Standardizace v cytometrii

Standardizace v průtokové cytometrii
Hana Glier, Martin Špryngar
Konference Analytická cytometrie VII
Mikulov, 2013
Osnova
1. Standardizace měření - co a proč standardizovat
2. Platforma BD – CS&T modul
3. Platforma B.Coulter - FlowCheck+FlowSet
4. Standizace měření mezi cytometry / mezi laboratořemi – EuroFlow
přístup
1. Standardizace měření - co a proč standardizovat
Zpracování vzorku
Měření
Vzorek
Analýza dat
Interpretace dat
Závěr
Standardizace měření
Cíl standartizace: mít porovnatelná data v dlouhodobém
horizontu
• naměřená na jednom cytometru
• naměřená na různých cytometrech
• naměřená v různých laboratořích
Reprodukovatelnost dat
Standardizace měření
Výstupem měření není absolutní fyzikální veličina
Získaná hodnota fluorescence je úměrná nastavení fotodetektorů
1. Definice Cílových hodnot MFI
standard
2. Udržení cílových hodnot MFI
změnou PMTV
Definice Cílových hodnot MFI
• Poznej svůj cytometr! (lasery, filtry,…)
• Optimalizace pro konkrétní aplikace
• „Standard“ – kuličky (CS&T, FlowSet, 8-peak Rainbow,…)
• Definice cílových hodnot MFI – vlastní, „standardní“
(EuroFlow)
• Konfigurace cytometru, baseline (charakterizace cytometru)
• Udržuj cytometr v optimální kondici
Definice Cílových hodnot MFI
35895
• Standardní - externí
• Vlastní
32941
Udržení cílových hodnot MFI
• Zajištění reprodukovatelnosti měřených dat
změnou PMTV
• Automaticky - Platformy výrobců
(CS&T, FlowCheck+FlowSet)
• Manuálně – „monitoring“ (EuroFlow)
Data změřená dnes stejně jako za týden, měsíc, rok…
= porovnatelná data v dlouhodobém horizontu
Udržení cílových hodnot MFI
564 V
Den 1
396 V
403V
403V
564 V
Den x
554V
Den x
2. BD – CS&T modul v Diva6
CS&T beads
CS&T modul v Diva 6
+ Application Settings
1. Baseline = charakterizace cytometru
2. Performance Check = Denní kontrola kvality
• ∆PMTV nutná k zachování Cílových MFI
3. Application settings = Standardizace konkrétní aplikace
• PMTV (Instrument settings), při kterých jsou nastaveny
požadované Cílové MFI, modifikace pro danou aplikaci
Při každém změření CS&T Performance Check a použití
Application settings je PMTV automaticky změněno tak, aby
byly zachovány cílové hodnoty MFI
CS&T modul: Baseline = charakterizace cytometru
Laser delay – vzdálenost mezi lasery
Area scaling factors – 1/výška paprsku laseru
Qr = účinnost detekce signálu, kolik fluorochromu je potřeba k
vygenerování 1 fotoelektronu
Br = optické pozadí – množství světla bez fluorochromu
rCV - pro všechny CS&T kuličky a všechny detektory
Linearita signálu pro všechny detektory+elektroniku
Elektronický šum pro všechny detektory+elektroniku
PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu (10 x SDEN / 2.5 x SDEN )
CS&T modul: Baseline
CS&T modul: Baseline
= min PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu
10 x SDEN / 2.5 x SDEN
Baseline definuje okno pro optimalizaci
PMTV pro konkrétní aplikaci (setup)
šum
CS&T modul:
Performance Check = Denní kontrola kvality
Laser delay – vzdálenost mezi lasery
Area scaling factors – 1/výška paprsku laseru
Qr = účinnost detekce signálu, pro každý detektor
Br = optické pozadí, pro každý detektor
rCV - pro všechny CS&T kuličky a všechny detektory
∆PMTV nutná k zachování cílových MFI
Výraznější změny znamenají problém!
