Biochemie 3 enzymy

ENZYMY
Obsah
• Reakční kinetika, enzymy jako biokatalyzátory
• Rozdělení enzymů a jejich třídy, názvosloví
• Kofaktory, koenzymy a prostetické skupiny
• Aktivní místo, katalytické místo
• Mechanismus působení (příklad serinových proteináz)
• Praktické
aspekty – klinické a technologické aplikace,
termostabilní enzymy
Historie poznávání enzymů
• 1810 J.L. Gay Lussaca počátek výzkumu fermentace – kvasinky rozkládají cukr na
CO2 a ethanol
• 1835 Berzelius – katalýza, usnadnění reakce, snížení Ea, transitní stavy
• 1860 Pasteur – fermentace je katalyzovány látkami, tuto schopnost však
nelze
oddělit od živých buněk, které jsou vybaveny tzv. životní sílou vis vitalis
• J. Liebig – fermenty jsou schopny katalyzovat tyto reakce i mimo živou buňku –
spor s Pasteurem
• 1878 W. Kühn – „enzym“ en zyme – v kvasnicích
• 1894 E. Fisher hypotéza zámku a klíče –
glykolytické enzymy rozlišují
stereoizomery cukrů. Chemické složení enzymů –potvrzeno až začátkem 20.
století.
• 1897 Eduard a Hans Büchnerovi – tyto reakce je schopen katalyzovat i samotný
extrakt kvasinek
• 1926 Summer – bílkovinná povaha enzymů – ureasa
• 1963 první AK sekvence enzymu – hovězí pankreatické ribonukleasy A
• 1965 struktura lysozymu pomocí rentgenostrukturní analýzy
Enzymy
• Enzymy
jsou katalyzátory biologických systémů umožňující
chemické přeměny. Umožňují také transformaci jednoho druhu
energie na druhý.
• Pro enzymy je charakteristická katalytická síla a specifita.
• Katalytická síla enzymu je definována jako poměr rychlosti reakce
katalyzované enzymem a rychlosti reakce nekatalyzované.
• Katalýza
se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném
aktivní místo.
• Látka jejíž přeměnu enzym katalyzuje se nazývá substrát.
• Téměř
všechny známé enzymy jsou proteiny (RNA jsou
pravděpodobně nejranější katalyzátory - ribozymy).
Příklady enzymů
porovnání rychlostních konstant spontánní a katalyzované reakce
a katalytické síly
Enzym
Poločas života
(neenzym.
reakce)
Nekatalyzovaná
reakce
(knoncat s-1)
Katalysovaná
reakce
(kcat s-1)
Poměr
(kcat/knoncat)
Orotidinmonofosfátdekarboxylasa
78 000 000 let
2,8 x 10-16
39
1,4 x 1017
Stafylokokální nukleasa
130 000 let
1,7 x 10-13
95
5,6 x 1014
AMP nukleosidasa
69 000 let
1,0 x 10-11
60
6,0 x 1012
Karboxypeptidasa A
7,3 let
3,0 x 10-5
578
1,9 x 1011
Ketosteroidisomerasa
7 týdnů
1,7 x 10-7
66 000
3,9 x 1011
Triosafosfátisomerasa
1,9 dnů
4,3 x 10-6
4 300
1,0 x 109
Chorismátmutasa
7,4 hodin
2,6 x 10-5
50
1,9 x 106
Karbonáthydratasa
5 vteřin
1,3 x 10-1
1 x 106
7,7 x 106
Globulární bílkoviny – enzymy
• Katalytická funkce bílkovin
• Většina reakcí
RNA – ribozymy
• Katalyticky účinné RNA - T. R. Cech a S. Altmann, Nobelova cena
1989
• Několik speciálních reakcí
Chemické katalyzátory
• látky urychlující chemické reakce
• nemění přitom rovnováhy chemických reakcí
• snižují aktivační energii
• „nemění“ se při reakci
Biokatalyzátory - enzymy
• urychlují ustanovení rovnováhy chemické reakce
• neovlivňují rovnovážnou konstantu
• jsou specifické ve smyslu katalyzované reakce (specifita účinku)
a ve smyslu výběru substrátu (substrátová specifita)
• snižují aktivační energii reakce, tvoří komplex se substrátem
• rychlost musí být přesně regulována podle potřeb organismu
Principy enzymové katalýzy
Princip katalýzy
Rozklad peroxidu vodíku
Biokatalyzátory liší od běžných chemických
katalyzátorů
1) Vyšší reakční rychlostí
2) Mírnějšími podmínkami reakce – T, pH, tlak
3) Vyšší specifitou
4) Schopností regulace
Vlastnosti enzymů
• Bílkovina
mající schopnost
a přeměnit je na produkty
vázat
reaktanty
(substráty)
• K tomu dochází v tzv. aktivním místě (centru)
• Struktura aktivního centra umožňuje specifickou
interakci
a vazbu s omezeným výběrem substrátů
•K
tomu má vhodný geometrický tvar a rozložení reaktivních
skupin – chemické interakce – architektura
• Specificita enzymů – klíčová vlastnost
‐ Substrátová specifity
