Postup plnění úkolů k 25. listopadu 2010

1
Centrum biokatalýzy a biotransformací
BIOTRANS
Centra základního výzkumu – LC06010
Cíle projektu
Vyvinout software (2007); Zavést techniky rekombinantní DNA (2008); Studovat ES komplexy (2009);
Připravit knihovnu hydrolas (2009); Připravit knihovnu glykosidas (2009); Zorganizovat odborná a
výuková setkání (2010)
Doba řešení
1.4.2006 - 31.12.2011
Řešitelská pracoviště
Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky - příjemce - koordinátor
řešitelské pracoviště - Mikrobiologický ústav AV ČR
Křen Vladimír Prof. Ing. DrSc. - řešitel koordinátor
Masarykova univerzita v Brně - příjemce
řešitelské pracoviště - Masarykova univerzita v Brně
Damborský Jiří Doc. Mgr. Ph.D. - řešitel
Jihočeská Univerzita v Českých Budějovicích - příjemce
řešitelské pracoviště - Jihočeská Univerzita v Českých Budějovicích
Kutá Smatanová Ivana Mgr. PhD. - řešitel
Ústav systémové biologie a ekologie Akademie věd České republiky - příjemce
řešitelské pracoviště - Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR
Ettrich Rüdiger Doc., RNDr. PhD. - řešitel
Termín zahájení činnosti Centra 1. 3. 2006
Postup plnění úkolů k 25. listopadu 2010:
Materiál se předkládá Radě Centra – Brno 26. 11. 2010
2
Zpráva 2010 – společné pracoviště ÚSBE AVČR a ÚFB JU Nové Hrady
Postup plnění úkolů 2010:
Předmětem výzkumné činnosti oddělení struktury a funkce proteinů, společné
laboratoře Ústavu systémové biologie a ekologie Akademie věd ČR, v.v.i. a Ústavu fyzikální
biologie Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích se sídlem v Nových Hradech, je vývoj
a aplikace výpočetních metod, metod pro sledování změn v kvarterní struktuře ovlivňující
enzymovou aktivitu. Adaptace metod molekulární dynamiky a počítačového dokování pro
předpověď katalytické aktivity enzymů. Vývoj a zavedení nových nestandardních a
pokročilých krystalizačních metod pro získání difraktujících krystalů enzymů používaných v
Centru. S tímto cílem jsou spojeny molekulárně biologické, biochemické a biomolekulární
postupy vedoucí k získání definovaných a čistých vzorků proteinů vhodných pro
krystalogenezi.
V roce 2010 byl dokončen model vysvětlující allosterickou aktivaci bakteriálního
regulonu ArgR z E. coli podle symetrického MWC modelu a byl vytvořen nový symetrický
model allosterické aktivace pro případy záporné kooperace. Tyto výsledky byly publikován v
prestižním časopise PLOS Computational Biology.
Pokračoval výzkum s cílem objasnit mechanismus fungování restrikčníchmodifikačních systémů Typu I. Byly připraveny mutantní formy HsdR podjednotky
bakteriálního restrikčního enzymu EcoR124I z E. coli. Byl vytvořen nový komplexní model
propojení translokační a endonukleasové funkce pro restrikční-modifikační systémy Typu I na
základě hodnocení experimentálních výsledků (bodové mutace, krystalizace mutantů a in vivo
a in vitro testy) pro EcoR124I a EcoA1, a rozsáhlých výpočtů a simulací. Tyto výsledky byly
poslány k posouzení do prestižního časopisu Nature Structural& Molecular Biology.
Enzym DhaA z Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064 patří do skupiny haloalkan
dehalogenas, které katalyzují hydrolýzu halogenovaných alkanů na příslušné alkoholy.
Haloalkan dehalogenasa DhaA a její mutantní varianty můžou být použity k detoxikaci
průmyslových polutantů, např. 1,2,3-trichloropropanu (TCP). Tři mutantní formy DhaA04,
DhaA14 a DhaA15 byly připraveny z důvodu studia významu tunelů spojujících aktivní místo
s okolním solventem. Difrakční data všech enzymů byla naměřena do vysokého rozlišení,
struktury byly dorafinovány a v průběhu roku 2010 publikovány v impaktovaném
krystalografickém časopise Acta CrystD.
Z důvodu studia alkyl-enzymového meziproduktu při reakci DhaA13 s 1,2,3trichloropropanem a kumarinem byl připraven nový mutantní protein DhaA13 (DhaAH272F). Předpokládá se, že při reakci enzymu se substrátem vzniká kovalentní alkylenzymový meziprodukt, který nepodléhá další hydrolýze. Proto je DhaA13 mutant označován
jako inaktivní, tedy dovoluje substrátu navázat se do aktivního místa za předpokladu, že další
proměna substrátu není možná. Krystaly DhaAwt a DhaA13 byly měřeny na zdrojích
synchrotronového záření, kde byly také provedeny reakce krystalů s vybranými substráty a
zaznamenána kvalitní difrakční data. Publikace pojednávající o přípravě krystalů a jejich
reakcích se substráty byla odeslána do krystalografického časopisu Acta CrystF. Struktury
obou enzymů a enzymů se substráty budou v blízké době deponovány do PDB a začne se
s přípravou strukturní publikace.
3
Projekt týkající se přípravy difraktujících monokrystalů membránového proteinu core
komplexu fotosystému II izolovaného z hrachu setého (Pisum sativum) byl v letošním roce
zaměřen na vylepšení purifikační strategie. Protože jsme schopni připravit krystaly tohoto
fotosyntetického komplexu v měřitelné ale nedifraktující kvalitě, zaměřili jsme se na přípravu
proteinového komplexu použitím nových purifikačních protokolů. Paralelně byly zahájeny
experimenty se stejným proteinovým komplexem izolovaným ze špenátu. Izolované BBY
membrány byly a nadále budou dále zpracovány v Laboratoři krystalografických studií
v Granadě, kde již byly zahájeny nové krystalizační experimenty.
Byly dokončeny krystalizační studie nového typu haloalkan dehalogenasy DbeA
izolované z Bradyrhizobium elkani USDA94. Tato haloalkan dehalogenasa je podobná
enzymu DbjA z Bradyrhizobium japonicum USDA110 (71% sequence identity), ale vykazuje
odlišné biochemické vlastnosti. K porozumění pozměněné aktivity a specificity enzymu
DbeA, byla konstruována jeho mutantní verze DbeA1 obsahující unikátní sekvenci enzymu
DbjA. Obě formy dehalogenasy - divoký typ DbeA a DbeA1, byly vykrystalizovány metodou
difúze par v sedící kapce. Difrakční data byla naměřena do rozlišení 2.2 Å pro DbeA a
DbeA1. Krystalizační protokoly týkající se přípravy proteinových krystalů uvedených
enzymů byly odeslány k publikování do časopisu Crystal Growth and Design. Struktury obou
enzymů byly vyřešeny a nyní se dokončuje strukturní článek.
Fe-regulated protein D (FrpD) je membránový lipoprotein z Neisseria meningitides, který se
může podílet na ukotvení secreted Repeat in toxins (RTX) proteinu FrpC ke vnější bakteriální
membráně. Funkce ani biologická role obou proteinů FrpD a FrpC není doposud objasněna.
