Elucigene® TRP Návod k použití

Komentáře

Transkript

Elucigene® TRP Návod k použití
Elucigene® TRP Návod k použití
Elucigene® TRP
Návod k použití
Katalogové číslo: TH003B2 – 50 testů
Pro diagnostické použití in vitro
Manufactured by:
Elucigene Diagnostics
Greenheys House
Pencroft Way
Manchester Science Park
Manchester
M15 6JJ
For Sales, Customer Service and Technical Support:T: +44 (0) 161 669 8122
F: +44 (0) 161 669 8129
E: [email protected]
E: [email protected]
Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England
and Wales, registration number 8696299
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 1 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
Elucigene TRP (panel pro riziko trombózy)
Určené použití
Traditional
HGVS Nomenclature
cDNA name
Factor V Leiden
R506Q
F2 NM_000130.3:c.1601G>A
Protein name
Factor II
20210G>A
F2 AF478696.1:g21538G>A (c.-97G>A)
MTHFR
677C>T
MTHFR NM_005957.3:c.665C>T
Protein name
p.Arg534Gln
p.Ala222Val
Pro simultánní in vitro kvalitativní detekci mutací faktoru V Leiden (R506Q), protrombinu
(faktor II 20210A) a methylen-tetrahydrofolátreduktázy (MTHFR C677T) v DNA extrahované
z plné krve (konzervované pomocí EDTA) neboze vzorků suchých kapek krve.
Souhrn a vysvětlení
Žilní trombóza způsobuje v USA přibližně 50 000 úmrtí za rok a frekvence výskytu je 1 z
1 000 osob za rok1. Ke vzniku trombózy přispívá mnoho známých rizikových faktorů, např.
chirurgické operace, těhotenství, perorální antikoncepce a delší čas bez pohybu („syndrom
turistické třídy“)2.
Citlivou rovnováhu procesu koagulace krve také ovlivňuje genetický element. Biochemická
koagulační kaskáda je složitá a obsahuje mnoho faktorů, které proces posilují nebo inhibují,
a výsledkem jejich působení je buď nedostatečná srážlivost (hemofilie) nebo nadměrná
srážlivost (trombofilie). Z těchto faktorů byly tři identifikovány jako klíčové pro vznik většiny
případů dědičné trombofilie3,4,5. Genové mutace těchto faktorů jsou užitečnými indikátory
zvýšeného rizika žilní trombózy. Jedná se o faktor V Leiden (R506Q), faktor II (protrombin
20210A) a MTHFR (677C>T). MTHFR (methylen-tetrahydrofolátreduktáza) je nezbytná pro
udržování hladiny homocysteinu, což má vliv na proces srážení krve.
Faktor V Leiden je nejobvyklejší dědičná forma trombofilie. V USA a v Evropě jsou 3 až 8 %
obecné populace heterozygotní na faktor V Leiden6. Četnost výskytu homozygotů mutace
faktoru V Leiden je přibližně 1 z 5 000, avšak podstatně se liší u různých populací. Riziko
žilní tromboembolické příhody závisí jak na genetických, tak na „získaných“ faktorech.
Důležitým faktorem je věk, a u jedinců s mutací faktoru V Leiden se riziko zvyšuje rychleji.
Jedinec heterozygotní na mutaci faktoru V Leiden má 7krát vyšší pravděpodobnost, že se u
něj vyvine žilní trombóza, a u jedince homozygotního na faktor V Leiden je toto riziko 80ti
násobně zvýšené7. Ke zvýšenému riziku přispívají další rizikové genetické faktory
(protrombin 20210A a MTHFR 677C) – heterozygot faktoru V Leiden má 20krát vyšší riziko,
pokud je zároveň heterozygot na 20210A8. U žen, které užívají perorální antikoncepci, se
riziko žilní trombózy zvyšuje 30ti násobně, pokud je žena heterozygotní na faktor V Leiden, a
riziko je několiksetkrát vyšší, pokud je žena homozygotní na faktor V9.
Testování se obecně zaměřuje na pacienty mladší 50 let s anamnézou žilní trombózy a na
pacienty nebo příbuzné s rodinnou anamnézou zvýšené srážlivosti krve. Testování je kromě
toho vhodné u příbuzných jedinců s potvrzeným faktorem V Leiden a u žen, které několikrát
samovolně potratily, prodělaly závažnou preeklampsii nebo porodily mrtvé dítě. Znalost
statusu faktoru V Leiden může ovlivnit zvládání těhotenství a mít dopad na rozhodnutí o
