Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve

Možnosti diagnostiky chorob
u kanců a v inseminačních dávkách
MVDr. Petr Václavek, Ph.D.
Státní veterinární ústav Jihlava
MEVET / Topigs Norsvin seminář, Michalovice, 10. března 2015
Možnosti diagnostiky chorob u kanců a v
inseminačních dávkách
OBSAH:
1) Laboratorní diagnostika u kanců obecně
2) Diagnostické metody chorob prasat/kanců a
interpretace výsledků
3) Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků
pro lab. diagnostiku
4) Porcinní epidemická diarhoea (PED)
Laboratorní diagnostika u kanců obecně
• povinné vyšetřování – SZ – viz Metodika kontroly zdraví
– povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu
brucelóza, KMP, ACH, VCHP
• dobrovolné vyšetřování
ü monitoring – PRRS apod.
ü cílené diagnostické testy
ü kontrola semene – bakteriologická/virologická
Laboratorní diagnostika u plemenných kanců obecně
• povinné vyšetřování – Metodika kontroly zdraví povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu
EpB130 BRUCELÓZA – VyLa - sérologické vyšetření (RBT + RVK)
Plemenní kanci v hospodářství původu před přijetím do izolační
stáje – v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
EpB131 BRUCELÓZA – VyLa - sérologické vyšetření (RBT + RVK)
Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
EpB132 BRUCELÓZA – VyLa - sérologické vyšetření (RBT + RVK)
Plemenní kanci v izolační stáji před přijetím do střediska pro
odběr spermatu nejdříve za 15 dnů po zahájení izolace - v souladu
s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
Laboratorní diagnostika u plemenných kanců obecně
• povinné vyšetřování – Metodika kontroly zdraví povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu
EpB303 KLASICKÝ MOR PRASAT – VyLa - sérologické vyšetření (ELISA)
Plemenní kanci v hospodářství původu před přijetím do střediska pro
odběr spermatu – v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
EpB304 KLASICKÝ MOR PRASAT – VyLa - sérologické vyšetření (ELISA)
Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně - v souladu
s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
EpB403 AUJESZKYHO CHOROBA – VyLa- sérologické vyšetření (ELISA)
Plemenní kanci v hospodářství původu před přijetím do izolační stáje –
v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
EpB404 AUJESZKYHO CHOROBA – VyLa- sérologické vyšetření (ELISA)
Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně - v souladu
s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
EpB405 AUJESZKYHO CHOROBA – VyLa- sérologické vyšetření (ELISA)
Plemenní kanci v izolační stáji před přijetím do střediska pro odběr
spermatu nejdříve za 15 dnů od zahájení izolace - v souladu s přílohou č. 5
k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
Státní veterinární ústav Jihlava
Komplexní diagnostika chorob prasat
ODDĚLENÍ
bakteriologie
bakteriologická vyšetření
virologická a sérologická vyšetření
molekulárně-biologická vyšetření
virologie
histologická a imunohist. vyšetření
patologie
patologicko–anatomická vyšetření
chemie
parazitologie
krmiva
biochemická, toxikologická a
hematologická vyšetření
parazitologická vyšetření
mikrobiologická, mykologická a
chemická vyšetření
Výsledek vyšetření + interpretace, konzultace a návrh řešení.
Diagnostické metody
A) Nepřímý průkaz =
• sérologický průkaz specifických protilátek
MATERIÁL: sérum, plasma, sliny
B) Přímý průkaz =
• průkaz patogena /antigenu / nukleové kyseliny
MATERIÁL: krev, sliny, sperma, výtěry, trus, sekční materiál,
seškraby
7
Diagnostické metody - nepřímý průkaz =
sérologický průkaz specifických protilátek
MATERIÁL: sérum, plasma, sliny
• ELISA – APP, PRRS, M. hyop, PCV2, H. parasuis, P. multocida, SIV,
VGP, KMP, AMP, VCHP, ACH, Salmonella sp., brucelóza, chlam.,
PED, Lawsonia intracellularis, atd.
