Stanovení budivých návykových látek (amfetamin, efedrin, extáze

Stanovení budivých návykových látek (amfetamin, efedrin, extáze)
pomocí LC-MS, GC-MS a CE-MS
Budivé aminy
Budivé aminy patří mezi stimulační látky (stimulanty) zvyšující hladinu noradrenalinu, serotoninu,
a dopaminu v mozku. Využívají se v léčbě poruchy pozornosti s hyperaktivitou [ADHD] zejména
u dětí, dále při léčbě úrazů mozku, narkolepsie a chronického únavového syndromu. Původně se
některé budivé aminy používaly i jako anorektikum k potlačení hladu a snížení tělesné hmotnosti.
Budivé aminy patří mezi drogy. Drogy je možné definovat jako jakoukoli látku, která je-li vpravena
do živého organismu, může pozměnit jednu nebo více jeho funkcí a vyvolat závislost.
Kromě budivých aminů patří mezi stimulanty i např. kofein a thein, nikotin a kokain a částečně
i extáze. Chemické struktury drog patřící do skupiny amfetaminů (fenetylaminy amfetaminového
typu)
a jejich prekurzorů jsou zobrazeny na obr. 1.
Obr. 1: Struktury amfetaminů a jejich prekurzorů
Stimulační drogy mají obecně následující účinky na lidský organismus:
1) zvyšují vnitřní napětí a strach, vyvolávají úzkostné stavy a psychózy,
2) zvyšují riziko agresivního chování,
3) vedou ke změnám v chování (např. zvyšují sebevědomí, vedou k přeceňování vlastních
schopností),
4) vysazení užívání budivých aminů vede ke spavosti, únavě, zvýšenému snění, dysforie
a deprese,
5) jejich užívání vede ke vzniku psychické závislosti, fyzická závislost nevzniká.
Amfetamin a methamfetamin
Amfetamin (a-methylphenythylamin) a methamfetamin (N-methyl- a-methylphenetylamin).
Jako volná báze je dostupný v kapalné formě. Nejčastěji je amfetamin distribuován jako síran,
hydrochlorid nebo fosfát ve formě bílé až nažloutlé krystalické látky. Čistota distribuovaného
amfetaminu v ilegálním pouličním prodeji bývá nejčastěji méně než 20 %. Kromě prášku bývá
někdy amfetamin v podobě tablet.
Syntéza amfetaminu a methamfetaminu
Existuje mnoho metod syntézy amfetaminu. Nejjednodušší syntéza amfetaminu je Leuckartova
syntéza. Kromě Leuckartovy syntézy existují například ještě Birchova metoda (využívaná nacisty
za II. světové války a metoda využívající jodovodík. Obě syntetické cesty jsou zobrazeny na obr. 2.
(I.)
(II.)
(III.)
Obr. 2: Reakční schémata vedoucí k syntéze methamfetaminu. (I.) Leuckartova syntéza, (II.) metoda využívající
jodovodík, (III.) Birchova syntéza (převzato a upraveno z S. Bell: Forensic Chemistry)
Amfetamin je nejčastěji ředěn kofeinem, aby byla maskována nízká koncentrace amfetaminu
v dávce a ke zvýšení stimulačního účinku amfetaminu. Amfetamin i methamfetamin jsou navíc
opticky aktivními sloučeninami a oba se vyskytují ve dvou optických izomerech L- a D-. Denantiomery jsou mnohem více fyziologicky účinnější formy, ale jsou z organismu rychleji
eliminovány než odpovídající L-isomery.
Metabolismus amfetaminu a methamfetaminu
Podstatná část aplikovaného metamfetaminu se vylučuje močí v nezměněné formě (cca 45% během
24 h po aplikaci). Vylučování je silně závislé na pH. V kyselé moči se v nezměněné formě vyloučí
až 76%, zatímco v alkalické moči jsou to jen cca 2% aplikované dávky.
