Protilátky proti Toxoplasma gondii (IgG)

Protilátky proti Toxoplasma gondii (IgG)
Návod na použití ELISA testu
Objednací číslo
EI 2410-9601G
Určení
Toxoplasma
gondii
Třída IgG
IgG
Substrát
Ag-potažené
mikrotitrační
jamky
Formát
96 x 01 (96)
Princip testu: ELISA kit umožňuje kvantitativní provedení in-vitro testu pro určení lidských
protilátek třídy IgG proti Toxoplasma gondii. Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené
proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy antigeny
Toxoplasma gondii.V prvním reakčním kroku jsou v jamkách inkubována ředěná séra získaná
od pacientů. V případě pozitivních vzorků se specifické IgG (také IgM a IgA) protilátky
navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená
s enzymem značenou protilátkou proti lidským IgG ( enzymový konjugát), která je schopna
vyvolat barevnou reakci. Intenzita barevné reakce je přímo úměrná koncentraci protilátek
proti antigenům Toxoplasma gondii.
Obsah kitu:
- Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky,
každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití)
- Kalibrační sérum 1, 200 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno
tmavě červeně.
- Kalibrační sérum 2, 10 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno
červeně.
- Kalibrační sérum 3, 1 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno světle
červeně.
- Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno modře.
- Negativní sérum (lidské IgG): 1x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno zeleně.
- Enzymový konjugát: peroxidasou značené králičí protilátky proti lidským IgG: 1 x 12 ml,
připraveno k použití. Značeno zeleně.
- Vzorkový pufr: 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno světle modře.
- Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný)
- Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen:
tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku.
- Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 1 N kyselina fosforečná.
- Návod k provedení testů
- Protokol s hodnotami.
Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až +8 oC,
nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do
vyznačeného data expirace.
Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a
nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HbsAG, anti-HCV, anti- HIV-1 a
anti-HIV-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně
infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou
jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu,
omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava a stabilita reagencií
Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu.
Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a
trhnutím otevřete lepící ochranný obal . Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska
vytemperovaná na pokojovou teplotu, tím zabráníte zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned
přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného
zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném
ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 oC až +8 oC, lze je
použít po dobu nejméně dvou měsíců.
Kalibrační a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně
promíchat.
Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat.
Vzorkový pufr: Připraven k použití
Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství
pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou.
Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je
stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 oC až +8 oC.
Poznámka: Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 oC a před
ředěním promíchejte.
Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití,
obsah je citlivý na světlo.
Zastavovací roztok. Připravený pro užití
Ředění séra a vzorků plasmy
Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte
10 µl séra k 1 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte.
Poznámka: Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití.
Neřeďte je znovu.
Inkubace
Inkubace vzorku: 1. Krok. Přeneste 100 µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly
nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a
inkubujte 30 minut při pokojové teplotě.
Promývání:
Vyprázdněte jamky a následně promyjte každou jamku třikrát pomocí
300 µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechte pufr
v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu,
teprve potom jamku vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů
(provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte,
vyklepejte promývací pufr poklepem desky dnem vzhůru na filtrační papír.
Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou
značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po
dobu 30 minut při pokojové teplotě.
Promývaní:
Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše
Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé
mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve
tmě.
Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační
desky a to v tom samém pořadí , jako byl kapán chromogen/substrátový
roztok.
Měření:
Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové
délce 450 nm a referenční vlnové délce mezi 620 a 650 nm za 30 minut
od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační
desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku.
Pipetovací protokol
1
2
A
C1
P4
B
C2
P5
C
C3
P6
D
pos
P7
E
neg
P8
F
P1
P9
G
P2
P10
H
P3
P11
3
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
4
P20
P21
P22
P23
P24
5
6
7
8
9
10
11
12
Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem analýzy sér od 24 pacientů (P1 až P24).
Kalibrační séra (C1 až C3), pozitivní a negativní kontrolní séra (pos a neg) a všechny vzorky
sér od pacientů byly inkubovány každý v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit
užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužků. To
umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií.
Výpočet výsledků:
Horní hranice referenčního rozsahu u neinfikovaných osob (cut-off value ) je podle
doporučení EUROIMMUN 10 mezinárodních jednotek na mililitr (IU/ml). Hodnoty vyšší,
než je tato hranice, se považují jako pozitivní, pod touto hranicí jako negativní. Jak pozitivní,
tak negativní kontrolní sérum, slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu, musí být proto
zařazeny v každém prováděném testu.
Kvalitativní nebo
semikvantitativní vyhodnocení: Hodnoty extinkce vzorků sér
dosahujících maximálních hodnot séra 2 (10 IU/ml) se považují za pozitivní, séra s hodnotami
pod touto hranicí jako negativní. Vedle této kvalitativní interpretace je možné také jemnější
vyhodnocení výsledků. Poměry > 1,0 se považují jako pozitivní, poměry < 1,0 jako negativní.