Nativní FrpD43-271 a jeho selenomethioninový derivát Se-Met FrpD43-271 byly purifikovány,
podařilo se vypěstovat monokrystaly obou proteinů, které difraktovaly do rozlišení 2.25 Ǻ a
2.00 Ǻ. Krystaly nativního FrpD43-271 proteinu patří do hexagonalní prostorové grupy P62
zatímco krystaly Se-Met substituovaného derivátu FrpD43-271 proteinu patří do primitivní
orthorombické prostorové grupy P212121. Příprava krystalů a předběžná difrakční analýza
obou proteinových struktur byli publikovány v krystalografickém časopise Acta CrystF.
Struktury obou proteinů se nyní upřesňují a připravují k deponování do PDB.
Bylo dokončeno studium apo a holo forem proteinu WrbA a výsledky publikovány
v prestižním časopise. Struktury slouží k modelovacím studiím. Byly dokončeny
proteolytické experimenty a zahájeny krystalizační experimenty uvedeného enzymu
s různými substráty.
Dále pokračovalo v oblasti výpočtů intenzivní používání metod a parametrů pro
výpočty komplexů substrátů a enzymů jakými jsou hexosaminidasy, galaktosidasy,
galaktosaminidasy. Společně s pracovištěm na MBÚ byly publikovány dva články v
prestižním časopise Glycobiology a další dvě publikace jsou odeslány k posouzení do BMC
Biotechnology a FEBS Journalu.
Akce pořádané v roce 2010:
V době od 12. do 14.3.2010 se v AUC Nové Hrady uskutečnil již osmý ročník Setkání
strukturních biologů s názvem „8th Discussions in Structural Molecular Biology“. Setkání se
zúčastnilo 112 účastníků z českých a slovenských institucí.
4
Ve dnech od 25.6. do 2.7.2010 se v AUC Nové Hrady konal již čtvrtý ročník FEBS
kombinovaného praktického a přednáškového kurzu „Advanced methods in macromolecular
crystallization IV“, kterého se zúčastnilo 55 přednášejících a studentů. Kurz byl označen za
jeden z nejúspěšnějších (96% účastníků jej označilo jako výborný).
Ve dnech od 25.5. do 27.5.2010 se v Szegedu, Maďarsko, konalo „2nd Mini-symposium on
Computation of Interactions in Biological Systems“. Dr. Babak Minofar byl jeden z dvou
organizátorů toho setkání. Setkání se zúčastnilo kolem 50 účastníků z Česka, Maďarska,
Rakouska, Anglie, Německa a Polska.
Zahraniční styky –AUC Nové Hrady:
Oddělení struktury a funkce proteinů v Nových Hradech aktivně spolupracuje s řadou
významných zahraničních pracovišť zabývajících se biochemií, krystalogenezí, proteinovou
krystalografií a strukturní bioinformatikou. Tyto spolupráce jsou aktivně rozvíjeny také
v rámci Centra. Od roku 2002 spolupracujeme s Univerzitou v Princetonu (NJ, USA). Tato
spolupráce se odehrává na úrovni vědecké – strukturní a proteolytické studie proteinů, a také
na úrovni vzdělávací – díky projektu Kontakt ME640 (do roku konce 2006), Kontakt
ME09016 (2009-2012) a také díky letním školám Schola ludus (od r. 2006) se každoročně
zúčastňují studenti z naší laboratoře a Laboratoře biochemie University v Princetonu
výměnných 10-týdenních pobytů a pracují na vědeckých projektech. Do dnešní doby
navštívilo AUC v Nových Hradech 17 studentů z Princetonu v celkové délce pobytu 16
měsíců a 8 našich studentů působilo na Univerzitě v Princetonu celkem 13 měsíců. Od roku
2003 spolupracujeme s Laboratoří krystalografických studií Univerzity (LEC) v Granadě
(Španělsko) na výzkumu a způsobu aplikace pokročilých krystalizačních technik, které jsou
rozvíjeny ve španělské laboratoři a v naší Laboratoři krystalogeneze a biomolekulární
krystalografie jsou testovány na rozpustných i membránových proteinech. Od roku 1999
aktivně spolupracujeme s kolegy z Univerzity v Lübecku (Německo) (dříve působili na
Ústavu molekulární biotechnologie v Jeně) na strukturních studiích a také organizování
krystalizačních kurzů a FEBS kombinovaných kurzů, a také dlouhodobě s Univerzitou v Linci
(Rakousko) a od r. 2005 s Univerzitou v Miláně (Itálie). V roce 2004 byla zahájena
spolupráce s Biological Research Center of the Hungarian Academy of Sciences (BRC)
Szeged (Maďarsko). V roce 2010 byla nově zahájena spolupráce s Univerzitou v Ulmu,
Německo, konkrétně s Institute of Applied Physiology, Ulm University, Prof. Stephan
Grissmer, kde byl zahájen společný výzkum na interakcích CTX Toxinu s Kv1.3
membránovým kanálem. Jde o rozsáhlé výpočty molekulární dynamiky. V tomto roce byla
také zahájena další nová spolupráce se skupinou Prof. Marrinku v Groningenu, Holandsko,
ohledně coarse-grainingu interakcí proteinů s membránami. V tomto případě byl podán
společný grant k HPC2-programu evropské unie.
Za nejvýznamnější letošní návštěvy se dá považovat návštěva:
Prof. Carey z Princetonu, která v Nových Hradech byla od 1.7. do 31.7.2010.
V roce 2010 absolvovali studenti a postdoktorandi centra v oddělení struktury a funkce
proteinů v Nových Hradech tyto domácí/zahraniční stáže:
Maryna Lahoda a Alena Stsiapanava (Dr. Jereon Mesters, University of Luebeck, Německo),
3-týdenní pobyt
Tatyana Prudnikova (Doc. Jiří Damborský, Loschmidt laboratories MU Brno), 1 týden
5
Ladislav Csefalvay (Prof. Jannette Carey, Princeton University), 1 měsíc
Morteza Khabiri (Prof. Jannette Carey, Princeton University), 3 týdny
Tatiana Baikova (Dr. Santosh Panjikar, EMBL Hamburg), 2 týdny
Natalia Kulik (Prof. Jannette Carey, Princeton University), 2 týdny
Abdul Samad (Prof. Jost Ludwig, Bonn University, Germany) 1 měsíc
Žofie Sovová (Prof. Siewert Marrink, Groningen University, Netherlands) 1 měsíc
V roce 2010 získali studenti tyto stipendia:
Maryna Lahoda získala stipendium a mohla se zúčastnit 2-týdenního kurzu International
School of Crystallography, Structure and Function from Macromolecular Crystallography:
Organization in Space and Time, Erice, 3-13 June 2010, Italy
Morteza Khabiri získal stipendium “International travel grants of the Biophysical Society“ a
mohl se zúčastnit: 54th Annual Meeting, 20-24 února, 2010 San Francisco , USA
Abdul Samad získal stipendium od OPEC a mohl se zúčastnit: 3rd interdisciplinary meeting
with Nobel Laureates at Lindau (Germany) 26-06 to 3-07.2010.
Abdul Samad získal stipendium od Baden-Württemberg International, a mohl se zúčastnit:
Post Conference Programme to the 60th Meeting of Nobel Laureates in Lindau (Germany),
3.07 to 7.07.2010.
Abdul Samad získal stipendium od YTF FEBS, a mohl se zúčastnit: Fundamentals of Modern
Methods of Biocrystallography - BioCrys2010 Oeiras, (Portugal) 9-16.10.2010.
Ekaterina Sviridova získala stipendia a mohla se zúčastnit:
8-10.06.2010 EMBO Young Scientist Forum, Prague, Czech Republic
poster: "Preliminary crystallographic characterization of Iron-regulated protein
FrpD from Neisseria meningitidis".
