Anti-native DNA (nDNA) Antibody IFA CZ

NÁVOD K POUŽITÍ
REF
REF
1106
48 stanovení (6 x 8)
1106-02 96 stanovení (12 x 8)
POUŽITÍ
Nepřímý imunofluorescenční test pro detekci a kvantifikaci protilátek proti nativní (dvouvláknové) DNA (nDNA) v séru.
ÚVOD
Anti-nDNA protilátky jsou vysoce specifické pro systémový lupus erythematodes (SLE), zřídka se vyskytují u pacientů s revmatoidní artritidou,
sklerodermií nebo u jiných autoimunitních onemocnění. Frekvence a titr protilátek kolísá s aktivitou onemocnění a má tendenci vymyzet po
imunosupresivní léčbě nebo během oslabení. Existuje dobrá korelace mezi aktivitou onemocnění a anti-nDNA hladinou protilátek.
Dvě nejčastěji používané metody detekce anti-nDNA jsou radioimunoesej a imunofluorescence. Specificita a senzitivita Crithidia luciliae
imunofluorescenčních metod je srovnatelná nebo dokonce lepší než radioimunoesej. Nepřímý imunofluorescenční test za použití Crithidia luciliae
jako antigenního substrátu, je jednoduchá a přesná metoda stanovení anti-nDNA protilátek. Crithidia luciliae obsahuje kinetoplast, organelu skládající
se z kompaktní kruhové DNA, která reaguje jasně zelenou barvou, jestliže je testovaný vzorek pozitivní.
PRINCIP TESTU
V nepřímé imunofluorescenční metodě použité v tomto testu jsou pacientská séra inkubována na stěrech z Crithidia luciliae tak, aby se protilátky
navázaly k substrátu. Nenavázané protilátky jsou odstraněny promytím. Navázané IgG protilátky jsou detekovány pomocí inkubace substrátu s
fluoresceinem značeným, anti-lidským IgG konjugátem. Při pozorování pod fluorescenčním mikroskopem, vybaveným příslušnými filtry, se pozitivní
reakce objevují jako jasně zelená fluorescence kinetoplastu s nebo bez příslušného zabarvení jader. Titr, což je převrácená hodnota nejvyššího ředění s
pozitivní reakcí, je stanoven na základě analýzy sériového ředění.
SKLADOVÁNÍ A PŘÍPRAVA
Všechny reagencie skladujte při 2-8°C. Všechny reagencie jsou připraveny k použití po vytemperování na laboratorní teplotu.
SOUČÁSTI SOUPRAVY
ImmunoGloTM nDNA Kit REF 1106 48 stanovení
ImmunoGloTM nDNA Kit REF 1106 96 stanovení
Kit obsahuje dostatečné množství k provedení 48, popř. 96 stanovení.
6 x
SORB / SLD / 8
8 well Substrate Slides, Crithidia luciliae (1106)
12 x
SORB / SLD / 8
8 well Substrate Slides, Crithidia luciliae (1106-02)
1 x 0,5 ml
CONTROL / + / nDNA* nDNA pozitivní kontrola, obsahuje lidské sérum.
1 x 0,5 ml
CONTROL / - *
negativní kontrola, obsahuje lidské sérum.
1 x 5 ml
IgG-CONJ / FITC*
Anti-lidský IgG FITC konjugát. Chráněn přes světlem.
1 x 5 ml
IgG-CONJ / FITC / EB*† Anti-lidský IgG FITC konjugát obsahující Evan´s Blue. Chráněn přes světlem.
1 x 60 ml
BUF*
Ředící pufr
2 x vial
BUF / WASH
Fosfátový pufr (PBS). Rozpustit každou vialku v 1. litru.
1 x 5 ml
MOUNTING / MEDIUM* Montovací medium. Nezmrazujte
1 x 1 ml
EVANS
Evan´s Blue
1 x 12
COVER / SLD
Krycí sklíčka
* obsahuje < 0,1% NaN3
† Nahrazuje konjugát bez fluorescenčního barviva u číselných kódů obsahujících "EB".