užívání perorální antikoncepce10. Jakmile byl identifikován faktor V Leiden, je velmi
informativní provést testy na další rizikové faktory trombózy jako je protrombin (faktor II) a
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 2 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
MTHFR. Přínosem identifikace mutace faktoru V Leiden u pacientů se žilní trombózou je
skutečnost, že asymptomatičtí členové rodiny se mohou rozhodnout zjistit, zda u nich rovněž
existuje zvýšené riziko žilní trombózy. Toto zjištění jim může pomoci při vedení
antitrombolytické léčby v obdobích největšího rizika, jako jsou chirurgické operace,
těhotenství, orální antikoncepce a delší období nehybnosti při dálkových letech11.
Principy metody
Metoda používaná v testu Elucigene TRP je založena na systému diferenciální amplifikace
mutací (Amplification Refractory Mutation System, ARMS), což je technologie alelověspecifické PCR amplifikace, která je schopna detekovat bodové mutace nebo malé delece
deoxyribonukleové kyseliny (DNA)12. Test obsahuje dvě reakční směsi, které se vzájemně
doplňují. První reakční směs specificky amplifikuje všechny TRP alely, které nejsou
zasaženy mutacemi faktoru V Leiden (R506Q), faktoru II (protrombin 20210A) a MTHFR
(677C>T) , tj. divoký typ. Druhá reakční směs naopak obsahuje primery, které specificky
amplifikují pouze alely s mutacemi R506Q, 20210A a 677C>T. Obě reakční směsi také
zahrnují primery, které amplifikují DNA sekvence bez faktoru V Leiden, protrombinu a
MTHFR, jako vnitřní amplifikační kontrolu testu, která označuje úspěšnou amplifikaci.
Amplifikované produkty (amplikony) těchto dvou reakcí jsou separovány elektroforézou v
agarózovém gelu a přítomnost proužků v gelu indukuje status alel profaktor V Leiden
(R506Q), faktor II (protrombin 20210A) a MTHFR (677C>T).
Varování a bezpečnostní opatření
1. Kontrolní vzorek DNA dodaný s touto soupravou je humánního původu a byl nezávisle
testován pomocí rozboru na bázi PCR a shledán negativním na virus hepatitidy typu
B (HBV), na virus hepatitidy typu C (HCV) na virus lidské imunodeficience 1 (HIV1).
2. Při manipulaci s materiály humánního původu je nutno postupovat opatrně. Všechny
vzorky se musí považovat za potenciálně infekční. Žádná testovací metoda nemůže
zaručit úplnou jistotu, že produkt neobsahuje HBV, HCV nebo HIV 1 nebo jiná infekční
agens.
3. Při manipulaci se vzorky a komponentami testu a při jejich používání, skladování a
likvidaci je nutno postupovat v souladu s postupy definovanými příslušnými státními
normami nebo zákony pro nakládání s biologicky nebezpečnými materiály.
4. Podle současné správné laboratorní praxe musí laboratoře při každém testu zpracovat
své vlastní vzorky pro kontrolu kvality se známým genotypem, aby bylo možné
vyhodnotit validitu postupu.
5. Pokud je krabice soupravy poškozená, mohlo dojít k poškození obsahu. Soupravu
nepoužívejte a kontaktujte zákaznický servis.
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 3 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
Symboly použité na označení
Symboly použité na všech štítcích a na obalech odpovídají harmonizované normě
ISO 15223
Výrobce
Počet testů
Přečtěte si návod k použití
X°
C
Skladujte při teplotě nižší, než je zde uvedeno
Datum exspirace
Katalogové číslo
Číslo šarže nebo dávky
Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 4 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
Dodávané materiály
Reagencie se musí skladovat v oblasti, kde nehrozí riziko kontaminace produktů DNA nebo
PCR.
Všechny reagencie jsou dodávány připravené k použití Neotevřené a otevřené reagencie
skladujte při teplotě -20 °C. Otevřené reagencie lze skladovat až 3 měsíce.
Součástí dodávky jsou materiály dostačující na 50 testů:
