schlichtholz,B.(1994) Multifactorial analysis of p53
alteration in human cancer: a review. Int J Cancer 57, 1-9.
[3] Scian MJ, Stagliano KE, Deb D, Ellis MA, Carchman EH, Das A, Valerie K, Deb SP, Deb
S.(2004) Tumor-derived p53 mutants induce oncogenesis by transactivating growth-promoting genes.
Oncogene. ;23(25):4430-43.
[4] Deppert, W. (2000) The nuclear matrix as a target for viral and cellular oncogenes. Crit Rev
Eukaryot Gene Expr 10, 45-61.
This work was supported by 1K04119 (The Ministry of Education, Youth and Sports Czech
Republic), QLGA-CT-2001-52001 (Marie Curie Individual Fellowship) to M.B, and by funds
from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFF) and the EU (QLG1-1999-00273) to W.D.
42
METABOLISM OF THE ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE BY RAT AND
RABBIT CYTOCHROMES P450
Marie Stiborová1, Anna Březinová1, Věra Kotrbová1, Dagmar Aimová1, Eva Frei2
Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2
2
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
1
Ellipticine is an alkaloid exhibiting potent antineoplastic and anti-HIV activities. This
agent and some its derivatives are used in the therapy of breast cancer and leukemia and have
multiple cellular targets. Among these, the inhibition of topoisomerase II after intercalation
into DNA, was hitherto considered the most important property for its cytotoxicity. Recently,
we found that ellipticine also acts as alkylation (arylation) agents, covalently binding to DNA
in vitro and in vivo. The formation of the major DNA adduct is dependent on the activation of
ellipticine by cytochrome P450 (CYP) and peroxidases [1-4]. The most potent activating
human enzyme is CYP3A4, followed by CYP1A1 and CYP1A2 [1-3].
Here we describe the metabolism of ellipticine catalyzed by rat and rabbit cytochromes
P450 and compare this metabolism with that catalyzed by human enzymes. The pattern of
ellipticine metabolites formed by CYPs of all species is analogous. Five ellipticine
metabolites are generated by microsomal cytochromes P450 from livers of all organisms
studied in the present work; 7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticine and
the N2-oxide of ellipticine are formed from ellipticine in these subcellular systems. The role of
specific CYPs in the oxidation of ellipticine to its metabolites in rats and rabbits was
investigated using the inducers and inhibitors of individual CYP enzymes. On the basis of this
analysis, formation of 9-hydroxy- and 7-hydroxyellipticine was attributable to CYP1A1 and
1A2 of rat and rabbit, similarly like in the human CYP systems [4], while production of 13hydroxyellipticine and the N2-oxide, the metabolites responsible for formation of two major
DNA adducts [4], to rat CYP3A1 and human 3A4. The formation of 12-hydroxyellipticine is
mediated mainly by CYP2B and this metabolite is also formed non-enzymatically, from the
ellipticine N2-oxide. Using cytochromes P450 isolated from rat and rabbit hepatic microsomes
reconstituted with NADPH:CYP reductase confirm the results found in microsomal systems.
The results indicate that rat enzymatic systems are more suitable models to mimic the
oxidation of ellipticine in humans than CYP enzymes of rabbits.
References
1) Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675 (2001).
2) Stiborová M., Stiborová-Rupertová M., Bořek-Dohalská L., Wiessler M., Frei E.: Chem.
Res. Toxicol., 16, 38-47 (2003).
3) Stiborová M., Breuer A., Aimová D., Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.: Int. J.
Cancer, 107, 885-890 (2003).
4) Stiborová M., Sejbal J., Bořek-Dohalská L., Aimová D., Poljaková J., Forsterová K.,
Rupertová M., Wiesner J, Hudeček J., Wiessler M., Frei E.: Cancer Res., 64, 8374-8380
(2004).
Supported by the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM0021620808).
43
REGULACE NADP-MALÁTDEHYDROGENASY (DEKARBOXYLAČNÍ) Z LISTŮ
TABÁKU DVOJMOCNÝMI KATIONTY KOVŮ
Veronika Doubnerová1, Karel Müller1, Noemi Čeřovská2, Helena Ryšlavá1
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 2030,
128 00 Praha 2
2
Ústav experimentální botaniky, Akademie věd České republiky, Na Karlovce 1a, 160 00
Praha 6
1
U enzymu NADP - dependentní malátdehydrogenasy (dekarboxylační) EC 1.1.1.40,
dále jen NADP-ME, izolovaného z listů tabáku (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1)
byly stanoveny některé kinetické parametry, především Michaelisovy konstanty pro substrát
malát a pro koenzym NADP v přítomnosti 4 různých kofaktorů. Kofaktory NADP-ME jsou
dvojmocné ionty kovů. Pro aktivitu NADP-ME je přítomnost dvojmocných iontů kovůkofaktorů nezbytná. Nejúčinnějším iontem je Mn2+, dále Mg2+, nižší rychlost reakce je
v přítomnosti Co2+ a Ni2+. V přítomnosti iontů Ca2+ a Cu2+ enzymová reakce neprobíhá.
Afinita NADP-ME k malátu při pH 7,4 závisí na druhu iontu přítomného v reakci, nejvyšší
Km pro malát je v přítomnosti Mg2+. Hodnoty Km NADP-ME pro NADP při pH 7,4
v přítomnosti studovaných iontů jsou srovnatelné.
Také byla studována závislost reakční rychlosti na koncentraci kofaktoru. U všech
kofaktorů se objevily odchylky od hyperbolické závislosti Michaelise-Mentenové. U Mg2+
iontů byly z výnosu podle Lineweavera-Burka stanoveny 2 hodnoty Michaelisových konstant,
naznačující možnost dvou vazebných míst pro Mg2+.
Závislost reakční rychlosti na koncentraci Mn2+, Co2+ a Ni2+ je však sigmoidální, byly
tedy stanoveny konstanty S0,5 a Hillovy koeficienty. Tyto parametry se v závislosti na
použitém kofaktoru liší, stejně jako limitní rychlost enzymové reakce.
Poděkování: Tato práce je podporována granty: GA UK 428/2004, GA ČR 206/03/0310
DNA APTAMER SPECIFICKÝ PRO THROMBIN TVOŘÍ BIMOLEKULÁRNÍ
TETRAPLEX
Markéta Fialová, Michaela Vorlíčková
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
Aptamery jsou molekuly nukleových kyselin, které mají schopnost specificky se vázat
k různým biologicky důležitým molekulám a jako takové představují potenciální nástroj pro
terapeutické účely. Intenzívně jsou proto syntetizovány různé deriváty aptamerů a studovány
jejich strukturní vlastnosti zajišťující optimální vazbu v cílovým molekulám.
Jedním z nejvíce prostudovaných aptamerů je 15-mer DNA tvořený posloupností
GGTTGGTGTGGTTGG, který se specificky váže k thrombinu a inhibuje jeho aktivitu
v řetězci reakcí, které vedou ke srážení krve. Má tedy potenciální význam v kardiovaskulární
chirurgii, v prevenci mozkových a srdečních infarktů apod.
Na základě NMR měření bylo navrženo (1,2), že thrombinový aptamer se skládá do
vysoce kompaktního monomolekulárního symetrického uspořádání, tvořeného dvěma
guaninovými tetrádami spojenými třemi smyčkami. Tato struktura se stala prototypem
nejmenšího monomolekulárního tetraplexu.
44
Studovali jsme konformační vlastnosti thrombinového aptaméru pomocí cirkulárně
dichroické (CD) spektroskopie a polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE). Zjistili
jsme, že aptamer tvoří guaninový tetraplex s CD spektrem charakteristickým pro antiparalelní
uspořádání řetězců. Toto chování thrombinového aptameru jsme sledovali v různých
podmínkách. Tetraplex vzniká již v roztoku s nízkou iontovou sílou, v přítomnosti K+ iontů
nebo etanolu se stabilizuje, naopak přítomnost Na+ iontů na jeho stabilitu nemá výrazný vliv.
Překvapujícím zjištěním však bylo, že velikost CD signálu byla závislá na koncentraci
řetězců, což je v rozporu s monomolekulárním útvarem. PAGE tento rozpor vysvětlila:
aptamer na gelu migruje jako dvouřetězcový asociát. Rovněž Fergussonova analýza potvrdila,
že thrombinový aptamer tvoří tetraplex bimolekulární. Pro srovnání jsme studovali analogy
thrombinového aptameru s podobnou primární strukturou a zjistili jsme, že teprve
prodloužení sekvence tvořící smyčky mezi guaninovými tetrádami umožňuje vznik
intramolekulárního tetraplexu.
Studium tetraplexů probíhá v rámci projektu A4004201 GAAVČR.
1.
2.
Macaya, R.F., Schultze, P., Smith, F.W., Roe, J.A. and Feigon, J. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 3745-3749.
Wang, K.Y., McCurdy, S., Shea, R.G., Swaminathan, S. and Bolton, P.H. (1993)
Biochemistry, 32, 1899-1904.
MODULATION AROMATASE ACTIVITY BY FLAVONOIDS
Julie Fidlerová, Petra Gottvaldová, Petr Hodek
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40
Prague 2
Aromatase belong to superfamily of cytochromes P450 (CYP). CYP are hemthiolate
proteins responsible for the metabolism of endogenic and xenobiotic compounds. Aromatase,
CYP19, plays crucial role in estrogen synthesis, as it converts androgens, androstendione and
testosterone to estrogens, estron and estradiole, respectively. It is expected that aromatase is
expressed at high levels in ovary, testis, placenta, and also in tissue of hormone dependent
cancer e.g. in breast cancer, prostate cancer.
Inhibitors of CYP19 can be used to treat postmenopause breast cancer and other
estrogen dependent diseases. Recently, some flavonoids have been identified as potent
aromatase inhibitors. Flavonoids represent a group of phytochemicals exhibiting a wide range
of biological activities arising mainly from their antioxidant properties and ability to modulate
several enzymes or cell receptors. Flavonoids are classified into eight groups: flavans,
flavanones, isoflavanones, flavons, isoflavones, anthocyanidines, chalcones and
flavonolignans. Structure of flavonoids is derived from a chromane. Flavonoids are present in
most plants being concentrated in seeds, fruit thin or peel, bark and flowers.
We probed the panel of flavonoids for its effect on aromatase aktivity. In these
experiments we used human placental microsomes or recombinant aromatase. Aromatase
activity was determined fluorimetrically using dibenzylfluorescein or 7-ethoxy-4trifluormethylcoumarin as non-physiological substrates or on HPLC when using natural
steroids, testosterone and androstendione. Of flavonoids, flavone, 7-hydroxyflavone, 5,7dihydroxyflavone,
4´,5,7-trihyhdroxyflavone,
α-naphthoflavone,
β-naphthoflavone,
45
decreasing aromatase activity, the highest inhibition showed α-naphthoflavone. It is likely
that inhibitory properties of flavonoids are a consequence of structural similarities between
flavonoid and steroid skeletons.
Further, we tested newly synthesized derivates of flavonoids, namely α− and βthionaphtoflavons. Surprisingly, neither of these compounds inhibited aromatase, however,
they elevated aromatase activity up to 160% depending on the thioflavonoid used. To explain
this stimulatory effect homology model of aromatase was constructed and thionaphtoflavons
were docked into the enzyme active center. In contrary to flavonoid inhibitors that bind in a
close vicinity to the heme, thioflavonoids preferred for binding a different site located distally
from the heme. Thus, two binding sites, one for substrate (or inhibitor) and the other for
stimulator were identified. Simultaneous binding of thionaphtoflavon and a substrate
increases the substrate binding affinity that results in the stimulation of its metabolism.
To understand the fate of thioflavonoids in the body we concentrate on study of
metabolism of α-thionaphthoflavon by CYP3A6 (major intestinal isofom of CYP) in vitro,
using rabbit liver microsomes prepared from rabbits premedicated by riphampicine, inductor
of CYP3A6. α-thionaphthoflavon is metabolized by CYP3A6 primary into α−naphthoflavon
and then into α−naphthoflavon derivates 5,6-dihydrodiol, 7,8-dihydrodiol and 5,6-epoxide.
STUDIUM INDUKČNÍHO VLIVU VYBRANÝCH FLAVONOIDŮ NA
CYTOCHROM P 450 1A1
Kateřina Fridrichová, Petr Hodek
Univerzita Karlova v Praze, katedra biochemie, Hlavova 2030, Praha 2
Cytochromy patří mezi nejdůležitější enzymy, které se účastní první fáze metabolismu
cizorodých látek (xenobiotik). Ovšem oxidace xenobiotik cytochromem P-450 nemá za
následek jen detoxikaci xenobiotik v positivním slova smyslu, ale může mít i negativní
důsledky. Činností cytochromů P450 vznikají reaktivní metabolity, které mohou poškozovat
biomakromolekuly (proteiny, DNA).
Flavonoidy představují velmi rozsáhlou skupinu fytochemikálií, které vykazují širokou
paletu biologických aktivit. Významné jsou především pro své antioxidační vlastnosti a
schopnost ovlivňovat různé typy enzymů a buněčných receptorů. Flavonoidy vykazují i
antibakteriální a antivirové aktivity, protizánětlivý a protialergický efekt, mají i cytostatický
účinek. Proto jsou tyto sloučeniny často podávány jako potravní doplňky lidské stravy.
Existují však i studie prokazující zdraví ohrožující efekty některých flavonoidů. Jedná se
o mutagenní efekty či schopnost podstatně zasahovat do významných biochemických drah.
Mezi proteiny, které interagují s flavonoidy patří i cytochromy P450. Prostřednictvím indukce
specifických cytochromů P450 mohou flavonoidy zvyšovat aktivaci karcinogenů a ovlivňovat
metabolismus běžně dostupných chemikálií z potravy. Fungují pak i přes veškeré pozitivní
efekty jako tzv. ko-karcinogeny. Proto v naší práci posuzujeme vliv vybraných flavonoidů na
indukci cytochromu P450 1A1 v jaterních a střevních tkáních experimentálních zvířat a to
vzhledem k cestě podání (p.o. – gaváží, i.p. - intraperitoneálně) a typu flavonoidu.
Z výsledků pilotních studií prováděných na samcích a samicích kura domácího bylo
zjištěno, že podávání flavonoidů (alfanaftoflavonu a jeho thioanalogu) vedle k indukci
cytochromů P450 rodiny 1A v jaterních i střevních mikrosomech. Navíc celkový obsah
cytochromů P450 po podání alfanaftoflavonu ve střevní tkání mnohanásobně vzrostl oproti
kontrole. Cílem naší následující studie, bylo dokázat tuto indukci i v jaterních a střevních
46
mikrosomech (Rattus norvegicus). Metodou „Western-blotting" bylo zjištěno, že aplikace αNF vyvolává u potkanů indukci cytochromu P450 1A1 v jaterních i střevních mikrosomech.
Dále bylo zjištěno, že podání alfanaftoflanu intraperitoneálně vykazovalo vyšší indukci
v obou tkáních než perorální podání gaváží. Další sledované flavonoidy jsou quercetin a
chrysin u kterých předpokládáme podobné výsledky jako u alfanaftoflavonu. Jedná se o
sloučeniny, které v testech s buněčnými liniemi vykazují vazbu na Ah-receptor, která je
určující pro navození indukce cytochromu P450 1A1.
ANALÝZA TEPLOTNĚ SENZITIVNÍCH MUTANTŮ p53
Diana Grochová, Miluška Svitáková, Barbora Ravčuková, Šárka Pavlová, Jana Šmardová
Patologicko-anatomický ústav a Oddělení lékařské genetiky FN Brno, Jihlavská 20, 625 00
Brno
Nádorový supresor p53 je transkripční faktor podílející se na kontrole mnoha procesů
v buňce. Převážná většina jeho funkcí je realizována přímou vazbou tetrameru p53 na
specifické sekvence v promotorech cílových genů a následnou aktivací transkripce těchto
genů. Inaktivace p53 je častou událostí při vývoji různých nádorů. Nejčastější formou
inaktivace p53 jsou mutace genu p53, a to hlavně bodové záměny. Většina mutací p53 se
nachází v centrální DNA vazebné doméně a způsobuje ztrátu schopnosti proteinu p53 vázat se
na své cílové sekvence DNA. Různé typy mutací p53 se liší frekvencí výskytu u jednotlivých
typů nádorů a také svými funkčními důsledky.
FASAY („functional analysis of separated alleles in yeast“) je citlivá semikvantitativní
metoda používaná k detekci mutací p53 v klinickém materiálu (v nádorové tkáni, v buňkách
periferní krve, apod.). Metoda využívá reparačního mechanismu na principu homologní
rekombinace („gap repair“), který se uplatňuje v kvasinkových buňkách, a toho, že lidský
protein p53 funguje v kvasinkách jako transkripční faktor. Transkripčně aktivační schopnost
p53 odvozeného metodou RT-PCR z vyšetřované tkáně je v kvasinkových buňkách testována
s využitím reportérského genu ADE2. Míra transaktivační schopnosti p53 je hodnocena podle
zbarvení kvasinkových kolonií, které rostou na plotnách s nízkou hladinou adeninu a které
exprimují danou variantu p53. FASAY dokáže rozlišit plně inaktivující mutace od mutací
pouze částečně snižujících transaktivační schopnost proteinu p53.
Postupně jsme sestavili panel 18 teplotně senzitivních mutantů p53. Všechny mutanty
jsme exprimovali v kvasinkových buňkách vybavených reportérským genem ADE2 pod
kontrolou tří různých responzivních elementů p53, a to odvozených z promotorů genů RGC,
p21 a bax. Stanovili jsme hladinu proteinu p53 v těchto kvasinkových buňkách
imunoblotingem s využitím monoklonální protilátky DO-1. Podrobně jsme analyzovali
transaktivační schopnosti jednotlivých mutantů p53 v kvasinkových buňkách, a to ve vztahu
k teplotě a k sekvenci responzivního elementu. Zjistili jsme, že jednotliví teplotně senzitivní
mutanti p53 se liší mírou své teplotní závislosti, tj. liší se teplotou, při které dochází k plnému
nebo alespoň částečnému obnovení jejich transaktivační schopnosti. Většina teplotně
závislých mutantů se liší mírou své aktivity na různých typech promotorů (RGC, p21, bax),
tedy mají tak zvaně diskriminující povahu.
