Enzymy aktivní p i nízkých teplotách

FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
En zym y aktivn í
p i n ízkých tep lotách
Vojtch Sp iwok
sp iwokv@vsch t.cz
Ústav b ioch em ie a m ikrob iologie
VŠCHT v Praze
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Organ ism y adap tovan é n a n ízké tep loty:
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
ADAPTACE:
- en zym y
100
80
aktivita
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
o
teplota [ C]
- m em b rán y
+
+
N
O
O P O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
- d alší …
N
O
O P O
O
O
O P O
O
O
O
N
+
N
O
O
- cold sh ock / cold aclim ation p rotein y
- an tifreeze p rotein y
+
+
O
O P O
O
O
O P O
O
O
O
N
+
N
O
O
O
O
O
O
O
O P O
O
O
O
O
O
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Enzym y aktivní p i nízkých teplotách:
100
term ofilní
aktivita
80
m esofilní
60
psychrofilní
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
o
teplota [ C]
70
80
90
100
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Enzym y aktivní p i nízkých teplotách:
100
aktivita
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
o
teplota [ C]
70
80
90
100
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Enzym y aktivní p i nízkých teplotách:
20
100
0
80
aktivita
0
10
20
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
o
teplota [ C]
70
80
90
100
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Enzym y aktivní p i nízkých teplotách:
Xylan asa z b akterie Pseu doalterom on as h aloplan k tis TAH3a je:
9 x aktivn jší n ež ze Streptom yces sp . S38 a
130 x aktivn jší n ež z Clostridiu m th erm ocellu m
p i 10 ºC
15 x aktivn jší n ež ze Streptom yces sp . S38 a
260 x aktivn jší n ež z Clostridiu m th erm ocellu m
p i 0 ºC
T Collin s, M-A Meuwis, C Gerday, G Feller (2003) Activity, Stability and Flexibility in Glycosidases
Adapted to Extrem e Therm al Environm ents. J Mol Biol 328, 419–428.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Enzym y aktivní p i nízkých teplotách:
www.neb.com
www.prom ega.com
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Enzym y aktivní p i nízkých teplotách:
Vlastn osti:
- více h yd rofob n ích am in okyselin n a p ovrch u
- více n ab itých am in okyselin u vn it glob u le
- v tší p om r Lys / (Arg+Lys)
- více Gly ve sm y kách
- m én p itažlivých elektrostatických in terakcí
- více Gln n a p ovrch u
- m én Pro
- Pro v h elixech
- m én π – π in terakcí
- m én kation – π in terakcí
- n ižší d ip ólové m om en ty h elix
- zm n a elektrostatických vlastn ostí aktivn íh o m ísta
- vyšší dostu p n ost aktivn íh o m ísta
…
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
TEORIE I.:
- vyšší aktivity je dosažen o d íky vyšší flexibilit
(celkové n eb o lokáln í)
- vyšší flexib ilita je n a ú kor stab ility
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
IPMDH z term ofiln íh o
m ikroorgan ism u vykazu je n ižší
flexib ilitu p i 25 ºC, ob a en zym y
vykazu jí p ib ližn stejn ou
flexib ilitu p i op tim áln ích svých
tep lotách .
Flexibilita proteinu hraje
zásadní
roli v teplotní adaptaci
P Závod szky, J Kardos, Á Svin gor, GA Petsko (1998) Adjustm ent of conform ational flexibility is a
key event in the therm al adaptation of proteins. PN AS 95(13): 7406-7411.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Mu tace am in okyselin aktivn íh o
m ísta (Am p C β-laktam asy a lysozym u )
vedla k zvýšen í stab ility.
Aktivní m ísta enzym jsou
optim alizována
pro katalysu a ne pro stabilitu.
BM Beadle, BK Shoichet (2002) Structural Bases of Stability–function Tradeoffs in Enzym es. J Mol Biol 321(2): 285-296.
BK Shoichet, WA Baase, R Ku roki, BW Matthews (1995) A relationship between protein stability and protein function. PNAS 92(2):
452-456.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Dynam ika
proteinu
hraje
klí ovou
roli v reakci
katalysované
adenylatkinasou
M Wolf-Watz, V Thai, K Hen zler-Wildm an , G Hadjipavlou, EZ Eisen m esser, D Kern (2004)
Linkage between dynam ics and catalysis in a therm ophilic-m esophilic enzym e pair. Nat Stru ct Mol Biol. 11, 945-949.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Míra fluktuací
protein roste
s teplotou více
u protein
psychrofilních
m ikroorganism
M Tehei, B Fran zetti, D Madern , M Gin zburg, BZ Gin zburg, MT Giudici-Orticon i, M Bruschi, G Zaccai (2004) Adaptation to extrem e
environm ents: m acrom olecular dynam ics in bacteria com pared in vivo by neutron scattering. EMBO Rep 5, 66-70.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
TEORIE II.:
- aktivita n em á p ím ou sou vislost s flexibilitou
- vyšší/ n ižší stab ilita je d sled kem evolu n ích tlak
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Evolu n í stu d ie p om ocí m ížkovéh o m od elu p rotein u u kázala:
proteiny jsou nestabilní p i vyšších teplotách v
d sledku absence evolu ních tlak proudržení stability.