1. 2 lahvičky x 450 µl, Primer směs A (TA), obsahující primery specifické pro amplifikaci
alel nezasažených mutacemi faktoru V, faktoru II a MTHFR, kontrolní primery a
deoxynukleotid-trifosfáty v pufru (404502).
2. 2 lahvičky x 450 µl, Primer směs B (TB), obsahující primery specifické pro amplifikaci
alel zasažených mutacemi faktoru V, faktoru II a MTHFR, kontrolní primery a
deoxynukleotid-trifosfáty v pufru (404503).
3. 2 lahvička x 600 µl, vkládací barvivo (LD). (404481)
4. 1 lahvička x 200 µl, ředicí pufr (DB). (404482)
5. 1 lahvička x 50 µl, DNA kontrola (DC), normální výsledek na mutace faktorůV Leiden
R506Q a protrombin 20210A, a homozygotní na alelovou mutaci MTHFR 677C.
(404487)
Potřebný materiál, který se nedodává
Laboratorní potřeby: rukavice, zkumavky pro mikrocentrifugy se šroubovacím uzávěrem,
pipetovací špičky, tenkostěnné 0,2 ml nebo 0,5 ml lahvičky pro PCR (použití lahviček dvou
různých barev usnadní identifikaci směsi primeru).
Preparace DNA: sterilní deionizovaná voda dobré kvality, chlorid sodný (NaCl), EDTA
(kyselina etylendiamintetraoctová), granule hydroxidu sodného (NaOH), krystalizovaný 2amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris-báze), 36 % kyselina chlorovodíková (HCl,
specifická hmotnost 1,18), chlorid amonný (NH4Cl).
PCR amplifikace: lehký bílý minerální olej Sigma*, sterilní destilovaná voda dobré kvality,
AmpliTaq Gold (Applied Biosystems).
Elektroforéza: materiály pro gelovou elektroforézu, včetně NuSieve 3:1 agarózy (Lonza),
žebříček s 50 páry bází, ethidium bromid.
* Pro amplifikaci prováděnou v 0,5 ml PCR lahvičkách nebo v termálních cyklovačích bez
vyhřívaného víka.
Požadované vybavení
Vybavení laboratoře: přesné pipety (2 sady, 1 pro manipulaci před amplifikací a 1 pro
manipulaci po amplifikaci, doporučujeme pipety bez vzduchového polštáře), laboratorní sklo,
ochranný oděv, vortexová třepačka, mikro centrifuga, vyvažování, stojany na vzorky.
Preparace DNA: vyhřívací blok (zahřívání do 100 °C).
Amplifikace: termální cyklovač kompatibilní s 0,5 ml nebo 0,2 ml lahvičkami (s tepelnou
přesností +/-1 °C mezi 33 °C a 100 °C a rovnoměrností statické teploty +/-1 °C), vyhřívané
víko je volitelné.
Elektroforéza: horizontální gelová nádoba typ Submarine, napájení, mikrovlnné zařízení,
vodní lázeň pro chlazení agarózy, UV prosvětlovač, fotografický systém.
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 5 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
Odběr a uchovávání vzorku
Musí se používat vzorky plné krve (EDTA) nebo suché kapky krve.
Bylo hlášeno, že zařízení na odběr vzorků v určitých případech poškozují integritu určitých
analytů a mohou rušit některé technologie metody13. Všem uživatelům doporučujeme, aby
zkontrolovali, zda se zvolené zařízení používá podle pokynů výrobce a zda jsou zařízení na
odběr vzorků a alternativní metody preparace DNA kompatibilní s tímto testem.
Před preparací DNA se vzorky krve musí uchovávat při teplotě -20 °C. Zabraňte opakovanému
zmrazování a rozmrazování.
Preparace DNA ze vzorků plné krve (EDTA)
1. Napipetujte 80 µl každého vzorku krve do mikrocentrifugové zkumavky se šroubovacím
uzávěrem.
2. Napipetujte do každé zkumavky 320 µl roztoku 170 mM (9,09 g/l) NH4Cl.
3. Míchejte 20 minut jemným kroužením a převracením. Vyhněte se silnému třepání, aby se
nevytvořila pěna.
4. Centrifugujte všechny zkumavky 2 minuty při 12 000 g, až se vytvoří shluk buněk.
5. Pipetou odstraňte supernatant a zlikvidujte jej.
6. Napipetujte do každé zkumavky 300 µl roztoku 10 mM (0,58 g/l) NaCl / 10 mM (3,72 g/l)
EDTA a ve vortexové třepačce znovu vytvořte suspenzi buněk.
7. Centrifugujte všechny zkumavky 1 minutu při 12 000 g, až se vytvoří shluk buněk.
8. Opakujte kroky 5 až 7 ještě nejméně dvakrát, až bude ze supernatantu zcela odstraněno