Tato práce je podporována grantem IGA MZ ČR č. NR/8068-3
47
KATALYTICKÉ ELEKTROCHEMICKÉ SIGNÁLY PEPTIDOVÉ NUKLEOVÉ
KYSELINY.
Luděk Havran, Miroslav Fojta, Emil Paleček
Biofyzikální ústav AVČR, Královopolská 135, Brno, [email protected]
Peptidová nukleová kyselina (PNA) je jedním z nových syntetických analog DNA,
potenciálně využitelných v genové terapii [1]. Cukr-fosfátová páteř DNA byla v PNA
nahrazena pseudopeptidovým řetězcem. Jeho základní jednotkou je N-(2aminoethyl)glycin.
Báze jsou na tento řetězec napojeny přes atom dusíku glycinu methylenkarbonylovou
skupinou. PNA nenese při neutrálním pH náboj a je achirální molekulou. Velmi ochotně
interaguje s jedno- i dvouřetězcovou DNA [2]. Tato interakce je silně sekvenčně specifická a
lze jí využít při konstrukci elektrochemických hybridizačních senzorů, které pak mohou
rozpoznávat přítomnost bodové mutace v molekule oligonukleotidu[3]. Absence náboje
v molekule PNA silně ovlivňuje její adsorpčně-desorpční chování [4]. Vzhledem k tomu, že
obsahuje stejné báze jako DNA, podléhá podobným oxidačně-redukčním procesům na
rtuťových a uhlíkových elektrodách[5].
Pokud molekula PNA má ve svém pseudopeptidovém řetězci zbytek aminokyseliny
cysteinu, pak tato PNA poskytuje kromě již zmíněných oxidačně-redukčních signálů na
rtuťových elektrodách i signály katalytické. Jedná se o takzvanou Brdičkovu reakci (vznik
charakteristického dvojpíku), kterou běžně na rtuťových elektrodách v přítomnosti iontů
kobaltu dávají peptidy a proteiny obsahující zbytky cystinu a cysteinu [6]. Popsaný signál
neposkytují PNA a DNA oligonukleotidy bez cysteinového zbytku. Tohoto signálu bylo
využito pro velmi citlivé stanovení PNA s detekčním limitem 0,2 ng/ml.
Práce byla financována grantem KJB4004302 Grantové agentury AVČR a účelovou dotací
MPO projektu č. 1H-PK/42.
[1] M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, R.H. Berg, J. Am. Chem. Soc 1992, 114, 1895.
[2] P.E. Nielsen, M. Egholm, O. Buchardt, J. Mol. Recognition 1994, 7, 165.
[3] J. Wang, E. Palecek, E.P. Nielsen, G. Rivas, X. Cai, H. Shiraishi, N. Dontha, D. Luo,
P.A.M. Farias, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7667.
[4] M. Fojta, V. Vetterl, M. Tomschik, F. Jelen, P. Nielsen, J. Wang, E. Paleček, Biophys. J.
1997, 72, 2285.
[5] M. Tomschik, F. Jelen, L. Havran, L. Trnkova, P.E. Nielsen, E. Palecek, Journal of
Electroanalytical Chemistry 1999, 476, 71.
[6] M. Tomschik, L. Havran, M. Fojta, E. Paleček, Electroanalysis 1998, 10, 403.
48
MUTATION DETECTION USING SOMATIC MUTATION AND RECOMBINATION
TEST AND SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM IN
DROSOPHILA MELANOGASTER
Viktor Hlaváč, Veronika Zajíčková, Karel Chroust
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
Volatile halogenated aliphatic hydrocarbons are commonly used in industry as solvents.
Some of them seem to have toxic or genotoxic effect. Many of them are toxic for liver and
kidney in rodents. N-methyl-N-nitroso-urea (MNU) is a strong alkylating teratogenic agent. It
is used as a positive control for genotoxicity.
We detect mutations in Drosophila melanogaster on phenotypical and molecular level.
Somatic mutation and recombination test (SMART) and PCR amplification with subsequent
single strand conformatin polymorphism analysis (SSCP) were used. For detection of posible
genotoxicity of halogenated hydrocarbons we exposed third-istar larvae from cross-breed of
mwh (multiple wing hairs) and flr3 (flare-3) stocks (containing recessive markers mwh and
flr). Larvae were treated with different substances at 50% lethal concentrations (LC50) for 48
hours - according to chronical exposition. Induced mutations and recombinations are detected
as single or twin spots respectively on the wings of imagos. Further we analysed gametic
mutations and the stability of a transgene. WG-1152 stock containing lacZ fragment was used.
Second-instar larvae trans-heterozygous for mwh were exposed for 48hrs. PCR was realized
with three pairs of primers for the transgene and 1-iodopenthane was analysed by SSCP in F2
generation. LC50 and genotoxicity were determined in MNU. Embryos and hatched imagos
from the F2 generation were used for mutation screening.
Genotoxicity was proved at chloracetonitrile, 2-chloropropane, 1,3-dibrompropane and
1-iodopenthane. The genotoxicity increases with a number of halogenes in molecule. Until
now no mutations were found with SSCP analysis and direct sequencing in lacZ transgene
neither with 1-iodopenthane, nor with methyl-nitroso-urea.
This work was supported by the grant MSMT 14100008.
ELEKTROCHEMICKÉ STANOVENÍ UREASY A UREASOU MODIFIKOVANÁ
ELEKTRODA
Jan Hradecký1, Jitka Petrlová1, Josef Zehnálek1, Petr Babula2, Vojtěch Adam1,
David Potěšil1, René Kizek 1
1)
Ústav chemie a biochemie, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, e-mail:
[email protected]
2)
Ústav přírodních léčiv, FaF VFU Brno, Palackého 1/3, 612 46 Brno
Úvod: V roce 1926 byl izolován enzym z Cannavalia enzyformis (Fabacae) štěpící močovinu
na amoniak a oxid uhličitý a byl označen jako ureáza. Později se podařilo prokázat, že enzym
ureáza (EC 3.5.1.5, močovina amidohydroláza) je obecně rozšířeným enzymem u rostlin a je
také přítomna u řady eukaryotických mikroorganismů a baktérií. U vyšších živočichů nebyla
dosud přítomnost ureázy prokázána. Nejvyšší aktivita ureázy byla pozorována v zárodečných
rostlinných pletivech, a to především v semenech řady druhů z rodu Fabaceae a
Curcubitaceae. U vyvíjejících embryí byl popsán vysoce aktivní izoenzym ureázy. Bylo
zjištěno, že enzym vykazuje absolutní substrátovou specifitu, což znamená, že hydrolyzuje
49
pouze močovinu a nereaguje s žádnou jinou strukturně podobnou sloučeninou. Je dobře
známo, že baktérie mají výraznou ureázou aktivitu, což se u řady z nich využívá pro jejich
identifikaci. Nedávno se však podařilo prokázat, že baktérie rodu Helicobacter pylori
(způsobuje záněty žaludku a vyvolává vznik žaludečních vředů) lze velmi dobře
diagnostikovat podle množství aktivní ureázy.
Materiál a metody: Elektrochemické měření bylo prováděno na AUTOLABu (EcoChemie,
Holandsko) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). Byl použit tříelektrodový
systém, který se skládal z visící rtuťové kapkové elektrody (HMDE) jako pracovní elektrody s
plochou 0.4 mm2, Ag/AgCl/3 mol.l-1 KCl elektrody jako referenční elektrody a platinového
drátku jako pomocné elektrody. DPV parametry pro analýzu ureázy: počáteční potenciál –0,9
V, konečný potenciál –0,3 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok
1,05 mV/s, modulační amplituda 25 mV.
Výsledky a diskuse: Studovali jsme enzym ureázu pomocí diferenční pulzní voltametrie na
rtuťové kapkové visící elektrodě. Ureáza poskytuje elektrochemický signál při potenciálu
kolem –0.55 V. Pozorovaný signál pravděpodobně odpovídá sloučenině proteinu se rtutí.
Nejdříve bylo studováno základní elektrochemické chování ureázy v roztoku základního
elektrolytu (acetátový pufr). Zjistili jsme, že nejvyšší pozorované DPV odezvy byly
pozorovány v rozmezí pH 4,8 až 5,8. Koncentrační závislost nebyla v celém rozsahu lineární
(Langmuierovská izoterma). Pozorovaný tvar křivky souvisí s nasycením povrchu pracovní
elektrody a tvorbou více vrstev na povrchu elektrodového povrchu. Avšak v nižším
koncentračním rozsahu (100 – 1 µg/ml) je pozorovaná závislost lineární (y = 16.79x +
0.0533; R2 = 0.9994). Ze získaných experimentálních dat byl určen limit detekce jako 3S/N
250 ng/ml.
Závěr: Analýza proteinů a peptidů představuje v současné době velmi intenzivně a rychle se
rozvíjející obor analytické biochemie. Významný nástroj pro detekci proteinů a peptidů
představují elektroanalytické techniky umožňující vysoce senzitivní detekci.
Poděkování: Příspěvek vznikl za podpory grantu GAČR 525/04/P132.
Literatura
Mobley, M. L. & Hausinger, R. P.: Microbiol. Rev. 53, 85-108 (1989).
Robotis, J.: Gastroenterology 124, A176-A177 (2003).
Xia, H. H. X. & Wong, B. C. Y.: Journal of Gastroenterology and Hepatology 17, 629-632 (2002).
Yee, Y. K. et al.: Alimentary pharmacology and Therapeutics 16, 1739-1742 (2002).
PRODUCTION OF CAROTENOIDS BY RECOMBINANT E.COLI CELLS
TRANSFORMED BY CRT GENES FROM ERWINIA CAROTOVORA
Hrdličková J., Pokorná J., Drábková M., Márová I.
Department of Food Chemistry and Biotechnology Faculty of Chemistry, Technical
University of Brno, Purkyňova 118, 612 00 Brno, Czech Republic
Carotenoids are naturally occuring membrane-protective antioxidant pigments, that
efficiently scavenge singlet oxygen and peroxyl radicals. Carotenoids are produced in higher
plants, algae and phototrophic bacteria as well as in non-phototrophic bacteria, yeasts and
fungi. In recent years, there is evidence that accumulating of carotenoids plays an important
role in human health by preventing degenerative diseases. From a commercial point of view,
there is an increasing demand of special carotenoids in nutrient supplementation, for
50
pharmaceutical purposes, as food colorants and in animal feeds. Biotechnological production
of carotenoids by exploiting the carotenoid genes cloned from different species is of
increasing interest.
Presented work is focused on isolation and cloning of crt gene cluster from bacterium
Erwinia carotovora, expression of crt genes in recipient E.coli cells and selection of
carotenoid overproducing transformants suitable for biotechnological applications. As
transformation vector plasmid pHSG298 was used. DNA fragments containing crt genes
were isolated using restriction endonucleases XbaI, EcoRI and BamHI. E. coli transformants
were selected based on genotype (resistance to kanamycin, isolation of recombinant plasmid)
as well as fenotype changes (yellow-coloured transformed E.coli cells, isolation and analysis
of produced carotenoids). Identification of carotenoids produced by recombinant cells was
verified by HPLC analysis. In individual E.coli transformants different production of lutein,
lycopene, α-carotene, β-carotene and phytoene was demonstrated. Selected E.coli
transformants were able to produce about 14 µg of lutein per gram of d.w., 57 µg of lycopene
per gram of d.w. and about 490 µg of beta-carotene per gram of d.w. Production of
carotenoids in E.coli cells transformed by several recombinant vectors pHSG298/crt was
substantially higher then those found in E.carotovora cells ( 0.1 µg of lutein /g d.w. 46 µg of
β -carotene/g d.w.). For high-yield carotenoid production, further optimization should focus at
different levels.
VLIV VIROVÉ INFEKCE NA TRANSGENNÍ ROSTLINY NESOUCÍ GENY PRO
NESTRUKTURNÍ PROTEINY POTYVIRŮ HC-PRO A P3
Martina Janošková1, Veronika Doubnerová1, Helena Ryšlavá1, Noemi Čeřovská2
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 2030,
128 00 Praha 2
2
Ústav experimentální botaniky, Akademie věd České republiky, Na Karlovce 1a, 160 00
Praha 6
1
V rostlinách nesoucích gen pro nestrukturní protein potyvirů HC-Pro, který má
transportní funkci a je nositelem pathogenicity viru, a gen pro P3 protein, jehož funkce není
přesně známa, byla zjišťována vnímavost vůči virové infekci a vliv na vedlejší metabolické
cesty v průběhu virové infekce.
Gen pro P3 protein byl vnesen do rostlin tabáku (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana
SR1; transgen laskavě poskytnut dr. Šubrem, SAV, Slovensko), gen pro HC-Pro do rostlin
Nicotiana benthamiana (transgen laskavě poskytnut dr. Savenkovem, SLU Uppsala,
Švédsko). Inokulace byla provedena NTN kmenem Y viru bramboru (PVYNTN), relativní
obsah viru byl sledován imunochemicky (TAS-ELISA). Ve studovaných rostlinách byla
měřena aktivita fosfoenolpyruvátkarboxylasy (PEPC, EC 4.1.1.31.), NADP-dependentní
malátdehydrogenasy dekarboxylační (NADP-ME, EC 1.1.1.40.) a pyruvát, fosfátdikinasy
(PPDK, EC 2.7.9.1.).
V netransgenních rostlinách tabáku se vlivem virové infekce zvyšuje aktivita PEPC,
NADP-ME a PPDK (Ryšlavá a kol. 2003). Bylo zjištěno, že gen pro P3 protein nemá vliv v
pokusných rostlinách na citlivost vůči potyvirové infekci. Aktivita PEPC, NADP-ME a PPDK
je v těchto rostlinách zvýšena, zvýšení je srovnatelné s netransgenními rostlinami tabáku.
Transgenní rostliny Nicotiana benthamiana s genem pro HC-Pro protein jsou citlivější
vůči
infekci PVYNTN oproti netransgenním kontrolám. V případě rostlin Nicotiana
benthamiana nebylo v průběhu virové infekce zjištěno průkazné zvýšení aktivity PEPC,
51
NADP-ME a PPDK. Nativní elektroforéza extraktů studovaných rostlin s detekcí aktivity
NADP-ME ukázala, že v rostlinách Nicotiana benthamiana je tento enzym přítomen ve dvou
isoformách. Virovou infekcí se zvyšuje aktivita NADP-ME isoformy s vyšší pohyblivostí
(netransgenní i transgenní), v transgenních neinfikovaných rostlinách isoforma s nižší
pohyblivostí.
Literatura: Ryšlavá H., Müller K., Semorádová Š., Synková H., Čeřovská N.: Photosynthetica
41, 357-363 (2003)
Poděkování: Tato práce je podporována granty: GA UK 428/2004, GA ČR 206/03/0310
SYNTHESIS AND APPLICATION OF DEUTERIZED PHOTOLABILE
COMPOUNDS TO STUDY A MEMBRANE TOPOLOGY OF CYTOCHROMES P450
Karabec Martin1, Šulc Miroslav1,2, Hodek Petr1
1
Charles University in Prague, Faculty of Nature Science, Department of Biochemistry,
Hlavova 2030, 128 43 Prague 2
2
Institute of Microbiology AV CR, Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4
The cytochromes P450 are located in membrane of endoplasmic reticulum. The
membrane topology of the mammalian P450 cytochromes has been studied extensively by
proteolysis, genetic engineering, chemical modification, immunochemistry and computational
approaches. Recent results shows, that cytochromes P-450 are exposed to the cytosol with the
exception of the N-terminal peptide (amino acid residues 1 to 21), or two transmembrane
peptides (residues 1 to 60). Most likely, additional parts of the enzyme macromolecule might
be inserted into membrane, too.
Our approach of investigation of cytochrome P450 membrane topology consists in using
photoaffinity labeling - chemical modification technique developed for study of protein
structure and interactions. By UV-light irradiation is generated highly reactive intermediate of
the photolabile probe, which is able to modify amino acid residues of a protein, at certain
place and exact time.
Diamantane like compounds are highly specific substrates of phenobarbital-inducible
cytochrome P450 2B4. We used Wolf-Kishner reduction of 3-diamantanone to exchange
hydrogen with deuterium and further oxidation by sulfuric acid to obtain mixture of monoand di-deuterized 3-diamantanone. Then, membrane soluble probe, deuterized 3azidiamantane [spiro-(diazirine-3,3’-diamantane)], was synthesized by known procedure. is
Deuterization of the probe makes its detection within a target molecule by mass spectroscopy
feasible.
In our experiments we use a mixture of the probe and purified cytochrome P450 2B4 in
artificial or microsomal membranes. Upon photolysis (366 nm) deuterized 3-azidiamantane
gives highly reactive carbene intermediate modifying amino acid residues of transmembrane
peptides or of part of enzyme body that might span into membrane bilayer.
After photoaffinity labeling, modified enzyme (including its transmembrane anchor) is
cleaved by protease and labeled peptides are separated on HPLC RP C18. Separated peptides
are analyzed on MALDI TOF and MS-DECA. Because we use mixture of mono- and di- and
non-deuterized 3-azidiamantane, modified peptides will be detectable according to by triplets
of equal intensities (differing by 1 m/z) that are unique in the whole MS spectrum.
52
Moreover, this approach of deuterized photolabile probes is widely applicable, for
example, for cross-linking experiments examining interactions of cytochrome P450 with
reaction partners in membrane.
IDENTIFIKACE NOVÝCH IZOLÁTŮ BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ RODU
BIFIDOBACTERIUM
Lenka Klesnilová, Alena Španová, Bohuslav Rittich
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie, Tvrdého 14,
602 00 Brno
Rychlá a přesná detekce a identifikace baktérií mléčného kvašení (BMK), které jsou
využívány v potravinářském průmyslu, je důležitá pro kontrolu kvality mléčných výrobků.
Jednou z často využívaných molekulárně biologických metod je polymerázová řetězová
reakce (PCR). Technika PCR je vhodná pro zařazení bakterií jak do rodu, tak i do druhu.
