Biochemici - severní Evropa

OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
Historie biochemie
KBC/HIBC
prof. Mgr. Marek Šebela, Ph.D.
LS 2014/2015
Biochemici ze severní Evropy
Emil Christian Hansen
(*8. 5. 1842, Ribe - †27. 8. 1909, Hornbæk)
byl dánský botanik, mikrobiolog, mykolog
a fyziolog, který se zabýval procesem
kvašení v pivovarnictví. Je znám pro svůj
objev izolace čistých kultur kvasinek.
Vyrůstal v Ribe (jižní Dánsko) ve
skromných poměrech. Otec Joseph
Christian byl malířem pokojů, matka se
jmenoval Ane Cathrina. Otcův život byl
dobrodružný, putoval po jižním Německu
a v roce 1830 vstoupil do Cizinecké legie,
bojoval v Alžírsku a ve Španělsku,
účastnil se povstání ve Francii.
E. C. Hansen se učil prodavačem, ale později se věnoval malířství. Náhodou
získal místo učitele a vychovatele správce zámku Holsteinborg. Dělal
učitelské zkoušky („Artium”) a zdokonaloval se v přírodních vědách, hlavně
botanice. Vzdělával se též na Technické univerzitě, studia se stipendiem
ukončil v roce 1869. Aby si přivydělal, psal v té době novely pod
pseudonymem E.C. Další studia absolvoval na Kodaňské univerzitě.
Získal místo asistenta u profesora Japeta Steenstrupa a věnoval se studiu
rašelinišť. V roce 1876 získal ocenění (zlatou medaily Kodaňské univerzity)
za práci o houbách. Fyziolog, profesor Peter Ludvig Panum, navrhl, aby
společně studovali proces fermentace. V té době hledal ředitel pivovaru
Nový Carlsberg, Carl Jacobsen, někoho pro každodenní mikroskopické
pozorování piva. V roce 1877 se uvolnilo místo vedoucího Oddělení
fyziologie v Carlsberské laboratoři v Kodani-Valby, založené r. 1876
Jacobem Christianem Jacobsenem, zakladatelem pivovaru Carlsberg
(1847). Hansen získal svolení v laboratoři pracovat, zde dokončil disertaci,
kterou obhájil v roce 1879. V té době už byl vedoucím Oddělení fyziologie.
V roce 1880 se oženil s Mathildou Melchiorovou.
Hansen znal práci Louise Pasteura (1822-1895) a protože mikrobiální
kontaminace často znamenala ztráty v pivovarnictví („nemocné pivo”),
usiloval o získání čistých kultur pivovarských kvasinek. Odhadl obsah
kvasinek v pivu a pak prováděl sériová ředění vzorku piva, aby se dostal ke
koncentraci 0.5 buňky/ml piva. Alikvoty (1 ml) tohoto ředění pak inokuloval
baňky obsahující mladinu. Po týdnu inkubace našel v některých baňkách
jedinou kolonii, někde více či žádnou. Odtud dospěl k úvaze, že je možné
získat kolonii, která je odvozena od jediné buňky. Tento předpoklad
testoval na směsi různých kvasinek a získal kultury jednotlivých typů.
Hansen také zavedl kultivaci na pevném médiu (želatině), jako to vymyslel
Robert Koch (1843-1910) u baktérií. To mu umožnilo charakterizaci
kontaminujících kmenů.
V roce 1883 ohlásil Hansen svůj objev izolace čistých kvasinkových kultur
a v pivovaru Starý Carlsberg byly tyto vyzkoušeny pro výrobu piva. Tato
událost je považována za jeden z milníků průmyslové revoluce, od té doby
se S. cerevisiae carlsbergensis používají v pivovarech po celém světě.
Hansen objevil nové druhy kvasinek (jeho jméno nese methylotrofní
kvasinka Hansenula polymorpha – nově Pichia angusta, z rodiny
Saccharomycetaceae. Zkoumal také vztah mezi kvasinkami horního a
spodního kvašení a zjistil, že se jedná o dvě fyziologické formy.
Z knihy The Carlsberg Laboratory (1976)
Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl
(*16. 8. 1849 – †18. 7. 1900)
Kjeldahlovo jméno (dánský chemik) je známé
pro objev metody stanovení dusíku v
organickém materiálu (1883).
Narodil se v Jægerspris na otrově Sjæland,
jako syn lékaře. Studoval na katedrální škole
v Roskilde a v roce 1873 ukončil studium na
Technické universitě. Stal se pak asistentem
v chemické laboratoři na Veterinární a
zemědělské univerzitě. Prostřednictvím svého
šéfa C. T. Barfoeda se setkal s J. C.