viditelné červené zbarvení.
9. Pipetou odstraňte supernatant a zlikvidujte jej.
10. Napipetujte do každé zkumavky 200 µl roztoku 50 mM (2 g/l) NaOH a ve vortexové
třepačce znovu vytvořte suspenzi buněk.
11. Inkubujte ve vyhřívacím bloku při teplotě 100 °C po dobu 10 minut.
12. Napipetujte do každé zkumavky 40 µl roztoku 1 M (121,1 g/l) Tris-báze/HCl (pH 7,5) a
promíchejte ve vortexové třepačce.
13. Přidejte do každé mikrocentrifugové zkumavky 1 ml sterilní deionizované vody, aby měl
vzorek DNA celkový objem 1,24 ml.
14. Centrifugujte všechny zkumavky 1 minutu při 12 000 g, až se vytvoří shluk buněčného
odpadu. DNA je obsažena v supernatantu.
Preparace DNA ze suchých kapek krve
1. Vyrazte ze vzorkové karty do 1,5ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem 2 disky o průměru
3 mm(b).
Disky se musí vyrazit z části karty, která je zcela saturována krví.
Před každým dalším vzorkem vyrazte do odpadu několik disků z čistých karet, aby
nedocházelo k přenosu vzorků.
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 6 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
2. Přidejte 1 ml roztoku 10 mM (0,58 g/l) NaCl / 10 mM (3,72 g/l) EDTA a v rotační míchačce
míchejte po dobu 15 až 20 minut. Pokud není k dispozici rotační míchačka, promývání
může být nutno prodloužit až na 30 minut.
3. Odstraňte a zlikvidujte promývací roztok.
4. Opakujte kroky 2 a 3 ještě jednou.
5. V tomto okamžiku by měla být většina krevního pigmentu z disku vyplavena. V této fázi
však obvykle disky s krevními vzorky ještě mohou mít lehké červenohnědé zabarvení.
6. Krátce zpracujte v mikrocentrifuze (3 vteřiny), aby se zbývající promývací roztok
shromáždil na dně zkumavky. Pipetou odstraňte co největší množství promývacího
roztoku, které lze odstranit bez narušení disků s krevními vzorky.
7. Toto krátké zpracování v mikrocentrifuze obvykle odstraní z disků s krevními vzorky další
krevní pigment.
8. Přidejte do každé zkumavky 150 µl roztoku 50 mM (2 g/l) NaOH. Opatrně poklepejte
prstem, aby se obsah promíchal.
9. Vařte ve vyhřívacím bloku po dobu 10 minut. Vyhřívací blok se musí vyvážit na 100 °C.
10. Krátce zpracujte v mikrocentrifuze, aby se supernatant shromáždil na dně zkumavky.
11. Přidejte do každé zkumavky 30 µl roztoku 1 M (121,1 g/l) Tris-báze/HCl (pH 7,5) za účelem
neutralizace, a opatrně promíchejte.
12. Přidejte ke každému DNA vzorku 420 µl sterilní vody Sigma, aby měl vzorek celkový objem
600 µl.
13. Dobře vzorky promíchejte a před odběrem zpracujte v mikrocentrifuze.
14. Přeneste supernatant do nové, označené zkumavky se šroubovacím uzávěrem.
Uchovávejte extrahovanou DNA při teplotě -20 °C.
Celková plocha použitého krevního vzorku by měla být přinejmenším ekvivalentní dvěma
3mm kruhovým diskům s krevním vzorkem. Lze například použít jeden 6mm disk z karty,
pokud je to vhodné.
(b)
Pro preparaci DNA z plné tekuté krve byla také použita souprava na odběr krve QIAamp DNA
Blood Kit (Qiagen) a potvrdilo se, že poskytuje reprodukovatelné výsledky, které lze
interpretovat.
Společnost Elucigene Diagnostics doporučuje metody preparace DNA popsané výše, o
kterých je prokázáno, že podávají konzistentní a spolehlivé výsledky. DNA připravená jinými
metodami nebo z jiných typů vzorků nemusí být pro test Elucigene TRP optimální a může
podávat suboptimální výsledky. Klíčová kritéria pro alternativní metody preparace DNA jsou
koncentrace DNA a absence inhibitorů PCR.
Před použitím výsledků testu pro diagnostické účely se doporučuje test Elucigene TRP
důkladně vyhodnotit s alternativními metodami a různými typy vzorků. Nedoporučuje se
testovat vzorky DNA o koncentraci <10 ng / 5 µl. Za podmínek optimálních pro PCR jsou
výsledky pravidelně získávány za koncentrací DNA 10 až 100 ng / 5 μl.