Asi 15% dávky se v játrech metabolizuje hydroxylací na hydroxymetamfetamin. Přibližně 7%
dávky se N-demethylací metabolizuje na amfetamin, ze kterého dále vznikají hydroxyamfetamin
(2-4%) a norefedrin (2%) (z kterých vzniká hydroxynorefedrin (0,3%)) a konečně fenylaceton
(0,9%) metabolizovaný dále na kyselinu benzoovou, resp. kyselinu hippurovou. Jeden z metabolitů,
tj. amfetamin je aktivní, ale má slabší účinky než metamfetamin.
Schématické znázornění metabolismu methamfetaminu a amfetaminu je na obr. 3
Obr. 3: Schématické znázornění metabolismu methamfetaminu a amfetaminu.
MDMA
Methylendioxymethamfetamin (MDMA) patří mezi skupinu drog s budivými účinky obecně
označována jako fenetylaminy. Kromě MDMA existuje ještě několik strukturně podobných látek s
podobnými působením na lidský organismus (MDA - methylendioxyamfetamine, MDEA methylendioxyethylamfetamin, MBDB - N-methyl-1-(1,3-benzodioxol-5-yl)-butanamin).
MDMA je nejběžnější a nejčastější součástí tablet označovaných jako extáze (taneční droga).
Tablety mají typický rozměr okolo 10 mm, jsou ploché eventuálně bikonvexní a váží obvykle v
rozmezí 200 až 300 mg. Tablety mají vyraženou charakteristické logo, či strukturu.
Charakteristický design tablet není ale vázán pouze na extázi, ale také na další drogy např.
amfetamin. Logo na tabletách nevypovídá nic o obsahu a chemické struktuře drogy. Do dnešního
dne byly zaznamenány stovky různých log na tabletách obsahující drogu. Jedna z mnoha možností
jak mohou vypadat tablety obsahující extázi je zobrazena na obr. 4.
Obr. 4: Příklad tablety obsahující MDMA.
Hlavní farmakologický účinek MDMA je zvýšení sekrece a inhibice vychytávání serotoninu,
dopaminu a norepinefrinu v mozku. MDMA způsobuje euforii, zvýšenou empatii pocit zvýšení
energie v organismu a také prohloubení hmatových vjemů. Často je také užití MDMA spojeno
přechodně s hypertenzí, hypertermií a dehyratací, zatímco dlouhodobé působení vede k depresi díky
snížené produkci serotoninu v CNS.
Syntéza MDMA
Několik syntetických metod bylo popsáno, přičemž nejznámější je uvedena na následujícím
reakčním schématu (obr. 5)
Obr. 5: Reakční schéma syntézy MDMA.
Identifikace reakčních meziproduktů a vedlejších produktů syntézy umožňuje provést identifikaci
konkrétní syntetické cesty a tím i odhalit původ zachycených drog.
Průkaz MDMA barevnou reakcí
Marquisovo činidlo poskytuje temně modré zbrarvený s MDMA. Reakce není specifická
s Marquisovým činidlem reagují i další léčíva či drogy (např. fenothiaziny, betablokátory
a alkaloidy).
Marquisovo činidlo: K 5 mL 37-40% roztoku formaldehydu se opatrně přidá 100 mL
koncentrované kyseliny sírové (18 M).
Analýza budivých aminů chromatografickými metodami
Pro rozlišení a identifikaci jednotlivých budivých aminů v biologickém materiálu případně
v materiálech zadržených v sítích nelegální distribuce jsou nejvhodnější chromatografické metody
(GC, LC), případě kapilární elektroforéza (CE).
Zejména v případě analýzy biologického materiálu je nutné provést úpravu a extrakci budivých
aminů. Budivé aminy v lidském organismu podléhají jen velmi minimálně konjugaci a není tedy
nutná hydrolýza metabolitů (konjugátů) před vlastní extrakcí. Jako extrakční metody se nejčastěji
používá extrakce z kapaliny do kapaliny (L-L) extrakce a extrakce pevnou fází (SPE) extrakce.
V případě následné analýzy budivých aminů pomocí GC je nutné aminy derivatizovat, zatímco
derivatizace aminů pro LC není nutná. V mnoha případech se ale derivatizace budivých aminů
provádí i před LC analýzou, a to zejména pro zlepšení retence. Derivatizace není nutná v případě
následné analýzy pomocí CE.