POUŽITÉ SYMBOLY
číslo šarže
katalogové číslo
datum expirace
skladujte mezi 2-30°C
čtěte pozorně návod
použití pouze in vitro
výrobce
testů v soupravě
POŽADOVANÝ, ALE NEDODÁVANÝ MATERIÁL
•
•
•
•
•
fluorescenční mikroskop
mikropipeta nebo pasteurova pipeta
serologické pipety
nádobka na barvení sklíček (např. Coplinova nádoba)
malá testovací zkumavka (např. 13 x 75 mm) a stojánek na zkumavky
•
•
•
•
•
destilovaná nebo deionizovaná voda
1 litrový kontejner
promývací láhev
absorpční papír
inkubátor
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ
Pouze pro in vitro diagnostiku. Všechny použité lidské komponenty byly testovány na HbsAg, HCV, HIV-1, HIV-2, HTLV-I a byly zjištěny negativní
výsledky dle FDA požadovaných testů. Se vzorky nakládejte jako s potenciálně biologicky nebezpečným materiálem. Postupujte dle správné
laboratorní praxe při skladování, výdeji a likvidaci tohoto materiálu.
UPOZORNĚNÍ - Azid sodný (NaN3) může reagovat s olovem a mědí za vzniku vysoce výbušných azidů. Při odstraňování kapalin vypláchněte
velkým množstvím vody tak, aby se zabránilo nahromadění velkého množství azidů. Azid sodný může být po požití toxický. V případě požití
okamžitě kontaktujte vedení laboratoře.
Provádějte přesně dle uvedených instrukcí k zajištění platných výsledků. Nepoužívejte nebo nemíchejte reagencie z různých souprav a šarží.
Nepoužívejte po uplynutí doby expirace.
ODBĚR VZORKU A JEHO SKLADOVÁNÍ
Pouze vzorky séra by měly být použity pro tento postup. Silně hemolyzované, lipemické nebo mikrobiologicky kontaminované vzorky mohou
ovlivnit výsledky tohoto testu, tudíž nemohou být použity. Vzorky mohou být skladovány při teplotě 2-8 °C maximálně 1 týden. Pro delší dobu
skladování, muže být sérum zamrazeno při -20 ° C. Rozmrazené vzorky znovu nezmrazujte.
PRACOVNÍ POSTUP
Testovací metoda
A. Skríning
1. Nařeďte každé pacientovo sérum 1:10 s přiloženým ředícím pufrem (10 µl séra + 90 µl pufru). Neřeďte pozitivní ani negativní kontroly. Uložte
neředěné sérum pro případné stanovení titru protilátek, pokud bude skríningový test pozitivní.
2. Sáčky obsahující sklíčka nechte temperovat při laboratorní teplotě 10-15 minut.Opatrně vyjměte sklíčka, nedotýkejte se přitom subtrátu.
3. Sklíčka označte a umístěte je do inkubátoru na papírový ručník navlhčený vodou, aby se zabránilo vysychání.
4. Kápněte 1 kapku (přibližně 50 µl) negativní kontroly do 1. jamky a 1 kapku pozitivní kontroly do 2. jamky. Vyvarujte se přeplnění jamek.
5. Mikropipetou nebo Pasteurovou pipetou aplikujte 1 kapku (přibližně 50 µl) naředěného pacientova séra do ostatních jamek. Vyvarujte se přeplnění
jamek.
6. Sklíčko inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě v inkubační nádobě zakryté víkem.
7. Vyjměte sklíčko z inkubační nádoby, držte jej za okraj a jemně opláchněte asi 10 ml PBS za pomocí pipety. Nepoužívejte promývací láhev. Poté
ihned přeneste sklíčko do Coplinovy nádoby a promývejte 10 minut. Proces opakujte u všech zbývajících sklíček.
8. Vyjměte sklíčko z Coplinovy nádoby. Absorpčním papírem vysušte přebytečné PBS z okraje sklíčka. Umístěte sklíčko do inkubační nádoby a ihned
aplikujte 1 kapku (přibližně 50 µl) konjugátu do každé jamky.
9. Opakujte postup 7 a 8 na každém sklíčku.
10. Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě.