Jacobsenem
a
získal
zaměstnání
v
Carlsberské laboratoři (1. 5. 1875).
Od 1. 10. 1876 se stal vedoucím Oddělení chemie tamtéž, ve funkci pak
setrval téměř 25 let. V roce 1892 se stal profesorem, 1894 získal čestný
doktorát kodaňské univerzity a v r. 1898 se stal Rytířem Dannebrogu. Ke
konci života trpěl vyčerpáním a depresemi, léčil se pobyty v jižní Evropě a
Norsku, zemřel náhodně během plavání, zřejmě na mozkovou trombózu.
Kjeldahl přišel na svoji metodu díky studiu metabolismu proteinů během
klíčení ječmene a alkoholové fermentace. Vycházel z prací J. A. Wanklyna
J. A. Wanklyn použil k rozkladu organického
materiálu hydroxid draselný a manganistan. Dusík z
proteinů se takto uvolňoval ve formě amoniaku pouze
částečně, zatímco amidy a aminy se převáděly
kvantitativně.
James Alfred Wanklyn
(1834 –1906)
Kjeldahl použil oxidaci v kyselém prostředí.
Nejdříve zkoušel zředěnou kyselinu a nakonec
koncentrovanou H2SO4, zahřívání k bodu varu a
oxidaci manganistanem. Zdlouhavé bylo vymyslet
praktické provedení a standardizovat metodu
(jodometrické
stanovení
amoniaku).
Metoda
umožnila dokázat, že v proteinech nejsou
azoskupiny, nitro- nebo nitrososkupiny.
Po zdokonalení metody stanovení dusíku se Kjeldahl již dále metabolismu
proteinů nevěnoval s výjimkou předběžných studií proteolytických enzymů.
Zabýval se rozmanitou metodikou, např. stanovením složek piva a mladiny
(extrakt, alkohol, ..) pro technickou standardizaci. Dostal se i ke studiu
enzymů biosyntézy sacharidů, kvantitativnímu stanovení cukrů ve směsi a
extrakci proteinů z ječmene.
Kjeldahl J. (1883) Neue Methode zur
Bestimmung des Stickstoffs in organischen
Körpern. Zeitschrift für Analytische Chemie,
366–382
Kjeldahlova metoda stanovení dusíku v organických sloučeninách
rozklad vzorku: vzorek + H2SO4 → (NH4)2SO4(aq) + CO2(g) + SO2(g) + H2O(g)
uvolnění amoniaku: (NH4)2SO4(aq) + 2NaOH → Na2SO4(aq) + 2H2O(l) + 2NH3(g)
záchyt amoniaku: B(OH)3 + H2O + NH3 → NH4+ + B(OH)4–
titrace: B(OH)3 + H2O + Na2CO3 → NaHCO3(aq) + NaB(OH)4(aq) + CO2(g) + H2O
Max Henius
(1859-1935)
Henius byl dánský pivovarník a biochemik
působící ve Spojených státech. Narodil se v
Alborgu. V l. 1877-1880 studoval chemii na
Polytechnické škole v Hannoveru a v r. 1881 získal
doktorát v Marburgu. Pak odjel do Ameriky, kde
vystřídal různá zaměstnání. Spolu s Robertem
Wahlem založil v Chicagu firmu pro chemické
analýzy a konzultace, ze které později vznikl
Wahl & Henius Fermentologický ústav s
pivovarnickou školou, který díky patentům,
metodice a psaným manuálům výrazně ovlivnil
vývoj amerického pivovarnictví.
Stal se veřejnou osobností, odmítl se ale angažovat v politice, naopak se
věnoval práci pro dánské krajany ve Státech a posiloval vazby s Dánskem
(Vytvoření dánskoamerické společnosti v r. 1906). Po zorganizování sbírky
mohla být americkými Dány zakoupena plocha 80 ha lesa v kopcích Rebild v
severním Jutsku jako národní park. Přispěl také k uskutečnění plebiscitu v
jižním Jutsku po I. světové válce. Na světové výstavě v Chicagu v r. 1933
uspořádal prezentaci dánské vědy. Atlantik přeletěl 80x, zemřel během
pobytu v Dánsku.
Søren Peter Lauritz Sørensen
(*9. 1. 1868 – †12. 2. 1939)
Narodil se v Havrebjergu u Slagelse. Otec
Hans byl farmářem. Absolvoval chlapeckou
školu Soro Akademi (1886), nejdříve
studoval medicínu a posléze chemii, kterou
ukončil v roce 1891. Při studiu si přivydělával
jako doučovatel a dále prací pro geologický
průzkum. V letech 1892-1901 byl asistentem
na Technické univerzitě v laboratoři u prof.