• hemaglutinačně-inhibiční test (HIT) – PPV
• rychlá a pomalá aglutinace (RA) – brucelóza
• reakce vazby komplementu (RVK) – brucelóza, chlamydióza
• MAT – Leptospira sp.
• VNT, NPLA, IPMA – KMP, AMP, ACH, apod.
8
Diagnostické metody - přímý průkaz =
průkaz patogena /antigenu / nukleové kyseliny
MATERIÁL: krev, sliny, sperma, výtěry, trus, sekční mat.
• (real time) RT PCR – PRRS, SIV, KMP VGP, PRCoV, PED
• (real time) PCR – PCV2, AMP, PPV, PMT, HP, APP, M. hyop., B.
hyodysenteriae, L. intracellularis, Mycoplasma suis
• imunochromatografický test – rotaviry, VGP, PED
• imunohistochemie – PCV2
• izolace virologická / bakteriologická
9
Interpretace výsledků
není pouze problém diagnostických metod
• limity diagnostické metody - specifita, sensitivita, robustnost, atd.
• reprezentativní počet vzorků /frekvence vzorkování
• stádium onemocnění - virémie/bakteriémie/ sérokonverze
• prevalence onemocnění
• klinické symptomy -
při klinice je nejpravděpodobnější záchyt patogena (ale
virus může být vylučován i před klinickými příznaky i po odeznění)
• materiál/vzorek transport vzorků
vylučování viru do spermatu apod., správný odběr, uchování a
Interpretace výsledků
není pouze problém diagnostických metod
Příklad - PRRSV
aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a jeho následnou interpretaci
PCR diagnostika viru PRRS:
ü RT PCR and nested PCR (diferenciace EU a AM kmene)
ü Real-time RT PCR
•
•
•
•
PCR – detekuje NK (nemusí být infekční)
k infekci je třeba určité dávky
mírná klinika u kanců s infekcí PRRS
virus kanci vylučují již 1-2 týdny před sérokonverzí (2.-9. den pravidelně,
10.-23. den variabilně)
• v krvi je virus detekován dříve a ve větší kvantitě než v semeni (rozdíl
cca 2 dny)
• striktní používání pouze ELISA testů bez PCR není doporučováno – v momentě
potvrzení sérologické pozitivity už může být viru sířen spermatem dále
• dlouhodobé/intermitentní vylučování viru PRRS u kanců
• virus perzistuje v tonsilách a m.u. (132-157 dnů)
• RNA PRRS virus je citlivý k degradaci – transport vzorků, uchování, …!!
Příklad PRRSV
aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a následnou interpretaci
ü IDEXX PRRS X3 Ab Test
ü ELISA Oral Fluid IDEXX
ELISA
ü AniGen PRRS Ab ELISA 4.0 (Bionote)
ü INGEZIM PRRS 2.0 (Ingenasa)
ü imunoperoxidázový test - IPMA (AM/EU kmeny)
•
specifita ELISA testů = téměř 100% , ALE falešně pozitivní výsledky mohou být nutnost konfirmačních testů či nutný opakovaný odběr k potvrzení diagnostiky
SVÚ Jihlava - nové ceny ELISA testů (od 1.4.2015):
ü IDEXX ELISA = 230,- Kč / 1 vzorek (zvýšeno pravděpodobně pouze dočasně)
ü ostatní ELISA = 150,- Kč / 1 vzorek
•
v mezinárodních kruhových testech ověřena kvalita a srovnatelné výsledky
•
testů AniGen a Ingezim
Interpretace výsledků
není pouze problém diagnostických metod
Příklad PRRSV
aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a následnou interpretaci
ü IDEXX PRRS X3 Ab Test
PRRS ELISA a kvalitativní/kvantitativní výsledek
IDEXX PRRS ELISA nám dává jednoduchý kvalitativní výsledek =
pozitivní/negativní.
Pozitivní kontrola je standardizována a reprezentuje signifikantní
hladinu specifických protilátek proti viru PRRS. Relativní hladina
protilátek je pak determinována kalkulací tzv. S/P hodnoty. Hodnota S/P
(vzorek/pozitivní kontrola) je porovnáním výsledku OD vzorku s výsledkem OD známého
standardu.