11. Vyjměte sklíčko z inkubační nádoby. Držte sklíčko za okraj a ponořte jej do kádinky s PBS pro odstranění přebytečného konjugátu. Umístěte
sklíčko do nádobky naplněné PBS na 10 minut. Pokud byl použit konjugát bez Evan´s Blue (viz odstavec "součástí soupravy"), přidejte 2-3 kapky
Evan´s Blue barviva do konečného promývání. Opakujte postup u všech sklíček.
POZNÁMKA: Nesprávné promytí může vézt ke zvýšení fluorescence na pozadí.
12. Vyjměte sklíčko z promývačky. Absorpčním papírem vysušte přebytečné PBS z okraje sklíčka. Kvůli zabránění vysušení sklíčka, pokračujte
ihned dalším krokem, dokud je sklíčko mokré.
13. Pomocí 3 kapek "Mounting Medium" umístěte krycí sklíčko na podložní sklíčko. Vyvarujte se použití nepřiměřeného tlaku a zabraňte bočnímu
pohybu krycího sklíčka.
14. Opakujte postup 12 a 13 na každém sklíčku.
15. Zkoumejte specifickou fluorescenci pod fluorescenčním mikroskopem při zvětšení 200x nabo větším.
Sklíčka mohou být odečtena co nejdříve po testu. Nicméně, vzhledem k přítomnosti krycí tekutiny v montovacím mediu, nedochází k žádné
významné ztrátě intenzity barvení, jestliže dojde k odečtení do 48 hodin. Sklíčka musí být skladována při teplotě 2-8°C ve tmě.
B. Endpoint stanovení (titrace)
Pozitivní sérum ve skríningové zkoušce může být dále testováno kroky 5 až 13 k určení titru. Každý proces testování by měl zahrnovat pozitivní a
negativní kontroly. Sériové dvojí ředění začíná při 1:10. Převrácená hodnota nejvyššího ředění, vytvářející pozitivní reakci, je titr.
Příprava sériového ředění
Zkumavky jsou označeny čísly 1-6. Přidejte 0.9 ml Sample Diluentu do zkumavky č.1 a 0.2 ml do zkumavky č.2-6. Pipetujte 0.1 ml neředěného séra
do zkumavky č.1 a důkladně promýchejte. Přeneste 0.2 ml ze zkumavky č.1 do zkumavky č. 2 a důkladně promýchejte. Pokračujte přenesením 0.2 ml
z jedné zkumavky do další (vedlejší) po promýchání, tak aby vzniklo ředění, které je znázorněno v následující tabulce.
KONTROLA KVALITY
V každém testu by měla být zahrnuta pozitivní i negativní kontrola. Negativní kontrola by neměla ukázat žádnou specifickou fluorescenci
kinetoplastu. Pozitivní kontrola by měla mít 2+ nebo vyšší barevnou intenzitu této struktury. Jestliže nejsou získány očekávané výsledky, měl by být
proces zopakován. Pokud nadále dochází k selhání kontrol, může to být způsobeno:
•
•
•
Zákal - vyřaďte a použijte novou kontrolu
Problémy s optickým systémem fluorescenčního mikroskopu - nesprávné nastavení, žárovka za hranicí životnosti atd.
Možnost vysušení sklíčka
INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Výsledky testů na anti-nDNA protilátky mohou být interpretovány jako negativní (<10) nebo pozitivní (≥320) nebo pozitivní se specifickým endpoint
titrem.
Hodnoťte pouze pole s obsahem dobře oddělených C.luciliae. Pozorujte specifické barvení kinetoplastů (viz obrázek 1 na konci tohoto příb.letáku).
Zbarvení jádra nebo polárních tělísek by nemělo být interpretováno jako pozitivní test na DNA protilátky. Absence specificky obarvených
kinetoplastů je považována za negativní výsledek na protilátky proti nDNA.
OMEZENÍ TESTU
V některých případech, séra pozitivní na obarvené kinetoplasty mohou být buď velmi slabá nebo negativní při úvodním screeningovém ředění díky
prozónovému efektu. V takovýchto pochybných případech by měla být séra vyšetřena při vyšších ředěních, v případě pozitivity je stanoven titr
protilátek.
Ve vzácných případech mohou být pozorovány falešně pozitivní reakce. To může být způsobeno výskytem velkého množství lipoproteinů nebo jiných
proteinů, které se váží na DNA.