S. M. Jørgensena a byl též chemickým
konzultantem v loděnicích Královského
námořnictva. V l. 1901-1938 byl vedoucím
Oddělení chemie v Carlsberské laboratoři.
Na Tech. univerzitě se věnoval např. studiu analytických standardů, stanovení chloru a soli v mořské vodě (1902). V Carlsberské laboratoři se
věnoval čtyřem hlavním směrům: a) syntéza aminokyselin, b) analytické
studie, c) výzkum na téma koncentrace protonů, d) studium proteinů.
Pro syntézu aminokyselin (od r. 1902) využíval Gabrielova postupu s
ftalimidem draselným. Připravil tak např. ornithin, prolin, arginin.
V letech 1903-1905 (spolu s C. Pedersenem a A. C. Andersenem) studoval
Kjeldahlovu metodu stanovení dusíku, kterou obhajoval proti kritikům.
V letech 1907-1910 se věnoval formolové titraci (spolupracovníci H. JessenHansen a V. Henriques). Byla to první skutečně kvantitativní metoda pro
sledování proteolytického štěpení:
RCH(NH2)COOH + HCHO + KOH → RCH(NHCH2OH)COOK + H2O
V pozdější práci „Studies on enzymes II“ se zabýval elektrochemickou
metodou stanovení koncentrace protonů, přípravou standardních roztoků
pro míchání pufrů o definované hodnotě pH, kolorimetrickou metodou
měření pH a posléze jejich aplikací pro studium enzymů. Popsal pH závislosti
aktivity invertasy, katalasy a pepsinu.
Sørensen se dále věnoval izolaci a fyzikální chemii ovalbuminu, protein byl
rovněž připraven v krystalické formě. Studován byl i osmotický tlak roztoků
ovalbuminu. V odbobí po 1. světové válce se zabýval rozpustností proteinů.
Ovalbumin je hlavní protein vaječného bílku (60-65% obsahu). Jeho funkce
dosud není známá, předpokládá se, že jde o zásobní protein. Je homologní s
rodinou serpinů avšak neinhibuje serinové proteasy. Má signální sekvenci na
N-konci (zbytky 21-47, neodštěpuje se), je acetylovaný na N-konci,
fosforylovaný na dvou místech a N-glykosylovaný na jednom místě.
Theodor H. E. ("The") Svedberg
(*30. 8. 1884 – †25. 2. 1971)
Svedberg byl švédský chemik a laureát
Nobelovy ceny za chemii v r. 1926. Studoval na
univerzitě v Uppsale, kde získal Ph.D. v r. 1908.
V r. 1905 získal místo asistenta na chemickém
ústavu a od r. 1907 učil chemii. V r. 1912 získal
pozici profesora fyzikální chemie, v r. 1949 pak
skončil jako emeritní profesor. Jeho odborná
práce se týkala koloidů a makromolekulárních
sloučenin. Jeho výsledky podpořily teorie
Brownova pohybu navržené A. Einsteinem
(1879-1955) a M. Smoluchowskim (1872-1917)
a potvrdili existenci molekul. S týmem
spolupracovníků studoval fyzikální vlastnosti
koloidů (difúze, absorpce světla, sedimentace).
Pro studium sedimentace zkonstruoval známou ultracentrifugu, s jejíž
pomocí analyzoval proteiny a jiné polymery. Demonstroval použití centrifugy
pro důkaz nehomogenity vzorku (kontaminanty). Nakonec se zabýval
problematikou jaderné chemie a radiační biologie. Je po něm pojmenovaná
jednotka Svedberg (10-13 s, 100 fs) stejně jako Svedbergova lab. v Uppsale.
Carl Peter Henrik Dam
(*21. 2. 1895 - †17. 4. 1976)
Dam byl dánský biochemik a fyziolog. V r.
1943 získal spolu s Edwardem Doisym (18931986) za objevitelskou práci na vitamínu K a
jeho roli v lidské fyziologii. Narodil se v
Kodani v rodině lékárníka a učitelky.
Absolvoval chemii na polytechnice v r. 1920.
Získal postupně asistentská místa v Kodani. V
r. 1925 studoval mikroanalýzu ve Štýrském
Hradci u Fritze Pregla (1869-1930). V r. 1929
se stal docentem na univerzitě v Kodani, v r.
1934 získal Ph.D. Díky Rockefellerově
stipendiu pracoval ve Freiburku (1932-1933)
a Curychu (1935). Vitamín K objevil v Kodani
při studiu metabolismu cholesterolu u kuřat.
Studoval výskyt, biologickou funkci u zvířat a člověka, fyzikálně-chemické
vlastnosti, izolaci. Spolupracoval s nobelistou Paulem Karrerem (18891971). V l. 1940-1941 byl na přednáškovém turné v Kanadě a USA. V l. 19421945 byl vědeckým pracovníkem na univerzitě v Rochesteru, N.Y.