5-10.09.2010 BCA/CCP4 Protein Crystallogaphy Summer School, Oxford, England
presentation: "Crystallographic study of the Iron-regulated protein FrpD from
Neisseria meningitidis".
9-16.10.2010 FEBS Course BioCrys 2010, Oeiras, Portugal. YTF grant.
poster: "Preliminary crystallographic characterization of Iron-regulated protein
FrpD from Neisseria meningitidis".
Změny ve složení řešitelského týmu:
Dne 22.10.2010 nastoupila na MD Tatyana Prudnikova, její místo bylo do konce roku 2010
obsazeno Alenou Stsiapanovou (stejný úvazek).
Stav financí:
pro rok 2010 nebyly investice plánovány
mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem
neinvestiční prostředky jsou čerpány minimálně z 95% v souladu s návrhem
6
Plán prací pro rok 2011 včetně odborných akcí:
V rámci dosavadní práce bylo získáno poměrně velké množství zkušeností,
krystalizačních dat, pomocí purifikace a exprese byly získány enzymy v dostatečné čistotě, a
také byly vyvinuty parametry silových polí GROMOS96, GMX a OPLS pro substráty
enzymů studovaných v Centru a současně byl vyvinut metodický postup pro sledování
aktivace proteinu přes změny v kvartérní struktuře.
Využití této expertízy pro ověření poznatků o symetrické allosterii podle MWC
modelu pro případy záporné kooperace, a dále pro vytvoření nového komplexního modelu
pentamerických restrikčních-modifikačních systémů Typu I, širší spektrum substrátů a
enzymů, a krystalogeneze a krystalografie dalších studovaných rozpustných a membránových
proteinů jsou plánovány na další rok 2011. Dále se intenzivně podílíme na komplexním studiu
β-N-acetylhexosaminidasy pomocí molekulárního modelování a konsolidaci výsledků.
Alternativní krystalizační techniky vyvinuté v naší laboratoři budou použity pro
optimalizaci krystalizačních podmínek za účelem získání krystalů nových druhů proteinů
v kvalitě a velikosti vhodné k difrakčním experimentům. Výsledky krystalizačních analýz
budou diskutovány v průběhu následujícího roku. Cíle projektu budou spočívat 1) v aplikaci
našich nejnovějších poznatků z krystalizace rozpustných a membránových proteinů na
krystalizaci nových rozpustných a membránových proteinových komplexů pomocí
standardních, pokročilých a alternativních technik, 2) ve snaze získat monokrystaly proteinů
v kvalitě vhodné k difrakčnímu měření, a v neposlední řadě 3) v použití nově vyvinutých
GCB sad krystalizačních roztoků, které budou aplikovány pro rozpustné i membránové
proteiny. Konkrétně se budeme zabývat studiem mutantních haloalkan dehalogenas DhaA12,
DhaA31, DhaA13 s vybranými substráty, DbeA, DbeA1 a DbeA3 se substráty, nového Spur
enzymu, membránových fotosyntetických komplexů a lipoproteinu (FrpD) z Neisseria
meningitidis, WrbA se substráty, HsdR podjednotky, atd.
Dále se zaměříme na komplexní model pentamerických restrikčních-modifikačních
systémů Typu I včetně pochopení propojení mezi jednotlivými enzymovými aktivitami.
Vytvoření a ověření nového komplexního modelu pentamerických restrikčních-modifikačních
systémů Typu I probíhá na základě hodnocení experimentálních výsledků (bodové mutace a
in vivo a in vitro testů) pro EcoR124I a EcoA1, a rozsáhlých výpočtů a simulací. V případě
ověření poznatků o symetrické allosterii podle MWC modelu pro případy záporné kooperace,
plánujeme rozsáhlé výpočty intaktního Arg Repressoru z E. coli. a jiných allosterických
systémů jako CyclicAMP Receptor Protein CAP k ověření poznatků.
Dále bude v oblasti výpočtů pokračovat intenzivní používání metod a parametrů pro
výpočty komplexů substrátů a enzymů jakými jsou hexosaminidasy, galaktosidasy,
galaktosaminidasy a WrbA. V případě WrbA bude dokončen screening substrátové databáze
k nalezení optimálního substrátu.
Dále se plánuje opakování letního symposia "Věda na hranicích". Letní škola se bude
už tradičně konat v červenci na Nových Hradech pro vysokoškolské studenty i absolventy
technických nebo přírodovědných oborů. Tato škola je zaměřena na praktické seznámení s
vědeckou praxí. V rámci letní školy probíhá cyklus přednášek předních světových odborníků
„Věda na hranicích“.
Tento úkol budou řešit všichni členové týmů ÚFB a ÚSBE, členové týmů MBÚ a MU
se budou podílet na některých přednáškách.
7
FEBS komisi bude předložen projekt na uskutečnění 5. ročníku FEBS kombinovaného
praktického a přednáškového kurzu „Advanced methods in macromolecular crystallization
V“, kterého hlavním organizátorem je Ivana Kutá Smatanová. Krystalizační kurz se bude
konat v AUC na Nových Hradech od 29.6. do 6.7.2012.
Noví studenti:
Volha Shmidt (garant I.Kutá Smatanová)
Katsiaryna Tratsiak (garant I.Kutá Smatanová)
Diraj Sinha (garant Rudi Ettrich)
Obhajoby (PhD.):
Jaroslava Kohoutova (śkolitel R. Ettrich, březen 2010 na PřF JU)
Abdul Samad (śkolitel R. Ettrich, listopad 2010 na PřF JU)
Publikace 2010:
IF
(2010)
E. Sviridova, L. Bumba, P. Řezacova, K. Prochazkova, D. Kavan, K. Bezouska, 0.511
M. Kuty, P. Sebo, I. Kuta Smatanova: Crystallization and preliminary
crystallographic characterization of the iron-regulated outer membrane
lipoprotein FrpD from Neisseria meningitidis. Acta Cryst F66, 1119-1126
(2010), DOI: 10.1107/S174430911003215X
Název publikace
Stsiapanava, A., Dohnalek, J., Gavira, J. A., Kuty, M., Koudelakova, T.,
Damborsky, J. and Kuta Smatanova, I.: Atomic resolution studies of haloalkane
dehalogenases DhaA04, DhaA14 and DhaA15 with engineered access tunnels.
Acta Cryst D66, 962-969, (2010), DOI: 10.1107/S09074449100027101
2.257
T. Prudnikova, J. A. Gavira, P. Řezáčová, E. Pineda Molina, I. Hunalová, E.
Sviridova, V. Shmidt, J. Kohoutová, M. Kutý, D. Kaftan, F. Vácha, J. M. GarcíaRuiz and I. Kutá Smatanová: Towards the crystallization of photosystem II core
complex from Pisum sativum L. Cryst. Growth Des. 10 (8) 3391-3396 (2010).
DOI: 10.1021/cg901593x
4.046
Rebecca Strawn, Michael Green, Thomas Stockner, Jannette Carey, Rudiger Ettri
ch (2010) Symmetric allosteric mechanism of hexameric Escherichia coli
arginine repressor exploits competition between L-arginine ligands and resident
arginine residues PLOS Computational Biology 6: 6. e1000801 June
5.759
Natallia Kulik, Lenka Weignerová, Tomáš Filipi, Petr Pompach, Petr Novák, Hy
nek Mrázek, Kristýna Slámová, Karel Bezouška, Vladimír Křen, Rüdiger Ettrich
(2010) The α-galactosidase type A gene aglA from Aspergillus niger encodes a
fully functional α-N-acetylgalactosaminidase Glycobiology 20: 11. 1410-1419.