CS&T modul + Application Settings
= Setup experimentu a instrument settings pro konkrétní
klinickou aplikaci
PMTV (Instrument settings), při kterých jsou nastaveny
požadované Cílové MFI, uložit jako Application settings
Při každém změření CS&T Performance Check je PMTV
automaticky změněno = drží cílové hodnoty MFI
Použití templátu s aplikačními settings korigovanými dle CS&T
Zajištění standardizace měření v čase
2. B.Coulter – FlowCheck + FlowSet
není analogické k CS&T modulu
•
Baseline = charakterizace cytometru – pouze servis
•
Denní kontrola kvality = Flow-Check Pro Fluorospheres (BC)
= monitoring cytometru – Kontrola optického alignmentu
a fluidiky cytometru
Zaznamenává HPCV (CV), x-Mean (MFI)
Levey-Jennings graf v SW Navios: Mean ± 2SD
•
Standardizace = Flow-Set Pro Fluorospheres (BC)
B.Coulter: Denní kontrola kvality – Flow-Check Pro
Mean ±2SD
B.Coulter
Standardizace – Flow-Set Pro Fluorospheres
• Nastavení: FSC/SSC, MFI (FL intenzita)
• Nastavení cílových hodnot MFI + tolerance pro každé
instrument settings (Levey-Jennings graf)
• Automaticky nastaví PMTV, větší variabilita než CS&T
• Po změření ručně uložit nové settings (přepsat předchozí)
• Flow-Set settings nalinkovat k experimentu jako
„Cytosettings“
4. Stand. měření mezi cytometry / mezi laboratořemi
– EuroFlow přístup
•
Definice Cílových hodnot MFI
Standard 8-peak Rainbow beads
•
Udržení cílových hodnot MFI
Manuálně
Tolerance Cílové hodnoty MFI ± 15%, 8-peak Rainbow
pokud MFI v rozmezí, PMTV se nemění = monitoring
EuroFlow – Cílové hodnoty MFI (pro BD cytometry)
SPHERO Rainbow Calibration Particles (8 Peaks), 2 µm (Spherotech)
www.euroflow.org
EuroFlow – Cílové hodnoty MFI - 7th peak Rainbow
beads
Reprodukovatelnost dat a rozlišení
Udržení cílových hodnot MFI
Medián bright bead populace byl
umístěn do stejného FL kanálu =
Cílová hodnota MFI
Pokles sensitivity na suboptimálně
nastavených cytometrech
ovlivní více “Low Intensity” rozlišení
Standardizace dat měřených na různých cytometrech
•
Synchronizace cytometrů = cytometry měří stejně
= Definice Cílových hodnot MFI – vlastní, standardní
•
Reprodukovatelnost měřených dat
= Udržení cílových hodnot MFI změnou PMTV
Manuálně - EuroFlow
Automaticky
- CS&T + Application settings (BD)
- FlowSet (BC)
Synchronizace cytometrů
BD FACS Canto
488 nm solid state 20mW
633 nm HeNe 17mW
530/30 FITC
585/42 PE
670LP PerCP-Cy5.5
870/60 PE-Cy7
660/20 APC
780/60 APC-Cy7
18 bit (218 kanálů), fcs
B. Coulter Navios
488 nm solid state 22mW
638 nm solid state 25mW
405 nm solid state 40mW
525/40 FITC
575/30 PE
620/30 ECD
695/30 PE-Cy5.5
755 LP PE-Cy7
660/20 APC
725/20 Alexa Fluor 700
755LP APC-Cy7/APCA750/APC-H7
450/50 PacBlue
550/40 PacOrange
20 bit (220 kanálů), LMD
Jak udělat, aby cytometry měřily stejně?
NAVIOS
CD4 PE
CD4 PE
CANTO
CD3 FITC
CD3 FITC
Definice cílových hodnot MFI
35895
32941
Cílové hodnoty MFI dle EuroFlow pro BD cytometry a
po optimalizaci pro Navios
Synchronizace os
Synchronizace cytometrů dle EuroFlow
= porovnatelná data z Canto a Navios
FITC
PE
APC
APC-Cy7
PerCP-Cy5.5
CANTO
NAVIOS
PE-Cy7
Cytometry měří stejně
NAVIOS
CANTO + NAVIOS
CD3 FITC
CD3 FITC
CD3 FITC
CD4 PE
CANTO
Monitoring cílových MFI – 8-peak Rainbow (Navios)
EuroFlow : odchylka ± 15% od Cílových hodnot MFI
pokud MFI v rozmezí, PMTV se nemění = monitoring
2
2
PE (FL2)
PacBlue (FL9)
PE (FL2) MFI x 100000 RB/7 peak
PE (FL2) HPCV RB/7 peak
1
1
PB (FL9) MFI x 1000000 RB/7 peak
PB (FL9) HPCV RB/7peak
121017
121011
121009
121003
120926
120921
120917
120912
120907
120903
120829
120824
120820
120815
120810
120806
120801
120727
120723
120723
120727
120801
120806
120810
120815
120820
120824
120829
120903
120907
120912
120917
120921
120926
121003
121009
121011
121017
0
0
2
APC (FL6)
APC (FL6) MFI x 1000000 RB/7 peak
APC (FL6) HPCV RB/7 peak
Stabilita PE, APC, PacBlue – 3 měsíce
1
121017
121011
121009
121003
120926
120921
120917
120912
120907
120903
120829
120824
120820
120815
120810
120806
120801
120727
120723
0
SPHERO Rainbow Calibration Particles (8 Peaks), 2 µm (Spherotech)
Standardizace CANTO vs. NAVIOS v praxi
Standardizace – schéma testování
Kdy provést?
Po
Změna Servis,
Měsíčně Změna
Denně
instalaci
optiky alignment
reagencií
cytometru
(tandemy)
Baseline
x
x
(X)
Denní kontrola
cytometru
X
X
X
Kompenzace
X
X
x
x
x
Kontrola gates
(FMO)
x
x
x
x
x
x
Kompenzace
Stejné MFI = stejná pozice = stejná kompenzace
Den 1
Instrument Setup
+ kompenzace
PE
Den x
Změna PMTV (stejné MFI)
+ stejné kompenzace
PE
single pozitivní
single pozitivní
double pozitivní
double pozitivní
=
double negativní
single pozitivní
FITC
double negativní
single pozitivní
FITC
Kompenzační matice se nemění, dokud se nezmění fluorochrom
(tandemy!) nebo cytometr (filtry)
Děkuji za pozornost