Během nepřítomnosti byl Dam jmenován profesorem biochemie (1941), v r.
1950 pozice změněna na profesuru biochemie a výživy. Po návratu do
Dánska v r. 1946 se zabýval vitamíny K a E, tuky, cholesterolem,
nutričními studiemi ve vztahu k tvorbě žlučových kamenů. V l. 1956-1962
byl vedoucím biochemického oddělení na Danském výzkumném ústavu tuků.
V roce 1929, zjišťoval roli cholesterolu tak, že krmil kuřata potravou
ochuzenou o tuto látku. To přivodilo pokusným zvířatům po několika
týdnech vnitřní krvácení – léze pod kůží, krvácení nešlo zastavit
přidáváním samotného cholesterolu. Protože symptomy připomínaly
kurděje, zkusil i vitamín C, avšak bez úspěchu. Kromě cholesterolu musela
být přidávána do potravy látka. které se pak začalo říkat koagulační
vitamín nebo vitamin K (písmeno K odvozené z německého „Koagulation“,
výsledky byly poprvé publikovány v německém časopise).
Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang
(*29. 11. 1896 – †25. 5. 1959)
Tento dánský biochemik je znám pro definování
proteinové struktury na čtyřech úrovních:
primární, sekundární, terciární a kvarterní.
Narodil se na předměstí Kodaně (Frederiksberg) do učitelské rodiny. Jeho teta Theodora
dokonce založila školu v Silkeborgu, která nese
její jméno. Po matce zdědil umělecké nadání.
Známí rodičů pocházeli z akademických kruhů.
Jeho otec zemřel náhle, když mu bylo 15, o
devět let později zemřela i matka. V 17ti
letech začal Lang studovat chemii na
Technické universitě.
Chemie ho tehdy příliš nebavila, spíše se věnoval umění, např. psaní
dramatických kusů. Se studiem měl ke konci problémy, nicméně absolvoval
školu v roce 1919. Pak získal první místo chemika v zemědělském výzkumném
ústavu, ale záhy se stal asistentem v Oddělení chemie v Carlsberské
laboratoři a pracoval u S. P. L. Sørensena.
V poválečné krizi se věnoval především přípravě nedostupných sloučenin.
Sørensen měl bezesporu velký vliv na jeho vědecké směřování k biochemii.
Jeho první publikace se Sørensenovými z roku 1921 se zabývala použitím
chinon-hydrochinonové elektrody pro měření pH.
Věnoval se pak především fyzikální chemií a matematickými pozadím teorie
chemických procesů. V roce 1923 se objevila Debye-Hückelova teorie
elektrolytů („iontová atmosféra“), na jejímž základě Lang publikoval
klasickou práci o ionizaci proteinů. Zde ukázal, že titrační křivky proteinů
jsou ovlivněny iontovou silou v roztoku.
Doktorát obhájil v roce 1928 v souvislosti s frakcionací proteinů
(heterogenita kaseinu). Vypracoval v té době i postup stanovení
aminoskupin titrací v acetonu s naftylovou červení jako indikátorem,
vhodnou pro měření aktivity proteolytických enzymů.
Jedním z Langových objevů v souvislosti s proteolytickými enzymy bylo
zjištění, že štěpení nezávisí na délce řetězce, ale na konfiguraci substrátu,
tedy že např. neexistuje nespecifická dipeptidasa. V roce 1937 publikoval
práce o použití tzv. kartézského potápěče („Cartesian diver“) pro
mikrogasometrická měření.
Také se zabýval metodikou měření specifické váhy
(relativní hustoty) malých kapiček kapaliny vznášejících
se v kapalném médiu (organika) o gradientu hustoty.
Využití: měření enzymových reakcí, které vedou ke
změně specifické váhy substrátu. Mnohem citlivější
měření než titrace (100x)
Definování úrovní struktury proteinů (primární, sekundární, ….) proběhlo v
Langově přednášce na Stanfordově universitě v roce 1951.
Lang se v poslední fázi vědeckého života věnoval studiu isotopové výměny
proton/deuterium s cílem popsat faktory, které stabilizují sekundární a
terciární strukturu proteinů. K výměně isotopů vodíku dochází na přístupných
–OH a –NH- skupinách v proteinech. Lze takto sledovat strukturní změny
např. v souvislosti s denaturací. Tímto to způsobem můžeme popsat vodíkové
atomy v peptidové vazbě, které se podílejí na tvrobě sekundární struktury.
Lang měřil koncentraci deuteria sledováním mikrokapiček v gradientové
trubici za účelem určení rychlosti výměny za rozmanitých experimentálních
podmínek.