Hraniční hodnota (cut-off) mezi poz. a neg. je stanovena na S/P = 0,4.
S/P poměr je rekalkulován na „titer-like value“ =
ne pravý titr protilátek!
14
PRRS monitoring u plemenných kanců
SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ / FREKVENCE
Obecná pravidla:
• doporučován sérologický monitoring v kombinaci s PCR testy ze
stejných vzorků krve
• různá schémata pro monitoring PRRS: např. 1 x týdně test
spermatu metodou PCR a měsíční sérologické testování séra
• četnost vyšetření a počet vzorků? STATISTIKA x EKOMOMIKA
• někdy povoleno směsování vzorků na PCR test (3-5 vz.) –
odůvodněné v negativních chovech, kde se testuje často
• ID by neměly být pouštěny bez negativního výsledku
• striktní používání pouze ELISA testů bez PCR není doporučováno
– v momentě potvrzení sérologické pozitivity už může být viru
sířen spermatem dále
PRRS monitoring u plemenných kanců
SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ
Počet vzorků k potvrzení nákazy – Excel tabulka
(včetně vlivu sensitivity použitého testu)
Velikost populace (ks)
Požadovaná spolehlivost (95%)
Citlivost metody (%)
Předpokládaná prevalence (%)
Počet vzorků (ks) n
n=
α=
D=
N=
50
95%
100%
5%
32
potřebný počet vzorků
požadovaná jistota detekce infekce (většinou 0,95)
počet infikovaných zvířat (odhad prevalence)
velikost (četnost) populace
SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ
Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s
testem se 100% senzitivitou
Prevalence (%)
Velikost
populace
50
40
30
25
20
15
10
5
2
1
0.5 0.1
20
4
6
7
9
10
12
16
19
20
20
20
20
30
4
6
8
9
11
14
19
26
30
30
30
30
40
5
6
8
10
12
15
21
31
40
40
40
40
50
5
6
8
10
12
16
22
35
46
50
50
50
60
5
6
8
10
12
16
23
38
55
60
60
60
70
5
6
8
10
13
17
24
40
62
70
70
70
80
5
6
8
10
13
17
24
42
68
79
80
80
90
5
6
8
10
13
17
25
43
73
87
90
90
100
5
6
9
10
13
17
25
45
78
96
100
100
150
5
6
9
11
13
18
27
49
95
130
148
150
200
5
6
9
11
13
18
27
51
105
155
190
200
500
5
6
9
11
14
19
28
56
129
225
349
500
1000
5
6
9
11
14
19
29
57
138
258
450
950
5000
5
6
9
11
14
19
29
59
147
290
564 2253
10000
5
6
9
11
14
19
29
59
148
294
581 2588
∞
5
6
9
11
14
19
29
59
149
299
596 2995
Správný počet vzorků
Používáme malé množství vzorků, abychom získali informace
o velkém množství zvířat. Výsledek má zajistit relevantní
informaci aplikovatelnou na celou populaci (halu, farmu).
• statistika – určuje ideální počet vzorků
• praxe – bere v úvahu také ekonomickou stránku
Chovatel/majitel tlačí počet vzorků a frekvenci vzorkování
dolů. Potom přichází klíčové otázky:
Kolik informací ztrácím?
Jaká rizika vznikají snížením počtu vzorků (popř. frekvence) ?
Standardní a alternativní postupy odběru
diagnostických vzorků u kanců
Matrice:
• KREV
• VÝTĚRY
• SEKČNÍ MATERIÁL
• SLINY
• SEŠKRABY Z MANDLÍ
• SPERMA
SPERMA a jeho specifika jako diagnostického vzorku
Možnosti laboratorního vyšetření:
• konvenční bakteriologické vyšetření
- ne vždy optimální
výsledky (přerůstání, interpretace, apod.)