Cílem práce byla identifikace nových izolátů BMK rodu Bifidobacterium s využitím
molekulárně biologických metod. V experimentech byla použita DNA, izolovaná z 21 izolátů
metodou fenolové extrakce a přečištěna pomocí magnetického nosiče A112 (ferrit pokrytý
kyselinou alginovou). Kvalita purifikované DNA byla ověřena pomocí agarózové gelové
elektroforézy; koncentrace a čistota DNA byla stanovena spektrofotometricky. Bakterie rodu
Bifidobacterium byly identifikovány pomocí rodově specifických primerů Pbi F1 a Pbi R2
(Roy a Sirius, 2000). Druhově specifická PCR byla prováděna pomocí deseti druhově
specifických primerů navržených dle Matsuki a spol. (2002). S použitím druhově specifických
primerů byly kmeny zařazeny do druhů B. adolescentis, B. longum, B. bifidum, B. infantis.
Druhové zařazení B. longum bylo potvrzeno na základě rozdílné délky fragmentů vzniklých
štěpením rodově specifických PCR produktů restrikčními endonukleázami BamHI, TaqI a
Sau3A.
Práce byla podpořena grantem NAZV 1G46045.
DESTRUKCE CYTOCHROMŮ P450 A VZNIK OXIDATIVNÍHO STRESU VLIVEM
METABOLITŮ BENZENU V JATERNÍCH MIKROSOMECH MINIPRASETE
Eliška Kondrová1,2, Pavel Stopka3, Pavel Anzenbacher4, Pavel Souček2
1
3.lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Ruská 87, 100 00 Praha 10, E-mail:
[email protected],
2
Centrum pracovního lékařství, Státní zdravotní ústav, Šrobárova 48, 100 42 Praha 10,
3
Ústav anorganické chemie AV ČR, 250 68 Řež,
4
Katedra farmakologie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého, Hněvotínská 3, 775 15
Olomouc
Chronická expozice benzenu má za následek zvýšené riziko závažných poruch
krvetvorby, jako např. aplastické anémie nebo akutní myeloidní leukémie. Klíčová role v
toxicitě benzenu je přitom připisována jeho metabolismu. Mezi reaktivní metabolity benzenu
zodpovědné za jeho účinky patří hydrochinon a benzochinon. U těchto látek byl pozorován
destruktivní účinek na cytochromy P450 in vitro v lidských a potkanních jaterních
mikrosomech. Lidské a potkanní jaterní cytochromy P450 vykazují rozdíly v citlivosti vůči
53
destrukčnímu působení metabolitů benzenu i vůči oxidativního stresu způsobenému
přítomností NADPH. Potkan proto není vhodným modelovým druhem pro studium těchto
účinků. Miniprasata jsou považována za vhodnější druh pro studium biotransformace, protože
jejich nejdůležitější biotransformační enzymy jsou svým obsahem i aktivitami srovnatelné s
lidskými. V současné práci byly proto studovány interakce reaktivních metabolitů benzenu s
cytochromy P450 s použitím miniprasete jako modelového druhu.
Jaterní mikrosomy miniprasete byly inkubovány v přítomnosti různých koncentrací
studovaných metabolitů benzenu (benzochinonu, hydrochinonu, katecholu) a NADPH.
Následně byl spektrofotometricky stanoven obsah cytochromu P450 a pomocí ESR bylo
stanoveno množství hydroxylových radikálů.
Ze sledovaných látek měl největší destrukční účinek na cytochrom P450 benzochinon,
zatímco největší tvorba hydroxylových radikálů byla zaznamenána při inkubacích
s hydrochinonem. Z těchto výsledků vyplývá, že při destrukci cytochromu P450 vlivem
metabolitů benzenu pravděpodobně nehraje významnou roli oxidativní stres, ale probíhá
nejspíše přímou vazbou na molekulu enzymu. Stimulace tvorby hydroxylových radikálů
vlivem hydrochinonu potom ukazuje na oxidativní stres jako další možný mechanismus
toxických účinků benzenu a jeho metabolitů, který ovšem pravděpodobně nezpůsobuje
destrukci cytochromů P450.
Podpořeno grantem GAČR, číslo 203/02/1152
VYUŽITÍ MIKROSKOPIE ATOMÁRNÍCH SIL A REZONANCE POVRCHOVÉHO
PLASMONU PŘI STUDIU FIBRINOGENU A JEHO PŘEMĚNY NA FIBRIN
Roman Kotlín1, Jan E. Dyr1, Eduard Brynda2
1
Ústav hematologie a krevní transfuze, U nemocnice 1, 128 20 Praha 2
2
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Heyrovského nám. 2, 162 06 Praha 6
Fibrinogen je glykoprotein krevní plasmy o molekulové hmotnosti 340 kDa. Je
syntetizován v hepatocytech a cirkuluje v krevní plasmě. Je sestaven ze tří párů různých
polypeptidových řetězců Aα, Bβ a γ. Řetězec Aα je tvořen 610 aminokyselinami a má
molekulovou hmotnost 64 kDa. Řetězec Bβ je tvořen 461 aminokyselinami a má
molekulovou hmotnost 57 kDa. Řetězec γ je tvořen 411 aminokyselinami a má molekulovou
hmotnost 48 kDa. K rětezcům Bβ a γ jsou připojeny N-glykosidicky vázané biantenární
oligosacharidy N-acetyllaktosaminového typu. Všech šest řetězců je kovalentně spojeno
disulfidovými vazbami.
Působením serinové proteasy - α-thrombinu dojde k postupnému uvolnění
fibrinopeptidů A (N koncová část Αα řetězce) a fibrinopeptidů B (N koncová část Bβ řetězce)
z molekuly fibrinogenu. Tím dojde k odkrytí vazebných míst pro další molekulu fibrinogenu a
tvorbě protofibril. Protofibrily následně asociují a tvoří fibrinová vlákna, která spolu
s krevními destičkami, erytrocyty tvoří hemostatickou zátku.
Pomocí rezonance povrchového plasmonu (SPR – surface plasmon resonance) jsme
sledovali adsorpci fibrinogenu na zlatý povrch, jeho přeměnu na fibrin, tvorbu multimerních
vrstev a vliv přítomnosti vápenatých iontů. Zajímala nás především tvorba fibrinového
dimeru, fibrinového trimeru a fibrinového tetrameru. SPR je optická metoda využívající ke
sledování dějů na povrchu senzoru v reálném čase tvorbu evanescentního pole, které vzniká
dopadem laserového paprsku na vrstvu zlata. Měřením jsme zjistili, že množství
54
adsorbovaného fibrinogenu na povrchu senzoru závisí na koncentraci fibrinogenu použitého
v roztoku.
Při použití roztoku fibrinogenu o koncentraci 2 µg/ml se na povrch imobilizovalo 5,2
± 0,3 RU fibrinogenu. Při použití roztoku o koncentraci 200 µg/ml se na povrch imobilizovalo
14,7 ± 1,1 RU fibrinogenu. Po přidání 2 mmol/l roztoku vápenatých iontů k roztoku
fibrinogenu množství fibrinogenu adsorbovaného na povrch senzoru vzrostlo na 17,4 ± 0,9
RU. S rostoucí koncentrací vápenatých iontů (až do koncentrace 50 mmol/l) rostlo i množství
molekul fibrinogenu na povrchu. Při vyšších koncentracích vápenatých iontů byl efekt
opačný, způsobený vysokou iontovou silou roztoku.
Sledováním tvorby tetramerní fibrinové vrstvy jsme zjistili, že množství molekul
sorbovaných do jednotlivých vrstev se liší. Množství fibrinogenu sorbovaného do druhé
vrstvy bylo 92,11 %, množství fibrinogenu sorbovaného do třetí vrstvy bylo 71,93 % a
množství fibrinogenu sorbovaného do čtvrté vrstvy bylo 99,30 %. Po přidání vápenatých
iontů se opět projevil jejich pozitivní vliv na adsorpci.
Pomocí mikroskopie atomárních sil jsme sledovali fibrinové sítě vytvořené působením
thrombinu na skleněném a polystyrenovém povrchu. Sledovali jsme vliv koncentrace
fibrinogenu a vliv přítomnosti vápenatých iontů na rozměry fibrinových vláken a mezer mezi
nimi. Mikroskopie atomárních sil (AFM – atomic force microscopy) je mikroskopická metoda
využívající pro sledování povrchu vzorku kontakt miniaturního hrotu se vzorkem. Pomocí
této metody jsme zjistili, že vlákna vzniklá z fibrinogenu o koncentraci 200 µg/ml měla šířku
100 – 550 nm, póry mezi nimi měli šířku 80 – 150 nm. Při použití roztoku fibrinogenu o
koncentraci 1000 µg/ml vznikali vlákna o šířce 300 – 850 nm. Póry mezi nimi byli menší a
jejich rozměry se pohybovali mezi 50 – 100 nm. Vlivem přítomnosti vápenatých iontů
v roztoku, došlo k vytvoření vláken širších v průměru o 30%.
Poděkování: Tato práce vznikla díky finanční podpoře GAČR č. 303/03/0249.
CYTOPLAZMATICKÉ ENZYMOVÉ SYSTÉMY KVASINKY CANDIDA
TROPICALIS ZODPOVĚDNÉ ZA HYDROXYLACI FENOLU
Jan Páca Jr.a, Veronika Kremláčkováa, Marie Stiborováa,Jan Pácab
a
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030,
128 40 Praha 2, Česká republika.
b
Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko technologická, Technická 5,
166 28 Praha 6, Česká republika.
Řada složek životního prostředí je v současné době kontaminována fenolickými látkami.
Nejdůležitějšími zdroji kontaminace jsou průmyslové zpracování hnědého uhlí, procesy
petrochemického průmyslu, výroba mnohých léčiv a barviv. Odpady ze všech těchto výrob
představují výraznou zátěž pro životní prostředí. Kvasinka Candida tropicalis je schopna
fenol využívat jako zdroj uhlíku a energie pro svůj růst. Tohoto faktu by se mohlo využít při
biologické dekontaminaci životního prostředí znečištěného fenolickými látkami. Naše
laboratoř pracuje s kmenem Ct2, který byl získán z kontaminované půdy na Mostecku.
Metabolická degradace fenolu probíhá prostřednictvím cytochromu P450 přítomného v
mikrosomální frakci a fenolhydroxylasy přítomné v cytosolární frakci.. Vzniklý katechol je v
případě eukaryot ortho dráhou dále metabolizován enzymem katechol-1,2-dioxygenasou (EC
1.13.11.1) na kyselinu cis-cis mukonovou, která je přemněňována až na AcetylCoA a
55
sukcinát.
Cílem naší práce je izolace a charakterizace enzymů schopných hydroxylovat fenol ve
studovaném mikroorganismu, konkrétně se jedná o cytosolární fenolhydroxylasu. Nejprve
bylo nutné získat, a to frakční centrifugací, dostatečné množství cytosolární frakce. V takto
připravené buněčné frakci byla sledována aktivita enzymů potenciálně schopných oxidovat
fenol. Buněčné
kompartmenty C. tropicalis, rostoucí v mediu obsahujícím fenol,
vykazovaly fenolhydroxylasovou aktivitu, tedy v cytosolární frakci došlo působením fenolu
k indukci
flavoproteinové monooxygenasy, NADPH-dependentní fenolhydroxylasy (EC
1.14.13.7). V současné době se zabýváme izolací fenolhydroxylasy z buněčného cytosolu.
Prvním separačním krokem byla chromatografie na DEAE–Sepharose, kde bílkoviny byly
eluovány gradientem NaCl. K následné purifikaci fenolhydroxylasy byla použita frakční
precipitace polyethylenglykolem 6000 (PEG 6000). Finálním separačním krokem byla gelová
permeační chromatografie na Sepharose-4B. Purifikovaný enzym byl charakterizován
z hlediska molekulové hmotnosti a jeho kvalita pomocí elektroforesy na polyakrylamidovém
gelu (SDS-PAGE).
Podporováno GAČR (grant 104/03/0407) a Ministerstvem školství České republiky (MSM
1131 00001).
REGULACE A VÝZNAM EXPRESE VIMENTINU PŘI DIFERENCIACI
MONOBLASTŮ TRANSFORMOVANÝCH ONKOGENEM V-MYB
Vendula Macečková, Petr Beneš, Jan Šmarda
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
Maligní transformace hematopoetických buněk je spojena s poruchou mechanismů
řídících proliferaci, diferenciaci a/nebo apoptózu a často se projevuje zablokováním určité
diferenciační dráhy s následným omezením tvorby zralých krevních buněk. Studium faktorů,
které aktivně ovlivňují diferenciaci hematopoetických buněk, přispívá k objasnění těchto
mechanismů a může naznačit nové možnosti, jak tyto poruchy krvetvorby eliminovat.
Při
studiu
monocytické/makrofágové
diferenciace
kuřecích
monoblastů
transformovaných onkogenem v-myb (BM2) indukované různými činidly jsme v těchto
diferencujících buňkách pozorovali nárůst hladiny neznámého proteinu, který jsme následně
hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF identifikovali jako cytoskeletární protein vimentin.
Transkripčně-aktivačními testy jsme zjistili, že nárůst hladiny vimentinu v buňkách BM2
vystavených forbolovému esteru TPA, trichostatinu A (TSA) či okadaikové kyselině (OA)
koreluje s nárůstem aktivity promotoru genu kódujícího vimentin. Dále jsme pozorovali, že
transkripce vimentinu je indukovaná transkripčními faktory c-Myb, v-Myb, c-Jun, v-Jun a
také aktivovanými jadernými receptory pro kyselinu retinovou. Pro zjištění významu
vimentinu při indukované diferenciaci BM2 jsme použili strategii snížení exprese vimentinu
pomocí siRNA. Po stabilní transfekci buněk BM2 vektorem obsahujícím specifickou siRNA
sekvenci se nám podařilo získat několik klonů, u kterých úroveň exprese vimentinu dosáhla
pouze 30 % ve srovnání s mateřskou linií. U těchto klonů kultivovaných za přítomnosti TPA,
respektive TSA, jsme pozorovali výrazně sníženou schopnost tvorby makrofágových
polykaryonů a sníženou schopnost fagocytózy.
56
Uvedené výsledky ukazují, že přesně regulovaný nárůst exprese vimentinu je důležitou
podmínkou
tvorby
plně
funkčních
makrofágových
polykaryonů
během
monocytické/makrofágové diferenciace.
Tato práce byla podporována granty 301/03/D022 a 301/03/1055 Grantové agentury České
republiky.
INFLUENCE OF ANTIOXIDANT FOOD SUPPLEMENT INTAKE ON SELECTED
METABOLIC FUNCTIONS
Simona Macuchová1, Ivana Márová1, Rostislav Kotrla2
Vysoké učení technické v Brně, Chemická fakulta, Ústav potravinářské chemie
a biotechnologie, Purkyňova 118, 612 00 Brno
2
Nemocnice Kyjov p.o., Oddělení klinické biochemie, Strážovská 967, 697 33 Kyjov
1
Oxidative mechanisms may play an important role in various pathologic processes as
well as in ageing. The most of chronic degenerative diseases such as diabetes and
atherosclerosis may be related to a deficit in the intake of antioxidant vitamins and trace
elements, as well as to an impaired adaptive enzymatic mechanism against oxidative stress.
Physiological modifications occurring during the lifetime and environmental influences are
significant factors contributing to the impairment of micronutrient status. In the present state
of knowledge, combined supplementation by antioxidants could be the best way to prevent
accelerated ageing and reduce the risk of several common age-related and degenerative
diseases. Moreover, in the Czech population strongly seasonal differences in natural
antioxidant intake were found.
The aim of this work was to contribute to actual knowledge of the influence of an
antioxidant supplement type on metabolic and antioxidant status in a sample of type 2
diabetics. The influence of vitamin supplementation on several clinical and biochemical
parameters as well as on levels of antioxiants in human serum was carried out in an
intervention clinical study. The total of 50 subjects were enrolled into the study. These
subjects divided into three groups (1. NIDDM; n = 20, 2. group of healthy individuals; n = 20,
3. control group; n = 10). The influence of antioxidant intake was followed in the nine-month
study. In the first period of experiment (October – December 2003) took all groups normal
diet. During the second period (January – March 2004) the food supplement containing
antioxidants (5 mg β-carotene, 0.75 mg retinol, 2.5 mg lycopene, 50 mg ascorbic acid, 50 mg
ascorbyle-palmitate, 50 mg α-tocopherol, 25 µg Se, 4 mg Zn, 1 mg Mn, 5 mg Q10, 50 mg Lcystein, 5 mg L-glutathion, 50 µg α-lipoic acid, 10 mg extract from Ginkgo Biloba, 7.5 mg
extract from green tea, 2.5 mg extract from blueberries) was applied to groups 1 and 2. During
the experiment blood samples were taken in regular intervals. Set of biochemical parameters
(urea, creatinine, uric acid, bilirubin, albumin, cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol,
triacylglycerols, apolipoproteins, glycosyled hemoglobin), total antioxidant status as well as
levels of low molecular weight antioxidants (flavonoids – rutin, morin, quercetin; carotenoids
– lutein, lycopene, α-, β-carotene; retinol, α-tocopherol) were determined in all samples.
Antioxidant supplementation led to the significant hypolipidemic effect both in diabetics
(e.g. total cholesterol 6.26 vs. 5.69 mmol/l, LDL-cholesterol 3.96 vs. 3.46 mmol/l,
apolipoprotein B 1.37 vs. 1.17 g/l) and healthy individuals (e.g. total cholesterol 6.27 vs. 5.52
mmol/l, LDL-cholesterol 3.71 vs. 3.24 mmol/l, apolipoprotein B 1.31 vs. 1.04 g/l). In the
57
group of healthy individuals increase of serum levels of low molecular weight antioxidants
was observed.
It is an old concept that food and health are intimately linked; in 400 B.C. the
physician Hippocrates wrote, “Let food be your medicine and medicine be your food”. This
study confirmed that the intake of complex antioxidant micronutrients positively influenced
total antioxidant and metabolic status in diabetics as well as in healthy subjects. According to
our findings, an optimum supplement should contain a complex mixture of naturally
occurring antioxidants to ensure an adequate ratio for the synergistic biological effect of the
whole group of antioxidants.