Langovým nást. byl Martin Ottesen (vedoucí Oddělení chemie Carlsberské
laboratoře v l. 1959-1987), nar. 1920. Ve vědecké kariéře se věnoval
především studiu proteolytických enzymů. Při rekrystalizaci ovalbuminu na
konci 40. let si povšiml netypického tvaru krystalů určitého vzorku. Později
zjistil, že příčinou byla kontaminace vzorku baktérií Bacillus subtilis, která
vylučuje serinovou proteasu subtilisin. Působením této proteasy došlo k
limitované proteolýze ovalbuminu za vzniku plakalbulminu s odlišnými
vlastnostmi vůči původnímu ovalbuminu. Později objevil několik odlišných
variant subtilisinu v závislosti na produkujícím kmeni B. subtilis.
Einar Lundsgaard
(1899-1968)
Lundsgaard, E.: Biochem. Z. 1930; 217: 162-177.
Lundsgaard byl dánský fyziolog známý pro práci z
r. 1930, kdy ukázal, že svalové kontrakce nezávislé
na průběhu glykolýzy lze provést na úkor
defosforylace kreatinfosfátu. Přínos této práce
byla dále rozvinut Hermanem Kalckarem (19081991) a Fritzem Albertem Lipmannem (18991986). Oba v roce 1941 nezávisle představili teorii
makroergické vazby a načrtli roli ATP jako
univerzálního zdroje energie pro biochemické
reakce. Lundsgaard byl profesorem fyziologie na
univerzitě v Kodani v l. 1934-1967.
Pokusy v Lundsgaardově laboratoři ukázaly, že žabí sval otrávený
jodacetátem, který není schopen glykolýzy (štěpení glukózy na kyselinu
mléčnou), může provádět omezený počet kontrakcí. Ukázalo se, že tyto
kontrakce proběhnou díky defosforylaci kreatinfosfátu, který objevil a
charakterizoval jen o pár let dříve americký biochemik Cyrus H. Fiske
(1890-1978) na lékařské fakultě Harvardu (1927).
Conrad Arnold Elvehjem
(*27. 5. 1901- †27. 7. 1962)
C.A. Elvehjem byl americký biochemik s norskými kořeny. Narodil se ve Wisconsinu.
Absolvoval Wisconsinskou universitu v
Madisonu, kde získal titul Ph.D. v roce 1927.
V roce 1937 nalezl v čerstvém mase a
kvasinkách vitamín, nyní zvaný niacin. Jeho
objev vedl k léčbě nemoci zvané pelagra.
Po absolutoriu získal stipendium pro pobyt
na univerzitě v Cambridge. V roce 1936 se
stal profesorem, v roce 1944 vedoucím
katedry biochemie, v roce 1946 pak
děkanem. Konečně se v roce 1958 stal
rektorem Wisconsinské university.
Vědecky pokračoval v práci Josepha Goldbergera (rodák ze Slovenska)
věnované pelagře, tehdy endemické chorobě na jihu USA. Objevu niacinu
předcházelo zjištění, že faktor z filtrátu jater léčí pelagru u kuřat a
ověření léčebných účinků při nemoci černého jazyka u psů vyvolané
krmením kukuřicí. Původně byl na počest Goldbergera nazván vitamín G.
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius
(*10. 8. 1902 – †29. 10. 1971)
Tiselius se narodil ve Stockholmu. Po smrti
otce se rodina přestěhovala do Göteborgu.
Po absolvování gymnázia v r. 1921 studoval
chemii na univerzitě v Uppsale, zajímal se o
fyzikální chemii a biochemii. V r. 1925 se
stal pomocnou vědeckou silou u Thea
Svedberga (1884-1971), kdy se podílel na
vývoji ultracentrifugy (metoda měření
indexu lomu). Věnoval se však dále
elektroforéze,
zjistil
nehomogenitu
preparátů,
které
se
zdály
i
v
ultracentrifuze být homogenní. V r. 1930
obhájil doktorát (elektroforéza proteinů,
metoda pohyblivého rozhraní).
Po obhajobě se věnoval studiu zeolitů, které ztrácejí krystalovou vodu bez
ovlivnění struktury, „prázdný“ krystal funguje jako molekulové síto. Zeolity
sbíral na Faerských ostrovech a do r. 1935 publikoval řadu prací na téma
difuse a adsorpce v přírodních zeolitech. V l. 1934-1935 pobýval na stáži v
Princetonu v laboratoři Hugha Stotta Taylora (1890-1974) díky stipendiu
Rockefellerovy nadace.