Poznámka: Vzhledem k proměnlivosti kvality a výtěžku DNA může být někdy nutné konečný
roztok DNA až 5ti násobně zředit, aby se zajistila účinná amplifikace.
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 7 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
Testovací protokol
Postup amplifikace
Množství uvedená v tabulkách 1 a 2 lze zvýšit v poměru k počtu testů (pokud se liší od
počtů uvedených v tabulkách). Vzhledem k malým objemům, které se používají,
společnost Elucigene Diagnostics nedoporučuje provádět v jednom běhu méně než 5
testů.
1. Naprogramujte termální cyklovač souborem s prodlevou tak, aby se AmpliTaq Gold
aktivoval při 94 °C na dobu 20 minut, s navazujícím programem amplifikačního cyklování
se schématem 30 vteřin při 94 °C (denaturace), 2 minuty při 58 °C (anelace) a 1 minuta při
72 °C (extenze) po 35 cyklů. Na toto schéma je třeba navázat souborem s prodlevou 20
minut při 72 °C (extenze) ve finálním cyklu.
Poznámka: Pro PCR reakci v 0,5ml lahvičkách zvolte na termálním cyklovači metodu
„Block“.
2. Rozmrazte a centrifugujte lahvičky se směsí primeru A (TA), směsí primeru B (TB),
AmpliTaq Gold (nedodává se), vkládacím barvivem (LD) a ředicím pufrem (DB) po dobu
10 vteřin při 12 000 g, jemně promíchejte ve vortexové třepačce a pak opět lahvičky 10
vteřin centrifugujte.
Poznámka: Kroky 3 – 6 se musí provádět v oblasti, kde se nevyskytuje DNA.
3. Podle tabulky 1 připravte dostatečné množství roztoku AmpliTaq Gold s ředicím pufrem, s
dodaným vkládacím barvivem a sterilní destilovanou vodou, které bude postačovat pro
plánovaný počet testovaných vzorků a kontrol. Důkladně promíchejte jemným nabíráním
a vytlačováním pipetou.
Tabulka 1. Ředění přípravku AmpliTaq Gold
Objem sterilní destilované vody (µl)
Objem vkládacího barviva (µl)
Objem ředicího pufru (µl)
Objem přípravku AmpliTaq Gold (µl)
Objem celkem (µl)
Počet
požadovaných testů
5
10 20 50
21 42 84 210
30 60 120 300
6
12 24 60
3
6
12 30
60 120 240 600
4. Podle tabulky 2 připravte reakční směsi A a B. Do označené mikrocentrifugové zkumavky
vložte alikvot směsi primeru A. Do druhé označené mikrocentrifugové zkumavky vložte
alikvot směsi primeru B. Novými pipetovacími špičkami přidejte do každé zkumavky
příslušný objem naředěného roztoku AmpliTaq Gold (z kroku 3). Jemně zkumavky
promíchejte ve vortexové třepačce a 10 vteřin je centrifugujte při 12 000 g.
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 8 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
Tabulka 2. Příprava reakčních směsí A a B
Objem směsi primeru A (µl)
Objem směsi primeru B (µl)
Objem naředěného enzymu (µl)
Objem celkem (µl)
Počet požadovaných testů
5
10
20
50
A
B
A
B
A
B
A
B
82,5
165
330
825
82,5
165
330
825
27,5 27,5
55
55
110 110
275
275
110
110 220 220 440 440 1100 1100
5. Pro každý vzorek označte jednu lahvičku písmenem A a druhou písmenem B nebo pro
každou směs primeru použijte lahvičku jiné barvy (pokud jsou k dispozici).
6. Napipetujte 20 µl připravené reakční směsi A na dno všech PCR lahviček označených
písmenem A. Postup opakujte s příslušným počtem PCR lahviček označených písmenem
B a přidejte do nich reakční směs B.
7. Vždy novou pipetovací špičkou přidejte do všech párů lahviček A a B 5 µl testovaného DNA
vzorku. Přidejte jednu kapku lehkého bílého minerálního oleje Sigma na pokrytí vodné fáze
*. Pevně znovu uzavřete.
8. Pro negativní kontrolu do jednoho páru lahviček A a B nepřidávejte žádnou DNA. Přidejte
1 kapku lehkého bílého minerálního oleje Sigma na pokrytí vodné fáze *. Pevně znovu
uzavřete.
9. Centrifugujte lahvičky A a B po 10 vteřin při 12 000 g.
10.Lahvičky pevně uložte do bloku termálního cyklovače. Zahajte cyklus s prodlevou při teplotě
94 °C následovaný programem amplifikačního cyklování.