DISTRIBUTION OF THE ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE INCORPORATED
IN MICELLES IN RATS
Marie Stiborová1 , Zuzana Manhartová1, Jan Kučka1,2, Martin Hrubý3, Eva Frei4
Department of Biochemistry and 2Department of Organic Chemistry, Charles University,
Albertov 2030, 128 40 Prague 2
3
Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague
4
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
1
Ellipticine is an alkaloid exhibiting potent antineoplastic activities. The derivatives of
agent are used in the therapy of breast cancer and leukemia and have multiple cellular targets.
Among these, the inhibition of topoisomerase II after intercalation into DNA was hitherto
considered the most important property for ellipticine toxicity. Recently, we found that
ellipticine also forms covalent DNA adducts in vitro and in vivo and that the formation of the
major adduct is dependent on the activation of ellipticine by cytochromes P450 (CYP) and
peroxidases [1-4].
Here, we incorporated ellipticine into the artificial micelles and analyzed whether
ellipticine in this form is distributed in the rat experimental model to tissues, which are
available to action of ellipticine applied in the non-micelle form. Analysis of DNA adducts
generated by ellipticine in vivo [3] and that of incorporation of radioactive labeled micelles
into the rat tissues were used to study the distribution of micelles with ellipticine and without
this anticancer drug in the rat animal model, respectively. Stability of ellipticine in micelles
was studied in vitro simulating its behavior under the physiological conditions (the
physiological solution, different pH, stability in the presence of membranes of endoplasmic
reticulum).
Male Wistar rats were treated with two different doses of ellipticine in micelles (4.0 and
10.0 mg of ellipticine per kg of body weight) and DNA from various organs were analyzed by
32
P-postlabeling. Ellipticine-specific DNA adduct patterns, similar to those found in most
organs of rats treated with non-micelle form of ellipticine (liver, kidney, lung, spleen, heart
and brain), were detectable in DNA of analyzed tissues. The formation of adducts was
concentration-dependent. Similarly to results of the former study [3], the highest level of
ellipticine-derived DNA adducts was found in liver, followed by spleen, lung, kidney, heart
and brain. One major and one minor ellipticine-mediated adducts were found in DNA of all
tissues of rats exposed to ellipticine in micelles, but their levels were lower than those in rats
exposed to ellipticine in the non-micelle form. The predominant adducts are identical to the
deoxyguanosine adducts generated in DNA by two ellipticine metabolites formed by CYPs,
13-hydroxyellipticine and the N2-oxide of ellipticine, in vitro [1,2,4].
The results are the first report studying the distribution of ellipticine in micelles in rats.
58
References
1) Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675
(2001).
2) Stiborová M., Stiborová-Rupertová M., Bořek-Dohalská L., Wiessler M., Frei E.:
Chem. Res. Toxicol., 16, 38-47 (2003).
3) Stiborová M., Breuer A., Aimová D., Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.:
Int. J. Cancer, 107, 885-890 (2003).
4) Stiborová M., Sejbal J., Bořek-Dohalská L., Aimová D., Poljaková J., Forsterová K.,
Rupertová M., Wiesner J, Hudeček J., Wiessler M., Frei E.: Cancer Res., 64, 83748380 (2004).
Supported by the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM0021620808).
STANOVENÍ PROTEINU MUTS A DETEKCE BODOVÝCH MUTACÍ V DNA
S POUŽITÍM ELEKTROCHEMICKÝCH METOD A PIEZOELEKTRICKÉHO
BIOSENZORU
Michal Masařík1, Kateřina Cahová1, René Kizek2, Miroslav Fojta1 a Emil Paleček1
1
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
2
Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta MZLU, Zemědělská 1, 61300 Brno
Protein MutS hraje významnou úlohu v reparačním systému DNA u prokaryotických i
eukaryotických buněk, kde rozpoznává nespárované nebo špatně spárované báze v
dvoušroubovici DNA a může být využit pro detekci bodových mutací in vitro 1. Jedná se o 90
kDa protein patřící do skupiny ABC ATPáz. Z krystalové struktury vyplývá, že MutS protein
tvoří stabilní dimery a v této formě se také váže na heteroduplexy DNA 2-5.
Před časem jsme ukázali, že malá množství tohoto proteinu je možné elektrochemicky
detekovat na rtuťové elektrodě bez jakéhokoliv značení6. S využitím chronopotenciometrické
rozpouštěcí analýzy a rtuťové elektrody jsme schopni detegovat desítky attomolů proteinu
MutS. S použitím MutS proteinu jsme schopni rozpoznat nesprávně spárované báze případně
inserce/delece v duplexech DNA přichycených na magnetické kuličky. Z našeho měření
vyplynulo, že největší afinitu měl MutS protein k „nesprávnému“ páru bazí G:T DNA v
kombinaci s insercí jednoho thyminu v jeho sousedství.
V následných experimentech jsme využili adsorptivní rozpouštěcí square wave
voltametrii ke stanovení proteinu MutS na uhlíkové pastové elektrodě (CPE), která využívá
přítomnosti tyrosinových a tryptofanových zbytků v molekule proteinu. Touto technikou jsme
schopni detegovat protein MutS v pikogramových množstvích. Dále jsme opět využili
dvoupovrchovou detekci bodových mutací v DNA s využitím MutS proteinu a s pomocí
magnetických kuliček pokrytých streptavidinem. Z elektrochemických měření na CPE, které
byly ověřeny i pomocí piezoelektrického biosenzoru, jsme ve shodě s předchozími výsledky
zjistili, že ze zkoumaných heteroduplexů má MutS protein nejvyšší afinitu k DNA obsahující
„mismatch“ G:T.
Tato práce byla financována granty IGA MZ NC/7574–3 dále IGA AVČR Z 5004920 a
S5004355 a firmou November AG, Erlangen, Německo.
(1)
(2)
Jiricny, J. Curr. Biol. 2000, 10, R788-790.
Biswas, I.; Hsieh, P. J. Biol. Chem. 1996, 271, 5040-5048.
59
(3)
(4)
(5)
(6)
Jones, P. M.; George, A. M. Cell. Mol. Life Sci. 2004, 61, 682-699.
Lamers, M. H.; Perrakis, A.; Enzlin, J. H.; Winterwerp, H. H.; de Wind, N.; Sixma, T.
K. Nature 2000, 407, 711-717.
Obmolova, G.; Ban, C.; Hsieh, P.; Yang, W. Nature 2000, 407, 703-710.
Paleček, E.; Masařík, M.; Kizek, R.; Kuhlmeier, D.; Hassman, J.; Schülein, J. Anal.
Chem. 2004, 76, 5930-5936.
STUDY OF ANTIMUTAGENIC PROPERTIES OF VARIOUS SORTS OF TEA
Mikulcová A. 1, Kubešová J. 1, Ptáček P. 1, Márová I. 1, Buňková R. 2
1
Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Department of Food Chemistry and
Biotechnology, Purkyňova 118, 612 00 Brno
2
The Institute of Biophysics of the Academy of Sciences of The Czech Republic,
Královopolská 135, 612 65 Brno
Mutagenesis plays the important role in initial phase of carcinogenesis. Oxygen free
radicals and lipid peroxidation processes are important factors in the induction of mutagenesis
and carcinogenesis, and are considered to be major contributors to DNA damage.
The powerful reactivity of active oxygen species can cause functional damage to man,
triggering mutagenesis, carcinogenesis, circulatory disturbances and aging.
The aim of this work was the study of antimutagenic effects of selected natural
substances, especially various sorts of tea. Four sorts of green tea, one sort of white tea, one
sort of semi-fermented tea, one sort of black tea, two sorts of Rooibos, one sort of Lapacho
and Ginkgo were studied. Biological activity of individual tea samples was compared with
content of its active components. The study of tea composition was performed by HPLC
analysis. In tea extracts high content of flavonoids, especially (-)-catechin and (-)catechingallate, was found. The highest amount of catechins was detected in green tea.
Presence of rutin and quercetin was also confirmed. During long-time storage of tea gradual
decrease of concentration of tea catechins was observed. This decrease was higher in green
tea Gun Powder and in specific natural tea Ginkgo when compared with fermented sorts of
tea.
Simultaneously with HPLC analysis the total antioxidant status of tea extracts was
determined. Using ABTS method the highest antioxidant activity was found in green tea and
non-fermented white tea.
Biological effects of tea extracts were studied using two in vitro tests: i) test with yeast
strain Sacharomyces cerevisiae D7 and ii) test with protozoon Euglena gracilis.
High antimutagenic effect was found out in green tea extracts (Gun Powder, Lung Ching), in
semi-fermented tea Oolong, Rooibos, white tea and Lapacho. Most of these tea extracts
exhibited high content of tea catechins as well as high total antioxidant activity.
Antimutagenic effect depends on sort of tea and concentration of extract. Tea extracts
probably may contain other active compounds with antimutagenic and/or genotoxic activity.
Using E. gracilis test system, high antimutagenic effect of Lapacho was confirmed.
However, this test was not usable for so exact testing of antimutagenic activity of tea extracts
as test with yeast Saccharomyces cerevisiae D7.
60
KVANTIFIKACE GENU FOSFOENOLPYRUVÁTKARBOXYLASY V
ROSTLINÁCH TABÁKU INFIKOVANÝCH Y VIREM BRAMBORU
Karel Müller1 , Noemi Čeřovská2, Helena Ryšlavá1
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 2030,
128 00 Praha 2
2
Ústav experimentální botaniky, Akademie věd České republiky, Na Karlovce 1a,160 00
Praha 6
1
Byla studována role fosfoenolpyruvátkarboxylasy (PEPC, EC 4.1.1.31) v rostlinách
tabáku (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1) infikovaných Y virem bramboru,
kmenem NTN (PVYNTN). Primární funkce PEPC v C4 rostlinách je fixace atmosferického
CO2. V C3 rostlinách je PEPC důležitým anaplerotickým enzymem s klíčovou úlohou
v metabolismu uhlíku a dusíku. PEPC je citlivě regulována na mnoha úrovních (aktivace a
inhibice metabolity, fosforylace specifickou PEPC kinasou, disociace podjednotek).
V desátém dni infekce byly odebrány směsné vzorky vrcholových
listů a
imunochemicky prokázána přítomnost viru. Aktivita PEPC byla v infikovaných rostlinách
třikrát vyšší v porovnání s kontrolními rostlinami. Metodou real time PCR bylo sledováno,
dochází-li ke zvýšení transkripce mRNA pro PEPC. Relativní kvantifikace byla vztažena ke
genu pro Aktin9, který se vlivem virové infekce nemění. Mírné zvýšení obsahu mRNA pro
PEPC (1,5 krát) v rostlinách infikovaných PVYNTN nevysvětluje zvýšení enzymové aktivity.
V listech infikovaných rostlin bylo zjištěno zvýšení obsahu malátu a glukosa-6-fosfátu, které
jsou významnými modulátory aktivity PEPC. Citlivost na tyto efektory je však ovlivněna
podílem fosforylované/defosforylované formy PEPC. Proto je tato úroveň regulace v práci
také diskutována.
PODĚKOVÁNÍ: Tato práce je podporována granty: GA UK 428/2004, GA ČR 206/03/0310.
Primery pro Aktin9 byly laskavě poskytnuty RNDr. Helenou Štorchovou z ÚEB AV ČR.
INHIBITION OF HUMAN LIVER MICROSOMAL CYTOCHROME P450 2E1 BY
PHOSPHONATES OF ACYCLIC NUCLEOSIDES
Jana Nekvindová1, Eva Anzenbacherová2, Alena Veinlichová1 and Zdeněk Zídek3
Palacky University, Faculty of Medicine, Department of 1Pharmacology and 2Medical
Chemistry and Biochemistry, Hnevotinska 3, 775 15 Olomouc
3
Institute of Experimemental Medicine, Academy of Sciences of the Czech Republic, Vídeňská
1083, 142 20 Praha 4, Czech Republic
INTRODUCTION: Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) (1) is clinically and toxicologically
important enzyme which is expressed in the liver and many other tissues. It is involved in the
oxidative biotransformation of numerous therapeutic agents (e.g. paracetamol) and
procarcinogens (e.g. nitrosamines). CYP2E1 also plays a role in the metabolism of
endogenous compounds including fatty acids; its activity is affected by some pathophysiological conditions such as diabetes. CYP 2E1 is inducible by alcohol, acetone, isoniazid
and other compounds, many of which are substrates of the enzyme. Acyclic nucleoside
phosphonates have been studied during the past 15 years for their potential as antiviral drugs.
One of these compounds, 9-(2-phosphonomethoxyethyl)adenine (PMEA; adefovir) was
61
recently approved in the form of its bis(pivaloyloxymethyl)ester (adefovir dipivoxil,
Hepsera®) for use in hepatitis B therapy. Tenofovir disoproxil fumarate (Viread®) is an oral
prodrug of tenofovir (9-(2-phosphonomethoxypropyl)adenine; PMPA), a nucleotide
(nucleoside monophosphate) analogue with activity against retroviruses, including HIV-1,
HIV-2 and hepadnaviruses (2).
METHODS: Inhibition of two CYP2E1 activities (chlorzoxazone or p-nitrophenol
hydroxylation) by four following substances, adefovir (PMEA), adefovir dipivoxil
(bis(POM)-PMEA), tenofovir (PMPA) and tenofovir disoproxil (bis(POC)-PMPA) using
human liver microsomal fraction was followed by established methods using HPLC analysis
with UV detection.
RESULTS: CYP2E1 activities was not inhibited neither by PMEA or bis(POM)-PMEA; on
the other hand, PMPA moderately inhibited 2E1 activity measured by chlorzoxazone by
approx. 30%, and bis(POC)-PMPA inhibited both activities (chlorzoxazone and pnitrophenol) by 60%. The character of inhibition was not clear giving characteristics of fully
acompetitive inhibition at lower substrate concentration and of a mixed inhibition at higher
concentration of substrate. The respective IC50 value (p-nitrophenol hydroxylation inhibited
by bis(POC)-PMPA) is in the range of 200 µM. As the plasmatic levels of this drug
(bis(POC)-PMPA, tenofovir disoproxil) are relatively high, this fact may be of clinical
importance for drug interactions. The results are the first in the literature documenting
conclusively an interaction of drugs based on acyclic nucleoside phosphonates with human
liver microsomal cytochromes P450.
References
1. Tanaka E, Terada M, Misawa S: Cytochrome P450 2E1: its clinical and toxicological role.
J Clin Pharmacy Therapeutics 25, 165-175 (2000)
2. Kearney BP, Flaherty JF, Shah J.: Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology
and pharmacokinetics. Clin Pharmacokinet 43, 595-612 (2004)
Acknowledgment
The support from the Grant Agency of the Czech Republic (305/04/0127) is gratefully
acknowledged.
THE ANALYSIS OF OLIGOGALACTURONIC ACIDS BY HIGH-PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY
Jiřina Omelková, Lucie Jančeková and Eva StratilováÂ
Faculty of Chemistry, Technical University of Brno, Purkyňova 118, CZ – 612 00 Brno,
Czech Republic
Â
Institute of Chemistry of SAS,Dúbravská cesta 9, SK – 845 38 Bratislava, Slovakia
The analysis of uronic acids such as D-galacturonic acid and the analysis of
oligogalacturonic acids by high-performance liquid chromatography was studied. The
oligogalacturonic acids were separated on a strong anion-exchange column (NUCLEOSIL
100-5 SB) with acetate buffers as eluent.
High-performance anion-exchange chromatography coupled with a RI detector was used
to identify oligogalacturonic acid components in pectins. Enzyme preparation Rohament P
was used to generate oligomers from sodium polygalacturonate.
62
A mixture of oligogalacturonic acids obtained by enzymatic degradation of pectic acid,
was successfully separated by system based on anion-exchage chromatography.
The method was also applied for the characterization of products formed by the enzyme
degradation of pectines.
KONTINUÁLNÍ AEROBNÍ BIODEGRADACE FENOLU ZE
SIMULOVANÉ ODPADNÍ VODY V PRŮTOČNÝCH REAKTORECH
Jan Páca Jr.a, Alena Kostečkováb, Marie Stiborováa, Andrew Mark Gerrardc
a
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128 40
Praha 2, Česká republika, Tel: +420-221951285, Fax: +420-2219521283, e-mail:
[email protected]
b
Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko technologická, Technická 5,
166 28 Praha 6, Česká republika; Tel: +420-224353785, Fax: +420-224355051, e-mail:
[email protected]
C
University of Teeside, School of Science & Technology, Middlesbrough, England TSI 3BA
Fenol patří mezi aromatické polutanty, které jsou přítomny v průmyslových odpadech, a
to hlavně z výrob koksárenských, petrochemických, farmaceutických a z výrob umělých
hnojiv, barviv, výbušnin, fungicidů a fenolformaldehydových pryskyřic. V současné době je
vedle fyzikálně chemických či chemických způsobů odstraňování škodlivých látek z prostředí
platnou variantou také biologické čištění, avšak za podmínky, že dané látky jsou biologicky
rozložitelné. Biologické čištění je ekonomicky výhodnější oproti fyzikálně chemickým a
chemickým procesům při stejné účinnosti čištění. Z odpadních vod je fenol vzhledem
k rychlejšímu a všestrannějšímu metabolismu mikroorganismů lépe odstraňován v aerobním
prostředí. K tomu může být například využit náplňový reaktor s imobilizovanou mikrobní
populací. Navíc může být toto zařízení použito přímo v terénu tzv. metodou „pump and
clean“ v lokalitách, kde jsou spodní vody nebo půda kontaminovány fenolem.
Tato studie se zabývá problematikou degradace fenolu z vodného prostředí. K degradaci
byly použity náplňové reaktory. Průměr reaktorů byl 50 mm a pracovní objem 650 ml.
Degradace probíhaly při teplotě 30 °C a pH vstupního media 7,2. Reaktory byly provozovány
v souproudém režimu toku vzduchu a kapalné fáze. Pro imobilizaci buněk byly použity
následující materiály: kokosová vlákna, polyurethanová pěna, porézní skleněné kuličky a
expandovaná břidlice. Měřené parametry byly: koncentrace fenolu na vstupu a výstupu, pH a
množství rozpuštěného kyslíku ve výtokovém proudu, průtok vzduchu a kapalné fáze.