‐ Reakční specifita (specifita účinku)
Specificita enzymů
pyruvát
laktát
200 000x hůře
u živočichů
u bakterií
Model interakce substrátu s enzymem
• Zámku a klíče
• Indukovaného
přizpůsobení,
postupné změny konformace
Třídění klasifikace
IUB – 1961, 6 tříd podle typu katalyzované reakce
1. třída oxidoreduktasy – oxidačně redukční reakce – nejpočetnější
třída - laktátdehydrogenasa
2. třída transferasy – přenos skupin - aspartátaminotransferasa
3. třída hydrolázy – hydrolyticky (za účast H2O) štěpí vazby –
početná skupina - ureasa
4. třída lyasy – nehydrolyticky (bez účast H2O) štěpí vazby, eliminace
i adice - karbonátdehydratasa
5. třída izomerasy – intramolekulární přesuny atomů či skupin glukosa-6-fosfátizomerasa
6. třída ligasy – vznik energeticky náročných vazeb nejčastěji za
spotřeby ATP - asparaginsyntethasa
Názvosloví enzymů
Triviální
• Názvy souvisely s místem výskytu nebo funkcí – ptyalin (sliny),
trypsin, pepsin, starý žlutý enzym
Jednoduché
• Název substrátu nebo reakce + koncovka –asa: amylasa, ureasa,
oxidasa, hydrolasa, transaminasa
Systematické názvosloví
• Odráží reakční specificitu – základ systematického třídění
Regulérní
• Substráty:produkty-reakce, typické pro jednotlivé třídy
• L-Glu:NAD+-oxidoreduktasa (deaminující)
Zjednodušené
• Substrát + reakce + -asa
• glukosa-6-fosfátdehydrogenasa
Názvosloví enzymů - tvorba
Třída /
% zastoupení
Tvorba názvu
Příklad systematického názvu
EC 1. Oxidoreduktasy Donor:akceptor25,6
oxidoreduktasa
(S)-malát:NAD+-oxidoreduktasa
EC 2. Transferasy
27,6
Donor:akceptorpřenášená
skupinatransferasa
ATP:glycerol-3-fosfotransferasa
EC 3. Hydrolasy
22,9
Substrát hydrolasy,
Adenosinaminohydrolasa
odstraňovaná substrátová Triacylglycerolacylhydrolasa
skupina-hydrolasa
EC 4. Lyasy
13,1
Substrát, odstraňovaná
substrátová skupina
ATP-difosfolyasa
EC 5. Isomerasy
5,3
1.Substrát-isomerasa
2.Substrát-racemasa
3.Substrát-epimerasa
4.Substrát-mutasa
Xylosa-ketolisomerasa
Alaninracemasa
Glukosaepimerasa
Methylmalonyl-CoA-mutasa
EC 6. Ligasy
5,5
1.molekula-2.molekula
spojení ligasou
Alanyl:tRNA ligasa (AMP)
Pyruvát:CO2-ligasa(ADP)
Třídění klasifikace
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html
EC a.b.c.d
Např. alkohol:NAD:oxidoreduktasa (alkoholdehydrogenasa)
EC 1.1.1.1
EC 1 – oxidoreduktasy
EC 1.1. – skupina CHOH
EC 1.1.1. – kofaktor NAD
EC 1.1.1.1 – číslo uvnitř skupiny
Třídění klasifikace
Struktura enzymů
Jednoduché enzymy – složené pouze z proteinu
• globulární protein
• enzymy monomerní, tvořené jedinou podjednotkou
• oligomerní, tvořené z více podjednotek
Složené enzymy – obsahují též nebílkovinou složku – kofaktor
vázanou na bílkovinnou součást apoenzym (apoprotein – bílkovina)
APOENZYM + KOFAKTOR
HOLOENZYM
• Organická skupina či sloučenina
‐ Pevně (většinou kovalentně) vázaná – prostetická skupina
(širší význam) – odstranění – ztráta aktivity - na téže
enzymové bílkovině, je pevně vázáná
‐ Volně vázaná – koenzym – vratně disociuje – disociuje z dané
enzymové bílkoviny a může se regenerovat v jiné enzymové
reakci - druhý substrát
Koenzym x prostetická skupina
Kovový ion – metaloenzymy
Typy kofaktorů
• Rozdělení podle reakcí
‐ Někdy spadají do více skupin (THF - tetrahydrofolát)
‐ Kofaktory
1. oxidoreduktas
2. transferas
3. isomeras, ligas, lyas
• Jako prekurzory slouží vitaminy
‐ Většinou, někdy jiné esenciální složky
‐ Možnost syntézy z neesenciálních prekurzorů – hem
• Relativita pojmu
‐ Kofaktor x druhý substrát (ATP)
‐ Vazba kovů
‐ Produkty přeměny aminoacylů – PQQ
Kofaktory oxidoreduktas
Nikotinamidové kofaktory
• Koenzymy
• Prekurzor niacin
• Pyrimidinové kofaktory
• Disociabilní
• 2e- redukce
• Přenos H• NADH - katabolické dráhy
→respirace
• NADPH – redukční činidlo při
biosyntézách
• Změna spektra
• A340 = f(c)
Oxidovaná forma
O
Redukovaná forma
H
H
+
NH2 + H
NH2 + 2 [H ]
Nikotinamid
+
N
O
CH2
H
D-Ribosa
N
O
R
H
H
OH
OH
OH
NH2
O
P
OH
O
O
P
O
N
N
OH