3.929
Kristýna Slámová, Radek Gažák, Pavla Bojarová, Natallia Kulik, Rudiger Ettrich
, Helena Pelantová, Petr Sedmera, Vladimír Křen (2010) 4-Deoxy-substrates for
beta-N-acetylhexosaminidases: how to make use of their loose specificity
3.929
8
Glycobiology 20: 8. 1002-1009.
Žofie Sovová, Vladimír Kopecký Jr, Tomáš Pazderka, Kateřina Hofbauerová,
Daniel Rozbeský, Ondřej Vaněk, Karel Bezouška, Rüdiger Ettrich (2010)
Structural analysis of natural killer cell receptor protein 1 (NKR-P1)
extracellular domains suggests a conserved long loop region involved in ligand
specificity Journal of Molecular Modeling DOI: 10.1007/s00894-010-0837-y
Abdul Samad, Lucie Sura, Jan Benedikt, Rudiger Ettrich, Babak Minofar,
Jan Teisinger, Viktorie Vlachova (2010) The C-terminal basic residues
contribute to the chemical and voltage-dependent activation of TRPA1
Biochemical Journal doi: 10.1042/BJ20101256.
N. Kulik, K. Slamova (2010) Computational Modelling of Catalytic Properties
and Modified Substrates of Fungal beta-N-Acetylhexosaminidases, Mini
Reviews in Organic Chemistry, in press
Chen, X.; Minofar, B.; Jungwirth, P.; Allen, H. (2010): Interfacial molecular
organization at aqueous solution surfaces of atmospherically relevant
dimethylsulfoxide and methane sulfonic acid using sum frequency spectroscopy
and computer simulations. Journal of Physical Chemistry B, in press
Jana Jirásková, Rudiger Ettrich, Barbora Vorlová, Hillary Hoffman, Martin Lepší
k, Petr Jansa, Jan Konvalinka (2010) Inhibition of Human Serine Racemase, an
Emerging Target for Medicinal Chemistry Current Drug Targets in press.
R Strawn, T Stockner, M Melichercik, L Jin, J Carey, R Ettrich (2010) Synergy
of molecular dynamics and isothermal titration calorimetry in studies of allostery.
In: Methods in Enzymology, Biothermodynamics C Edited by:Michael L.
Johnson, Jo M. Holt , Gary K. Ackers, in press
Ondrej Kaplan, Karel Bezouska, Ondrej Plihal, Rudiger Ettrich, Natallia Kulik,
Ondrej Vanek, Daniel Kavan, Oldrich Benada, Anna Malandra, Ondrej Sveda,
Alicja B Vesela, Anna Rinagelova, Kristyna Slamova, Maria Cantarella,
Jurgen Felsberg,
Jarmila Duskova,
Jan Dohnalek,
Vladimir Kren,
Ludmila Martinkova (2010) Heterologous expression, purification and
characterization of nitrilase from Aspergillus niger K10 BMC Biotechnology
submitted.
Stsiapanava, A., Chaloupková, R., Fortova, A., Brynda, J., Weiss, M. S.,
Damborsky, J. and Kuta Smatanova, I.: Crystallization and preliminary X-ray
diffraction analysis of the wild type haloalkane dehalogenase DhaA and the
variant DhaA13 complexed with different ligands. Submitted to Acta Cryst F.
(2010)
T. Prudnikova, R. Chaloupkova, Y. Sato, Y. Nagata, M. Kuty, J. Damborsky, and
I. Kuta Smatanova: Development of crystallization protocol for the DbeA1
variant of novel haloalkane dehalogenase from Bradyrhizobium elkani USDA94.
Submitted to Crystal Growth and Design (2010)
Eva Csefalvay, Mikalai Lapkouski, Alena Guzanova, Ladislav Csefalvay,
Tatiana Baikova, Igor Shevelev, Pavel Janscak, Ivana Kuta Smatanova, Santosh
Panjikar, Jannette Carey, Marie Weiserova, Rüdiger Ettrich:
Functional coupling of duplex translocation to DNA cleavage in a type I
restriction enzyme, Submitted to Nature Structural&Molecular Biology (2010)
2.336
5.155
1.448
3.471
3.932
Book
chapter
2.732
0.511
4.046
12.273
9
Přednášky:
Rudiger Ettrich: Coupling of endonuclease and translocase functions in Type I restrictionmodification complexes, PepCon 2010, Proteins intercating with DNA or RNA, Bejing,
China, 21-23.3.2010 (invited lecture)
Rudiger Ettrich: Coupling of endonuclease and translocase functions in Type I restrictionmodification complexes, 2nd Mini-symposium on Computation of Interactions in Biological
Systems, May 25 – 27 2010 Szeged, Hungary (invited plenary lecture)
Ivana Kutá Smatanová: Crystallogenesis as a limited step to use X-ray analysis to solve
macromolecular structures, La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, USA
26.4.2010 (invited lecture)
Ivana Kutá Smatanová: Protein Crystallography at the University of South Bohemia.
Materials Structure 17, 2a, k29-30 (2010). Struktura 2010, Soláň, Czech Republic
Rudiger Ettrich: Was binding of free amino acids an early innovation in the evolution of
allostery?, 8th Discussions in Structural Molecular Biology, Nove Hrady, 18–20.3.2010
(invited plenary lecture)
Rudiger Ettrich: Structural and thermodynamic evidence for allosteric relaxedstate symmetry, Hofmeisterfest, October 13 – 16 2010 Prague, Czech Republic (invited
plenary lecture)
B. Minofar: Conference Talk, Solvation,structure and dynamics of ions at the air/water
interface, Aqueous Solvation of Ions,February 22 - 24, 2010, Zurich, Switzerland
B. Minofar: Conference Talk, Surface propensity and ion pair in organic
solvents, Solvation in Complex Liquids: Bridging Length Scales by Theory and
Experiment, June 23- 25 2010, Leipzig, Germany
B. Minofar: Conference Talk, Aqueous Salt Solution of Organic Solvents as a Media for
Enzymatic Reactions, 2nd Mini-symposium on Computation of Interactions in Biological
Systems, May 25 – 27 2010 Szeged, Hungary
Morteza Khabiri, Babak Minofar, Veronika Stepankova, Radka Chaloupkova, Jiri
Damborsky, Rudiger Ettrich, “Organic solvent effects on structure and fuction of haloalkane
dehalogenase DbjA, 2nd Mini-symposium on computation of Interactions in biological
systems University of Szeged, Hungary, May, 2010 (selected lecture)
Morteza Khabiri , Eva Csefalvay , Mikalai Lapkouski , Alena Guzanova , Ladislav
Csefalvay, Igor Shevelev,Pavel Janscak , Ivana Kuta Smatanova, Jannette Carey , Marie
Weiserova, Rüdiger Ettrich. “Coupling of endonuclease and translocase functions in type I
restriction-modification
enzymes“.