Derivatizace amfetaminů pro GC
V případě GC dochází velmi často k rozmývání a deformacím píků (“tzv. tailing”) budivých aminů
a derivatizace se tedy provádí za účelem zlepšení tvaru píků a snížení nežádoucí sorpce analytů na
stacionární fázi. Derivatizací amfetaminů před GC analýzou navíc dojde ke zvýšení selektivity
stanovení a snížení vlivu nežádoucích interferentů. Derivatizace může být prováděna jako achirální
či chirální. Derivatizace achirálními derivatizačními činidly je využívána častěji a hlavně
v případech, kdy není nutná separace jednotlivých optických izomerů budivých aminů. V případě,
že je studován i poměr jednotlivých enantiomerů budivých aminů ve vzorku provádí se derivatizace
chirálními derivatizačními činidly.
Další výhodou derivatizace může být zvýšení citlivosti a selektivity hmotnostně spektrometrické
detekce. Samotné budivé aminy neposkytují příliš velkou citlivost při hmotnostně spektrometrické
detekci s pomocí ionizace elektronem. Vnesením elektronegativního zbytku do molekuly budivých
aminů se výrazně zvýší účinnost ionizace a tím i citlivost detekce oproti nederivatizovaným
analytům. Navíc MS spektra derivátů budivých aminů jsou mnohem unikátnější než MS spektra
nederivatizovaných aminů, které obsahují nespecifické fragmenty a jejich identifikace je velmi
složitá. Stejné nespecifické fragmenty se běžně vyskytují i v MS spektrech biologických vzorků, ve
kterých budivé aminy nejsou přítomny.
Nejčastější derivatizační reakce pro derivatizaci budivých aminů zahrnují silylaci, acylaci
a alkylaci. Jako derivatizační činidla se využívají anhydrid trifluoroctové kyseliny (TFA), anhydrid
kyseliny pentafluorpropionové (PFPA), anhydrid kyseliny heptafluoromáselné (HFBA) a dále
perflourooktanoylchlorid, carbethoxyhexafluorobutyrylchlorid (CB) a N-methyl-N-t-butyldimethylsilyltrifluoroacetamid (MTBSTFA). Pro chirální derivatizaci jsou využívány
trifluoroacetyl-L-prolylchlorid
(L-TPC),
pentafluoropropionyl-L-prolylchloride
(L-PPC)
a heptafluorobutyryl-L-prolylchlorid (L-HPC). Reakční schéma acetylace amfetaminů je na obr. 6.
Kromě spojení GC-MS se pro detekci derivátů budivých aminů využívají ještě plamenově-ionizační
detekce (FID), dusíkový-fosforový detektor (NPD), a detektor elektronového záchytu (ECD).
Obr. 6: Příklad acetylace amfetaminů a jeho derivátů.
Derivatizace amfetaminů pro LC
Retenční chování budivých aminů v LC je obecně lepší než v případě GC analýz. Nicméně i zde je
derivatizace prováděna pro zlepšení retenční vlastností a zvýšení citlivosti detekce. Například
amfetamin absorbuje UV záření, ale jeho molární dekadický absorpční koeficient je nízký.
Vnesením dalšího chromoforu do molekuly budivého aminu tak dojde ke zvýšení absorpce UV
záření a tím i citlivosti detekce. Některé derivatizační činidla navíc umožňují uskutečnit citlivou
fluorescenční detekci, či elektrochemickou detekci.
Jako derivatizační činidla se pro LC používají 3,5-dinitrobenzylchlorid (DNB), fenylisothiokyanát,
4-(N,N-dimethylaminosulphonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazol (DBD-F), fluorosceinisothiokyanát,
1,2-naftochinon-4-sulfonát, fluorenylmethylchloroformiát (FMOC-Cl) a dansyl chlorid.
Pro chirální derivatizaci se využívá Marfyho činidla (1-fluoro-2,4-dinitrofenyl-5-L-anilinamid)
a dále (-)-1-(9-fluorenyl)ethylchloroformiát (FLEC) a fluorenylmethylchloroformiát-L-prolyl
chlorid (FMOC).