N
N
CH2
Adenosin
O
H
H
H
OH
OH
OX
X = H
Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+)
X = PO32-
Nikotinamidadenindinukleotidfofát (NADP+)
O
Warburgův optický test
OH
H3C
+
C
H
H
Ethanol
NAD+
O
ADH
H3C
C
H
+
Acetaldehyd
NADH
+
H+
Flavinové kofaktory
• Prekurzor riboflavin
• Izoaloxazinová skupina
• Cukerný alkohol ribitol
• Prostetické skupiny
• Dva 1e- kroky
• Semichinony, radikály (zdroj ROS)
• Změna A nevýrazná
• Žlutá (ox) x leukoforma (red)
Redukce FAD
(Mechanismus shodný s flavinmononukleotidem (FMN))
H
H
H3C
O
H3C
N
N
H3C
H
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H2C
P
O
O
O
P
6
N
9a
5a
10
5
N
10a
4a
4
N
O
N
CH2
3
N
H
O
N
H
H
R
H3C
N
H3C
N
N
O
O
H
O
O
2
Flavinadenindinukleotid (FAD)
(oxidovaná nebo chinonová forma)
N
H
-
1
H
N
-
9
H
NH2
O
O
H3C
O
N
H
8
7a 7
Reaktivní místa
NH
8a
R
H
H
H
OH
OH
H
N
H
H
O
FADH (radikálová nebo semichinonová forma)
H
H3C
O
N
H3C
N
H
H
N
N
R
Oxidovaná forma
(FAD)
H
+
O
+
2 H
+
H
H3C
N
H3C
N
N
R
H
N
2 e-
H
H
O
Redukovaná forma
(FADH2)
H
O
H
R
H
H3C
N
N
H3C
N
H
H
O
N
H
O
FADH2 (redukovaná nebo hydrochinonová forma)
Další kofaktory oxidoreduktas
Kys. lipoová
• Vitamin
• Vázán amidicky na apoprotein
• Odtud lipoamid
[
Ubichinon, CoQ
• Volná interakce
• UQ-5n, CoQn, n = 6 – 10
• Semichinony, radikály, ROS
Ferredoxinové typy
• Nehemově vázané Fe, FeS proteiny
• Klastry Fe-S různé struktury
Hemově vázané Fe
• Různé substituenty, též lipofilní
• Různý způsob vazeb
GSH
• Detoxikace, GSH peroxidasa x reduktasa
• Též přenos skupin, xenobiotika
S
k.lipoová
O
O
+ 2 [H]
C
OH
C
OH
- 2 [H]
S
HS
SH
ubichinon
O
O
H3CO
CH3
+2e
-2e
]n H
H3CO
O
-1e
-
+1e
-
+1e
O
-
]n H
[
ferredoxiny
Cys
Cys
S
Fe
S
Fe
S
S
S
Cys
Cys
hem
HC
N
CH
N
Fe
N
HC
N
CH
glutathion
2 GSH
- 2 [H]
+ 2 [H]
-
O
-1e
CH3
H3CO
[
H3CO
H3CO
S
CH3
H3CO
-
.
O
-
-
GSSG
-
-
]n H
Další kofaktory oxidoreduktas
Plastochinon
• Obdoba UQ
• Fotosyntéza
• Redukce 2 x 1e-
Další kofaktory oxidoreduktas
Naftochinony
• Vitaminy K
• Speciální funkce
• Tvroba karboxyGlu
• Srážení krve
Další kofaktory oxidoreduktas
Fe-S klastry
• příklady prostetických skupin bílkovin feredoxinového typu
Další kofaktory oxidoreduktas
Přeměněné AK
• Prostetické skupiny
• Bílkovinný původ
Pyrolochinolinochinon
PQQ
TOPAchinon
TrihydrOxyPhenylAlanin
Kofaktory transferas
Koenzym A, CoA, CoASH
• Vyznačena struktura složeného nukleotidu s reaktivní SH skupinou
na konci.
• Pantothenát – vitamin B5.
cysteamin
pantothein
-alanin
Reaktivní skupina
pantothenová kyselina
pantoová kyselina
H
HS
NH
N
O
OH
NH
O
O
O
H3C
CH3
P
O
-
O
O
P
O
N
O
H
Thioesterová vazba s vysokým obsahem energie.
Acetyl CoA + H2O = acetát + CoA + H+
D Go´ = - 31, 4 kJ/mol
R
H
H
H
OH
ADP
O
O
C
N
O
H
Pantothenát
N
H
-
OH
-Merkaptoethylamin
NH2
S
Acyl CoA
CoA
H3C
C
S
Acetyl CoA
CoA
Lipoová kyselina
Lipoamid
isopeptidová vazba lipoové
kyseliny na vedlejší řetězec
apoenzymu (Lys) s vyznačením
reaktivní disulfidové vazby
O
H
N
H
Postranní řetězec
lysinu
S
S
OH
HN
O
H
O
Lipoová kyselina
H
S
Přenos acetylu z
acetyldihydrolipoamidu na CoA
Reaktivní disulfidová vazba
SH
Koenzym A
+
H3C
S
H
O
Acetyllipoamid
Lipoamid
O
HS
CoA
S
CoA
S
R
HS
CH3
+
HS
H
Acetyl CoA
R
Dihydrolipoamid
Další kofaktory transferas
Biotin
• Vitamin B
• Vázán na Lys enzymu
• Aktivní karboxyl
Kys. listová
THF – tetrahydrofolát
• Z folátu
• Disociabilní
• Aktivní 1C metabolity
• Syntézy nukleotidů – bazí
TPP – tiaminpyrofosfát
• Aktivní aldehydy (2C)
• Prostetická skupina
Další kofaktory transferas
ATP
• Přenos aktivních skupin
• Aktivace metabolitů
• Reakce s R-OH
‐ Voda – hydrolýza
‐ Sacharidy, bílkoviny
‐ Kinasy
• Reakce s Met
‐ Aktivní metyl
• Reakce s R-OH
‐ Přenos PP, Rib-5P na P-Rib-PP
• Reakce s R-COOH
‐ Aktivace acylů, aminoacylů
• Reakce se síranem
‐ Aktivní kys. sírová
Další kofaktory transferas
ATP
Fosfoesterová NH2
vazba
Fosfoanhydridové
• ATP urychluje řadu metabolických
reakcí při kterých dochází k jeho
hydrolýze.