Vlivem setkání a diskusí s mnoha vědci (Landsteiner, Michaelis, Northrop,
Anson) se po návratu do Uppsaly znovu věnoval elektroforéze, zejména pro
separaci proteinů. Metodu postupně značně zdokonalil. Pro detekci zavedl
měření indexu lomu, vhodnější než UV absorpce. Vzorek krevního séra
rozdělil na frakci albuminu, α-, β- a γ-globulární frakci (1937). Tehdy článek
nepřijali v biochemickém časopise, zdál se jim příliš fyzikální. Edwin Joseph
Cohn (1892-1953) si objednal Tiseliův přístroj! V r. 1937 získal Tiselius
sponzorovanou profesorskou pozici. Teprve v r. 1946 byl založen Biochemický
ústav na Přírodovědecké fakultě univerzity v Uppsale, který Tiselius dlouho
vedl (do r. 1968), od r. 1952 v nové samostatné budově.
Během války se věnoval např. adsorpční chromatografii. Tiselius a spol. byli
švédským výrobcem cukru požádáni o identifikaci původce kontaminovaného
řepného extraktu tvořícího sliz ucpávající filtry při rafinaci. Potvrdili
Leuconostoc mesenteroides produkující dextran. Při hledání specifické reakce
pro dextran zjistili, že imunizovaným králíkům se proti němu netvoří
protilátky - farmaceutické použití jako náhražka plazmy. Tím začala
spolupráce firmy Pharmacia s ústavem. V r. 1948 obdržel Tiselius Nobelovu
cenu za chemii za práci na vývoji elektroforézy a za prokázání heterogenní
povahy proteinů krevního séra. Jeho žák Stellan Hjertén (*1928) vypracoval
použití agarosových gelů pro elektroforézu. Podílel se též na zavedení
hydroxyapatitu jako nosiče pro proteinovou chromatografii.
Zajímavá je historie objevu gelové permeační chromatografie. Laboranti
naplnili kolonu pro elektroforézu zesíťovaným dextranem. Zapomněli pustit
proud, přesto došlo k separaci vzorku. Klíčové pak byly práce Poratha a
Flodina, Hjertén později navrhl používání agarosy a polyakrylamidu.
Záležitost byla podkladem pro další spolupráci s firmou Pharmacia. Další
práce Poratha vedly k přípravě funkcionalizovaného dextranu, např.
dextranových iontoměničů.
Tiselius se aktivně podílel na poválečném vývoji švédské vědy jako člen
národní poradní, byl také prezidentem Mezinárodní unie čisté a aplikované
chemie (IUPAC, 1951-1955) a konečně předsedou rady pro Nobelovu nadaci
(1960–1964). Získal mnoho ocenění a čestných doktorátů.
Axel Hugo Theodor Theorell
(*6. 7. 1903 – †15. 8. 1982)
Narodil se v Linköpingu. V r. 1921 začal
studovat
medicínu na Ústavu Karolinska
(KU). V r. 1924 se stal bakalářem medicíny a
pak absolvoval tříměsíční pobyt na Pasteurově
ústavu v Paříži, kde se věnoval bakteriologii u
A. Calmetteho (1863-1933). V roce 1930
získal titul doktora medicíny za práci o
lipidech v krevní plazmě a získal místo
profesora fyziologické chemie. V r. 1932
získal místo docenta na univerzitě v Uppsale.
V l. 1933-1935 pobýval díky Rockefellerově
stipendiu u Otto H. Warburga (1883-1970)
v Berlíně-Dahlemu.
Po návratu se stal v r. 1936 šéfem biochemického oddělení na nově
založeném Nobelově medicínském ústavu při KU, který se přesunul do
nové budovy v r. 1947. Theorell získal v r. 1955 Nobelovu cenu za fyziologii
a medicínu za objevy, které se týkaly podstaty a mechanismu působení
oxidoreduktas.
Jak již bylo zmíněno, jeho první výzkum se týkal vlivu lipidů na sedimentaci
krvinek. V r. 1931 určil molekulovou hmotnost myoglobinu s pomocí
centrifugy. V Berlíně-Dahlemu vyizoloval Theorell poprvé enzym z kvasinek,
známý jako „žlutý oxidační ferment“ (též „starý žlutý enzym“, OYE) a
dokázal reverzibilně oddělit jeho koenzym od bezbarvého proteinu. Tehdy
šlo o první identifikovaný flavoenzym.S OYE se také pojí objev biochemické
role vitamínu. Theorell prokázal migrací při elektroforéze, že žlutý koenzym
(flavinmononukleotid) má záporný náboj na rozdíl od podobného, ale
elektroneutrálního vitamínu B2 (riboflavin).
Na charakterizaci OYE pokračoval Theorell ve své laboratoři i řadu let
poté. V 50. letech byla např. zvládnuta jeho krystalizace. Velký přínos pro
strukturně-funkční charakterizaci enzymu měl později Viktor Massey.