• konvenční virologické vyšetření
– ne vždy optimální výsledky z
různých důvodů – nízká sensitivita, délka analýzy/izolace, interpretace,
kontaminace TK, cytotoxicita na TK
• biologický pokus na prasnicích
– byl používán, citlivější než
izolace na TK – nelze systematicky používat z welfare důvodů i z praktického
hlediska
• molekulární diagnostika - PCR – vysoká sensitivita, rychlé, vysoká
kapacita (poč. vz.), ALE …
SPERMA a jeho specifika jako dg. vzorku na PCR
• pozitivní výsledek molekulární diagnostiky (PCR) nemusí
znamenat, že sperma obsahuje infekční patogen – detekujeme
genom (NK) ne infekční organismus
• k infekci je navít třeba jistá infekční dávka – množství virových
partikulí
Ø např. test RT-nPCR na PRRSV detekuje 100 TCID50/ins. dávku = 20x méně
viru než je třeba na exp. infekci 1 z 5 prasniček (Benfield et al. 2000)
Ø ALE byla zaznamenána vysoká korelace (94%) mezi PCR a exp. infekcí, tzn. je
vysoká pravděpodobnost, že vzorek s pozitivním výsledkem v PCR obsahuje
infekční dávku (Christopher-Hennings et al. 1995)
• sperma je ideální spíše pro pozitivní chov, kde se snažím
limitovat šíření viru směrem dolů – u PRRS pozitivního kance totiž
nemohu dle séra předpokládat vylučování viru ve spermatu
• směsování vz. spermatu se nedoporučuje (kvůli nižší sensitivitě)
• virus PRRS v semeni – intermitentní vylučování, nemusí
korelovat s protilátkami a virem v krvi
SPERMA a jeho specifika jako diagnostického
vzorku na PCR
NATIVNÍ SPERMA
• vysoká koncentrace balastní DNA oproti hledanému
targetu – řešení – úprava metodiky zpracování vzorku
INSEMINAČNÍ DÁVKA
• problém naředění = „snížení citlivosti“ testu
• potencionální inhibiční vlivy protektiv /ředidel, která by
mohla způsobovat inhibici při PCR testu
• množství spermatu – optimum 2 ks pejet/kapilár /1 zvíře potřeba min. 200 ul do testu na izolaci NK (+ případná
rezerva)
SÉRUM a jeho specifika jako diagnostického vzorku
•
•
ideální vzorek – virus PRRS vylučován dříve než v
krvi a ve větší kvantitě
preferovaný vzorek pro negativní stáj (sperma je
ideální spíše pro pozitivní chov, kde se snažím limitovat šíření
viru směrem dolů)
•
•
možno směsování pro PCR diagnostiku (3-5 vz.)
zpracování na PCR (PRRS) rychleji než standard na
sérologii – chlazené do 24 hodin do lab.
krev
24 h/pokojová t.
sérum 7-14 dní/2-8°C
3 dny/2-8°C
déle při -20°
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
Odběr vzorků krve u kanců:
• standardní odběr do HEMOS zkumavek – v. jugularis, v. cava anterior
• alternativní odběry
ü ušní žíly - v. auricularis
ü ocasní žíla – v. caudalis mediana, perineal
ü tarzální žíla – v. tarsalis (v. saphena lateralis – ne vždy vidět)
na /do:
ü filtrační papír (TEGO)
ü tampon + PBS
ü plast. kapilára
ü mikrozkumavka
KDY?
ü na fantomu
ü při ejakuaci!
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„Blood swab metod“: krevní stěr
• komprese ušní žíly
• narušení jehlou (20G)
• stěr tamponem – tyčinka s polyesterovým
tamponem
• umístit do zkumavky s PBS (0,5-1 ml)
• odběr během ejakulace
• „flinch rate“= 10% (ne všichni kanci reagují
pozitivně)
• naředění (7-20x ředící efekt) = nižší sensitivita
testu – směsování vzorků se nedoporučuje
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„Blood-swab metod“ – shoda s ostatními vzorky
• citlivější než testování spermatu!