11.Zlikvidujte všechny nepoužité zbytky naředěného přípravku AmpliTaq Gold a reakčních
směsí A a B.
12.Po dokončení programu amplifikačního cyklování lze před provedením analýzy gelovou
elektroforézou vzorky uchovávat při pokojové teplotě přes noc nebo při teplotě 2 až 8 °C
pro dobu až 7 dnů.
* Pro amplifikaci prováděnou v 0,5 ml PCR lahvičkách nebo v termálních cyklovačích bez
vyhřívaného víka.
Gelová elektroforéza
Všem uživatelům doporučujeme zkontrolovat, zda se zvolené vybavení používá podle pokynů
výrobce a zda je kompatibilní s tímto testem. V tomto kontextu jsou klíčovými parametry
rozměry gelové mřížky a hřebínku (pomůcky k vytváření jamek). Výsledky byly získány za
následujících podmínek elektroforézy:
1. Produkt PCR byl zpracován elektroforézou v 3 % agarózovém gelu NuSieve 3:1 za použití
tris-boritanu s ethidium bromidem (TBE/EtBr) jako reakčního pufru. TBE/EtBr byl připraven
jako pufr s 134 mM (16,2 g/l) Tris-báze, 74,9 mM (4,63 g/l) kyseliny borité, 2,55 mM (0,95
g/l) EDTA s přídavkem 0,1 µg/ml ethidium bromidu.
2. 3 g přípravku NuSieve 3:1 byly rozpuštěny ve 100 ml TBE/EtBr a nality do 15 x 12 cm
horizontálního gelového podnosu s hřebínkem na tvorbu jamek 1,5 mm x 5 mm zavěšeným
1 mm nad základnou.
3. 15 µl produktu PCR z každé PCR lahvičky bylo vloženo do sousedících jamek na
připraveném agarózovém gelu.
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 9 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
4. Žebříček o 50 párech bází byl zpracován vedle vzorků jako měřítko molekulární váhy.
5. Elektroforéza byla prováděna za napětí 5 až 6 V/cm mezi elektrodami, až se přední hrana
barvy přesunula 4 cm od zakládacích jamek k anodě (1 až 1,5 hodiny).
6. Po elektroforéze byly gely umístěny do UV prosvětlovače o vlnové délce 260 nm, zobrazeny
a vyfotografovány.
Interpretace výsledků
1. Negativní kontrola nesmí mít proužky v oblasti definované horními a spodními kontrolními
proužky (viz obr. 1).
2. Horní i spodní kontrolní proužky musí být u všech vzorků jasně viditelné (viz obr. 1).
3. Poloha horních i spodních kontrolních proužků musí indikovat správnou velikost molekul
(viz obr. 1).
Pokud není kterýkoliv z výše uvedených bodů dodržen, výsledky se nesmí interpretovat a test
je nutno opakovat.
Obrázek 1 zobrazuje ve formě diagramu velikost, páry báze a relativní umístění PCR produktu
v gelu, které se očekává u heterozygotního genotypu trombózy (přenášejícího mutace faktoru
V, faktoru II nebo MTHFR) při použití reagencie testu zjišťujícího riziko trombózy.
Obrázek 1
ŽEBŘÍČEK
600 bp
500 bp
400 bp
PCR
VELIKOST
MUTACE
526 bp
Horní kontrola
423 bp
Horní kontrola
Normální Mutantní
350 bp
300 bp
250 bp
200 bp
260 bp
Faktor II
200 bp
Faktor V
140 bp
MTHFR
150 bp
100 bp
97 bp
Spodní kontrola
50 bp
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 10 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
Funkční charakteristiky
Ve studii prováděné v laboratořích společnosti bylo s použitím doporučeného protokolu
testováno testem Elucigene TRP (TH003B2) třicet vzorků dříve genotypovaných pomocí
restrikční enzymové analýzy. Dvacet devět vzorků DNA bylo úspěšněamplifikováno pomocí
soupravy Elucigene TRP. U jednoho vzorku DNA se amplifikace nezdařila, ale při
opakovaném testování byl výsledek přijatelný. U dvaceti šesti vzorků podala souprava
Elucigene TRP pozitivní výsledek na mutace, a u čtyř vzorků nebyly zjištěny žádné mutace. Z
30 testovaných vzorků bylo 7 pozitivních na mutace faktoru V (R506Q), 10 bylo pozitivních na
mutace faktoru II (protrombin 20210A) a 16 bylo pozitivních na mutace MTHFR (677C>T).
Všechny výsledky získané pomocí soupravy Elucigene TRP potvrdily původní výsledky
genotypizace.
Ve studii prováděné v laboratořích společnosti bylo s použitím doporučeného protokolu