n ativn í
den atu rovan ý
DM Tavern a, RA Goldstein (2002) Why are proteins m arginally stable? Protein s 46(1):105-109.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
U n kterých enzym se pr b h aktivity na teplot nem ní p i teplotách pod
teplotu dynam ického p echodu
Xylanasa
0
100
200
300
400
RV Dun n , V Réat, J Fin n ey, M Ferran d, JC Sm ith, RM Dan iel (2000) Enzym e Activity and Dynam ics: Xylanase Activity in
the
Absence of fast Anharm onic Dynam ics. Biochem J 346: 355-358
Glutam atdehydrogenasa
RM Dan iel, JC Sm ith, M Ferran d, S Héry, R Dun n , JL Fin n ey (1998) Enzym e Activity below the Dynam ical Transition at
220
K. Biophys J 75: 2504–2507.
RM Dan iel, JL Fin n ey, V Réat, R Dun n , M Ferran d, JC Sm ith (1999) Enzym e Dynam ics and Activity: Tim e-Scale
Dependence of Dynam ical Transitions in Glutam ate Dehydrogenase Solution. Bioph ys J 77: 2184–2190.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
U n kterých enzym se naopak m ní
Bacteriorhodopsin
0
100
200
300
400
M Ferran d, AJ Dian oux, W Petry, G Zaccai (1993) Therm al m otions and function of bacteriorhodopsin in
purple
m em branes: effects of tem perature and hydration studied by neutron scattering. PNAS. 90: 9668 –9672.
Ribonukleasa A
BF Rassm ussen , AM Stock, D Rin ge, GA Petsko (1992) Crystalline ribonuclease A loses function below the
dynam ical
transition at 220K. Natu re. 357: 523– 424.
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Studium flexibility:
m etoda
krystalové struktury
(B-faktor)
výhody
nevýhody
atom ové rozlišení
nem ožné srovnávat
více protein
NMR
atom ové rozlišení
om ezená velikost
proteinu
rozptyl n 0 ,
m etody založené
na rozptylu
m ožné m it pro sm si,
in vivo atd.
sim ulace m olekulové
dynam iky
atom ové rozlišení
H/D vým na
áste né atom ové
rozlišení
bez atom ového
rozlišení
znám a 3D struktura,
om ezené asové m ítko
om ezená m ožnost
asového rozlišení
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
α-am ylasa
1AQM-1HX0
alkalická p roteasa
1G9K-1KAP
citratsyn th asa
1A59-1AJ8
xylan asa
1H12-1CEM
m alatdeh ydrogen asa
1B8P-1IZ9
FOBIA kongres
Alterom on as
h aloplan ctis
1AQM
1.85
448
Ca 2+,
Cl -
Prase
1H
X0
1.38
495
antarktická bakterie DS23R
1A59
2.09
2x 377
-
Pyrococcu s fu riosu s
1AJ8
1.9
0
1.9
0
2.0
0
1.9
6
1.6
4
2x
371
2x
327
-
Aqu aspirillu m arcticu m
h erm u s th erm oph ilu s Hb8
alkalická
proteasa
Pseu dom on as sp .
Pseu dom on as aeru gin osa
Alterom on as h aloplan k tis
xylanasa
Clostridiu m th erm ocellu m
1B8
P
1IZ
9
1G9
K
1KA
P
1H1
2
1CE
M
1.20
1.6
5
Ca 2+, Cl -
-
2x 327
461
Identita sekvencí
[%]
m alátdehy
dro-genasa
Kofaktory
citrátsyntha
sa
PDB
Po et am inokys.