The
24th
AnnualGibbs
Conference
on
Biothermodynamics, 25-28 Sep 2010 Illinois University in Carbondale, IL, USA (selected
oral communication)
10
Rudiger Ettrich: Structural and thermodynamic evidence for allosteric relaxedstate symmetry, Chemistry Department, Princeton University, NJ, USA, 16.2.2010 (invited
seminar)
Rudiger Ettrich: Coupling of endonuclease and translocase functions in Type I restrictionmodification complexes, La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, USA
2.8.2010 (invited seminar)
Rudiger Ettrich: Structural and thermodynamic evidence for allosteric relaxedstate symmetry, Department of Chemical and Biochemical Engineering, University of
Vanderbilt University, Nashville, TN, USA, 10.8.2010 (invited seminar)
Rudiger Ettrich: Structural and thermodynamic evidence for allosteric relaxedstate symmetry, Max Planck Institute for Mathmatics, Leipzig, Germany, 29.10.2010 (invited
seminar)
Rudiger Ettrich: Structural and thermodynamic evidence for allosteric relaxedstate symmetry, Faculty of Sciences, University of South Bohemia, 16.11.2010 (invited
seminar)
Babak Minofar: Organic and inorganic ions at the surfaces, Department of Chemical and
Biochemical Engineering, University of Vanderbilt University, Nashville, TN, USA,
12.8.2010 (invited seminar)
Morteza Khabiri, Babak Minofar, Jiri Damborsky, Rudiger Ettrich. “A computational study
of the influence of organic solvents on the structure and enzymatic activity of haloalkane
dehalogenase DBJA.“ 18th Feb 2010, University of South California (USC), Department of
chemistry, Prof. Arieh Warshel group (invited seminar)
Morteza Khabiri, Babak Minofar, Jiri Damborsky, Rudiger Ettrich “Influence of organic
solvents on the structure and activity of haloalkane dehalogenase.“ 30th Apr 2010, Institute of
Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prof.
Pavel Jungwirth group (invited seminar)
Morteza Khabiri, Rudiger Ettrich “ A computational study of Interactions of CTX Toxin
with the Kv1.3 wildtype and mutant “ 4th Nov 2010, Institute of Applied physiology, Ulm
University, Germany,Prof. Stephan Grissmer group (invited seminar)
Maryna Lahoda, Alena Stsiapanava, Radka Chaloupkova, Jiri Damborsky and Ivana Kuta
Smatanova: Structural analysis of mutated DhaA protein from Rhodococcus rhodochrous.
Book of Abstracts of 13th Heart of Europe bio-Crystallography Meeting (HEC13), Schoneck,
Germany ( ML oral presenation)
Konferenční příspěvky publikovány ve vědeckých časopisech – prezentace formou posterů:
I. Kutá Smatanova, J. Wolfova, J. Brynda, J. R. Mesters, M. Kuty, R. Ettrich, J. Carey: New
family of tetrameric flavoproteins WrbA. Programmme and abstract book 171 (2010). 13th
International Conference on the Crystallization of Biological Macromolecules, Dublin,
Ireland
11
Michal Kuty, Tatyana Prudnikova, Tomas Mozga, Pavlina Rezacova, Radka Chaloupkova,
Yukari Sato, Yuji Nagata, Jiri Brynda, Jiri Damborsky, and Ivana Kuta Smatanova: A novel
haloalkane dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94. Programmme and
abstract book 172 (2010). 13th International Conference on the Crystallization of Biological
Macromolecules, Dublin, Ireland
Žofie Sovová, A.H. De Vries, R. Ettrich, S. Marrink, DGDG bilayer as a first step in
thylakoid membrane building, Book of Abstract from: Multiscale modeling of lipid bilayers
under equilibrium and non-equilibrium conditions, October 27, 2010 to October 29, 2010,
CECAM-HQ-EPFL, Lausanne, Switzerland
Rudiger Ettrich, Rebecca Strawn, Milan Melichercik, Thomas Stockner, Jannette Carey,
Structural and thermodynamic evidence for allosteric relaxed-state symmetry, The 24th
annual Symposium of The Protein SocietyAugust 1 – 5 2010, San Diego, California, USA
Michal Kuty, Julie Wolfova, Jiri Brynda, Jeroen Mesters, Rudiger Ettrich, Jannette Carey,
Ivana Kuta Smatanova, Structural characterization of new family of tetrameric flavoproteins
WrbA, The 24th annual Symposium of The Protein SocietyAugust 1 – 5 2010, San Diego,
California, USA
Maryna Lahoda, Alena Stsiapanava, Jeroen Mesters, Tana Koudelakova, Jiri Damborsky and
Ivana Kuta Smatanova, Structural analysis of DhaA12 mutant of the haloalkane dehalogenase
from Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064. Book of Abstract from International School
of Crystallography, Structure and Function from Macromolecular Crystallography:
Organization in Space and Time, Erice, 3-13 June 2010, Italy
Ivana Kutá Smatanová: Introduction to macromolecular crystallization. Materials Structure
17, 3a, c27-29 (2010). FEBS combined practical and lecture course 2010, Nové Hrady, Czech
Republic
E. Sviridova, L. Bumba, P. Řezáčová, P. Sebo, I. Kuta Smatanova: Crystallization study of
the iron-regulated protein FrpD from Neisseria meningitidis. Materials Structure 17, 1a, b5253 (2010). 8th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic
A. Stsiapanava, R. Chaloupková, A: Jesenská, J. Brynda, J. Damborský, I. Kuta Smatanova:
Crystallization and preliminary X-ray analysis of DhaAwild type and DhaA13 proteins from
Rhodococcus rhodochrous. Materials Structure 17, 1a, b51-52 (2010). 8th Discussions in
Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic
T. Prudnikova, T. Mozga, P. Řežáčová, R. Chaloupková, Y. Sato, M. Kutý, T. Koudeláková,
Y. Nagata, J. Damborský, I. Kutá Smatanová: Crystallization and structure-functional analysis
of a novel haloalkane dehalogonase DbeA from Bradyrhizobium elkani. Materials Structure
17, 1a, b49 (2010). 8th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech
Republic
M. Lahoda, T. Koudeláková, J. Damborský, I. Kutá Smatanová: Crystallization and
crystallography analysis of haloalkane dehalogenase mutant DhaA12 from Rhodococcus
thodochrous. Materials Structure 17, 1a, b43 (2010). 8th Discussions in Structural Molecular
Biology, Nové Hrady, Czech Republic
12
T. Baikova, M. Lapkouski, I. Kutá Smatanová, R. Ettrich, E. Csefalvay: Crystallization of
mutated enzymes potentially involved in coupling of endonuclease and translocase functions
in EcoR124I. Materials Structure 17, 1a, b32 (2010). 8th Discussions in Structural Molecular
Biology, Nové Hrady, Czech Republic
J. Wolfová, J. Carey, J. Brynda, R. Ettrich, I. Kutá Smatanová: Defining structural features of
the family of tetrameric flavoprotein WrbA. Materials Structure 17, 1a, b19-20 (2010). 8th
Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic
T. Prudnikova, T. Mozga, P. Řežáčová, R. Chaloupková, Y. Sato, M. Kutý, Z. Prokop, Y.
Nagata, J. Damborský, I. Kutá Smatanová: Structural and biochemical characterization of
novel haloalkane dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94 revealed two
halide binding sites in haloalkane dehalogenases. Materials Structure 17, 1a, b10 (2010). 8th
Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic
V. Kopecký Jr., K.Hofbauerová, J. Kohoutová, M. Lapkouski, Ž.Sovová, I. Kutá Smatanová,
R. Ettrich: Structure differences between protein crystals and solution structures monitored by
Raman spectroscopy – case study of PsbP protein. Materials Structure 17, 1a, b6 (2010). 8th
Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic
Morteza Khabiri, Veronika Stepankova, Radka Chaloupkova, Babak Minofar, Rudiger
Ettrich, Jiri Damborsky. “Influence of Organic Solvents on the Structure and Enzymatic
Activity of Haloalkane Dehalogenase DhaA“. Biophysical Society 54th Annual Meeting 2024 Feb, 2010, SanFransisco, USA, Abstract Published in Biophysical Journal, Volume 98,
Issue 7, 1374, 7 April 2010
Morteza Khabiri, Babak Minofar, Veronika Stepankova, Radka Chaloupkova, Jiri
Damborsky, Rudiger Ettrich, “Organic solvent effects on protein tertiary structure and
enzyme stability: A computational study“ 8th Discussions in Structural Molecular Biology,
18-20 march, 2010 , Nove Hrady Czech republic
Cloning and expression of rhsA and rhsB genes from E.coli, Vitali Bialevich, Eva Csefalvay
and Rudiger Ettrich, 8th Discussions in Structural Molecular Biology, Materials Structure,
vol. 17, no. 1a (2010), p. b34.