Experimenty byly rozděleny do dvou částí. Nejdříve byla studována počáteční perioda
provozu, tzv. „start-up period“. Následovaly zátěžové studie. U reaktoru s náplní
polyurethanové pěny byl testován vliv doby zdržení, organické zátěže, vliv limitace kyslíkem
a vliv obsahu dusíku v mediu na provoz bioreaktoru.
Výsledky demonstrují schopnost náplňového reaktoru efektivně odstraňovat fenol
z odpadní vody.
Tento projekt je finančně podporován GAČR (104/03/0407) a Ministerstvem školství České
republiky (MSM 1131 00001).
63
PŘÍPRAVA SUBCELULÁRNÍCH SYSTÉMŮ KVASINKY CANDIDA TROPICALIS
HYDROXYLUJÍCÍCH FENOL
Jan Páca Jr.a, Iva Mátlováa, Marie Stiborováa, Jan Pácab
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128 40
Praha 2, Česká republika, Tel: +420-221951285, Fax: +420-2219521283, E-mail:
[email protected]
b
Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5,
166 28 Praha , Česká republika Tel: +420-224353785, Fax: +420-224355051.
a
S bouřlivým rozvojem technologických procesů se do životního prostředí začaly
dostávat a kumulovat se v něm cizorodé látky se kterými se v průběhu evoluce organismy
nesetkaly. Mezi tyto polutanty patří i fenol, který je pro většinu organismů toxický. Zdroje
kontaminace fenolem jsou rozmanité. V minulém století již byly navrženy fyzikálněchemické technologie, které byly ekonomicky nákladné a pro životní prostředí nešetrné.
Současnou snahou je vývoj bioremediací za využití mikroorganismů. Prvním krokem aerobní
degradace fenolu je jeho hydroxylace na katechol.
Cílem této práce bylo poznat nejefektivnější metodu pro dezintegraci buněk kvasinky
Candida tropicalis k získání dostatečného množství mikrosomální a cytosolární frakce těchto
buněk. Obě subcelulární frakce jsou nutné pro sledování enzymů účinných v prvém kroku
biodegradace fenolu studovaným mikroorganismem.
Jako nejvhodnější metoda pro získání preparátů s aktivními enzymy katalyzujícími
hydroxylaci fenolu na katechol byla vyhodnocena metoda vymražování buněk kapalným
dusíkem s mechanickou dezintegrací.
Tato práce vznikla jako součást projektů GAČR (104/03/0407) a Ministerstva školství České
republiky (MSM 1131 00001).
DETEKCE BETA-DEFENSINŮ A NOS V NORMÁLNÍ A PATOLOGICKÉ NOSNÍ
SLIZNICI ČLOVĚKA
Pácová Hana1, Kučera Tomáš2, Astl Jaromír1, Martínek Jindřich2
Klinika otorhinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku, 1. lékařská fakulta, Univerzita
Karlova, V Úvalu 84, 150 00 Praha 5, Česká Republika, Tel.: +420-224434397, e-mail:
[email protected]
2
Ústav pro histologii a embryologii, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 4,
128 01 Praha 2, Česká Republika, Tel.: +420-224968127, e-mail: [email protected]
1
Defensiny-beta, stejně jako oxid dusnatý (NO), jsou důležitými složkami přirozené
imunitní odpovědi. Podobně jako u jiných obranných mechanizmů, mohou i tyto imunitně
aktivní látky působit škodlivě na buňky a tkáně vlastního organismu v případě, že je jejich
regulace narušena. Nosní polypóza je poměrně časté onemocnění, jehož etiopatogeneza je
dávána do souvislosti s poruchou řízení imunitní odpovědi. Abychom mohli nalézt případnou
roli defensinů-beta a NO v této patologii, provedli jsme imunohistochemickou detekci
defensinu-beta 2, defensinu-beta 3 a endotelové syntázy NO v nosních polypech a v relativně
normální nosní sliznici. Ve snaze o nalezení souvislosti mezi lokální produkcí NO a defenzinů
64
beta s buněčnou proliferací a programovanou buněčnou smrtí (apoptózou) jsme v témž
materiálu provedli imunohistochemickou detekci markerů obou těchto procesů.
Vzorky lidské nosní sliznice z dolní nosní skořepy a nosní polypy byly získány během
operací pro odstranění polypů a pro nápravu deviace nosní přepážky. Část materiálu byla
fixována v 4% paraformaldehydu a zpracována do parafinu, část vzorku byla rychle zmražena
v tekutém dusíku, a některé vzorky byly též zpracovány pro EM. Imunohistochemická
detekce lidského defensinu-beta 3 byla provedena imunofluorescenční metodou na
zmrazených řezech. Beta-defensin 2, endotelová NOS, proliferační marker Ki-67 a marker
apoptózy aktivní kaspáza-3 byly detekovány na parafínových řezech třístupňovou
imunoperoxidázovou metodou s užitím diaminobenzidinu jako substrátu.
Beta-defensin 3 byl detekován v nosních polypech. Byl variabilně přítomen
v cytoplazmě buněk povrchového epitelu, ve žlázkách a jejich vývodech. Beta-defensin 2 byl
pravidelně detekován v nosních polypech i v části vzorků normální nosní sliznice. Reakční
produkt byl lokalizován v povrchovém epitelu v cytoplazmě řasinkových a bazálních buněk,
případně na povrchu řasinkových buněk. Endotelová NOS byla prokazována v endotelových
buňkách zásobujících lamina propria zdravé i patologické tkáně. Detekce apoptotického
markeru – aktivované kaspázy-3 ukázala přítomnost ojedinělých apoptotických buněk v
epitelu a lamina propria normální sliznice i nosních polypů. Pozitivita jader pro marker
proliferace Ki-67 byla pravidelně nalézána v určitém procentu bazálních buněk.
Byla prokázána přítomnost antibakteriálně působících peptidů – defensinů beta 2 a beta
3 v povrchovém i žlázovém epitelu normální i patologické nosní sliznice. Tento nález
ukazuje na indukci jejich syntézy v důsledku bakteriální kolonizace sliznice. Přítomnost
endotelové syntázy v cévách lamina propria normální i patologické nosní sliznice poukazuje
na její známou roli v regulaci funkcí endotelu a cév, která je patologickým procesem
pravděpodobně nepostižena. Proces apoptózy epitelových buněk nebyl v analyzovaných
vzorcích příliš významný. Exprese defensinů tedy zřejmě nepůsobí nadměrné poškození
tkáně, které by mohlo navodit vyšší míru apoptózy. Vztah produkce defensinů a proliferace
buněk epitelu bude možné stanovit po vyhodnocení více vzorků s různou expresí defensinů a
různou mírou proliferace.
Tato práce byla podporována z grantu FRVŠ č.986 a z grantu NC 7487-3 IGA MZ ČR.
NMR STUDY OF PROTEIN POTENTIALLY INVOLVED IN MOLYBDOPTERIN
SYNTHESIS
Anna Pavelková, Lukáš Žídek, Pavel Macek
National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk Univerzity,
Kotlářská 2, 611 37, Brno
Molecule of interest, TA1019, is a protein possibly involved in molybdopterin synthesis. It
consists of 107 amino acid residues.
Structural study of TA1019 represents a part of proteomic project of a prokaryote organism,
Thermoplasma acidophilum. The recombinant protein TA1019 was prepared at the University
of Toronto, Canada, by Adelinda Yee and coworkers. Aggregation and low stability of the
sample excluded this project from automatically performed structural investigation. Due to
this fact, the sample was offered to our laboratory and subjected to careful structure
elucidation by NMR. At the present time, were made first basic steps in the course of
65
structural determination, i.e., assignment of the measured frequencies to the individual atoms
of the protein molecule. The obtained backbone sequential assignment and partial side chain
assignment is a necessary prerequisite for 3D structure determination. In addition, knowledge
of resonance frequencies of certain nuclei permits preliminary secondary structure prediction.
This work was supported by grant LN00A016
IDENTIFIKACE MODIFIKÁTOROVÝCH GENŮ POZDNÍHO KVETENÍ
U ARABIDOPSIS THALIANA
Vratislav Peška, Pavel Lízal, Jana Řepková, Jiřina Relichová
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
Variabilita v penetranci a expresivitě u monogenně podmíněných znaků může být
způsobena vlivem prostředí i genetickými faktory, například modifikátorovými geny.
Modifikátorové geny (modifikátory) suprimují, nebo zesilují, účinek cílových
(modifikovaných) genů. U člověka a živočišných modelů byla už popsána řada modifikátorů,
které pozměňují účinek především alel podmiňujících choroby (vrozená hluchota, cystická
fibróza, enzymopatie). U rostlin zatím modifikátory popsány nebyly.
Přechod z vegetativní fáze do reprodukční fáze je u rostlin klíčový proces. SpiS96
(dominantní mutace Spi indukovaná na genetickém pozadí raně kvetoucí linie S96) oddaluje
kvetení a mění tak rostliny raného fenotypu na pozdně kvetoucí. V této práci byla sledována
interakce alely SpiS96 a odlišného genetického pozadí raně kvetoucí linie Columbia (Col).
V generaci F2 po křížení SpiS96 s raně kvetoucím standardem S96 dochází
k jednoduchému štepení fenotypových tříd v poměru 1 : 3 (rané : pozdní). V generaci F2 po
křížení SpiS96 s raně kvetoucí linií odlišného genetického pozadí Columbia je výsledný
fenotypový štepný poměr také 1 : 3 (rané : pozdní), avšak u velké části pozdně kvetoucích
rostlin je zřetelné další výrazné prodloužení doby do kvetení oproti rodičovské linii. Existence
této fenotypové třídy ukazuje na přítomnost modifikátorových genů pro pozdní kvetení u A.
thaliana. V generaci F2 tohoto křížení byla proto provedena rekombinační analýza s cílem
indentifikace lokusů s takovým modifikačním účinkem. Tímto postupem byla zachycena
vazba s markerem nga225 na krátkém raménku 5. chromozómu. Nalezený modifikátorový
lokus byl předběžně zmapován do pozice 23,6 ± 5,1 cM od uvedeného markeru.
Tato práce vznikla za finanční podpory projektu MSM 143100008.
66
CYTOTOXICITY OF THE ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE AGAINST
HUMAN LEUKEMIA HL-60 CELLS AND NEUROBLASTOMA CELL LINES IN
CULTURE
1
Jitka Poljaková1, Jan Hraběta2, Tomáš Eckschlager2, Eva Frei3, Marie Stiborová1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40
Prague 2, The Czech Republic
2
Clinic of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles
University, V Úvalu 84, 150 00 Prague 5, The Czech Republic
3
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Reserach Center, Im Neuenheimer
Feld 280, 69 120 Heidelberg, Germany
Ellipticine is an alkaloid exhibiting potent antineoplastic and anti-HIV activities. This
agent and some its derivatives are used in the therapy of breast cancer and leukemia and have
multiple cellular targets. Among these, the inhibition of topoisomerase II after intercalation
into DNA, was hitherto considered the most important property for its cytotoxicity. Recently,
we found that ellipticine also acts as alkylation (arylation) agents, covalently binding to DNA
in vitro and in vivo. The formation of the major DNA adduct is dependent on the activation of
ellipticine by cytochrome P450 (CYP) and peroxidases 1-3.
Here we show for the first time that ellipticine is an efficient agent strongly cytotoxic
against human leukemia HL-60 and CCRF-CEM cells and human neuroblastoma cell lines in
culture (i.e. IMR-32). The IC50 values are in a range of 1 microM for all tumor cells tested in
the study. We also demonstrate that the enzymatic systems present in the tumor cells mediate
the activation of the antineoplastic agents to form two ellipticine-derived DNA adducts.
Moreover, ellipticine cytotoxicity against human leukemia HL-60 and CCRF-CEM cells
correlates with formation of these DNA adducts. Because myeloperoxidase is expressed in
many human leukemia cells (i.e. HL-60), we have studied its potential to activate ellipticine.
Myeloperoxidase as well as another model peroxidase, lactoperoxidase, oxidizes ellipticine to
a dimer and N(2)-oxide of ellipticine as major and minor metabolites, respectively. Using
mass- and NMR spectroscopy, the structure of the ellipticine dimer was identified; two
ellipticine residues are connected via N(6) and C(9) atoms in this dimer. In order to elucidate
the mechanisms of ellipticine-DNA adduct formation, we focused on identification of the
target deoxynucleotides in DNA and metabolite(s) generated from ellipticine by peroxidases
responsible for ellipticine DNA binding. We identified deoxyguanosine as the target for
ellipticine binding to DNA after its activation by peroxidases. Two deoxyguanosine adducts
in DNA are generated by the peroxidase- mediated radical of ellipticine and ellipticine N(2)oxide. The reaction mechanism of formation of these ellipticine-deoxyguanosine adducts is
proposed.
Activation of ellipticine to a DNA binding species by peroxidases is an interesting
finding in view of the compound’s activity against human leukemia and other tumors like
neuroblastoma cancer. The results obtained in this study might, moreover, be employed for
development of new drugs utilizing in gene therapy and for tumor targeting.
1
Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675 (2001).
Stiborová M., Breuer A., Aimová D., Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.: Int. J.
Cancer, 107, 885 (2003).
3
Stiborová M., Sejbal J., Bořek-Dohalská L., Aimová D., Poljaková J., Forsterová K.,
Rupertová M., Wiesner J., Hudeček J., Wiessler M., Frei E.: Cancer Res., 64, 8374 (2004).
2
Supported by the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM0021620813).
67
FORMATION OF DNA ADDUCTS BY THE ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE
IN BREAST ADENOCARCINOMAS IN RATS
Marie Stiborová1 , Martina Rupertová1, Norbert Frank2, Eva Frei2
Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2
2
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
1
Ellipticine is an alkaloid exhibiting potent antineoplastic activities. This agent and some
its derivatives are used in the therapy of breast cancer and leukemia and have multiple cellular
targets. Among these, the inhibition of topoisomerase II after intercalation into DNA was
hitherto considered the most important property for its toxicity. Recently, we found that
ellipticine also forms covalent DNA adducts in vitro and in vivo and that the formation of the
major adduct is dependent on the activation of ellipticine by cytochromes P450 (CYP) and
peroxidases [1-5]. Here, we investigated whether ellipticine-derived DNA adducts are
generated also in target tumor tissue, breast cancer. Chemical-mediated breast adecarcinomas
(by methylnitrosourea) were induced in female rats and used as the model in this study.
Healthy and tumor (breast adenocarcinoma)-bearing female Sprague-Dawley rats were
treated with 4.0 mg of ellipticine per kg of body weight and DNA from healthy and tumor
breast tissues was analyzed by 32P-postlabeling. Ellipticine-specific DNA adduct patterns,
similar to those found in vitro [1,2,4] and in vivo in several healthy organs of male and female
rats (i.e. liver, kidney, lung) [3,5] were detected in both healthy and tumor breast tissues. One
major and one minor ellipticine-mediated adducts were found in DNA of both tissues of rats
exposed to ellipticine. These predominant adducts are identical to the deoxyguanosine adducts
generated in DNA by two ellipticine metabolites formed by CYPs, 13-hydroxyellipticine and
the N2-oxide of ellipticine, in vitro as shown by cochromatography in two independent
systems. The significant higher levels of the major ellipticine-derived DNA adduct (adduct
generated by 13-hydroxyellipticine) were generated in tumor tissue than in healthy breast
cells.
The results presented here are the first report showing the formation of covalent DNA
adducts by ellipticine in vivo in the target tumor tissue, breast cancer, in the rat animal
experimental model.
References
1) Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675
(2001).
2) Stiborová M., Stiborová-Rupertová M., Bořek-Dohalská L., Wiessler M., Frei E.:
Chem. Res. Toxicol., 16, 38-47 (2003).
3) Stiborová M., Breuer A., Aimová D., Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.:
Int. J. Cancer, 107, 885-890 (2003).
4) Stiborová M., Sejbal J., Bořek-Dohalská L., Aimová D., Poljaková J., Forsterová K.,
Rupertová M., Wiesner J, Hudeček J., Wiessler M., Frei E.: Cancer Res., 64, 8374-8380
(2004).
5) Stiborová, M., Frei, E.: In: Cytochrome P450, Biochemistry, Biophysics and Drug
Metabolism. (Anzenbacher P. and Hudecek J., eds.), pp. 99-105. Monduzzi Editore,
Bologna, 2003.
Supported by the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM0021620808).
68
HUMAN ENZYMES ACTIVATING 3-NITROBENZANTHRONE
ARE INDUCED BY THIS MUTAGEN
Helena Rýdlová1, Volker M. Arlt2, Jana Hájková1, Eva Frei3, Heinz H. Schmeiser3, Marie
Stiborová1
1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 6, 12840
Prague 2, The Czech Republic
2
Section of Molecular Carcinogenesis, Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, United
Kingdom
3
Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany
Determining the capability of humans to metabolize the potent mutagen 3-NBA and
understanding which human enzymes are involved in its activation are important in the
assessment of individual susceptibility to this environmental contaminant found in diesel
exhaust and ambient air pollution1. We compared the ability of human hepatic microsomal
and cytosolic samples to catalyze DNA adduct formation by 3-NBA. Using the 32Ppostlabelling method we found that both hepatic subcellular fractions were competent to
mediate formation of DNA adducts qualitatively similar to those found in vivo in rats. To
define the role of human microsomal and cytosolic reductases in the activation of 3-NBA, we
investigated the modulation of 3-NBA-DNA adduct formation by cofactors or selective
inhibitors of the reductases present in both subcellular fractions. Most of the activation of 3NBA in human hepatic microsomes is mediated by NADPH:CYP reductase, but participation
of CYP1A1/2, 2B6 and 2D6 cannot be excluded. In cytosols, NAD(P)H:quinone
oxidoreductase (NQO1) is the major enzyme involved in 3-NBA reductive activation. With
human recombinant enzymes the role of these enzymes in the formation of 3-NBA-DNA
adducts was confirmed. The role of conjugation enzymes (sulfotransferases, SULTs, and Nacetyltransferases, NATs) was also examined. We found the activation role of both human
hepatic SULTs and NATs. Using human recombinant NQO1 and NATs and SULTs, we
found that mainly NAT2 followed by SULT1A2, NAT1 and, to a lesser extent, SULT1A1
activate 3-NBA.