Kozí anti-lidský IgG FITC konjugát, dodávaný v této soupravě, je primárně specifický pro těžké řetězce, ale má i částečnou specificitu vůči lehkým
řetězcům. Reaguje primárně s IgG třídou autoprotilátek, ale v menší míře může reagovat i s lehkými řetězci jiných tříd protilátek např. IgM.
Lékař by měl zvážit výsledky všech pozitivních testů z nepřímé fluorescence spolu s výsledky jiných laboratorních testů a klinický stav pacienta při
stanovení diagnózy.
OČEKÁVANÉ HODNOTY
Jak je vidět v tabulce č. 1 na konci tohoto letáku, anti-nDNA nejsou detekovány (titr <10) ze séra od zdravých pacientů nebo pacientů se sklerodermií
nebo revmatoidní artritidou. Anti-nDNA protilátky (titr >10) se vyskytují u více než poloviny pacientů se SLE.
CHARAKTERISTIKA TESTU
Test ImmunoGlo nDNA byl srovnáván s dalším komerčně dostupným fluorescenčním testem na protilátky za použití C.luciliae jako substrátu.
Srovnání zahrnuje 106 vzorků sér od zdravých pacientů i od pacientů s diagnostikovaným SLE, sklerodermií nebo revmatoidní artritidou. Séra byla
testována v souladu s postupem a screeningovým ředěním doporučeným výrobcem. To přineslo srovnatelné výsledky s tabulkou č.2.
LITERATURA
1. Feltkamp TEW (Ed). The significance of the determination of anti-DNA and DNA/anti-DNA complexes. Scand J. Rheumatol Suppl. 1975; 11:7-64.
2. Tan EM. Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol. 1989; 44:93-151
3. Tzioufas AG, Manoussakis MN, Drosos AA et al. Enzyme immunoassays for the detection of IgG and anti-dsDNA antibodies: clinical significance
and specificity. Clin Exp Rheumatol. 1987; 5:247-253
4. Ruffati A. Calligaro A, Ross D et al. Anti-double stranded DNA antibodies in the healthy elderly: prevelance and characteristics. J Clin Immunol.
1990; 10:300-303.
5. Kadlubowski M, Jackson M, Yap PL and Neill G. Lack of specificity for antibodies to double stranded DNA found in four commercial kits. J clin
Path. 1991; 44:246-250.
6. Brinkman K, Termaat R, Van den Brink H et al. The specificity of the anti-dsDNA ELISA: a closer look. J Immunol Methods. 1991; 13:91-100.
7. Lange A. Evaluation of the simultaneous estimation of anti-dsDNA and anti-ssDNA antibodies for clinical purposes. Clin Exp Immunol.1978;
31:472-481.
8. Borg EJ, Horst G, Hum EJ et al. Measurement of insreases in antidouble stranded DNA antibody level as a predictor of disease exacerbation in
systematic lupus erythematosus: a long term, prospective study. Arth Rheum. 1990; 33:634-643.
9. Aarden LA, Lakmaker F, de Groot ER, et al.: Detection of antibodies to DNA by radioimmunoassay and immunofluorescence. Scand. J. Rheu.
1975; Suppl. 11:12-19
10. Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassay for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 1981; 24:534543.
11. Aarden LA, de Groot ER, Feltkamp TE: Immunology of DNA. III. Crithidia luciliae, a simple substrate for the detection of anti-dsDNA with
immunofluorescence techniques. Ann. NY Acad. Sci. 1975; 254:505-515.
12. Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthhritis and
Rheumatism 1977; 20:811-814.
13. Feltcamp TE, Kirkwood TB et al. The first international standard for antibodies to double stranded DNA. Ann Rheum Dis. 1988; 47:740-746.
14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, Fourth Edition, 1999; (HHS
Pub. # (CDC) 93-8395).
Obrázek 1. C. luciliae
Tabulka 1. Výskyt protilátek proti nDNA u kolagen – vaskulárních onemocnění detekovaných nepřímou imunofluorescencí na C. luciliae
Tabulka 2. Porovnání souprav používajících C. luciliae substrátu pro detekci protilátek proti nDNA