Cloning and expression of putative helikase Lhr from E.coli K12, Katsiaryna Shamayeva,
Vitali Bialevich, Eva Csefalvay and Rudiger Ettrich, 8th Discussions in Structural Molecular
Biology, Materials Structure, vol. 17, no. 1a (2010), p. b50.
Morteza Khabiri, Babak Minofar, Veronika Stepankova, Radka Chaloupkova, Jiri
Damborsky, Rudiger Ettrich, “Organic solvent effects on structure and fuction of haloalkane
dehalogenase DbjA: A Computational study“ EMBO Young Scientists Forum 8-10 June,
2010, Prague, Czech Republic
Morteza Khabiri , Eva Csefalvay , Mikalai Lapkouski , Alena Guzanova , Ladislav
Csefalvay, Igor Shevelev,Pavel Janscak , Ivana Kuta Smatanova, Jannette Carey , Marie
Weiserova , Rüdiger Ettrich. “Coupling of endonuclease and translocase functions in type I
restriction-modification enzymes“. The 24th AnnualGibbs Conference on
Biothermodynamics, 25-28 Sep 2010 Illinois University in Carbondale, IL, USA
13
B. Minofar,M. Khabiri, J. Damborsky, and R. Ettrich, Aqueous Salt Solution of Organic
Solvents as a Media for Enzymatic Reactions, The 24th annual Symposium of The Protein
SocietyAugust 1 – 5 2010, San Diego, California, USA
Abdul Samad, Jan Benedikt, Rudiger Ettrich, Jan Teisinger, Viktorie Vlachova: Structural and
functional study on Ankyrin (TRPA1) receptor. Fundamentals of Modern Methods of
Biocrystallography - BioCrys2010 9-16.10. 2010 Oeiras, Portugal.
Natallia Kulik, Lenka Weignerová, Tomáš Filipi, Petr Pompach, Petr Novák, Hynek Mrázek,
Kristýna Slámová, Vladimír Křen, Karel Bezouška and Rüdiger Ettrich, "The a-galactosidase
type A gene aglA from Aspergillus niger encodes a fully functional a-Nacetylgalactosaminidase", ISMB 2010 – 3DSig, 9-10.6. 2010, Boston, USA.
14
Zpráva 2010 – MBÚ AV ČR Praha
Studium fungálních nitrilas
Exprese, purifikace a charakterizace nitrilas z rodů Aspergillus, Gibberella, Penicillium a
Neurospora
Připravili jsme nové rekombinantní nitrilasy z vláknitých hub uvedených rodů. Jedná se o
první heterologní expresi enzymů tohoto typu. Pro jejich přípravu byl použit tento postup:
v databazích byly vyhledány geny kódující domnělé nitrilasy a vybráno několik mezi sebou
vzdáleně příbuzných (s identitou aminokyselinové sekvence asi 40 %); pro vybrané enzymy
byly navrženy a syntetizovány (GeneArt, SRN) geny optimalizované pro expresi v E. coli;
geny byly ligovány do plasmidů pET 28a(+), pET 30a(+) nebo pJOE2775 a exprimovány
v kmenech E. coli BL21-Gold (DE3) (indukce IPTG) nebo E. coli JM109 (indukce
rhamnosou). Takto byly získány nitrilasy z Aspergillus niger CBS 513.88, Neurospora crassa
OR74A, Gibberella moniliformis a Penicillium marneffei ATCC18224. Všechny enzymy
byly purifikovány, stanovena jejich substrátová specifita, reakční optima a stabilita. Bylo
zjištěno, že se liší optimálními hodnotami pH a teploty a stabilitou, ale hlavně substrátovou
specifitou. První dva enzymy jsou specifické pro arylalifatické nitrily (fenylacetonitril, 2fenylpropionitril, mandelonitril), ostatní využívají preferenčně aromatické a heterocycklické
nitrily (benzonitril, 4-kyanopyridin). Heterologní exprese byla velmi účinná, zvláště u
arylalifatických nitrilas. Rekombinantní kmeny obsahovaly vysoký podíl nitrilas na celkových
rozpustných proteinech (30-40 %); z 1 L kultury rekombinantního kmene tak bylo získáno
několik desítek mg čistého proteinu.
Sledování vlivu koexprese chaperonů na produkci rekombinantních nitrilas v E. coli
Sledovali jsme vliv koexprese kombinací různých chaperonů (GroEL/ES, dnaK-dnaJ-grpE)
na produkci výše uvedených rekombinantních nitrilas. Z několika desítek testovaných
kombinací byl vybrán systém GroEL/ES, který výrazně zvýšil celkovou produkci nitrilas u
kmenů produkujících enzymy z P. marneffei nebo G. moniliformis (až 7x vyšší produkce
nitrilas na 1 L kultury). Méně výrazný, avšak positivní vliv byl pozorován u kmenů
exprimujících kombinaci chaperonů GroEL/ES a „trigger factor“ a nitrilasy z A. niger nebo N.
crassa. Tento jev dále studujeme pomoc analýzy rozpustných a nerozpustných frakcí buněk.
Návrh a příprava mutantních nitrilas
Pro přípravu mutantů jsme zvolili jako výchozí enzymy z A. niger a N. crassa s vysokou
aktivitou k mandelonitrilu, který transformují na kyselinu mandlovou a v menší míře
mandelamid (vedlejší produkt). Navrhli jsme mutace aminokyselin v těsné blízkosti aktivního
centra, které by mohly mít vliv na enantioselektivitu a chemoselektivitu enzymů. Zatím jsme
připravili mutanty W163A u enzymu z N. crassa a W168A u enzymu z A. niger. Tyto mutace
způsobily, že enzymy tvoří z mandelonitrilu zvýšený podíl mandelamidu (v případě enzymu
z N. crassa ve vysokém přebytku nad kyselinou mandlovou). Tento enzym by se tedy dal
využít místo nitrilhydratas, které jsou mnohem méně stabilní. Další mutanty v současné době
připravujeme a analyzujeme jejich funkci. Příprava a analýza mutantů je náplní právě
probíhajícího studijního pobytu Mgr. A. Petříčkové na Univ. Stuttgart (září – prosinec 2010).
Výsledky byly publikovány v článcích v mezinárodních časopisech s recenzním řízením (3
originální články, 1 review; viz seznam) a presentovány na konferenci Biocat 2010
v Hamburgu (dva postery), na workshopu akce COST CM0701 ve Vilniusu (dvě přednášky,
15
poster) a na sjezdu chemických společností v Pardubicích (viz seznam). Další článek je
v recenzním řízení.