Another target of the study was to evaluate the effect of 3-NBA on the expression of
major enzymes activating this pollutant. Utilizing Western blotting and consecutive
immunoquantification employing chicken polyclonal antibodies raised against various CYPs
and NQO1, the expression of CYP1A1/2 and NQO1 was found to be strongly induced in rats
treated with the compound. Furthermore, EROD (7-ethoxyresorufin O-deethylation) activity,
corresponding to both CYP1A1 and 1A2, was significantly increased in rats pre-treated with
3-NBA. The activity of NQO1, major cytosolic 3-NBA activating enzyme, was also evidently
enhanced in these rats.
The results demonstrate the potential of human NADPH:CYP reductase, CYP1A1/2,
2B6 and 2D6 as well as NQO1, SULT1A1/2 and NAT1/2 to contribute to the metabolic
activation of 3-NBA and imply the potency of this chemical to generate precarcinogenic
lesions in humans.
Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 303/05/2195)
1
Enya T., Suzuki H., Watanabe T., Hirayama T., Hisamatsu Y.: Environ. Sci. Technol. 31,
2772-2776, 1997
69
3-AMINOBENZANTHRONE, HUMAN METABOLITE OF CARCINOGENIC
3-NITROBENZANTHRONE, INDUCES CYTOCHROMES P450 1A1 AND 1A2
IN RATS
Helena Rýdlová1, Volker M. Arlt2, Pavla Kadeřábková1, Eva Frei3, Heinz H. Schmeiser3,
David H. Phillips2, Marie Stiborová1
1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 6, 12840
Prague 2, The Czech Republic
2
Section of Molecular Carcinogenesis, Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey,
The United Kingdom
3
Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany
The suspected human carcinogen 3-nitrobenzanthrone (3-NBA) is one of the most
mutagenic nitroaromatic compounds identified in diesel exhaust and airborne particulate
matter1. A major metabolite of 3-NBA, 3-aminobenzanthrone (3-ABA), was recently detected
in the urine of salt mining workers occupationally exposed to diesel emissions2. Determining
the capability of humans to metabolize 3-ABA and understanding which enzymes are
involved in its activation are important in the assessment of individual susceptibility to this
molecule.
We compared the ability of eight human hepatic microsomal samples to catalyze DNA
adduct formation by 3-ABA. Using the 32P-postlabelling method, we found that all hepatic
microsomes were competent to activate 3-ABA. The role of specific cytochromes P450
(CYPs) in the human hepatic microsomal samples in 3-ABA activation was investigated by
correlating the CYP-linked catalytic activities in each of these samples with the level of DNA
adducts formed by the same microsomes. Most of the hepatic microsomal activation of 3ABA was attributed to CYP1A1 and 1A2.We confirmed the participation of these enzymes in
the formation of 3-ABA DNA aducts employing human recombinat CYP1A1 and 1A2 in
Supersomes, purified rat recombinant 1A1 and specific inhibitors of both enzymes.
Furthermore, we determined the expression levels and specific catalytical activities of
microsomal enzymes, CYP1A1/2, 2B, 2E1, 3A and NADPH:CYP oxidoreductase, of rats pretreated i.p. with 0.4, 4.0 and 40.0 mg of 3-ABA/kg of body weight and compared them to
those of untreated control rats. Significant increase in contents of CYP1A1/2 by 2.7, 3.4 and
2.5 times in liver, kidney and lung, respectively, was detected. Likewise, marker activities of
CYP1A1/2, 7-ethoxyresorufin O-deethylation, and CYP1A1, Sudan I oxidation, were
enhanced by treating rats with 40 mg 3-ABA/kg of body weight.
In summary, our results demonstrate a genotoxic potential of 3-aminobenzanthrone for
humans and indicate its potential to induce the expression of CYP1A1/2, the enzymes capable
of its activating to genotoxic metabolites.
Supported by Grant Agency of the Czech republic (grant 303/05/2195).
1
Enya T., Suzuki H., Watanabe T., Hirayama T., Hisamatsu Y.: Environ. Sci. Technol. 31,
2772-2776, 1997
2
Seidel A., Dahmann D., Krekeler H., Jacob J.: Int. J. Hyg. Environ. Health. 204, 333-338,
2002
70
ANALÝZA POLYMORFISMU KÓDUJÍCÍ OBLASTI PRIONOVÉHO GENU
OVCE A KONĚ
Jarmila Sedláčková, Ján Matiašovic, Petr Hořín
Ústav genetiky, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno,
Palackého 1-3, 612 42 Brno
Priony jsou autopropagující se infekční částice tvořené bílkovinami, avšak neobsahující
nukleové kyseliny (PRION = Proteinaceous Infectious Particle).
Transmisibilní spongioformní encefalopatie (TSE) jsou smrtelná neurologická
onemocnění. Jsou charakterizována typickou degenerací nervové tkáně šedé hmoty. Dochází
k vakualizaci neuronů, jejich rozpadu a vzniku amyloidních plaků. TSE se projevuje
porušenou kontrolou svalového tonu, třesem, myoklonickými záškuby, ztrátou koordinace a
progresivní demencí.
Přeměna prionu z benigní na patologickou formu je způsobena změnou v prostorovém
uspořádání molekuly prionového proteinu.
Ovčí prionový gen o velikosti 31 412 bp se nachází na chromozomu 13 a skládá se ze tří
exonů. Celá kódující oblast o velikosti 771 bp leží v oblasti třetího exonu. Prionový protein je
tvořen 256 aminokyselinami. Prionový gen koně je lokalizován na chromozomu 22 a je zatím
známá kódující oblast o délce 742 bp a 247 (248) aminokyselin prionového proteinu.
Vnímavost k prionovým chorobám je částečně podmíněna i geneticky. Prionový protein
ovcí je tvořen řetězcem 256 aminokyselin, v pěti kodónech lze analyzovat polymorfismus.
Především záměny 136., 154 a 171. aminokyseliny činí protein náchylným k nebezpečné
přeměně na patologickou formu. Nejodolnější ovce mají v těchto klíčových místech
aminokyseliny alanin, arginin, arginin. Naopak aminokyseliny valin, arginin a glutamin
předurčují prionový protein k změně konformace na infekční prionovou částici.
U koní byly dosud určeny pouze části sekvence prionového genu.
Za použití sekvenování a PCR-SSCP bylo zjištěno, že prionový protein koně se od ovčího liší
v 15 aminokyselinách, ale v kodónech 136, 154 a 171 má stabilně aminokyseliny alanin,
arginin a glutamin. Kodón číslo 33 kódující glycin může u některých jedinců chybět a snižuje
se tím počet aminokyselin na 247. K polymorfním oblastem patří 122 a 191 kodón, mutace
zde se vyskytující jsou synonymní, a kodón číslo 176 s aminokyselinami lysin (AAA) nebo
asparagin (AAC).
V další práci bude určena kompletní genomová sekvence a organizace genu.
DETEKCE PRIONU PODOBNÉHO GENU KONĚ
Jarmila Sedláčková, Petr Hořín
Ústav genetiky, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno,
Palackého 1-3, 612 42 Brno
PRN genová rodina se u savců skládá ze dvou členů, a to: genu prionového proteinu
(PRNP) a genu prionu podobného proteinu (PRND). Doppel je protein kódovaný genem
PRND. Jedná se o parology vzniklé duplikací z prapůvodního genu, PRND leží od PRNP ve
směru 3´. Homologie proteinové sekvence činí 25%, struktura obou proteinů je velice
podobná. Jedná se o glykoproteiny zanořené do buněčného povrchu skrze GPI kotvu.
Oba proteiny mohou způsobovat degeneraci CNS, i když odlišnými mechanismy. Před
vznikem neurologického onemocnění se prion podrobuje výrazné konformační přeměně.
Akumulace konvertovaného proteinu vede k degeneraci CNS. Exprese PRND byla zjištěna
71
pouze v buňkách varlat, kde ovlivňuje gametogenezi a působí jako regulátor funkce
akrosomu. Pokud je tento protein exprimován v CNS, působí neurotoxicky.
Podle dosud známých informací u člověka, skotu a ovce se gen PRND skládá ze dvou
exonů, přičemž kódující oblast se nachází v exonu číslo dva a je dlouhá přibližně 540 bp. U
koně nebyla tato sekvence známá vůbec.
Na základě mezidruhové homologie člověka, skotu, ovce a tapíra jako zástupce
lichokopytníků bylo navrženo několik párů primerů se snahou identifikovat PRND gen u
koně.
Prostřednictvím metody PCR se podařilo amplifikovat a sekvenováním ověřit 900 bp
dlouhou oblast PRND genu koně. Následně využitím λ fágové koňské genomové knihovny
byla získána odpovídající genomová DNA a sekvenováním byla potvrzena identita sekvence.
V současné době známe celou kódující oblast PRND genu koně.
Další práce bude zaměřena na charakteristiku genomové organizace genu a srovnávací
analýzu.
INTERAKCE XPA PROTEINU SE SUPERHELIKÁLNÍ DNA
1
I.Sedlářová,1 K. Stehlíková, V. Brabec , M. Vojtíšková
Katedra genetiky a mol. biologie, Přírodovědecká fakulta MU v Brně
Biofyzikální ústav AVČR, 612 65 Brno
Lidský XPA (xeroderma pigmentosum skupiny A) protein je jaderný metaloprotein,
obsahující 273 a.k., o celkové velikosti 31 kDa s jedním zinkovým vazebným motivem.
XPA protein je neoddělitelnou a významnou součástí procesu nukleotidové excizní opravy
(NER) v buňce. Tento způsob opravy rozeznává a odstraňuje velké množství strukturně a
chemicky rozdílných DNA poškození, vzniklých v důsledku UV záření, mnohými běžnými
mutageny a chemoterapeuticky používanými látkami jako např. cisplatinou, což v
samotném důsledku může vést ke snížení výsledného terapeutického efektu. Princip NER
spočívá v několika krocích : rozpoznání DNA poškození, vytvoření dynamického komplexu
opravných faktorů , vyštěpení poškozeného úseku řetězce , doplnění polymerázou podle
matrice a spojení opraveného úseku DNA. Celého procesu opravy se zúčastňuje velká řada
funkčně rozlišných proteinů >25. Počáteční rozpoznání lézí proti pozadí normální DNA je
kritické. Původně navržený NER model předpokládal (1), že XPA protein hraje
nezastupitelnou roli, zejména v primárním kroku. Současné znalosti však svědčí spíše o
úloze XPA proteinu při dynamickém ukotvení dalších proteinů jako TFIIH, RPA, ERCC1
(2) přímo v místě průběhu nukleotidové excizní opravy, přesto však ještě není zcela
objasněn podíl XPA proteinu při interakci s různým typem distorzí ve dvoušroubovici
DNA v místě lokálního poškození.
V této práci jsme se zaměřili především na prohloubení znalostí o vlastnostech
lidského XPA proteinu při interakci s DNA za podmínek in vitro . Za tím účelem jsme
XPA protein připravili rekombinantní technologií v bezbuněčném RTS systému (3) ,
purifikovali afinitní chromatografií a dále charakterizovali. Ověřili jsme metodou EMSA v
polyakrylamidových gelech , že připravený XPA protein (RTS) rozeznává adukty
cisplatiny na DNA (cisPt DNA) (4). Zjistili jsme, že počáteční reakce XPA proteinu s
cisPt DNA probíhá v čase <5min. , v různém složení reakčních pufrů a je nezávislá v
rozmezí teplot od 0o C do 30oC.
Vzhledem k tomu, že XPA protein je také vyžadován pro opravu oxidativního
poškození mitochondriální DNA (5) zajímalo nás, zda XPA protein bude reagovat s nativní
superhelikální DNA. Pro tento typ experimentů jsme využili metodu EMSA v agarózových
72
gelech, DNA plasmidu pUC19 a pozorovali jsme, že ve srovnání s linearizovanou DNA ,
vazba XPA proteinu na superhelikální DNA je úzce preferenční a nezávislá na době
reakce, což pravděpodobně významně souvisí s charakterem oblastí nespárovaných bazí v
dvoušroubovici DNA pUC19 v důsledku superhelikálního vinutí.
Literatura:
(1) Jones C.J. and Wood R.D. (1993) Biochemistry, 32, 12096 -12104
(2) Tapias A. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 19074 - 19083
(3) Vojtíšková M. et al. (2003) Abstr. "Memory of living systems", Brno, p. 17
(4) Stehlíková K et al. (2004) Abstr. "Metal compounds in the treatment of cancer", Bari, p.
18
(5) Cleaver J.E. and States J.C. (1997) Biochem. J. 328, 1-12
Tato práce byla podpořena grantem GAAV č. A5004101
KONFORMAČNÍ VARIABILITA EPILEPTICKÉHO (EPM1)
DODEKAMERU (C4G)2CG
Petra Školáková, Olga Bobrová, Iva Kejnovská, Michaela Vorlíčková
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
Progresivní myoklonická epilepsie (EPM1) je neurodegenerativní onemocnění s různým
průběhem, zpravidla vedoucí k mentální retardaci, demenci a cerebrální ataxii. Onemocnění je
způsobeno mutacemi v genu pro cystatin B (CSTB), lokalizovaném na 21. chromozomu.
Projev choroby EPM1 je spojován s prodloužením tandemového opakování dodekameru
d(C4GC4GCG) v promotoru genu CSTB. Předpokládá se, že za zvyšování počtu opakování je
odpovědná tvorba anomálních sekundárních struktur v tomto úseku DNA. Pomocí cirkulárně
dichroické spektroskopie, UV absorpční spektroskopie a polyakrylamidové gelové
elektroforézy jsme v různých prostředích studovali konformační vlastnosti dvanáctimeru
d(C4GC4GCG) a jeho 2 a 3 násobných opakování. Zjistili jsme, že tyto řetězce bohaté na
cytozin vytváří v neutrálním pH vlásenkové struktury, které přecházejí v mírně kyselém
prostředí do interkalovaných tetraplexů stabilizovaných hemiprotonizovanými cytozinovými
páry. V závislosti na délce řetězce se jedná o tetra-, bi- a monomolekulární struktury.
Práce byla vytvořena s podporou grantu GA AV ČR č. A 4004201
STUDY ON BINDING OF CARCINOGENIC ARISTOLOCHIC ACID TO THE
ACTIVE CENTENTER OF HUMAN CYTOCHROMES P450 1A1 AND 1A2
Marie Stiborová1, Bruno Sopko1, Petr Hodek1, Eva Frei2, Heinz H. Schmeiser2
1
Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2,
2
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
Aristolochic acid (AA), a naturally occurring nephrotoxin and carcinogen, has been
associated with the development of urothelial cancer in humans. This carcinogen is
reductively activated by human reductases to form DNA adducts in vitro and in vivo [1-3].
Using the 32P-postlabeling assay we show that AAI is reduced by human recombinant
NADPH:cytochrome P450 (CYP) reductase and CYP1A1 and 1A2 enzymes to species
73
generating DNA adduct patterns reproducing those found in renal tissues from humans
exposed to AA [3]. 7-(Deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam I, 7-(deoxyguanosin-N2yl)aristolactam I and 7-(deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam II were identified as AA-DNA
adducts formed from AAI by the enzymes. Here, we determined the concentrations required
for half-maximum DNA binding; they are 110, 72 and 41 µM AAI for its reductive activation
by human NADPH:CYP reductase, CYP1A1 and CYP1A2, respectively. Using difference
spectroscopy or homologue modeling and docking of AAI to the active centers of
cytochromes P450 1A1 and 1A2 the binding orientation of AAI to the iron of the heme
structure in the active sites of both these CYPs was evaluated to explain the mechanism of
AAI reduction by these enzymes. The studies indicate that AAI interacts with heme iron of
CYP1A1 and 1A2, being able to be reduced instead of oxygen by these enzymes. For AAI
binding to CYP1A2 there are additional interactions with the protein, increasing the affinity
of AAI to this enzyme. The values of the apparent spectral dissociation constant (Ks) for the
complexes of AAI with CYP1A1 and 1A2 equal to 36.3 and 15.4 µM, respectively.
The results obtained in this study identified the binding of AAI to CYP1A1 and 1A2
active centers. The results are also useful to explain the molecular mechanism of reduction of
nitro-aromatics by cytochromes P450.
References
[1] Arlt V., Stiborová M., Schmeiser H.H.: Aristolochic acid as a probable human cancer
hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis 17, 265-277 (2002).
[2] Stiborová M., Frei E., Sopko B., Sopková K., Marková V., Laňková M., Kumstýřová T.,
Wiessler M., Schmeiser H.H.: Human cytosolic enzymes involved in the metabolic
activation of carcinogenic aristolochic acid: evidence for reductive activation by human
NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Carcinogenesis 24, 1695-1703 (2003).
[3] StiborovÁ M., Frei E., Hodek P., Wiessler M., Schmeiser H.H.: Human hepatic and renal
microsomes, cytochromes P450 1A1/2, NADPH:CYP reductase and prostaglandin H
synthase mediate the formation of aristolochic acid DNA-adducts found in patients with
urothelial cancer. Int. J. Cancer 113, 189-197 (2005).
Supported by Grant Agency of Charles University (grant 432/2004/04/B-CH/PrF).
PURIFICATION OF POLYGALACTURONASE AND OLIGO-DGALACTOSIDURONATE HYDROLASE OF AUREOBASIDIUM PULLULANS
Eva Stratilová, Mária Dzúrová and Jiřina OmelkováÂ
Institute of Chemistry of SAS,Dúbravská cesta 9, SK – 845 38 Bratislava, Slovakia
Â
Faculty of Chemistry, Technical University of Brno, Purkyňova 118, CZ – 612 00 Brno,
Czech Republic
The strain of Aureobasidium pullulans isolated from forest soil and deposited under No.
CCY-27-1-115 produces multiple forms of extracellular polygalacturonase when cultivated on
pectin medium. This production is time, pH and nitrogen source dependent.
The mixture of extracellular proteins obtained from cultivation medium with starting pH
about 3, yeast extract as a N-source and after 48 h of cultivation was used for purification
experiments. Ion-exchange chromatography (CM-Sephadex C-50 and DEAE-Sephadex A-50)
as well as chromatofocusing (Mono P, FPLC device, in pH range 8.3 – 5.0 and 7.1 – 5.0)
followed by gel permeation chromatography (Superose 12, FPLC device) were used. The only
partially effective method was the chromatofocusing in pH range 7.1 – 5.0.
