Návod AmnioGrow-ČJ

CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Médium AmnioGrow Plus
Informace o produktu
Médium AmnioGrow Plus AGM-100M
100 ml (zmražené)
Médium AmnioGrow Plus AGM-500M
500 ml (zmražené)
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 1 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz
CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Médium AmnioGrow Plus
Návod k použití
UPOZORNĚNÍ:
Při práci dodržujte zásady práce s biohazardním materiálem
Katal. č. MGM-100 (100 ml zmraženého roztoku)
Popis produktu
Médium AmniGrow Plus je určeno pro použití v in vitro diagnostice a bylo vyvinuto
pro kultivaci lidských buněk amniotické tekutiny (AVS) a buněk choriových klků
(CVS), které mohou být následně použity při karyotypizaci, fluorescenční in situ
hybridizaci (FISH) a dalších cytogenetických metodách. Produkt byl velmi rozsáhle
testován předními Evropskými klinickými cytogenetickými diagnostickými
referenčními laboratořemi.
Obecné
Prenatální diagnostika vyžaduje a je závislá na různých invazivních a neinvazivních
technikách pro výzkum gestgace embrya a pro detekci případných zárodečných
abnormalit a dysfunkcí. Amniocentéza a biopsie choriových klků reprezentuje hlavní
invazivní diagnostické procedury používané v klinické diagnostice a jsou běžnými
rutinními metodami pro výzkum chromozomálnich abnormalit embrya, metabolických
enzymatických defektů a pro analýzu DNA.
Od chvíle, kdy začaly být používány buněčné kultury z amniotické tekutiny v
cytogenetických laboratořích, ukázalo se, že cytogenetická a biochemická
charakteristika takových kultur je vhodným nástrojem pro analýzu stavu embrya a
začaly se pro tento účel využívat.Technologie je založena na kultivaci a karyotypizaci
těchto buněk z amniotické tekutiny, které reprezentují různé histotypy. Takové buňky
se tradičně kultivují v buněčném médiu doplněném fetálním hovězím sérem.
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 2 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz
CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Popis produktu
Médium AmnioGrow Plus bylo vyvinuto speciálně pro in vitro prenatální diagnostické
testování lidské amniotické tekutiny a vzorků choriových klků a upraveno pro
jednoduché použití. Každé složení bylo optimalizováno pečlivým testováním kvality
na vzorcích s přídavky látek podporujících přisedání a růst, aby se minimalizovala
diagnostická doba zvýšením nasedání buněk a jejich růstu. Každá vyrobená šarže je
testována na ověřených standardech, aby se ověřil klinická správnost výsledků
Médium AmnioGrow Plus je dodáváno zmražené a kompletní, připravené k použití ve
100 ml nebo 500 ml lahvičkách. Obsahuje antibiotika, L-glutamin, zárodečné hovězí
sérum (FBS), hormony a růstové faktory.
Médium AmnioGrow Plus je pufrováno bikarbonátem sodným a jako pH indikátor je
použita fenolová červeň. Kompletnost média snižuje možnost technické chyby a
kontaminace kultury. Navíc toto médium podporuje pevnější přisednutí buněk a
buněčný růst, čímž je umožněná časná analýza chromozomů.
Skladování
Zmražené:
Skladujte při –20ºC a v temnu až do konce exspirační doby uvedené
na nálepce.
Chlazené:
Uchovávejte při 4ºC až 2 týdny.
Limitace:
Nepoužívejte po datu exspirace.
Návod k použití
Médium AmnioGrow Plus je kompletní médium, dodávané zmražené a sterilní.
Filtrování média není potřebné. Úspěšnost kultivace závisí na použití vhodných
aseptických technik.
AmnioGrow Plus uchovávejte po otevření ve tmě při 2 až 8ºC a spotřebujte do 2
týdnů pro maximální kvalitu kultivace. Vyvarujte se opakovanému zmrazování a delší
expozici světlu.
AmnioGrow obsahuje zárodečné hovězí sérum a tudíž se po rozmražení a
uchovávání může vyvinout sraženina.