• Chemická energie ATP se
uplatňuje při aktivním transportu,
může se převést na mechanickou
práci (svaly), na světlo
(bioluminiscence), elektrickou
energii a teplo.
vazby
O
O
-
P
O
-

O
O
P
-

O
O
O
P
-
biosyntetických reakcí přenosem
fosfátu, difosfátu, adenosylu a
adenylu na druhé metabolity.
N
N
O

CH2
O
H
O
H
H
OH
OH
OH
Adenosin
AMP
• ATP se účastní řady
N
N
ADP
ATP
Vitamíny
Vitaminy jako prekurzory kofaktorů
• Výskyt – vlastnosti (polarita)
• Rozpustné ve vodě – polární
• Rozpustné v tucích – nepolární
• Hledisko dietetické
• Korelace struktur s kofaktory
• Některé jsou spíše metabolity (askorbát)
•
Podrobnější přehled cs.wikipedia.org/wiki/Vitamín
Vitamíny
Kofaktor
Funkce, reakce
Onemocnění
B1
thiamin
Thiamindifosfát
Přenos aldehydické
skupiny
Beri-beri
B2
riboflavin
FMN, FAD
Oxidačně redukční
Dermatis
B2
nikotinová kyselina
NAD+.NADP+
Oxidačně redukční
Pelagra
B2
kyselina
pantothenová
CoA
Přenos acylové
skupiny
Hypertense
B2
kyselina listová
Tetrahydrofolát
Přenos C1 skupiny
Megaloblastická
anemie
B6
pyridoxin
Pyridoxalfosfát
Přenos aminoskupiny
Deprese
B12
kobalamin
Kobalamin
izomerace
Chudokrevnost
H
biotin
Biocytin
Přenos –COOH
skupiny
Není známo
C
kyselina askorbová
Kyselina askorbová
Hydroxylace donor
vodíku
Skorbut
Energetika enzymových reakcí
• Změna
volné (Gibbsovy) energie je termodynamická funkce
vedoucí k pochopení katalytického účinku enzymů.
1. Reakce probíhá samovolně, když má D G negativní znaménko.
2. Systém je v rovnováze, když je DG = 0.
3. Reakce neprobíhá samovolně, když je DG pozitivní. Musí být
dodána volná energie.
• Negativní
DG neznamená, že
proběhne dostatečně
reakce
rychle. Rychlost reakce závisí na
volné aktivační energii DG*.
Standardní volná energie a její vztah k rovnovážné
konstantě reakce.
A + B
C + D
DG = DGo + RT ln [C] [D] / [A] [B]
• DGo= změna standardní volné energie (standardní podmínky:
všechny reaktanty jsou přítomny v koncentracích 1,0 M)
• DGo´= změna standardní volné energie v biochemii: standardní
stav pH = 7. Aktivita H+ a vody je rovna 1.
Keq´ = [C] [D] / [A] [B]
DGo´ = - 2, 303 RT log10 Keq´
Keq´ = 10- DGo´ / (2, 303 RT)
Při 25oC, po zjednodušení: Keq´ = 10- DG
o´ / 1, 36
Chemické reakce
Vztah mezi rovnovážnou konstantou a ΔG
Enzymy snižují aktivační energii – volnou energii
aktivace
Přechodový stav, S
Volná energie
DG (nekatalyzovaná)
DG (katalyzovaná)
Substrát
DG reakce
Produkt
Směr reakce
Vyjadřování katalytické účinnosti enzymů
Vyjádření množství (koncentrace) enzymů
• jak čistých, tak v komplexní proteinové směsi
• hmotnostním, látkovým a katalytickým množstvím (koncentrací)
• účinnost enzymu - aktivity - odvozena od rychlosti enzymové
reakce – jako množství přeměněného substrátu či vzniklého
produktu za časovou jednotku. Tato rychlost (dc/dt) se
stanovuje vhodnými metodami, s výhodou fotometricky
Rychlost reakce
Určující charakteristika
• dc/dt
Enzymové jednotky
Aktivita enzymu = rychlost enzymem katalysované reakce
Stanovení počáteční rychlosti v0
1. Smluvní jednotky – např. u amylasy - množství enzymu, které
rozštěpilo za 30 min při 40 oC dané množství škrobu, aby ten nedával
reakci s jodem
2. Mezinárodní jednotka (IU) množství enzymu, které katalysuje
přeměnu 1 mmolu substrátu (tvorby produktu) za 1 minutu při 30°C
(za optimálních podmínek, pufr, pH, koncentrace substrátu, kofaktor)
3. Jednotka SI (rok 1973) katal (kat) množství enzymu, které katalysuje
přeměnu 1 molu substrátu (tvorby produktu) za 1 sekundu při 30°C
(za optimálních podmínek, pufr, pH, koncentrace substrátu,
kofaktor). Používají se mkat (10-6 kat) a nkat (10-9 kat).
1 kat = 1 mol/s = 6,107 IU
1 IU = 16,67 nkat
Vyjadřování katalytické účinnosti enzymů
Specifická aktivita
• aktivita vztažená na celkové množství (koncentraci) vztažného
parametru( bílkoviny) – např. nkat/mg
Číslo přeměny
• látkové množství substrátu (mol) přeměněné molem enzymu za
časovou jednotku (s) – k [s-1]
Aktivita se měří za optimálních podmínek – teplota, pH a iontová
síla roztoku.