testováno testem Elucigene TRP (TH003B2) třicet spárovaných vzorků plné krve a suchých
kapek krve od třiceti jedinců. Osmnáct z těchto spárovaných vzorků podalo pozitivní výsledek
na mutace detekované soupravou Elucigene TRP. Výsledky testu vzorků plné krve byly v
souhlasu s výsledky testu suchých kapek krve od stejného jedince.
Omezení postupu
1. Výsledky tohoto diagnostického testu i jiných testů musí být interpretovány ve spojení s
jinými laboratorními a klinickými údaji, které jsou dostupné lékaři.
2. Nepřítomnost mutací detekovaných touto soupravou nezaručuje, že nejsou přítomny jiné
mutace genů faktoru V Leiden, faktoru II a MTHFR. Mohou existovat jiné mutace, které tato
souprava nedetekuje.
3. U vzorků odebraných po nedávné transfuzi krve mohou být zjištěny chybné výsledky, stejně
jako u jiných genetických testů.
Uživatel těchto testů musí tyto skutečnosti zdůraznit při hlášení výsledků klinickému lékaři,
který stanovuje diagnózu, nebo lékaři z genetické poradny.
Reference
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 11 z 12
Elucigene® TRP Návod k použití
1. Heit JA, Silverstein MD, Mohr DN, Petterson TM, Lohse CM, O'Fallon WM, Melton LJ 3rd.
The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Thromb Haemost
2001;86:452-463.
2. Rosendaal FR. Risk factors for venous thrombotic disease. Thromb Haemost
1999;82:610-619.
3. Bertina RM, Rosendaal FR. Venous thrombosis – the interaction of genes and
environment. N Engl J Med 1998;338:1840-1841.
4. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3'untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma
prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996 Nov 15;88:36983703.
5. Press RD, Bauer KA, Kujovich JL, Heit JA. Clinical utility of factor V Leiden (R506Q)
testing for the diagnosis and management of thromboembolic disorders. Arch Pathol Lab
Med 2002;126:1304-1318.
6. Zöller B. Hillarp A, Berntorp E, Dählback B. Activated protein C resistance due to a
common factor V gene mutation is a major risk factor for venous thrombosis. Ann Rev
Med 1997;48:45-58.
7. Makris M, Preston FE, Beauchamp NJ, Cooper PC, Daly ME, Hampton KK, Bayliss P,
Peake IR, Miller GJ. Co-inheritance of the 20210A allele of the prothrombin gene
increases the risk of thrombosis in subjects with familial thrombophilia. Thromb Haemost
1997;78:1426-1429.
8. Endler G, Mannhalter C. Polymorphisms in coagulation factor genes and their impact on
arterial and venous thrombosis. Clin Chim Acta 2003;330:31-55.
9. Hirsch DR, Mikkola KM, Marks PW, Fox EA, Dorfman DM, Ewenstein BM, Goldhaber SZ.
Pulmonary embolism and deep venous thrombosis during pregnancy or oral
contraceptive use: prevalence of factor V Leiden. Am Heart J 1996;131:1145-1148.
10. Bokarewa MI, Bremme K, Blomback M. Arg506-Gln mutation in factor V and risk of
thrombosis during pregnancy. Br J Haematol 1996;92:473-478.
11. Spector EB, Grody WW, Matteson CJ, Palomaki GE, Bellissimo DB, Wolff DJ, et al.
Technical standards and guidelines: venous thromboembolism (factor V Leiden and
prothrombin 20210G>A testing): a disease-specific supplement to the standards and
guidelines for clinical genetics laboratories. Genet Med. 2005 Jul-Aug;7(6):444-53
12. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory
Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989).
13. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:1509-1510
(1994).
ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd.
ARMS is a trademark of AstraZeneca UK Ltd. QIA AMP is a trademark of the Qiagen
Group. NUSIEVE is a trademark of Lonza. AMPLITAQ GOLD is a trademark of Roche
Molecular Systems Inc.
Copyright  2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd.
TH003BYCS 001
Jul-2014
Strana 12 z 12