Amidasa a nitrilhydratasa u kmenů rodu Rhodococcus
Byla studována exprese genů pro amidasu a nitrilhydratasu, které jsou součástí souboru genů
nhr4, oxd, nhr2, nhr1, ami, nha1, nha2, nhr3, orfB kódujících enzymy a regulační proteiny
podílející se na konverzi aldoximů, nitrilů a amidů v Rhodococcus erythropolis A4 (kompletní
sekvence souboru genů 9552 bp, GenBank Acc. No. AM946017). Podle analýzy transkriptů
genů ami, nha1 a nha2 Northern hybridizací a aktivity enzymů amidasy a nitrilhydratasy při
použití buněk kultivovaných v minimálním médiu s přídavkem předpokládaných induktorů
(acetamid nebo acetonitril) je exprese genů ami, nha1 a nha2 konstitutivní. Soubor genů oxd,
nhr2, nhr1, ami, nha1, nha2 a nhr3 byl izolován také z kmene R. erythropolis CCM2595. Na
základě výsledků jejich sekvenování byly zjištěny odlišnosti v sekvencích amidasy a
nitrilhydratasy z kmenů A4 a CCM2595. Transkripční fúze identifikovaného promotoru Pami s reportérovým genem gfpuv potvrdila, že exprese operonu ami-nha1-nha2 je v obou
kmenech konstitutivní. Pro zvýšenou expresi chromosomových genů ami a nha1+nha2 byly
vybrány silné konstitutivní promotory (mutantní promotory P-per1M2 a P-dapAMA16
z Corynebacterium glutamicum). Silná transkripční aktivita těchto promotorů v kmenech R.
erythropolis byla ověřena. Promotory jsou vkládány před geny ami a nha1+nha2 systémem
dvojité rekombinace, při níž nejsou do chromosomu vnášeny vektorové sekvence ani markery
pro rezistence. Vzniklé kmeny R. erythropolis produkující amidasu a nitrilhydratasu tak
neobsahují žádné cizorodé geny.
Studium glykosidas a glykokonjugátů
Nově izolované geny pro glykosidasy byly klonovány a sekvenovány a především
sekvence α-galaktosaminidasy a α-galaktosidasy z A. niger posloužily pro srovnání
evolučních závislostí a též určení kritických míst pro vývoj jednotlivých aktivit (viz vyšlá
publikace v Glycobiology). β-N-Acetylhexosaminidasa z T. flavus - bylo zjištěno, že 4-deoxy
a 4,5-Δ substráty fungují též jako substráty pro transglykosylace, což bylo ověřeno v řadě
preparativních reakcí (viz vyšlá publikace v Glycobiology).
Byla připravena serie nových glykokonjugátů kombinovaných s imunoaktivními
peptidy LELTE, které byly spektrálně charakterizovány a byly otestovány jejich biologické
aktivity - ve spolupráce s pracovištěm v Grenoblu. Nově připravené látky mají etrémně
vysoké imunoaktivační aktivity (účinné v koncentracích 10-11 až 10-12 M) a kromě toho
nepůsobí autodestrukci imunocytů (NK buněk) spouštění apoptotické reakce (viz publikaci
v JACS).
Biotransformace flavonoidů
Byly vyvinuta původní metoda na diastereomerní diskriminaci silybinu pomocí lipas
(2 publikace vyšlé). Tato metoda byla rozpracována pro preparativní účely, což umožní
přípravu opticky aktivního silybinu v multigramových množstvím s možností scale-up i do
provozních podmínek. To má zásadní význam pro rozvoj dalšího výzkumu a aplikace této
látky. Dále byla dokončena a publikována práce řešící antivirové účinky acylderivátů silybinu
(spolu se spolupracovníky z Japonska).
Stav financí:
investiční prostředky nebyly pro letošní rok přiděleny
mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem
neinvestiční prostředky byly čerpány v souladu s návrhem, menší změny v čerpání jsou
zdůvodněny
16
Plán prací pro rok 2011:
Využití připravené knihovny hydrolas pro nové biokatalytické reakce.
U kmenů rhodokoků produkujících amidasu a nitrilhydratasu bude manipulacemi
v chromosomu R. erythropolis (zvláště modifikacemi nebo vnášením promotorů) ovlivňována
exprese příslušných genů a produkce enzymů vzniklými kmeny bude optimalizována
vhodnými kultivačními podmínkami.
Využití připravené knihovny glykosidas: Komplexní studium β-N-acetylhexosaminidasy,
konsolidace výsledků
Dokončit experimentální práce, zpracovat data, finalizovat publikace a doktorské práce
Publikace:
1. V. Vejvoda, D. Kubáč, A.Davidová, O. Kaplan, M. Šulc, O. Šveda, R. Chaloupková, L.
Martínková: Purification and characterization of nitrilase from Fusarium solani
IMI196840. Proc. Biochem. 45, 1115-1120 (2010). IF=2.44
2. A.B. Veselá, M. Franc, H. Pelantová, D. Kubáč, V. Vejvoda, M. Šulc, T. C. Bhalla, M.
Macková, P. Lovecká, P. Janů, K. Demnerová, L. Martínková: Hydrolysis of benzonitrile
herbicides and metabolite toxicity. Biodegradation 21,761–770 (2010). IF=1.873
3. O. Kaplan, K. Bezouška, A. Malandra, A.B. Veselá, A. Petříčková, J. Felsberg, A.
Rinágelová, V. Křen, L. Martínková: Genome mining for the discovery of new
nitrilases in filamentous fungi. Biotechnol. Lett., in press 2010. IF=1.636
4. L. Martínková, V. Křen: Biotransformations with nitrilases. Curr. Opin. Chem. Biol. 14,
130-137, 2010. IF=8.295
5. R. Gažák, K. Purchartová, P. Marhol, L. Živná, P. Sedmera, K. Valentová, N. Kato, H.
Matsumura, K. Kaihatsu, V. Křen: Antioxidant and antiviral activities of silybin fatty acid
conjugates. Eur. J. Med. Chem. 45, 1059-1067 (2010). IF= 3.269
6. D. Monti, R. Gažák, P. Marhol, D. Biedermann, K. Purchartová, M. Fedrigo, S. Riva,
V. Křen, Enzymatic Kinetic Resolution of Silybin Diastereoisomers. J. Nat. Prod. 73,
613-619 (2010). IF= 3.159
7. R. Gažák, P. Marhol, K. Purchartová, D. Monti, D. Biedermann, S. Riva, L. Cvak, V.
Křen: Large-scale separation of silybin diastereoisomers using lipases. Proc. Biochem.
45, 1657-1663 (2010). IF= 2.444
8. O. Renaudet, K. Křenek, I. Bossu, P. Dumy, A. Kádek, D. Adámek, O. Vaněk, D. Kavan,
R. Gažák, M. Šulc, K. Bezouška, V. Křen: Synthesis of multivalent glycoconjugates
containing the immunoactive LELTE peptide: effect of glycosylation on cellular
activation and natural killing of human peripheral blood mononuclear cells. J. Am. Chem.