L-L extrakce budivých aminů
L-L představuje nejjednodušší způsob extrakce budivých aminů z biologického materiálu. Budivé
aminy mají pK okolo 10. Jde o bazické sloučeniny, které do organického rozpouštědla z vodné fáze
budou přecházet z bazického pH. Spolu s bazickými sloučeninami dojde i k extrakci neutrálních
látek, takže se extrakt většinou přečištuje reextrakcí do vodné fáze a nakonec zpět do organické
fáze. Jako činidlo pro úpravu pH vodných vzorků před extrakcí do organického činidla se nejčastěji
používá NaOH.
Úkol: Proveďte izolaci amfetaminů z předloženého vzorku moči a identifikujte jednotlivé
budivé aminy ve vzorku a proveďte jejich stanovení.
Chemikálie: standardní roztoky methamfetaminu, amfetaminu a efedrinu o koncentraci 10 mg/L ve
vodě, 50% (w/v) roztok NaOH, 1-chlorobutan, zředěná kyselina sírová (1:1), deionizovaná voda,
anhydrid kyseliny heptafluoromáselné, methanol.
Pomůcky: mikrozkumavky, vialky pro GC, LC a CE, ultrazvuk, kádinky, odměrný válec, termovap
pro odpařování pod proudem dusíku, SPE manifold, SPE kolonky BondElut RP/katex.
Postup práce:
L-L Extrakce
a) Ke 2 mL vzorku ve zkumavce se přidá 50% (w/v) roztok NaOH, výsledné pH musí být okolo 10.
b) Ke vzorku se dále přidá 5 mL 1-chlorobutanu a 5 minut se protřepává. Po ustavní rovnováhy
se organická fáze přenese do čisté další zkumavky.
c) K organické fázi v čisté zkumavce se přidá zředěná kyselina sírová (5 mL) a zkumavka se
opět uzavře a 5 min protřepe.
d) Vodná fáze po reextrakci se přenese do další čisté zkumavky a budivé aminy se znovu
extrahují do 5 mL 1-chlorobutanu. Organická fáze po extrakci se přenese do čisté zkumavky
a nechá se za laboratorní teploty odpařit pod proudem dusíku.
e) Extrakt se derivatizuje pomocí HFBA pro případ analýzy vzorku pomocí GC-MS.
f) Pro analýzu s pomocí CE a LC se vzorek nederivatizuje. Odpařený extrakce se rekonstituje ve
200 mL methanolu a dávkuje do kapalinového chromatografu či do kapilární elektroforézy.
SPE extrakce
K vlastní SPE extrakci se využije SPE kolonek obsahující směs katexu a reverzní fáze (SPE
BondElute Certify RP/Katex). Návod k SPE extraktoru je přiložen níže.
1. Tři kolonky SPE umístěte do SPE extraktoru a proveďte jejich postupnou kondicionaci.
Nejprve kolonky kondicionujte s pomocí 2 mL methanolu a dále s pomocí pufru 2 mL 100
mM fosfátu sodného pH 6,0.
2. Následně na kolonky naneste 5 mL vzorku moči, a 5 mL směsi standardů amfetaminu a
methamfetaminu a blank (deionizovaná voda) a kolonky opět promyjte 2 mL 100 mM
fosfátu sodného pH 6,0.
3. Následně všechny 3 kolonky promyjte 2 mL 1 M kyseliny octové a kolonky proudem
dusíku vysušte a kolonky promyjte 6 mL methanolu.
4. Proveďte eluci zachycených analytů s pomocí 2 mL směsi
dichlormethan/isopropanol/hydroxid amonný (78/20/2).
5. Eluované vzorky odpařte do sucha pod proudem dusíku, extrakt rekonstitujte v 50 mL
mobilní fáze případně pufru pro CE a analyzujte.
Vlastní analýza
a) Pod vedením vedoucího cvičení postupně proměřte extrakt po derivatizaci na GC-MS a
extrakty bez derivatizace s pomocí LC-ESI-MS a CE-ESI-MS.
Podmínky analýz
1. GC
Kolona: 100% methyl polysiloxane, 12.5 m × 0.2 mm I.D., 0.33 µm, teplotní
program: oven: 60 °C (1 min) to 140 °C (4 min) at 30 °C/min, then to 276 °C at
20 °C/min, 4 min.