Podobné dokumenty

Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití

Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití nezávisle testován pomocí rozboru na bázi PCR a shledán negativním na virus hepatitidy typu B (HBV), na virus hepatitidy typu C (HCV) na virus lidské imunodeficience 1 (HIV1). 2. Při manipulaci s m...

Více

english synopsis - Časopis stavebnictví

english synopsis - Časopis stavebnictví architekta Jana Štípka, který sehrál zásadní roli při vzniku České komory architektů a byl jejím prvním předsedou. Také to byl člověk, který na konci roku 2006 poskytl vůbec první rozhovor č aso pi...

Více

Svp-podkovar-a-zemedelsky-kovar

Svp-podkovar-a-zemedelsky-kovar Pro žáky, jejichž porucha dosahuje takového stupně, že je opravňuje k zařazení do speciálního školství, je na žádost rodičů a na základě doporučení školského poradenského zařízení, připraven vzdělá...

Více

Laboratorní příručka - Laboratoř lékařské genetiky Karlovy Vary

Laboratorní příručka - Laboratoř lékařské genetiky Karlovy Vary - X-vázaná onemocnění (Duchennova/Beckerova muskulární dystrofie, hemofilie), pokud není dostupné cílené PCR vyšetření Vyšetření metodou PID předchází podrobná genetická konzultace obou partnerů, j...

Více