Metody stanovení aktivity enzymu
• Stanovení změny [P] nebo [S] v čase: –dc/dt
• Výhodnější [P], ale záleží na možnostech metody
• Spektrální – absorpční, fluorescenční aj., chemické,
elektrochemické (amperometrie), enzymové (spřažené reakce)
POZOR - vliv prostředí
Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymů
Warburgův optický test
Stanovení glukosy
Vliv prostředí na rychlost enzymové reakce
Optimální podmínky
• In vivo – fysiologické prostředí
• In vitro – napodobení fyziologických podmínek
Vliv pH
• Většina enzymů je aktivní pouze v úzkém rozmezí pH. Spočívá to ve
vlivu pH na kombinaci faktorů:
A) Vazba substrátu na enzym
B) Stav ionizace substrátu
C) Ionizační stavy vedlejších řetězců aminokyselin v aktivním místě
• Většina
enzymových reakcí vytváří zvonovou křivku závislosti
reakční rychlosti na pH.
• Hodnotu pH, při které dochází k nejvyšší rychlosti enzymové reakce
nazýváme pH optimum.
Vliv pH
Vliv teploty
• Teplotní stabilita enzymů závisí na řadě faktorů jako je pH, iontová
síla prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost ligandů.
• Substráty obecně
• Nízkomolekulární
chrání enzymy před tepelnou denaturací.
enzymy s jednoduchým polypeptidovým
řetězcem obsahující disulfidové vazby, jsou obvykle teplotně
stabilnější než vysokomolekulární oligomerní enzymy.
• Obecně, se zvyšující se teplotou roste aktivita enzymů.
• Enzymy jsou proteiny, u kterých se terciární a kvarterní struktura
udržuje slabými interakcemi jako jsou vodíkové vazby, iontové
interakce atd.
• Závislost
rychlosti na teplotě obvykle vykazuje vrchol, který
označujeme jak teplotní optimum.
• Při dalším zvyšování teploty obvykle dochází k denaturaci proteinu.
• Pro práci s enzymy je doporučována IUB teplota 30 oC.
Vliv teploty
Kinetika enzymové reakce
Časový průběh enzymové reakce – prestacionární a stacionární stav
Rovnice Michaelise a Mentenové
Kinetický popis aktivity enzymu
• Reakční rychlost vo se obvykle vyjadřuje jako počet molů produktu
vytvořených za sekundu.
Podmínky pro odvození kinetické rovnice Michaelise
a Mentenové
• Tvorba komplexu enzym-substrát [ES].
• Měříme počáteční rychlost vo, kdy
se nenahromadilo takové
množství produktu, že by ovlivňovalo zpětnou reakci.
• Ustálený
stav – koncentrace [ES] se nemění i když koncentrace
substrátu a produktu se mění. Rychlost tvorby [ES] je shodná
s rychlostí rozpadu [ES].
Leonor Michaelis (1875-1949)
Maud Menten (1879-1960)
E + S
k1
k2
ES
kcat
E + P
Ustálený stav
Tvorba [ES] = Rozpad [ES]
[ET] = [E] + [ES]
k1 [E][S] = k2 [ES] + kcat [ES]
[E] = [ET] - [ES]
k1 ([ET] - [ES]) [E]
= k2 [ES] + kcat [ES]
[S]=
k1 [ET] [S] - k1 [ES] [S] = k2 [ES] + kcat [ES]
k1 [ET] [S] = k2 [ES] + kcat [ES] + k1 [ES] [S]
k1 [ET] [S] = [ES] (k2 + kcat + k1 [S])
k1 [ET] [S]
[ET] [S]
[ET] [S]
=
[ES] =
=
(k2 + kcat + k1 [S]) (k2 + kcat + k1 [S])
(k2 + kcat) / k1 + [S]
[ES] =
k1
[ET] [S]
k1
Km = (k2 + kcat) / k1
Km + [S]
dP/dt = vO = kcat [ES]
dP/dt = vO =
vO =
Vlim [S]
Km + [S]
kcat [ET] [S]
Km + [S]
Vlim = kcat [ET]
Rovnice Michaelise a Mentenové
v0 = f([S])
Rovnice Michaelise-Mentenové
- hyperbolický průběh
Vlim
Vlim . [S]
v0 =
---------------KmM + [S]
Speciální případy
[S] ◄ KM
[S] ► KM
[S] = KM
Počáteční reakční rychlost [vO]
Vlim
Vlim / 2
Km
Koncentrace substrátu [S]
v0 = Vlim / 2
Stanovení kinetických parametrů
Linearizace tzv. vynesení dle Lineweavera a Burka 1/v0 = 1/f([S])
Vlim [S]
vO =
1
vO
1
vO
1
vO
Rovnice Michaelise a Mentenové
Km + [S]
=
=
=
Km + [S]
Vlim [S]
Km
Vlim [S]
Km
Vlim [S]
+
+
[S]
Vlim [S]
1
Sklon = Km /Vlim
Vlim
Průsečík = 1/Vlim
Dvojnásobně reciproká rovnice
Lineweavera a Burka
Stanovení kinetických parametrů
Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / vo proti 1 / [S] dle Lineweavera
a Burka
1 / vo = KM / Vlim . 1 / [S] + 1 / Vlim
1 / [vO]
Sklon = Km / Vlim

Průsečík = -1/Km
Průsečík = -1/Vlim
0
1 / [S]
Význam konstant
KM je mírou afinity substrátu k enzymu
• KM = (k2
+ kcat ) / k1 je vztah mezi KM a rychlostními konstantami
enzymové reakce ve smyslu rovnice Michaelise a Mentenové.