74
Two acidic enzymes were separated from the mixture of multiple forms. First one was a
typical polygalacturonase [EC 3.2.1.15] with random action pattern on pectate forming
oligogalactosiduronides as products, with pH optimum 4.8, isoelectric point about 4.5 and
molecular mass about 31 kDa. The second one was an oligo-D-galactosiduronate hydrolase,
enzyme with terminal action pattern leading to formation of D-galactopyranuronic acid, with
pH optimum 5.2, isoelectric point about 4.5 and molecular mass about 54 kDa. Oligo-Dgalactosiduronate hydrolase and exopolygalacturonase [EC 3.2.1.67] differ in the ability to
cleave substrates with different degree of polymerization.
E.COLI EXPRESSION, PURIFICATION AND BINDING STUDIES
OF GALECTIN-4
Veronika Suchá1, Gabriela Jeníková2, Vladimíra Marková2, Milan Fabry1, Petr Malý2, Jiří
Brynda1
1
Department of Recombinant Expression and Structural Biology, Institute of molecular
genetics, Flemingovo nám. 2, 166 37 Praha 6
2
Department of Molecular Glycobiology, Institute of molecular genetics, Vídeňská 1083,142
20 Praha 4
Galectins belong to a family of carbohydrate-binding proteins that share conserved
amino acid sequences and affinity for ß-galactoside sugars.
Galectin-4 is a monomer of about 36 kDa containing two carbohydrate-binding
domains (CDR1 and CRD2, 40% identical) within a single polypeptide chain. This protein is
expressed only in the alimentary tract, from the tongue to the large intestine. Strong
expression of galectin-4 can be induced in cancers from other tissues including breast and
liver. This distinct induction can make a valuable diagnostic marker and target for the
development of inhibitory carbohydrate-based drugs.
Galectins may also bind intracellular non-carbohydrate ligands and have intracellular
regulatory roles in processes such as RNA splicing, apoptosis, and, as suggested most
recently, the cell cycle.
The exact function of galectin-4 has not been exactly found out yet.
Full-length mouse galectin-4 and its respective carbohydrate recognition domains
CRD1 and CRD2 were expressed in E. coli and consecutively purified. Lactose-binding
affinity of CDR1 was determined by fluorescence assay based on fluorescence quantum yield
of two tryptophan residues (Trp 62, Trp 75) located on opposite borders of the binding site.
Specificity of recombinant galectin-4 and its respective carbohydrate recognition
domains CRD1 and CRD2 labeled with FITC was determined using a glycan array consisting
of
synthetic
and
natural
carbohydrates
attached
to
microtiter
plates.
http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/main.shtml
75
POUŽITÍ ANTIPEPTIDOVÝCH SLEPIČÍCH PROTILÁTEK KE STUDIU
CYTOCHROMŮ P-450 Z TULIPA FOSTERIANA A HELIANTHUS TUBEROSUS
Soňa Tomková, Tereza Purkrábková, Petr Hodek
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128
40 Praha 2, Česká republika
Cytochromy P-450 (CYP) (EC 1.14.14.1.) patří mezi klíčové enzymy metabolismu
cizorodých látek (xenobiotik) i látek endogenních. Vyskytují se jak u živočichů tak u rostlin.
Rostlinný CYP 73A1 katalyzuje 4-hydroxylaci kyseliny trans-skořicové na kyselinu pkumarovou. Tato 4-hydroxylasa kyseliny skořicové(C4H) katalyzuje první oxidativní krok ve
specificky rostlinné metabolické dráze, vedoucí k syntéze ligninu, flavonoidů, kumarinů a
dalších derivátů kyseliny fenylpropanové. Ke studiu CYP jsou často používány protilátky.
V našich experimentech jsme se zaměřili na detekci CYP 73A1 pomocí protilátek
imunochemickou metodou „Western blot“ jak v mikrosomech cibulí tulipánů (Tulipa
fosteriana), kde jeho existence zatím prokázána nebyla, tak v mikrosomálních preparátech
hlíz topinamburů (Helianthus tuberosus). K navození produkce protilátek slouží imunizace
odpovídajícím antigenem. Protože izolace antigenu C4H z rostlin je velmi obtížná, byla jako
imunogen použita látka, která obsahuje hapteny proteinu CYP 73A1 tj. krátké peptidické
struktury. Protože není známá sekvence C4H u tulipánů, byla k vytipování peptidů použita
sekvence C4H z topinamburů zjištěná z databáze cDNA. K imunizaci byl využit
experimentální model slepice, který je vhodný z hlediska humánního, neboť protilátky jsou
izolovány z vaječného žloutku a nedochází tedy k usmrcení zvířete. Vybrané peptidy byly
upraveny, aby byly rozpoznávány imunitním systémem slepic. Jejich RMH byla zvětšena buď
metodou „Multi Antigen Peptide“ (MAP) anebo navázáním peptidu na šnečí hemocyanin
(KLH). Jedna slepice byla imunizována antigenem I: (H-LAQSFEYNYG)8Lys7-OH tj.
MAPem a druhá slepice antigenem II: PEEFRPERF navázaným na KLH. Metodou ELISA
jsme ověřili specifitu protilátkových frakcí vůči peptidovým antigenům. Metodou „Western
blot“ byla ověřována specifita protilátkových frakcí vůči celým proteinům CYP 73A1. Takto
bylo potvrzeno, že protilátka připravená proti MAPu (antigen I), specificky reaguje s CYP
73A1 Helianthus tuberosus i Tulipa fosteriana. Protilátka specificky rozpoznala
imunoreaktivní zóny o RMH asi 58 000. Tato hodnota odpovídá CYP 73A1 topinamburů (dle
Swiss-Prot. DB je RMH pro C4H Helianthus tuberosus 57 920). Pomocí specifické protilátky
připravené proti KLH konjugátu s peptidem (antigen II) byl detekován CYP 73A1 tulipánů. U
mikrosomálních frakcí cibulí tulipánů protilátka specificky rozpoznala jednu munoreaktivní
zónu o RMH asi 58 00.
76
ENZYMY BAKTERIE COMMAMONAS TESTOSTERONI
DEGRADUJÍCÍ FENOLICKÉ LÁTKY
Jan Páca Jr.a, Michal Tureka, Marie Stiborováa, Jan Pácab
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030,
128 40 Praha 2, Česká republika.
b
Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko technologická, Technická 5,
166 28 Praha 6, Česká republika.
a
Biodegradace fenolických látek enzymovými systémy živých organismů se může
uplatnit při biologické dekontaminaci životního prostředí. Tyto postupy jsou levnější a pro
životní prostředí přirozenější a šetrnější. Mezi nejvýznamnější zdroje kontaminace fenoly
patří výroby na zpracování hnědého uhlí, odpadní vody ze zpracování hnojiv a léků či různý
organický odpad obsahující vedle fenolu řadu dalších organických látek. Vzhledem k
poměrně dobré rozpustnosti fenolických látek ve vodě dochází k jejich snadnému vymývání
z půdy do povrchových a podzemních vod a následnému vstupu do organismu. V poslední
době se stále zvyšuje množství informací a poznatků o mikroorganismech schopných žít
v přítomnosti fenolických látek a dokonce je i využívat jako zdroj uhlíku a energie. Na našem
pracovišti studujeme enzymové systémy bakterie Commamonas testosteroni, které jsou
zodpovědné za oxidaci fenolu. Hydroxylace fenolu na katechol je prvním, limitujícím krokem
aerobní degradace fenolu. Následné přeměny tohoto produktu katalyzují enzymy štěpící
aromatické dihydroxyderiváty. Katechol-2,3-dioxygenasa (EC 1.13.11.2) oxiduje katechol za
vzniku semialdehydu kyseliny cis, cis-mukonové (META dráha), který se dále metabolizuje
na pyruvát. Tento konečný produkt buňky využívají v intermediárním metabolismu.
Cílem předkládané studie bylo sledování potenciálu bakterie Commamonas testosteroni
degradovat fenol za oxidačních podmínek. Studovaná bakterie efektivně využívá fenol pro
svůj růst a vývoj. Zjišťovali jsme, které z enzymů uvedené bakterie jsou za degradaci fenolu
zodpovědné. Výsledky experimentů signalisují, že Commamonas testosteroni exkretuje
enzymy zodpovědné na metabolismus fenolu do růstového media. Jedná se o NADPHdependentní fenolhydroxylasu tvořící katechol. Buněčný homogenát připravený desintegrací
buněk Commamonas testosteroni sonikací, fenolhydroxylasovou aktivitu nevykazuje, je však
účinný v degradaci katecholu. V dalších experimentech bylo sledováno, zda je
fenolhydroxylasá aktivita Commamonas testosteroni lokalisována rovněž v cytoplasmě této
bakterie. K získání subcelulární cytosolární frakce byla použita frakční centrufugace
desintegrovaných bakteriálních buněk. S využitím metody HPLC byla v získaném cytosolu
detekována jen minimální aktivita flavoproteinové monooxygenasy, NADPH-dependentní
fenolhydroxylasy (EC 1.14.13.7), ale byla nalezena aktivita enzymu využívajícího katechol
jako substrát. Pouze v kultivačním mediu byl významně degradován jak fenol tak i katechol.
V současnosti je exkretovaná fenolhydroxylasa z media isolována a následně
charakterisována.
Podporováno GAČR (grant 104/03/0407) a Ministerstvem školství České republiky (MSM
1131 00001).
77
THE CYCLINE DEPENDENT KINASE INHIBITOR ROSCOVITINE
SINERGISTICALLY ENHANCES p53 TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY INDUCED
BY DIVERSE CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS IN HUMAN MELANOMA CELLS
Stjepan Uldrijan1,3, Eva Roubalová1, Miroslav Strnad2, Bořivoj Vojtěšek1
(1)
S.Uldrijan: Department of Experimental Oncology, Masaryk Memorial Cancer
Institute, Zluty kopec 7, 656 53 Brno, Czech Republic
(2)
M.Strnad: Laboratory of Growth Regulators, Palacky University & Institute of
Experimental Botany ASCR, Slechtitelu 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic
(3)
S.Uldrijan: Present address: The Beatson Institute for Cancer Research, Garscube
Estate, Switchback Road, Bearsden, Glasgow G61 1BD, UK
Purpose Roscovitine induces accumulation of transcriptionally active p53 tumour suppressor
in cancer cells at concentrations above 20 µM, whereas at lower concentrations roscovitine
synergistically activates p53 in ionising irradiated cells, an effect that has been attributed to a
partial inhibition of RNA synthesis. We tested whether the synergistic activation of p53 by 10
M roscovitine depends on the type of DNA damage.
Methods and results We treated the human melanoma cell line A375, clone Arn8, with
different DNA-damaging anticancer drugs including topoisomerase I and II inhibitors,
radiomimetic and alkylating agents and determined changes in the levels of β-galactosidase
transcribed from a stably integrated p53-responsive promoter in the presence of roscovitine.
Roscovitine strongly enhanced p53 activity induced by all anticancer drugs tested. We also
examined whether the synergistic activation of p53 occurs in Arn8 cells treated with
roscovitine and UV-C radiation, both inhibitors of RNA synthesis, and compared it to the p53
activation by roscovitine in ionising irradiated cells. Surprisingly, both X-ray- and UVinduced p53 activity was similarly enhanced by roscovitine, indicating that other mechanisms
than inhibition of transcription may be partially responsible for the enhancement of p53
activity induced by roscovitine.
Conclusions Our results suggest that roscovitine-mediated enhancement of the DNA damageinduced p53 protein transcriptional activity is a common mechanism not depending on the
type of DNA damage. This confirms the therapeutic potential of roscovitine as a sensitising
agent for DNA-damaging drugs and radiation in wild-type p53 expressing cancer cells.
METABOLISMUS A TRANSPORT TAXANŮ NOVÉ GENERACE
Radka Václavíková1, Marie Ehrlichová2, Stanislav Horský1, Petr Šimek3, Iwao Ojima4, Pavel
Souček1 a Ivan Gut1
1
Odd. Biotransformací, Státní zdravotní ústav, Šrobárova 48, 100 42 Praha 10, Česká
Republika, 2Laboratoř regulace buněčného růstu, ÚMG AV ČR Praha 4, Česká Republika,
3
Entomologický ústav AV ČR, České Budějovice, Česká Republika, 4Institute of Chemical
Biology & Drug Discovery, State University of New York at Stony Brook, Stony Brook, New
York, 11794-3400, USA
Klasické taxany paclitaxel (Taxol®) a docetaxel (Taxotere®) jsou velmi významná
protinádorová léčiva. Používají se zejména při léčbě rakoviny prsu, vaječníků či
bronchogenního karcinomu. Jejich terapeutické využití je, stejně jako všech cytostatik,
doprovázeno celou řadou nežádoucích účinků. Hlavní překážkou v úspěšné terapii je však
častý rozvoj resistence nádorových buněk vůči těmto cytostatikům. Proto je v poslední době
78
věnováno velké úsilí syntézám tzv. taxanů nové generace s vyšší terapeutickou účinností,
menším množstvím nežádoucích účinků a zejména s účinností u resistentních nádorových
buněk [1].
V této práci byl sledován metabolický profil třech taxanů nové generace označovaných
jako SB-T-1214, SB-T-1216 a SB-T-1103, který je velmi důležitý z hlediska možné
metabolické inaktivace těchto léčiv. Metabolismus byl sledován v jaterních mikrosomech
člověka, potkana, prasete a miniprasete. Současně byl metabolismus sledován v sérii šesti
různých cDNA exprimovaných lidských CYP (CYP1A2, 1B1, 2A6, 2C9, 2E1 and 3A4),
které jsou významnými enzymy podílejícími se na metabolismu xenobiotik a specificky
cytostatik. Analýza metabolitů byla provedena pomocí HPLC a jejich identifikace pomocí
MS/MS.
Nalezli jsme devět metabolitů taxanu SB-T-1214, osm metabolitů taxanu SB-T-1216 a
jedenáct metabolitů taxanu SB-T-1103 v jaterních mikrosomech různých živočišných druhů.
Některé metabolity byly společné pro všechny sledované druhy. Nejvýznamnějších šest,
sedm a pět metabolitů taxanů SB-T-1214, SB-T-1216 a SB-T-1103 bylo identifikováno
pomocí MS/MS. Z lidských cytochromů P450, které se podílejí na metabolismu nových
taxanů je nejvýznamnější CYP3A4, který se účastní metabolismu všech tří sledovaných
taxanů.
Protože opakované podávání klasických taxanů vede k rozvoji resistence nádorových
buněk, byl porovnáván rovněž transport klasických a nových taxanů v sensitivních (MDAMB-435) a resistentních(NCI/ADR-RES) lidských buněčných liniích rakoviny prsu. Buněčné
linie MDA-MB-435 a NCI/ADR-RES se liší expresí membránových transportních proteinů,
které jsou zodpovědné za rozvoj resistence. Exprese mRNA nejvýznamnějších genů z
hlediska resistence (MDR1, MRP1) byla stanovena pomocí RT-PCR reakce. Rozdílná
exprese byla nalezena zejména u MDR1 genu kódujícícho tvorbu P-glykoproteinu. Oba typy
buněčných linií vstřebávají stejná množství nových taxanů oproti klasickým taxanům, které
jsou vstřebávány resistentními liniemi až 10x méně než sensitivními nádorovými buňkami.
Všechny tři nové taxany mají také jednoznačně vyšší aktivitu u resistentních nádorových
buněk a proto je lze považovat za vhodné kandidáty terapie nádorů resistentních vůči
klasickým taxanům.
Tato práce byla sponzorována granty GA ČR 305/04/0403 a IGA 1A/8248-3.
LITERATURA:
Miller ML, Ojima I, The Chemical Record (2001) 1, 195:211.
KONFORMAČNÍ VLASTNOSTI FRAGMENTŮ DNA TVOŘENÝCH
OPAKOVANÝMI TRIPLETY (CGG)n, (AGG)n A MOTIVŮ SMÍŠENÝCH
SOUVISEJÍCÍCH S EXPRESÍ SYNDROMU FRAGILNÍHO CHROMOZÓMU X
Michal Zemánek1,2 a Michaela Vorlíčková2
1
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
2
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
Trinukleotidová opakování (CGG)n, která se nacházejí v 5` nepřekládané oblasti lidského
genu FMR1, mají schopnost expandovat, přičemž takto vznikající prodlužování souvisejí s
expresí Syndromu fragilního chromozomu X. Za prodlužováním, a tedy i nemocí, s nejvyšší
pravděpodobností stojí schopnost tohoto motivu zaujímat různá anomální prostorová
79
uspořádání.
U nepostiženého jedince má motiv (CGG)n 6-52 opakování, která jsou po každýém 9.11. tripletu přerušena jednou trojicí (AGG). U nepostižených jedinců s předmutačními alelami
(54-200 opakování) a postižených jedinců s mutovanými alelami (200-2000 opakování)
přerušení sekvence (CGG)n trinukleotidem AGG chybí.
Naším cílem bylo pomocí CD spektroskopie, UV absorpční spektroskopie
a polyakrylamidové gelové elektroforézy prozkoumat konformační vlastnosti dvanáctimerů a
čtyřiadvacetimerů tvořených pouze triplety (CGG), nebo (AGG) a dále motivů smíšených a
určit jaké změny vyvolává přerušení uniformní sekvence (CGG)n trinukleotidem AGG.
Zjistili jsme, že jednotlivé řetězce oligonukleotidů jsou schopny tvořit v závislosti na
iontové síle, typu kationtů a teplotě uspořádané homostruktury. Z našich pozorování vyplývá,
že oligonukleotidy (AGG)n tvoří velmi ochotně za přítomnosti draselných iontů tetraplexová
uspořádání, zatímco sekvence (CGG)n za analogických fyziologických podmínek (150 mM
K+) tetraplexy netvoří. Namísto tetraplexu tvoří vlásenku, jejíž stabilita roste s délkou motivu.
U smíšených motivů pak konformační vlastnosti závisejí na počtu přerušení oligonukleotidu
(CGG) trinukleotidem AGG, přičemž s rostoucím počtem přerušení roste stabilita
tetraplexového uspořádání. Naše výsledky naznačují, že vlásenka je strukturou odpovědnou
za prodlužování motivu souvisejícím s fragilním chromozómem X.