Rozmražení média
AmnioGrow Plus rozmrazujte před použitím ve vodní lázni s teplotou 37ºC za
občasného míchání. Alternativně můžete rozmrazit médium v CO2 inkubátoru při
37ºC s povoleným víčkem, aby se umožnila normalizace pH. Teplé médium se
správným pH je pro zahájení kultivace optimální.
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 3 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz
CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Kontrola pH
AmnioGrow Plus je dodáváno s optimálním pH 6,9 – 7,1 , někdy se ale může pH lišit:
AmnioGrow Plus obsahuje pH indikátor fenolovou červeň:
•
Růžová znamená vysoké pH. Fenolová červeň se mění na růžovou při pH 7,4.
Růžové médium (příliš alkalické) lze napravit pootevřením víčka (asi o ¼
otáčky) a inkubací lahvičky v 5% CO2 asi 1 hodinu. Médium zůstane sterilní a
samovolně upraví svoje pH na správnou hodnotu.
•
Žlutá znamená nízké pH. Fenolová červeň se změní na žlutou při pH 6,7.
Žluté médium (příliš kyselé) lze napravit stejným způsobem, jako růžové
médium.
•
Alternativně lze lahvičku s médiem nebo kultivační nádobku nasytit plynným
5% CO2 v laminárním boxu, dokud se nedosáhne červené barvy.
•
Barvu lze v případě potřeby porovnat s lahvičkou čerstvého rozmraženého
média.
Antibiotika
AmnioGrow Plus obsahuje 50 µg/ml gentamycinu, který je méně inhibující pro růst
buněk ve srovnání s penicilinem a streptomycinem.
Stabilita
•
AmnioGrow Plus je ve zmraženém stavu stabilní až do data exspirace
vyznačeného na štítku.
•
Nepoužívejte po vyznačeném datu exspirace.
•
AmnioGrow Plus můžete používat až 2 týdny po rozmražení, pokud ho
uchováte při 4ºC, následně ale glutamin degraduje. Můžete ho doplnit (ale
pouze jednou) L-glutaminem až do 2,0 mM (1/100 objemu 200 mM
glutaminového zásobního roztoku).
•
Vyvarujte se opakovaného zahřívání a chlazení, stejně jako expozici světlu.
Test kvality
AmnioGrow Plus je testováno na pH, osmolaritu, a kontaminace bakteriální,
mykoplazmatickou i plísňovou. Vedle těchto standardních specifikací je každá
výrobní šarže testována na buněčný růst přední evropskou cytogenetickou laboratoří
a kvalita produktu je porovnána s referenčním standardem. Certifikát kvality vám na
požádání zašleme.
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 4 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz
CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Upozornění
Kontaktujte přímo Sales & Marketing Department výrobce CytoGen GmbH pro
jakékoli pochybnosti o kvalitě média.
Nepoužívejte médium, jestliže je
•
Obal jakkoli porušen.
•
Médium kalné, nebo obsahuje viditelný precipitát.
•
Barva není oranžově červená.
Pokud obdržíte produkt rozmražený, nebo částečně rozmražený, okamžitě ho
zamrazte na –20ºC a kontaktujte distributora.
Limitace
AmnioGrow Plus je určeno pro in vitro diagnostické postupy vyžadující kultivaci a růst
lidských amniotických buněk nebo bioptických vzorků choriových klků.
Přidávání jakýchkoli dalších suplementů se nedoporučuje.
Každá laboratoř si musí médium sama otestovat ve vlastním provozu a v návaznosti
na vlastní zavedené postupy před začleněním do systému in vitro diagnostiky.
Příspěvkem firmy CytoGen je pouze kultivace buněk, respektive dodávka kvalitního
média. CytoGen nemůže zodpovídat za výsledky testů, které se po kultivaci následně
provádějí.