Enzym objevili O. Warburg a W. Christian v r. 1932, kteří si povšimli
skutečnosti, že OYE uzavíral tvorbou peroxidu vodíku in vitro repirační
dráhu vedoucí od glukosa-6-fosfátu k 6-fosfoglukonolaktonu. Dodnes však
neznáme skutečnou fyziologickou roli OYE, jeho substráty jsou α/βnenasycené aldehydy a ketony (cyklohexanon, durochinon, menadion),
inhibitorem je např. testosteron nebo p-hydroxybenzaldehyd.
Theorell studoval také cytochrom c, peroxidasy, katalasy, flavoproteiny a
enzymy s pyridinovými kofaktory zvláště alkoholdehydrogenasy.
Theorell také purifikoval cytochrom c. Ze 100 kg koňského srdce lze získat
3-4 gramy čistého proteinu. V r. 1938 ukázal, že porfyrinová část
cytochromu je připojena k proteinu prostřednictvím původně vinylových
skupin, které se přeměnily na thioetherové reakcí s cysteiny.
Herman Kalckar
(*26. 3. 1908 – †17. 5. 1991)
Kalckar byl dánský biochemik, který byl
průkopníkem studia buněčné respirace. Je tak
považován za zakladatele bioenergetiky, přispěl
novými metodami k rozvoji enzymologie, ke
studiu metabolismu galaktosy. Pocházel z
židovsko-dánské intelektuální rodiny. V r. 1933
ukončil studium medicíny na univerzitě v Kodani
a pak začal pracovat u fyziologa Einara
Lundsgaarda (1899-1968). Mentorem v Kodani
byl také F. Lipmann (1899-1986). S ním pak
později nezávisle postuloval roli ATP jako
makroergické sloučeniny. Převratným výsledkem
Kalckarovy práce bylo zjištění, že fosforylovace
organických sloučenin během metabolismu byla
spojena se spotřebou kyslíku.
„Aerobní fosforylace“, dnes nazývaná oxidační fosforylace tedy
demonstrovala (studium degradace sacharidů) propojení mezi oxidací
sacharidů a fosforylací a roli fosfátu jako spojení mezi anabolismem a
katabolismem.
Díky Rockefellerově stipendiu pobýval na ústavu Caltech v USA (od r. 1939).
Přitom navštívil laboratoř Coriových v St. Louis. V Pasadeně se setkal např. s
L. Paulingem a M. Delbrückem. V té době napsal přehledný článek o
energetickém metabolismu. Kalckar zde mluvil o makroergických
sloučeninách a jejich významu, zejména o centrální roli ATP. Současně
takovou práci napsal i F. Lippman.
Později Kalckar přesídlil do St. Louis, kde získal místo na Washingtonově
univerzitě. V r. 1942 zde s Sydneyem P. Collowickem (1916-1985) pracoval
na adenylátkinase, kterou purifikovali ze svalových extraktů. V další práci
na metabolismu nukleotidů našel nukleosidfosforylasu, klíčový enzym
recyklační dráhy („salvage pathway“). Tímto se více specializoval na studium
jednotlivých enzymů a jejich izolaci.
Na pozvání Olivera Lowryho (1910-1996) přešel do New York Public Health
Institute jako vědecký pracovník. Zde na spektrofotometru vyvinul řadu
postupů pro měření enzymových aktivit. Zabýval se dále enzymy
metabolismu purinů.
2 ADP =ATP + AMP
nukleosid + fosfát = purin + alpha-D-ribosa-1-fosfát
"With best wishes to our friend Herman Kalckar", Carl and Gerty Cori
Pehr Victor Edman
(*14. 4. 1916 – †19. 3. 1977)
Edman byl švédský biochemik, který vyvinul
metodu sekvencování proteinů zvanou
Edmanova degradace. Narodil se ve
Stockholmu, od r. 1935 studoval medicínu
na ústavu Karolinska, kde ho začal zajímat
základní výzkum. Po službě ve švédské
armádě během války školu dokončil v r.
1946. V době, kdy začal pracovat na
angiotensinu se o proteinech vědělo, že
mají definovanou molekulovou hmotnost,
náboj a strukturou. To ho inspirovalo k
vývoji metody pro sekvenční analýzu. V r.
1947 získal stipendium pro pobyt v
Rockefellerově ústavu pro medicínský
výzkum při univerzitě v Princetonu.