• Formálně disociační konstantou komplexu [ES]
• Není závislá na katalytickém množství (aktivitě enzymu) v pokusu,
pokud pracujeme v oblasti lineární závislosti v na [E]
• Lze ji tabelovat a užít jako srovnávací parametr
• Mění se s externími parametry (pH, iontová síla…)
• Liší se pro různé substráty téhož enzymu
• Kosubstráty – NAD+ apod. (LDH)
• Vztah k metabolickým hotovostem – „pool“. Koncentrace
substrátu, při které je substrátem obsazena polovina aktivních
míst enzymu. Odpovídá koncentraci substrátu in vivo.
Význam konstant
KM je mírou afinity substrátu k enzymu
• V případě, že k2 je mnohem větší než kcat to znamená, že ES
komplex disociuje na E a S mnohem rychleji, než se tvoří produkt.
• Vztah se zjednoduší na KM = k2 / k1. Disociační konstanta komplexu
ES je:
KES = [E] [S] / [ES] = k2 / k1
• Jinými slovy: KM je v tomto případě rovno disociační konstantě
komplexu ES.
• Vysoké hodnoty KM ukazují na slabou afinitu substrátu k enzymu,
a naopak nízké hodnoty na vysokou afinitu.
Hodnoty KM některých vybraných enzymů
a substrátů
Enzym
Substrát
KM ( mM.L-1)
Trypsin
N-Benzoyl-Arg ethyester
3000
Pyruvátkarboxylasa
Pyruvát
HCO3ATP
400
1000
60
Penicillinasa
Benzylpenicilin
50
Karbonátanhydratasa
CO2
8 000
-Galaktosidasa
Laktosa
4000
Hexokinasa
D-Glukosa
ATP
32
1200
Glukokinasa
D-Glukosa
ATP
340
250
Význam konstant
Vlim je ukazatelem aktivity enzymu,
• Závisí na katalytickém množství enzymu v experimentu
• Dá
se užít k vyjádření katalytické účinnosti a čistoty enzymu.
V těchto případech se vypočítá tzv. specifická aktivita jako poměr
Vlim a množství enzymu (typicky v mg bílkoviny neznáme-li jeho
Mr nebo pracujeme se směsí – homogenát, krevní sérum apod.)
• Známe-li
látkové množství enzymu, pak specifickou aktivitu
vztaženou na látkové množství enzymu nazýváme číslem
přeměny (TN):
Vlim / [E] [mol.s-1/mol] = TN [s-1] = kcat [s-1]
Obvyklá chyba studentů
• Uvažují,
že rychlostní konstanta kcat nemůže být větší než k1
neboť by to znamenalo, že se komplex ES se rozpadá rychleji než
se tvoří.
• Pozor:
konstanty mají různé jednotky a proto nemohou být
srovnávány !!
• Konstanta k1 má jednotky M-1. s-1 nebo (min)-1, konstanta kcat má
jednotky s-1 nebo min-1.
• Nejsou to rychlosti, ale rychlostní konstanty prvního a druhého
řádu !!!
• Rychlost tvorby [ES] je k1 [E][S]
• Rychlost rozpadu [ES] na E + P je kcat[ES]. Může nastat stav, kdy
kcat >>k2 !!! V tom případě se KM redukuje na kcat / k1 !!!
Číslo přeměny enzymu
• Definujeme jako počet molekul substrátu převedených na produkt
enzymovou molekulou za časovou jednotku při plné saturaci
enzymu substrátem.
• Nazývá se také katalytická konstanta kcat.
Enzym
Číslo přeměny enzymu
Karbonáthydratasa
600 000
3-ketosteroidisomerasa
280 000
Acetylcholinesterasa
25 000
Penicilinasa
2 000
Laktatdehydrogenasy
1 000
Chymotrypsin
100
DNApolymerasa
15
Lysozym
0,5
Konstanta specificity
• Kinetická dokonalost enzymové aktivity poměr kcat / KM
• kcat (vyšší – účinnější katalýza) a KM (nižší – větší afinita enzymu
k substrátu)
• Spolehlivější
ukazatel substrátové specificity – preference
substrátů
•V
případě, že koncentrace substrátu je mnohem vyšší než KM
rychlost enzymové reakce je dána kcat, což je číslo přeměny
• Za fyziologických podmínek enzym nebývá substrátem nasycen.
Poměr [S] / KM je mezi 0,01 až 1,0.
• Za situace, kdy je [S] < < KM je rychlost enzymové reakce mnohem
menší než kcat, protože je mnoho aktivních míst neobsazeno
Konstanta specificity
• Existuje
nějaké číselné měřítko, které by charakterizovalo enzym za
podmínek v buňce?
• Pomocí tohoto kriteria můžeme porovnávat preferenci enzymu pro
různé substráty.
• Horním limitem je rychlost difúze substrátu do aktivního místa
enzymu.