CytoGen média se připravují asepticky, pročež je každý výrobní krok validován pro
zajištění standardů sterility hodnoty spolehlivosti 10-3, tj. produkt, který vykazuje
výsledně úroveň kontaminace maximálně 1 z 1000 jednotek. Nejvyšší úroveň sterility
(vyšší než 10-6) je nedosažitelná bez závěrečné sterilizace, která by ovšem médium
vzhledem k jeho komplexnosti poškodila.
Kultivační protokoly
Následující protokol je návodem k provádění kultivací buněk AFC a CVS s použitím
AmnioGrow Plus. Může být použit dle uvážení zákazníka k náhradě buď části nebo
celého kultivačního protokolu. Většina cytogenetických laboratoří má vlastní
protokoly a AmnioGrow Plus může být ve většině případů použito v rámci těchto
protokolů. Nejběžnější kultivační metody používají „otevřený“ systém.
Velmi důležité upozornění:
Definice „otevřeného“ systému: kultury pěstované v Petriho miskách s mírně
zdviženým víčkem nebo v lahvičkách s povoleným víčkem v 5% CO2 atmosféře (CO2
inkubátor), kde je umožněna ventilace plynů.
Definice „uzavřeného“ systému: kultury rostoucí ve standardním suchém inkubátoru
v hermeticky uzavřených nádobách.
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 5 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz
CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Doporučení pro použití „otevřeného“ systému
In situ metoda
1. Koncentrujte buňky centrifugací amniotické tekutiny při nízkých otáčkách.
2. Odpipetujte 90-95% supernatantu a resuspendujte pelet ve zbylém objemu
amniotické tekutiny pacienta. Nařeďte koncentrovanou buněčnou suspenzi
médiem AmnioGrow Plus, abyste mohli následně pipetovat 0,5 ml na sklíčko
(celkem 4 sklíčka) nebo 2 ml na baňku.
3. Inkubujte kultury při 37ºC v 5% CO2 atmosféře.
4. Druhý den přidejte 2 ml AmnioGrow Plus do každé kultury.
5. Za 4 až 5 dní zkontrolujte růst. V případě růstu přidejte médium. Nejprve
odsajte vyčerpané buněčné médium a nahraďte jej 2 ml čerstvého AmnioGrow
Plus. Doporučujeme přidávat médium každý druhý den.
6. Zkontrolujte růst kultur za minimálně 5 dní a skliďte buňky, pokud zjistíte
dostatek kolonií.
7. Pro nejlepší výsledky přidejte médium den před sklizní.
Kultivace v baňce
1. Koncentrujte buňky centrifugací amniotické tekutiny při nízkých otáčkách.
2. Odpipetujte 90-95% supernatantu a resuspendujte pelet ve zbylém objemu
amniotické tekutiny pacienta. Nařeďte koncentrovanou buněčnou suspenzi
médiem AmnioGrow Plus, abyste mohli následně pipetovat 0,5 ml na sklíčko
(celkem 4 sklíčka) nebo 2 ml na baňku.
3. Inkubujte kultury při 37ºC v 5% CO2 atmosféře.
4. 5. den zkontrolujte růst. Odstraňte médium a nahraďte čerstvým AmnioGrow
Plus a skliďte v případě dostatečného nárůstu.
5. Kontrolujte růst v kulturách a kompletně měňte následně médium každý 2.
den, dokud nenaroste dostatečný počet kolonií a jsou připravené ke sklizni.
6. Pro nejlepší výsledky přidejte médium den před sklizní.
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 6 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz
CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Doporučení pro uzavřený systém
AmnioGrow Plus lze využít pro kultivaci buněk v „uzavřeném“ systému, pokud je pH
ve fyziologické oblasti (pH je mezi 6,9 a 7,4). Uzavřené systémy závisejí na vnitřní
pufrovací kapacitě média bez výhody vyplývající z rovnováhy mezi uhličitany v médiu
a 5% CO2 přítomnému v otevřeném systému inkubátoru. Uzavřené systémy fungují
nejlépe při kultivacích s nízkou koncentrací buněk, jelikož vyšší koncentrace
produkuje kyselé metabolity, které můžou okyselit médium nad jeho fyziologickou
pufrovací kapacitu. Udržování pH může být dosaženo v uzavřeném systému jednou
z následujících 3 metod:
•
Metoda 1: Přidejte k AmnioGrow Plus 2% (v/v) sterilního zásobního roztoku
1,0 M HEPES. Sterilní 1,0 M HEPES může být opraveno na pH 7,0 při 20ºC
přidáním 1,0 M NaOH. Upravené médium HEPES je následně smícháno
s buňkami a inkubováno při 37ºC v uzavřených kultivačních baňkách.