zbytk
α-am ylasa
Organism us
Rozlišení [Å]
Enzym
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
5
0.7
3
9.3
6
2.5
Stru ctu re 6: 1503-1516 (1998)
Biochem istry 40(25): 7700-7709 (2001)
Stru ctu re 6: 351-361 (1998)
Bioch em istry 36(33): 9983-9994 (1997)
J. Biol. Ch em . 272(17): 11761-11767
(1999)
dosu d
n epu blik ován o
Zn 2+,
Ca 2+
470
Zn 2+, Ca 2+
404
-
5
5.3
Protein s 50: 636-647 (2003)
EMBO J. 12(9): 3357-3364 (1993)
J. Biol. Ch em . 278(9): 7531-7539 (2003)
23.0
363
Odkaz
-
Stru ctu re 4(3): 265-275
(1996)
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Sim ulace m olekulové dynam iky:
p rogram
silové p ole
GROMACS 3.1.4
GROMACS
sim u lovan á d ob a
asový krok
1.0 – 1.4 n s
2 fs
tep lota
regu lace tep loty
tlak
regu lace tlaku
300 K
Beren d sen u v term ostat
0.1 b ar
Parin ell v & Rah m an v barostat
m odel vody
p o et m oleku l vod y
SPC (exp licit)
10 152 – 23 842
m ezn í vzd álen ost p ro
n evazeb n é in terakce
algoritm u s con strain t
1.4 n m
LINCS
E Lin dahl, B Hess, D van der Spoel (2001) J Mol Mod 7: 306–317. (www.grom acs.org)
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Sim ulace m olekulové dynam iky:
0
200 p s
400 p s
600 ps
800 ps
16 x 50 ps
800 ps
An alýza:
root-m ean -squ are d eviation
1 Σ (r – r 0)2
N
root-m ean -squ are flu ctu ation
RMSD =
RMSF =
Σ (r - <r>)
2
1
n kom p on en t
an alýza h lavn ích
E Lin dahl, B Hess, D van der Spoel (2001) J Mol Mod 7: 306–317. (www.grom acs.org)
1000 ps
α-am ylasa
1AQM – Alterom on as h aloplan ctis
FOBIA kongres
cit rat sy nt hasa
1A59 – Ant arkt ická
bakt erie
DS2-3R
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
1HX0 – p rase
1AJ8 - Pyrococcu s fu riosu s
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
m alatdeh yd rogen asa
1B8P – Aqu aspirillu m
1IZ9 – Th erm u s th erm oph ilu s
arcticu m
Hb 8
alkalická p roteasa
1G9K – Pseu dom on as sp .
1KAP – Pseu dom on as
aeru gin osa
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
xylan asa
1H12 – Alterom on as h aloplan k tis 1CEM – Clostridiu m
th erm ocellu m
RMSF [nm ]
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
α-am ylasa 1AQM-1HX0
N
citratsyn th asa 1A59-1AJ8
C
N
alkalická p roteasa 1G9K-1KAP
m alatdeh yd rogen asa 1B8P-1IZ9
C
N
C
N
C
xylan asa 1H12-1CEM
Rozložen í RMSF p odél et zce
- po ít áno po 50 ps
N
C
FOBIA kongres
Prm rn á flexib ilita C α atom
- p o ítán o p o 50 p s
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
FOBIA kongres
Prm rn á flexib ilita C α atom
- p o ítán o p o 800 p s
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
korelace flexib ility jed n otlivých Ca atom (m eso/ term ofiln í vs. p sych rofiln í)
- p o ítán o p o 50 p s
α-am ylasa
citratsyn th asa
alkalická
p roteasa
xylan asa
m alatd eh yd rogen asa
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
RMSF [n m ]
FOBIA kongres
d RMSF/ d T [n m / K]
tep lota [K]
xylan asa
1H12 – Alterom on as
h aloplan k tis
1CEM – Clostridiu m
th erm ocellu m
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
r
r
r
r
1A59 – Antarktická
bakterie DS2-3R
1AJ8 - Pyrococcus furiosus
r [nm ]
citratsyn th asa
as [ps]
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
An alýza h lavn ích kom p on en t (essen tial d yn am ics):
atom 1
atom 2
vlastní ísla rep resen tu jí m íru
vzájem n n ezávislých p oh ybu
ve sm ru vlastních vektor
trajektorie:
výp o et p r m rn ých
sou ad n ic jedn otlivých
atom
diagon alizace m atice
kovarian ní
m atice:
výp o et vektor
r(t) - <r>
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
An alýza h lavn ích kom p on en t (essen tial d yn am ics):
citratsyn th asa
1A59 – Antarktická
bakterie DS2-3R
1AJ8 - Pyrococcus furiosus
FOBIA kongres
An alýza h lavn ích kom p on en t (essen tial d yn am ics):
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Role vody:
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Sh rn u tí:
- až n a α-am ylasu jsou en zym y z p sych rofiln ích m ikroorgan ism
(o troch u ) celkov více flexib iln í
- ím d elší asové m ítko tím více se p rojevu je vyšší flexibilita
- vyšší flexib ilita u α-am ylasy je p atrn zp soben á
vzájem n ým i in zercem i
- vyšší flexib ilita je sp ojen a s rozsáh lejším i kon form a n ím i
zm n am i (otevírán í a zavírán í aktivn íh o m ísta atd …)
- závislost flexib ility n a tep lot je strm jší p ro
p sych rofiln í xylan asu
- term ofiln í en zym y vykazu jí siln jší in terakce s vodou
FOBIA kongres
1.4. 2005 St. Jan pod Skalou
Pod kování:
Prof. B. Králová, P. Lip ovová,
Z. Pu rkrtová, E. Ben ešová,
M. Marková, Š. Malá,Z. Win terová
J. Hašek, J. Doh n álek, T. Skálová,
E. Von d rá ková1, H. Petroková
Prof. G. Folkers, Prof. V. Pliška,
Prof. L. Scap ozza
P. Posp íšil
PRÁZDNINOVÉ
PO ÍTÁNÍ
Prof. K. Dem n erová, P. Jen , M. Marková,
Doc. J. Pazlarová, H. Strn ad, Prof. O. Valen tová
… a Vám za p ozorn ost