Reicks et al. 2006
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„Blood-swab metod“:
V séru je mnohonásobně vyšší koncentrace viru než ve
vzorku krevního stěru = rizika
NAVÍC brát v potaz:
•
•
•
•
Reicks et al. 2006
ideální podmínky experimentu
krátká doba mezi odběrem a testováním
neřeší se uchování a transport vzorku
ELISA test na detekci protilátek použitelný jen při výrazném posunu cut –
off (Patterson et al. 2007)
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„Plastiková kapilára s mikrocenrifugační zkumavkou“
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„Plastiková kapilára s mikrocenrifugační zkumavkou“:
SAFE-T-FILL Serum Gel Capillary Collection (RAM Scientific, USA)
•
•
•
•
může obsahovat separační gel nebo antikoagulant
výsledný vzorek je neředěné sérum
cca 300 ul krve – může být málo pro dg
zvíře musí být klidné – jinak vznik bublin v kapiláře
• alternativa: Bio- Tubes, Biovet inc, Kanada 600 ul krve
Postup:
• narušení žíly jehlou často nestačí
• potřeba malého skalpelu
• ucho před zákrokem očistit alkoholem
(ethanol nebo xylol)
• nebo lze kapiláru vsunout do jehly (18G)
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„Plastiková kapilární kapilární zkumavka “:
Patterson et et al. 2007
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„Mikrozkumavky “:
•
•
•
•
•
komprese ušní žíly
narušení jehlou (20G)
odběr do mikrozkumavky
odběr během ejakulace
na závěr opět komprese
ušní žíly aby nevznikl
hematom
Dewey et al. 2006
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„TEGO™ swine blood collection kit “
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
„TEGO™ swine blood collection kit “
Detekce viru testem PCR – porovnání: sérum x TEGO
Detekce protilátek ELISA testem – porovnání: sérum x TEGO
Standardní a alternativní postupy
odběrů vzorků krve
VÝHODY alternativních odběrů z periferních žil:
• jednodušší a méně invazivní odběry
• bez fixace = méně stresu = welfare
• bez rizik spojených s odběrem z v. jugularis –
potencionální poranění štítné žlázy, n. vagus, ductus
thoracicus
• při pravidelném odběru méně nebezpečné pro kance i
pro lékaře
• odběr do kapiláry a mikrozkumavky srovnatelné se
standardním odběrem z v. jugularis
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve
NEVÝHODY alternativních odběrů z periferních žil:
• v některých případech nižší sensitivita – naředění
(stěry krve, filtrační papír)
• nevhodné na směsování (stěry, papír)
• v některých případech vyšší náklady? (TEGO, kapiláry)
nutnost další validace postupů – testování v praxi
© Copyright The Norwegian School of Veterinary Science
Porcinní epidemická diarhoea (PED)
Epidemický průjem prasat
Alphacoronavirus I. - VGP, PRCV
Alphacoronavirus II. - PED
Betcoronavirus - SARS
Deltacoronavirus – SwDCV – Hong Kong, USA
(Swine deltacoronavirus)
Aktuální situace:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
USA 2013 - genetická variabilita, kmeny s různou patogenitou
Německo 2014 – výkrmny a dva chovy prasnic - kmen úzce příbuzný s
kmeny INDEL v USA - nízká patogenita
Rakousko 2014 – výkrmna s běhouny importovanými z Německa
Nizozemsko 2014
Ukrajina 2014 – podobný virulentním kmenům z Číny a USA
Slovensko 2015 (detekováno na SVÚ Jihlava) – nízce patogenní (5-6
dní průjem, do 10 dní úmrtnost 20-30% selat + prasnice 3-4 dny
nežraly a nedávaly selatům mléko)
Porcinní epidemická diarhoea (PED)
DIAGNOSTIKA na SVÚ Jihlava
Průkaz viru/NK
• RT PCR nebo Real-time PCR – 1000,- Kč
• imunochromatografický test - Anigen Rapid TGE/PED Ag
Test – 200,- Kč (resp. 400 Kč s TGE)
• ICH - pouze rychlý orientační (spíše stájový) test s nízkou
sensitivitou – nutnost odběru vyššího počtu vz.
• PCR – o několik řádů vyšší sensitivita i specifita
Sérologický screening
• ELISA Ab
Děkuji za pozornost!
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA
Oddělení virologie