•
Metoda 2: Předinkubujte kultivační baňky s AmnioGrow Plus a buňkami v 5%
CO2 inkubátoru 1 hodinu před uzavřením víčka a kultivací při 37ºC .
•
Metoda 3: Probublejte jednotlivé kultivační baňky obsahující AmnioGrow Plus
a buňky směsí 5% CO2 – 95% vzduchu sterilní pipetou 20 s. Poté uzavřete
víčko a kultivujte v uzavřeném systému při 37ºC . Nejlépe je připojit ke zdroji
CO2 sterilní zazátkovanou Pasteurovu pipetu, čímž se zajistí sterilita
vstupujícího plynu.
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 7 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz
CytoGen GmbH – Příbalový leták k médiu AmnioGrow
Bibliografie
A) Bartalini, G., Margollicci, M.A., Balestri, P., and Fois, A. Evaluation of lysosomal enzymes
in
uncultured and cultured chorionic villi and amniocytes. J. Inher. Metab. Dis. 11, Suppl. 2, 263
(1988).
B) Chang, H., Jones, O.W. Human amniotic fluid cells grown in a hormone-supplemented
medium: Suitability for prenatal diagnosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4795 (1982).
C) Epstein, C.J. The use of growth factors to stimulate the proliferation of amniotic fluid cells.
Methods inCell Biology 26, 269 (1982).
D) Gravel, R.A., Leung, A., Tsui, F., Koldny, H. A micromethod for the detection of
arylsulfatases
A and B in cultured fibroblasts and amniocytes. Anal. Biochem. 119, 360 (1982).
E) Hecht, F., Peakman, D.C., Kaiser-McCaw, B., Robinson, A. Amniocyte clones for prenatal
cytogenetics. Amer.J. Med. Genet. 10, 51 (1981).
F) Kleijer, W.J., First trimester diagnosis of genetic metabolic disorders. Contr. Gynecol.
Obstet.
15:80. 1986.
G) Priest, R.E., Marimuthu, K.M., Priest J.H. Origin of human amniotic fluid cultures. Lab.
Invest.
39, 106 (1978).
H) Renlund, M., and Aula P. Prenatal detection of Salla disease based upon Increased free
sialic
acid in amniocytes. Amer. J. Hum. Genet. 28, 377 (1987).
I) Sarkar, S., Chang, H., Porreco, R.P., Jones, O.W. Neural origin of cells in amniotic fluid.
Amer.
J.Obstet.Gynecol. 136, 67 (1980).
J) Steele, M.W. and Breg, W.R. Chromosome analysis of human amniotic fluid cells. Lancet
1,
383 (1966).
Pouze pro použití v in vitro diagnostice
NENÍ určeno pro humánní ani veterinární terapeutické účely. Použití jiné, než
doporučené, může být v rozporu s místními zákony.
Výrobce: CytoGen GmbH, Bienenweg 28, D-35764 Sinn, Německo
Bienenweg 28, D – 35764 Sinn, Germany
Tel. +49 – 2772 - 57 20 587
Fax +49 – 2772 – 570 945
E-Mail: [email protected]
Web: www.CytoGen.Info
Distributor pro Českou republiku a Slovensko: PentaGen s.r.o.,
[email protected]
+420 606 787 606
www.pentagen.cz
CytoGen GmbH, produktová informace z 10.11.2003 www.cytogen.info
Str. 8 z 8
Exkluzivní distributor pro Českou Republiku a Slovensko:
PentaGen s.r.o. tel.+420 606 787 606 [email protected] www.pentagen.cz