Poměry se vypočítají z následujícího vztahu:
Extinkce vzorku séra
Extinkce kalibračního séra 2
= Poměr
Kvantifikace: Křivka standardů, ze které se odečítá koncentrace protilátek ve vzorcích sér,
se sestrojí vynesením hodnot extinkce získaných z měření 3 kalibračních sér, bod po bodu,
proti odpovídajícím jednotkám (lineární/lineární). Následující vynesení je příkladem typické
kalibrační křivky. Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací protilátek
v sérech pacientů.
Jestliže hodnoty extinkce vzorku leží nad hodnotami standardní křivky, doporučujeme, aby
byl vzorek znovu otestován při ředění 1:400. Výsledek v IU/ml získaný ze standardní křivky
pro tento vzorek se potom musí vynásobit faktorem 4.
Charakteristiky testu
Kalibrace: Kalibrace se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) s využitím materiálu
třetího mezinárodního jednání o přípravě standardů Světové zdravotnické organizace (WHO).
Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a
mezinárodní jednotky určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro
tyto důležité hodnoty. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se
nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a proto se musí
opakovat.
Vazebná afinita protilátek, stejně tak aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a
hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota
během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví
také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra se vystaví stejnému vlivu, a to proto, že tyto
změny jsou povětšinou zakalkulovány ve výpočtu výsledků. Tyto změny se berou následovně
do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace substrátu vzhledem k pokojové teplotě:
Pokojová teplota 14 oC - 18 oC
Pokojová teplota 19 oC - 23 oC
doba inkubace substrátu 18 min
doba inkubace substrátu 15 min
Pokojová teplota 24 oC - 30 oC
doba inkubace substrátu 12 min
Antigen: Jako zdroj antigenu slouží lyzáty sonikovaných s gama zářením ošetřených
tachyzoites Toxoplasma gondii.
Linearita: Linearita testu byla zkoumána pomocí série ředění sér pacientů s vysokými
hladinami koncentrací protilátek. Následující obrázek ukazuje typickou linearitu vzorků
zjištěnou na základě 4 sér pacientů. ELISA anti-toxoplasma gondii (IgG) vykazuje linearitu
měření v oblasti 1 až 500 IU/ml.
Detekční limit: Detekční limit pro anti-Toxoplasma gondii ELISA (IgG) je přibližně
0,5 IU/ml.
Klinický význam: Patogen způsobující toxoplasmosu je výtrusovec Toxoplasma gondii.
Poprvé byl nalezen v Gundi, africkém hlodavci. Hlavním zvířecím hostitelem je kočka, u
které žije parazit ve střevních buňkách, kde se vyvíjejí oocysty (pohlavní rozmnožovací
cyklus). Během nepohlavního rozmnožovacího cyklu se parazit vyvíjí v mozkových buňkách,
svalech, játrech, slezině a i dalších buňkách
teplokrevných živočichů, kde dochází
k zapouzdření. Lidé jsou většinou infikováni perorálně polknutím oocysty (obsažené ve
výkalech infikovaných koček) či z masných výrobků ( syrové maso infikovaných zvířat
obsahuje cysty s viditelnými trofozoity). Toxoplasma se přenáší také diaplacentálně, byla-li
těhotná žena předtím nakažena.
Toxoplasmosa získaná postnatálně probíhá většinou s méně zjevnými příznaky. V tomto
případě se tvoří ve tkáních cysty obsahující trofozoity, které zde mohou léta přetrvávat a
podporovat imunitní reakci. V závislosti na tom, ve kterém orgánu se vyskytují, se odvíjí i
klinický obraz nemoci, který je charakterizován teplotou, zduřením mízních uzlin,
encefalitidou, chorioretinitidou, myositidou, myokarditidou, pneumonií, hepatosplenomegalií
a exanthemem. V případě pacientů, kteří jsou imunologicky oslabení (příjemci transplantátů,
pacienti s rakovinou, HIV infekcí) primární infekce toxoplasmosou nebo reaktivace infekce
může vést k život ohrožujícímu onemocnění. Při infekci probíhající u plodu v děloze v prvním
trimestru, dojde k masivnímu zasažení placenty a embrya a nakonec k vypuzení fétu. Infekce
v druhém a třetím trimestru se projeví příznaky na zárodku, které mohou být různé
v závislosti na době vzniku infekce, masivnosti infekce a imunitního stavu matky a plodu.
Nejčastějšími příznaky jsou: hepatosplenomegalie, pneumonie, myokarditida, purpura,
hydrocefalus, choriorenitida, intracerebrální kalcifikace.