Ester aminokyseliny
Vedlejší řetězec
kcat /KM (s-1M-1)
Glycin
-H
1,3 x 10-1
Valin
isopropyl
2,0
Norvalin
n-propyl
3,6 x 102
Norleucin
n-butyl
3,0 x 103
Fenylalanin
benzyl
1,0 x 105
Nejdokonalejším substrátem je fenylalanin
L-norleucin a L-norvalin - neproteinogenní -aminokyseliny
COO
H
C
H2
+
H2
C
CH3
C
H2
NH3
COO
H
C
H2
+
NH3
H2
C
CH3
Enzymy, pro které je hodnota kcat / KM
blízko difúzí kontrolované rychlosti vstupu substrátu
do aktivního místa
Enzym
kcat / KM (s-1M-1)
Acetylcholinesterasa
1,6 x 108
Karbonátanhydratasa
8,3 x 107
Katalasa
4,0 x 107
Fumarasa
1, 6 x 108
Triosafosfátisomerasa
2,4 x 108
-Laktamasa
1,0 x 108
Superoxiddismutasa
7,0 x 109
Dvousubstrátové reakce
Sekvenční - náhodný mechanismus (bi – bi)
• nezáleží
na tom, který z obou substrátů se váže jako první na
enzym
• příklad: kreatinkinasa
ATP Kreatin
Fosfokreatin ADP
Enzyme
Enzyme
E (kreatin)
(ATP)
Kreatin ATP
E (fosfokreatin)
(ADP)
ADP Fosfokreatin
Dvousubstrátové reakce
Sekvenční - uspořádaný mechanismus (bi – bi)
• substráty se váží do aktivního místa v určitém pořadí
• příklad: alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa
(nejdříve se
váže koenzym NADH a poté druhý substrát)
NADH Pyruvát
Enzyme
E (NADH) (pyruvát)
Laktát NAD+
E (laktát) (NAD+)
Enzyme
Dvousubstrátové reakce
Pingpongový mechanismus
• enzym přechází mezi dvěma stálými formami
• po vazbě prvního substrátu se tvoří substituovaný enzymový
meziprodukt - modifikovaný enzym
• první produkt se uvolní a poté se váže na modifikovaný enzym
druhý substrát a odštěpí se druhý produkt
• příklad: aspartátaminotransferasa
Aspartát
Oxaloacetát
E
(aspartát)
(E-NH3+ )
(oxaloacetát)
Enzyme
-Oxoglutarát
(E-NH+ )
3
(oxaloacetát)
(E-NH+
)
3
(-oxoglutarát)
Glutamát
Enzyme
E
(glutamát)
Regulační aspekty
Michaelisovská kinetika
•
vliv [S] na rychlost
Alosterické enzymy
•
•
oligomerní
•
neřídí se kinetikou Michaelise
a Mentenové.
kooperativita - efektivní
regulace
Aspartáttranskarbomoylasa (ATCasa)
• ATCasa katalyzuje první krok biosyntézy pyrimidinových nukleotidů.
• ATCasa je inhibována produktem – cytidintrifosfátem (CTP).
• Tento typ inhibice se nazývá – zpětnovazebná inhibice nebo
inhibice konečným produktem. Vždy je inhibován první reakční
krok.
• CTP je strukturně odlišný od substrátu a váže se proto na jiné místo
enzymu než substrát. Taková místa se nazývají allosterická (z řečtiny
allos jiná a steros struktura, místo).
• ATCasa
je složena ze dvou katalytických podjednotek (každá
obsahuje tři řetězce) a tří regulačních podjednotek (každá obsahuje
dva řetězce).
• ATP je allosterický aktivátor, CTP je allosterický inhibitor.
Modulace rychlosti enzymové reakce
Metabolický význam – in situ
• Regulace metabolismu
Studium metabolismu – in vitro
• Objasnění mechanizmu působení enzymů
• Součást regulací jako celku
Způsoby – účinek metabolitů, modifikace apoenzymu
• Modulátory, efektory
• Positivní – aktivátory
• Negativní - inhibitory
Inhibice enzymové aktivity
Typy inhibitorů
Ireversibilní
• Vážou
se pevně a nevratně. Blokují nevratně enzymovou
aktivitu tím, že vytváří s enzymem velmi pevný kovalentní
komplex enzym – inhibitor
Reversibilní
• Interagují s enzymem vratně
• Dají se odstranit např. dialýzou, gelovou chromatografií
• Typy reversibilních inhibicí
‐ Kompetitivní
‐ Nekompetitivní
‐ Akompetitivní
Ireverzibilní inhibice
CH3
H
CH3
OH
Ser
+
F
O
CH3
H
CH3
O
O
P
O
O
H
CH3
CH3
DIPF
Acetylcholinesterasa
H
O
+
P
F
-
+
+
H
O
CH3
CH3
Inaktivovaný enzym
Příklad: Inhibice cholinesterasy a proteinas diisopropylfluorfosfátem,
který se kovalentně váže na Ser v aktivním místě nebo
•
•
Organofosfáty, těžké kovy
Lze využít jako modifikační činidla pro studium aktivního centra
Ireverzibilní inhibice
• SH-inhibitory - inaktivace cysteinového řetězce enzymu
jodacetamidem
O
O
SH
Cys
+
I
C
H2
C
NH2
S
C
H2
C
Jodacetamid
Enzym
Inaktivovaný enzym
• Alkylační činidla, rtuťnaté sloučeniny (PCMB)
NH2
+
I
-
+
+
H
Reverzibilní inhibice
Kompetitivní
• Inhibitor se váže do aktivního místa
• Strukturní podobnost se substrátem
• Soutěžení inhibitoru se substrátem
Nekompetitivní
• Inhibitor se váže jinak
• Substrát neovlivní vazbu inhibitoru
Akompetitivní
• Inhibitor se váže na komplex ES
Alosterická
• Vazba na jinou podjednotku
Schéma kompetitivní inhibice
Kompetitivní inhibice
Klasická kompetitivní inhibice
S
I
Enzym
S
Enzym
I
Enzym
Neklasická kompetitivní inhibice
S
S
Enzym
I
Enzym
I
Enzym
Buďto vstoupí substrát do
aktivního místa enzymu a
zamezí vstupu inhibitoru
nebo naopak.