Pochopení závislostí konformačních vlastností trinukleotidových opakování
a mikrosatelitů obecně na jejich přesné primární struktuře v souvislosti s jejich biologickým
významem je předpokladem k možnosti pozitivního ovlivňování jejich exprese.
Tato práce byla podpořena grantem A 4004201 GA AV ČR.
VLIV TĚŽKÝCH KOVŮ NA PRODUKCI THIOLOVÝCH SLOUČENIN U
KUKUŘICE (ZEA MAYS) A LNU (LINUM )
Ondřej Zítka1, Andrea Kleckerová1, Karel Stejskal1, Radka Mikelová2, Vojtěch Adam2,
René Kizek2
1
SPŠ chemická, Vranovská 65, 614 00 Brno, 2Ústav chemie a biochemie, AF MZLU v Brně,
Zemědělská 1, 613 00 Brno
ÚVOD: V důsledku dlouhodobé průmyslové produkce je životní prostředí ohrožováno
nejrůznějšími zdroji škodlivých látek, mezi které patří například pesticidy, toxické organické
látky a v neposlední řadě také těžké kovy (arsen, kadmium, olovo, rtuť apod.). Přítomnost
těžkých kovů v rostlinách výrazně narušuje homeostázu a řadu biochemických procesů. Proto
byly organismy přinuceny vytvořit si své vlastní obranné mechanismy – detoxikace. Pokud
rostlinu vystavíme vlivům těžkých kovů, její buňky mohou zahájit syntézu thiolových
sloučenin jako jsou fytochelatiny (PC; základní struktura (γ-Glu-Cys)n-Gly, n = 2-11), což
jsou peptidy obsahující velké množství cysteinu, jehož SH skupiny odpovídají za vazbu iontů
kovu. Prekurzorem syntézy fytochelatinů je glutathion (GSH; γ-Glu-Cys-Gly). Cílem naší
práce bylo stanovení množství kadmia pomocí diferenční pulsní anodické rozpouštěcí
voltametrie (DPASV) obsaženého v modelových organismech - lnu anebo kukuřici, které
byly vystaveny účinkům 0, 50, 60, 80, 100 a 150 µM CdCl2 anebo 0, 50, 100, 150, 200, 400 a
500 µM CdCl2 během šestidenního experimentu. Pro separaci a detekci cysteinu, glutahionu a
fytochelatinu ve vzorcích rostlin, jsme použili vysoce účinnou kapalinovou chromatografii
s elektrochemickou detekcí (HPLC-ED).
MATERIÁLY A METODY: Elektrochemické měření bylo prováděno na AUTOLABu
(EcoChemie, Holandsko) ve spojení s tříelektrodovou celou VA-Stand 663 (Metrohm,
80
Switzerland). Byla použita pracovní elektroda – HMDE (plocha rtuťové kapky: 0.4 mm2),
referentní elektroda (Ag/AgCl, 3 M KCl) a uhlíková tyčinka jako pomocná elektroda. HPLCED systém byl složen ze dvou chromatografických pump, chromatografické kolony a osmikanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Detektor se
skládal z průtočné analytické komůrky (Model 6210, ESA, USA) obsahující referentní
(hydrogen paládiová), pomocnou a osm porézních grafitových elektrod.
VÝSLEDKY A DISKUSE: Nejprve jsme v naší práci sledovali vliv různých koncentrací
kadmia na růst kukuřice a lnu po dobu šesti dnů. U nejvyšší aplikované koncentrace jsme
pozorovali jak u lnu (150 µM) tak i kukuřice (500 µM) viditelnou růstovou depresi
v porovnání s ostatními variantami. Následně jsme v těchto rostlinách stanovovali množství
kadmia a studovali jsme jeho vliv na tvorbu thiolových sloučenin cysteinu (Cys), gluthationu
– redukovaný (GSH), gluthationu - oxidovaný (GSSG) a fytochelatinu (PC2). Se vzrůstající
alikovanou koncentrací těžkého se zvyšovala koncentrace fytochelatinu jak v případě lnu tak
kukuřice.
ZÁVĚR: V naší práci jsme dokázali, že pokud je rostlina vystavena účinkům těžkých kovů
(kadmia), je schopna tyto kovy detoxikovat pomocí zvýšené produkce fytochelatinu a
glutathionu.
LITERATURA
R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova, B. Klejdus, V. Kuban, Chem. Listy 97 (2003) 1003.
Poděkování
Příspěvek vznikl za podpory IGA MZLU 3/2004 a GAČR 525/04/P132.
MOLEKULÁRNÍ IDENTIFIKACE A TYPIZACE BAKTERIÍ MLÉČNÉHO
KVAŠENÍ RODU LACTOBACILLUS
Tereza Škapová, Alena Španová, Bohuslav Rittich
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie, Tvrdého 14,
602 00 Brno
Detekce a identifikace bakterií mléčného kvašení, které se využívají v potravinářském
průmyslu, je důležitá při kontrole kvality potravin, pro sledování fermentačních procesů a
v neposlední řadě pro identifikaci jejich probiotických vlastností. Oproti klasickým
kultivačním metodám je identifikace mikroorganismů molekulárně biologickými metodami
rychlá a přesná. Mezi nejběžněji používané metody patří polymerázová řetězová reakce
(PCR). Bylo analyzováno 19 sbírkových a 10 terénních kmenů náležejících do rodu
Lactobacillus. Z buněk byla DNA izolována metodou fenolové extrakce a přečištěna pomocí
magnetického nosiče A112 (ferrit – CoO. Fe2O3 - pokrytý kyselinou alginovou). Takto
připravená DNA byla použita jako matrice v PCR s rodově a druhově specifickými primery
(Dubernet a spol., 2002) a v RAPD s primerem OPL- 04 (Du Plessis a Dicks, 1995).
Specifické amplifikační produkty byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy
(1,8% agarózový gel, 0,5xTBE pufr, 60V/ 3 hod, barveno EtBr 1µg/ ml). Pomocí rodově
specifické PCR byla potvrzena příslušnost kmenů do rodu Lactobacillus. Pomocí druhově
specifické PCR byly identifikovány jednotlivé druhy Lactobacillus acidophillus. Metoda
RAPD byla optimalizována s cílem získat charakteristické DNA fingerprinty jednotlivých
analyzovaných kmenů.
Práce byla podpořena grantem NAZV 1G46045.
81
AUTORSKÝ REJSTŘÍK
A
E
J
Adam, J. ............................................37
Adam, V. ............... 3, 12, 38, 41, 49, 80
Adámková ...................................20, 39
Aimová........................................40, 43
Anzenbacher......................................53
Anzenbacherová................................61
Arlt ..............................................69, 70
Astl....................................................64
Eckschlager ....................................... 67
Ehrlichová ......................................... 78
Jagelská-Brázdová ............................ 13
Janalíková ........................................... 7
Jančeková.......................................... 62
Janošková.......................................... 51
Jedličková ......................................... 34
Jelen .................................................. 41
Jeníková ............................................ 75
Jeřábek .............................................. 21
B
Babula ..................................... 3, 12, 49
Bartáková ..........................................10
Bartůšek ............................................12
Beneš, M.J.........................................16
Beneš, P.............................................56
Blaštík ...............................................41
Bobrová.............................................73
Borská ...............................................30
Boudný ........................................20, 39
Brabec ...............................................72
Brázda ...............................................13
Brázdová .....................................13, 42
Brychtová ..........................................24
Brynda, E. .........................................54
Brynda, J. ..........................................75
Březinová ..........................................43
Buchtová .............................................3
Bukovská...........................................24
Buňková ............................................60
C
Cahová ......................................4, 7, 59
Č
Čejková ...............................................5
Čeřovská.......................... 14, 44, 51, 61
Češková...............................................5
D
Damborský ........................................21
Deppert..............................................42
Doubek ..............................................24
Doubnerová .................................44, 51
Drábková...........................................50
Drtílková ...........................................29
Dvořák J ............................................42
Dvořák Z ...........................................34
Dyr ........................................ 22, 33, 54
Dzúrová.............................................74
F
Fabry ................................................. 75
Fajkusová .......................................... 34
Fialová .............................................. 44
Fidlerová ........................................... 45
Fojta ........................ 4, 7, 13, 42, 48, 59
Fojtová .............................................. 20
Frank ................................................. 68
Frébort............................................... 15
Frei..................... 16, 40, 43, 58, 67, 68,
69, 70, 73
Fridrichová.................................... 6, 46
G
Gerrard .............................................. 63
Gilboa-Garber ..................................... 8
Gottvaldová....................................... 45
Grochová........................................... 47
Gross ................................................. 23
Gut .................................................... 78
H
Hájek................................................. 25
Hájková............................................. 69
Havel....................................... 3, 12, 18
Havran........................................... 7, 48
Helánová ........................................... 10
Hlaváč ............................................... 49
Hodek.................... 6, 45, 46, 52, 73, 76
Holý .................................................. 25
Horák ................................................ 16
Horský............................................... 78
Horváth ............................................. 26
Hořín ................................................. 71
Hraběta.............................................. 67
Hradecký........................................... 49
Hrdličková ........................................ 50
Hrubý ................................................ 58
Ch
Chmelík............................................. 21
Chroust........................................ 28, 49
I
Imberty.......................................... 8, 37
82
K
Kadeřábková ..................................... 70
Karabec............................................. 52
Kejnovská ......................................... 73
Kerstan.............................................. 23
Kizek..........3, 12, 18, 38, 41, 49, 59, 80
Kleckerová........................................ 80
Klesnilová ......................................... 53
Kocák................................................ 39
Koča.................................................. 37
Kondrová .......................................... 53
Konečná ............................................ 32
Kostečka ............................................. 7
Kostečková ....................................... 63
Kostlánová .......................................... 8
Kotašková ......................................... 30
Kotlín .......................................... 22, 54
Kotrbová ........................................... 43
Kotrla ................................................ 57
Kovařík, A. ....................................... 20
Kovařík, J.................................... 20, 39
Kozubíková....................................... 28
Kremláčková..................................... 55
Kříž ................................................... 37
Křížová ............................................... 9
Kubešová .......................................... 60
Kučera, P........................................... 23
Kučera, T. ......................................... 64
Kučka................................................ 58
Kuglík ............................................... 24
Kusenda ............................................ 30
L
Labuzek ............................................ 35
Lauerová ........................................... 39
Lenobel ............................................. 15
Linková............................................. 24
Lízal .................................................. 66
Lojek................................................. 26
M
Macečková........................................ 56
Macek ............................................... 65
Macuchová........................................ 57
Malčíková ......................................... 24
Malíková ...........................................25
Malý ..................................................75
Mandl ................................................10
Manhartová .......................................58
Marková ............................................75
Márová .................................. 50, 57, 60
Martínek ............................................64
Masařík .............................................59
Matějková..........................................11
Matiašovic.........................................71
Mátlová .............................................64
Matulová ...........................................25
Mayer ..........................................24, 30
Mentzlová..........................................24
Mikelová .......................................3, 80
Mikeš.................................................11
Mikšanová.........................................16
Mikulcová .........................................60
Mitchell ...............................................8
Mozga .................................................4
Müller..........................................44, 61
Přibyl................................................. 28
Psotová.............................................. 31
Ptáček................................................ 60
Purkrábková ...................................... 76
T
R
Raudenská ......................................... 28
Ravčuková ........................................ 47
Relichová .......................................... 66
Rittich................................ 9, 16, 53, 81
Roubalová ......................................... 78
Rupertová.......................................... 68
Rýdlová................................. 16, 69, 70
Ryšlavá............................ 14, 44, 51, 61
Ř
Nálezková..........................................21
Navrátilová........................................26
Nekvindová .......................................61
Němcová ...........................................13
Norris ................................................11
Nováková ..........................................27
O
Obálová .............................................18
Ojima.................................................78
Omelková ....................................62, 74
Opluštil..............................................21
Oscarson..............................................8
P
Páca ....................................... 55, 64, 77
Páca Jr. ............................ 55, 63, 64, 77
Pácová ...............................................64
Paleček ........................ 4, 13, 42, 48, 59
Papoušek ...........................................28
Pavelková ..........................................65
Pavlová..............................................47
Peška .................................................66
Petráš.................................................27
Petrlová ................................. 38, 41, 49
Petrová ..............................................16
Petřek ................................................12
Phillips ..............................................70
Pitelová .............................................29
Pivoňková..........................................13
Pokorná .............................................50
Poljaková...........................................67
Pospíšilová ..................................24, 30
Potěšil.......................... 3, 12, 38, 41, 49
Povolná .............................................32
Prokop ...............................................21
Průša..................................................41
Theiner.............................................. 29
Tichý................................................. 30
Tolstonong ........................................ 42
Tomková ........................................... 76
Trbušek ............................................. 24
Trnková....................................... 38, 41
Turek................................................. 77
U
Uldrijan............................................. 78
Řepková ............................................ 66
N
Štětina ............................................... 27
Štruncová .......................................... 30
Šulc ................................................... 52
S
Salaj .................................................. 33
Sedláček ............................................ 27
Sedláčková ........................................ 71
Sedlářová .......................................... 72
Schmeiser........................ 16, 69, 70, 73
Skládal .............................................. 28
Sklenář .............................................. 21
Sladký ................................................. 3
Sopko ................................................ 73
Souček......................................... 53, 78
Soudková .......................................... 16
Stehlíková ......................................... 72
Stejskal.............................................. 80
Stiborová.............. 6, 16, 40, 41, 43, 55,
58, 63, 64, 67, 68, 69, 70, 73, 77
Stopka ............................................... 53
Stratilová..................................... 62, 74
Strnad ................................................ 78
Strouhal............................................. 17
Suchá................................................. 75
Sures ................................................. 38
Suttnar............................................... 33
Svitáková .................................... 24, 47
Svobodová ........................................ 31
Synková ............................................ 14
Š
Šantrůček .......................................... 22
Šebela................................................ 15
Šerý ................................................... 29
Šimek ................................................ 78
Škapová............................................. 81
Školáková.......................................... 73
Šmajs................................... 5, 7, 11, 17
Šmarda .................................. 26, 32, 56
Šmardová .................................... 24, 47
Španová............................. 9, 16, 53, 81
Štaif................................................... 29
83
V
Václavíková ...................................... 78
Váňa.................................................. 32
Vaníčková ......................................... 33
Veinlichová....................................... 61
Víteček.................................... 3, 12, 18
Vlašínová .......................................... 12
Vojtěšek ...................... 5, 13, 26, 41, 78
Vojtíšková......................................... 72
Vorlíčková ............................ 44, 73, 79
Votruba ............................................. 25
Vrzal ................................................. 34
W
Walter ............................................... 42
Walterová.......................................... 31
Warnecke .......................................... 42
Weinstock ......................................... 11
Wimmerová .................................. 8, 37
Woznica ............................................ 35
Z
Zahradníčková .................................. 32
Zajíčková .......................................... 49
Zapletalová ....................................... 34
Zdařilová..................................... 31, 34
Zdráhal.............................................. 32
Zehnálek ..................................... 38, 49
Zeman ............................................... 10
Zemánek ........................................... 79
Zídek................................................. 61
Ziembinska ....................................... 35
Zítka.................................................. 80
Ž
Žídek........................................... 21, 65
SPONZORUJÍCÍ FIRMY
2 THETA ASE, s.r.o., Jasná 307, 735 62 Český Těšín – Mosty
tel: 558 732 122, 558 732 224, e-mail: [email protected]
www.2theta.cz
BIOTECH a.s, Služeb 4, 108 52 Praha 10
tel a fax: 420 272 701 739, email: [email protected]
www.biotech.cz
CANBERRA PACKARD spol. s r.o., Šultysova 37 , 16900 PRAHA 6,
tel:233 090 031, fax: 233 090 032, e-mail: [email protected]
www.cpce.net
CENTRAL EUROPEAN BIOSYSTEMS s.r.o., U Habrovky 247/11, 140 00 Praha 4
tel: 257 213 412, fax: 251 617 870, e-mail: [email protected]
www.cebiosys.com
CHROMSPEC s.r.o., Plachty 2, 634 00 Brno
tel.: 547 246 683-4; fax: 547 246 685, e-mail: [email protected]
www.chromspec.cz
Knihkupectví MALÉ CENTRUM, Kotlářská 2, 611 37 Brno
tel: 420 541 129 202 (prodej), 420 541 129 544, 420 541 129 630 (kancelář)
fax: 420 541 129 630, email: [email protected]
malecentrum.sci.muni.cz
KRD s.r.o., Pekařská 12, 155 00 Praha 5
tel: 257 013 400, fax: 271 013 405, e-mail: [email protected]
www.krd.cz
84
LAB MARK a.s., Na Míčánce 48, 160 00 Praha 6
tel.: 233 335 548, 233 335 930, fax: 224 311 830, e-mail: [email protected]
www.labmark.cz
MANEKO spol. s r.o., Na Pískách 71, 160 00 Praha 6
tel.: 233 335 638, 233 335 639, 233 336 645, 233 336 579
fax: 233 332 656, e-mail: [email protected]
www.maneko.cz
MEDESA s.r.o., Šaffova 37, Polička 572 01
tel.: 461 723 555, HOT LINE: 602238479, fax: 461 723 560
e-mail: [email protected]
www.medesa.cz
M.G.P. spol s r.o., Kvítková 1575, 760 01 Zlín
tel.: 577 212 140-2; fax: 577 211 724; e-mail: [email protected]
Pražská kancelář: [email protected]
www.mgp.cz
ROCHE s.r.o., Karlovo nam. 17, 120 00 Praha 2
Tel: 220 382 564-5, fax: 220 382 538, e-mail: [email protected]
www.roche-applied-science.com
SIGMA-ALDRICH s.r.o., Pobřežní 46, 186 21 Praha 8
tel: 246 003 200, fax: 246 003 291, e-mail: [email protected]
www.sigma-aldrich.com
TRIGON PLUS, spol s r.o., Západní 93, Čestlice, 251 01 Říčany u Prahy
tel.: 272 680 190, 272 680 370, 272 680 371, 272 680 982
fax: 272 680 914, e-mail: [email protected]
www.trigon-plus.cz
85