2. LC
Kolona: Discovery HS F5, 5 cm x 2.1 mm I.D., 3 µm, mobile phase: [A] 0.1%
ammonium acetát ve vodě; [B] 0.1% ammonium acetát v acetonitrilu; [C]
acetonitril; (10:30:60, A:B:C), průtok mobilní fáze 2 mL/min, teplota kolony 35
°C, MS ionizace v kladném modu, injekce vzorku 5 mL.
3. CE
Kapilára: nepokrytá křemenná kapilára, 60 cm celková délka, pracovní elektrolyt
50 mM acetát amonný pH 4.5, U = + 20 kV, injekce vzorku 100 mbar/10s.
Složení pomocné kapaliny 50:49.5:0.5 (%, v/v) MeOH:H2O:HCOOH, průtok
pomocné kapaliny 4 ml/min. MS ionizace v kladném modu.
Návod k obsluze SPE extraktor (membránové čerpadlo M 401 a Manifold SPE
Supelco)
Membránové čerpadlo M 401
Membránové čerpadlo slouží k vytvoření potřebného vakua v SPE manifoldu, tak aby mohla být
provedena kondicionace SPE patrony, samotný proces extrakce analytů a následně jejich eluce.
1. Membránové čerpadlo (MČ) se uvede do provozu zastrčením přívodního kabelu do zástrčky
elektrické sítě. MČ nemá samostatný vypínač. Zároveň je potřebné zkontrolovat, zdali je
připojena gumová hadice vedoucí od MČ na výstupu zajišťující vakuum. Příslušný výstup je
označen jako „VAKUUM“.
2. Na ventilu manometru SPE manifoldu se povolí bílý plastový ventil na maximum.
3. Druhý konec gumové hadice se připojí na vstup SPE manifoldu. Samotná regulace vakua
probíhá na regulátoru vakua na SPE manifoldu a s pomocí ventilů pro jednotlivé SPE
kolonky na horním víku manifoldu.
SPE Manifold
SPE manifold slouží k uskutečnění vlastní SPE extrakce
1. Do vnitřního prostoru manifoldu se umístí příslušná nádobka (odpadní nádobky, či nádobky na
záchyt eluátu). A manifold se uzavře víkem.
2. Zkontrolovat, zdali jsou všechny ventily pro SPE kolonky (hnědé ferulky na horní desce
manifoldu) uzavřeny (ferulky se utáhnou ve směru hodinový ručiček).
3. Do těchto ventilů se umístí SPE patrony pro extrakci.
4. Potřebné vakuum pro kondicionaci, nanášení vzorků, promývání SPE kolonek a eluci vzorku se
nastaví na hlavním regulátoru vakua (bílý plastový ventil) na manometru manifoldu, přičemž
velikost vakua musí být vždy nižší, než 20 mm Hg sloupce (červená stupnice manometru)
5. Pro kondicionaci, promývání, nanášení vzorku a eluci, se míra vakua adjustuje pomalým
pootevřením ventilů (hnědé ferulky se povolí proti směru hodinových ručiček) pro příslušnou
SPE kolonku. Opětovně je možné vakuum pro danou SPE kolonku zastavit utáhnutím
příslušného ventilu (hnědé ferulky ve směru hodinových ručiček).
Ukončení práce na SPE extraktoru
Vytáhnutí přívodního kabelu MČ z elektrické sítě se přeruší tvorba vakuu v SPE manifoldu. Je
možné ho případně vyčistit.
Použitá literature:
1. S. Bell, Forensic Chemistry, Prentice Hall, 2nd edition, 2012
2. D.G. Barceloux, Medical Toxicology of Drug Abuse, Wiley, 2012
3. B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, AACCPress, 4 edition, 2013
4. W.R. Kuelpmann ed., Clinical Toxicology Analysis Vol .1,2, Wiley 2009.
5. J. Bogusz: Forensic Science, Wiley, 2000.
Doplňující otázky:
1. Jaké jiné analytické techniky by bylo možné využít pro detekci amfetaminů a jejich
metabolitů v moči a krvi?
2. Navrhněte fragmentační cestu pro EI-MS amfetaminu.