Kompetitivní inhibice
Kompetitivní inhibitor
• Reaguje
s volným enzymem a
soutěží se substrátem
• Vazné místo v aktivním centru
• Může se navázat pouze na
volný enzym
•V
reakční směsi se pak
vyskytuje mimo E, S a ES ještě
EI (komplex enzym-inhibitor),
který se tvoří vratně mezi
volným enzymem a inhibitorem
• Zvýšení KM (zdánlivá hodnota)
• Vlim se nemění
Kompetitivní inhibice
Grafické vyjádření této závislosti vidíme na vynesení dle
Lineweavera a Burka
Kompetitivní inhibice
Inhibice SDH malonátem
• Jantaran (sukcinát) je
substrátem enzymu
sukcinátdehydrogenasy (vzniká
fumarát) (enzym citátového
cyklu)
• Malonát je kompetitivním
inhibitorem SDH (nelze ho
dehydrogenovat)
• Strukturní podobnost, někdy
bývá méně názorná (el. hustoty)
• Určení typu inhibice kineticky
-
COO
HC
CH2
-
Sukcinátdehydrogenasa OOC
CH2
-
COO
CH
+
2 H
-
COO
Sukcinát
Fumarát
-
COO
CH2
-
COO
Malonát
Kompetitivní
inhibitor
E + I
EI
Ki = [E] [I] / [EI]
Potlačení intoxikace ethylenglykolem – ethanolem
Tvorba oxalové kyseliny z ethylenglykolu je inhibována ethanolem:
H2C
OH
Alkoholdehydrogenasa
H2C
OH
Inhibováno ethanolem
Ethylenglykol
HO
+
CH2
CH3
Ethanol
O
H
C
H2C
COOH
OH
Aldehyd
COOH
Ethandiová
kyselina,
oxaláty
Schéma nekompetitivní inhibice
Nekompetitivní inhibice
S
S
Enzym
I
Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Nekompetitivní inhibice
•
•
Inhibitor není podobný substrátu
Váže se jak na volný E tak na
komplex ES
• Vytváří komplex EI
• [EI] nezávisí na [S], ale pouze [I]
• Vlim se snižuje
• KM se nemění
Nekompetitivní inhibice
Grafická analýza dle Lineweavera a Burka
Kompetitivní a nekompetitivní inhibice
Kompetitivní a nekompetitivní inhibice
Oranžová – nekompetice
Zelená - kompetice
Schéma akompetitivní inhibice
Akompetitivní inhibice
S
S
Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Akompetitivní inhibice
Stejné množství
substrátu a inhibitoru:
E + S
ES
+
I
30
Akompetitivní inhibice
E + P
1/vi =
Km
Vlim [S]
+
(
1
Vlim
1+
[I]
Ki
)
1 / [vO]
20
EIS
Nadbytek substrátu:
S S
S E + S
S + S
I
S
Bez inhibice
1/vO =
10
ES
Km
Vlim [S]
+
1
Vlim
ESI
Km se mění
Vlim se mění
Nadbytek substrátu
neovlivní reakci.
ES + I
Nemění se sklon
ESI
Ki = [ES] [I] / [ESI]
0
100
200
300
1 / [S], M-1
400
500
Tabulka typů inhibice a příslušných konstant
Inhibice
Kompetitivní
I se váže jen na E
Nekompetitivní
I se váže jak na E tak na ES
Akompetitivní
I se váže jen na ES
Konstanty
Roste KM, Vlim se nemění
Klesá Vlim, KM se nemění
Klesá Vlim a KM
Poměr Vlim / KM se nemění
Isoenzymy
Stejná aktivita
• Liší se apoenzym
• Podjednotkové složení
• Kinetické odlišnosti
• Úloha stáří organismu
• Orgánová specificita
Příklad LDH
Zymogeny - proenzymy
• Neaktivní formy
• Posttranslační modifikace
• Význam – proteasy
Organizace enzymů
Efektivita reakcí
• katabolické – jednodušší
• anabolické – význam organizovanosti
Typy
• enzymy volně rozpuštěné (cytoplasma – glykolýza)
• multienzymové komplexy (zvl. pro anabolické pochody –
syntéza MK, ale i katabolické pochody – využití energie)
• membránově vázané enzymy (organizovanost, vektoriální
průběh reakcí – využití energie – oxidační a fotosyntetická
fosforylace)
Praktické využití enzymů
Průmyslové využití
• Prací prostředky
• Krmivářství
• Potravinářství
• Farmacie
Lékařství
• Diagnostika - analytický nástroj
• Terapie - substituční, podpůrná, speciální
Bioanalytická chemie
• Stanovení substrátů
• Stanovení inhibitorů
Enzymová katalýza v organické chemii
• Stereoselektivita, kombinace metod
Patobiochemie - vrozené enzymatické defekty
• Známé stovky metabolických vrozených vad – incidence je 1
případ na 4000-5000 živě narozených dětí
• Příznaky se objevují obvykle několik dnů – týdnů po porodu
•Kumulace substrátů enzymu ajejich prekurzorů
•Vznik produktů vedlejšími reakcemi
Patobiochemie – diagnostika serových enzymů
• Aktivita enzymů v seru nízká - poškození buněk vede ke
zvýšení aktivity enzymů v séru → sérová diagnostika
Orgánová distribuce enzymů
LDH laktátdehydrogenasa
AST aspartátaminotransaminasa
ALT alaninaminotransaminasa
CK kreatininkinasa
HBDH hydroxybutyrátdehydrogenasa
GLDH glutamátdehydrogenasa
GGT g-glutamyltransferasa
Patobiochemie – cíle působení léků