Když se v r. 1950 se vrátil do Švédska, stal se odborným asistentem na
univerzitě v Lundu. V témže roce publikoval i první práci o použití PITC. Až
do smrti neustále zdokonaloval svůj postup pro delší řetězce a menší
množství vzorku.
fenylthiohydantoin
V r. 1957 se přestěhoval do Austrálie, kde byl v Melbourne ředitelem
Univerzity sv. Vincence pro medicínský výzkum. Zde v r. 1967 vyvinul první
automatický proteinový sekvenátor, spolu s asistentem Goeffreyem
Bergem.
V r. 1972 se přesunul od Ústavu Maxe Plancka pro biochemii v Martinsriedu
u Mnichova. Pracoval zde se svou druhou ženou Agnes Henschen-Edman,
která použila jeho metodu pro určení sekvence fibrinogenu (spolu s F.
Lottspeichem), publikace z konce 70. let 20. stol.
Jerker Porath
(*23. 10. 1921)
Porath je švédský biochemik, který je znám
pro objevy z oblasti separace biomolekul.
Studoval na univerzitě v Uppsale a
zpočátku se věnoval organické chemii. Po
stipendiu v Heidelberku se přiklonil k
biochemii a působil na biochemii u Arna
Tisselia (1902-1971). V l. 1951-1952 byl na
výzkumném pobytu v Kalifornii (Berkeley) u
Choa Hao Li (1913-1987) v laboratoři
studia hormonů. Po návratu do Uppsaly
vyvinul metody pro purifikaci hormonů
pomocí zónové elektroforézy a iontoměničové chromatografie.
V r. 1957 získal Ph.D. Nejznámnější z jeho separačních metod je gelová
filtrace, kterou vypracoval s Petrem Flodinem (1924-2006), který
pracoval jako výzkumný chemik u společnosti Pharmacia. V r. 1957 Porath
zjistil, že dextran z Pharmacie je použitelný jako molekulové síto vhodné
pro separaci biomolekul podle velikosti. Objev byl patentován a publikován
v časopise Nature. Krátce nato začal být prodáván Sephadex (Separation
Pharmacia Dextran)
Porath také pracoval na afinitní chromatografii a stal se profesorem na
univerzitě v Uppsale.
Sephadex je zesíťovaný dextranový gel. Frakcionační vlastnosti gelu lze
měnit změnou stupně zesíťování. Prodává se ve formě kuliček. Dextran je
komplexní rozvětvený polysacharid – glukan skládající se z mnoha
glukosových jednotek. Řetězce mají rozmanitou velikost (3-2000 kDa).
Lineární řetězec má α-1,6 vazby, větvení je vazbami α-1,3. Dextran
vzniká ze sacharosy působením baktérií mléčného kvašení (např.
Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans, Lactobacillus brevis).
Tvoří se také v zubním plaku. Poprvé byl popsán Luisem Pasteurem (18221895) jako mikrobiální produkt ve víně.
Používá se také v lékařství pro
antitrombotický účinek (vazbou na
erytrocyty,
destičky
a
cévní
endothel), snižování krevní viskozity
a jako objemový
expandér při
anémii či nouzových situacích při
ztrátě krve.
Klenow H a Henningsen I (1970). PNAS 65 (1): 168–175
Hans Klenow
(*17. 2. 1923 – †21. 2. 2009)
Klenow byl dánský biochemik, který studoval
nukleové kyseliny. Biochemii absolvoval v r.
1949, v l. 1964-1990 působil jako profesor
biochemie na univerzitě v Kodani. Pracoval v
laboratoři Otto Warburga (1883-1970) v
Berlíně a u Arthura Kornberga (1918-2007)
ve Spojených státech. Ve známost vešel
díky objevu možnosti rozdělit DNA
polymerasu I z E. coli subtilisinovým
štěpením do dvou fragmentů, z nichž jeden
si ponechává 5'→3' polymerasovou aktivitu
a 3’→5’ exonukleasovou aktivitu pro
odstranění předkódujích nukleotidů a opravy
a druhý má 5'→3' exonukleasovou aktivitu
(„primer removal“). První fragment byl
klonován a nazván „Klenowův fragment ".
Klenowův fragment DNA polymerasy později používal i Frederick Sanger
(*1918), když vyvinul metodu pro sekvencování DNA, za kterou získal svou
druhou Nobelovu cenu za chemii spolu s Walterem Gilbertem v roce 1980.
Použití Klenowova fragmentu:
- syntéza dvouvláknové DNA podle jednovláknového templátu
- vyplňování zkrácených 3' konců DNA fragmentů (tvorba zarovnaných konců)
- odstraňování odstávajících přesahů na 3' konci
- příprava radioaktivních DNA sond
Klenowův fragment byl také původním enzymem pro amplifikování úseků DNA v
polymerasové řetězové reakci (PCR), a to před tím, než byl nahrazen
termostabilními enzymy, jako jsou např. Taq polymerasa.