Soc. 132, 6800-6808 (2010). IF= 8.580
9. K. Slámová, R. Gažák, P. Bojarová, N. Kulik, R. Ettrich, H. Pelantová, P. Sedmera, V.
Křen: 4-Deoxy-substrates for β-N-acetylhexosaminidases: How to make use of its loose
specificity. Glycobiology 20, 1002-1009 (2010). IF= 3.929
10. G. Catelani, F. D’Andrea, A. Griselli, L. Guazzelli, P. Němcová, K. Bezouška, K.
Křenek, V. Křen: Deoxynojirimycin and its hexosaminyl derivatives bind to natural
killer cells receptors rNKR-P1A and hCD69. Bioorg. Med. Chem. Lett. 20, 4645-4648
(2010). IF= 2.650
17
11. K. Slámová, P. Bojarová, L. Petrásková, V. Křen: β-N-Acetylhexosaminidase: What‘s
in a name…? Biotech. Adv. 28, 682-693 (2010). IF= 8.250
12. N. Kulik, L. Weignerová, T. Filipi, P. Pompach, P. Novák, H. Mrázek, K. Bezouška, V.
Křen, R. Ettrich. The α-galactosidase type A gene from Aspergillus niger encodes a fully
functional α-N-acetylgalactosaminidase. Glycobiology 20, 1410-1419 (2010). IF= 3.929
Kapitola v knize:
Martínková L., Pátek M., Veselá A.B., Kaplan O., Uhnáková B., Nešvera J.: Catabolism
of nitriles. V (Alvarez H.M., Steinbüchel A., ed.) Biology of Rhodococcus, Microbiology
Monographs series, Springer Verlag, pp. 171-206.
Přednášky a postery:
i. Veselá A.B., Martínková L., Kaplan O., Petříčková A., Malandra A., Rinágelová A.,
Benada O., Křen V., Bezouška K.: Purification and Characterization of Recombinant
Nitrilase from Gibberella moniliformis Co-Expressed with GroES/EL Chaperone System,
BIOCAT 2010, Hamburg (Germany), 29.8.-2.9.2010. Book of abstracts p. 159, poster P113.
ii. Petříčková A., Martínková L., Veselá A.B., Kaplan O., Malandra A., Rinágelová A.,
Benada O., Křen V., Bezouška K.: Mining of sequence data for nitrilases in filamentous
fungi: expression and characterization of nitrilases in Aspergillus, Gibberella,
Neurospora and Penicillium genera. BIOCAT 2010, Hamburg (Germany), 29.8.2.9.2010. Book of abstracts p. 137, poster P091.
iii. Veselá A.B., Martínková L., Petříčková A., Kaplan O., Rinágelová A., Křen V., Bezouška
K., Malandra A., Cantarella M.: New fungal and bacterial nitrilases for biocatalysis and
bioremediation, COST Action CM0701 CASCAT (WG1, WG3, WG4), Vilnius (Lithuania),
8.9.-11.9.2010. Proceedings, oral presentation.
iv. Uhnáková B., Ludwig R., Haltrich D., Homolka L., Lisa L., Petříčková A., Křen V.,
Martínková L.: Biotransformation of brominated aromatics by basidiomycetes: roles of
oxidative enzymes, COST Action CM0701 CASCAT (WG1, WG3, WG4), Vilnius
(Lithuania), 8.9.-11.9.2010. Proceedings, oral presentation.
v.
Rinágelová A., Vejvoda V., Veselá A.B., Martínková L.: Development of screening and
assay methods for enzymes of nitrile metabolism, COST Action CM0701 CASCAT (WG1,
WG3, WG4), Vilnius (Lithuania), 8.9.-11.9.2010. Proceedings, poster.
vi. Veselá A.B., Kubáč D., Vejvoda V., Martínková L. (2010) Hydrolysis of benzonitrile
herbicides by soil actinobacteria. Poster 12P-09. 62. sjezd asociací českých a slovenských
chemických společností. Pardubice 28.-30.6.2010.
vii. K. Křenek: Carboxylated calixarenes acting as glycomimetics in immunoactivation,
Biocatalysis and Medicinal Chemistry: Crossroads and Synergies, Semmering (Austria),
18.1.-21.1.2010. Book of abstracts: oral presentation.
viii. V. Křen, O. Renaudet: Glycopeptide rafts – immunotherapeutic at “homeopatic”
concentrations, Biocatalysis and Medicinal Chemistry: Crossroads and Synergies,
Semmering (Austria), 18.1.-21.1.2010. Book of abstracts: oral presentation.
ix. K. Slámová: 4-Deoxy hexosamines as novel substrates of β-N-acetylhexosaminidases:
Ways to new glycomimetics, Biocatalysis and Medicinal Chemistry: Crossroads and
Synergies, Semmering (Austria), 18.1.-21.1.2010. Book of abstracts: oral presentation.
18
x. L. Weignerová: Selective glycosylation of glycomimetics with β-N-acetylhexosaminidases,
Biocatalysis and Medicinal Chemistry: Crossroads and Synergies, Semmering (Austria),
18.1.-21.1.2010. Book of abstracts: poster.
xi. P. Marhol, R. Gažák, V. Křen: Comparison of C18 silica-rod monolithic and C18 packed
columns in HPLC separation of silybin and ecatylsilybindiastereoisomers, Advances in
Chromatography and Electrophoresis and Chiranal 2010, Olomouc (ČR), 8.2.-11.2.2010.
Book of abstracts: oral presentation, p. 48, ISBN 978-80-244-2470-5.
xii. K. Slámová, P. Bojarová, K. Křenek, R. Gažák, K. Bezouška, V. Křen: β-NAcetylhexosaminidase Catalyzed Transglycosylation with Altered Substrates, BIOCAT
2010, Hamburg (Germany), 29.8.-2.9.2010. Book of abstracts p. 135, poster P089.
xiii. V. Křen, R. Gažák, P. Marhol, D. Biedermann: Do we need optically pure nutraceuticals?!
Chemoenzymatic separation of silybin A and B and their biological activities, 10th
International Nutrition and Diagnostics Conference, Praha (ČR), 4.9.-7.9.2010. Book of
abstracts p.62, oral presentation L42.
xiv. Pavlík A., Knoppová M., Kaplan O., Kubáč D., Nešvera J., Martínková L., Pátek
MExpression of the genes for conversion of nitriles and amides in Rhodococcus
erythropolis 11th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms.
Melbourne, June 28 – July 1, 2010, Program Handbook p. 26, oral presentation.
xv. Pavlík A., Kaplan O., Knoppová M., Nešvera J., Pátek M.: Expression of the nitrilhydratase
and amidase genes and its regulation in Rhodococcus erythropolis, 25. kongres
Československej spoločnosti mikrobiologickej, Stará Lesná 15. -18. 9. 2010. Abstrakty str.
198.
Personální zajištění a vědecká výchova
Do konce roku 2010 se podílí na práci centra (100 % prac. úvazku) Ing. David Kubáč, který
dokončil a odevzdal disertační práci „Microbial enzymes transforming nitrogen compounds
and their application in organic chemistry“. Obhajoba na VŠCHT (Ústav kvasné chemie a
bioinženýrství, FPBT) se bude konat pravděpodobně v lednu 2011.
Doktorandi:
Mgr. Alena Petříčková, PřF UK v Praze, PGS 2. ročník - biochemie; školitelka:
L.Martínková; téma disertační práce „Struktura a biokatalytické vlastnosti nitrilas z
vláknitých hub“
Mgr. Anna Drozdová, PřF UK, PGS, školitel: V.Křen, téma disertační práce „Selektivní
glykosylace imunoaktivních látek“
Mgr. Barbora Fliedrová, PřF UK, PGS, školitelka: L.Weignerová, téma disertační práce
„Enzymy metabolismu mannosidů v přípravě N-acetyl-mannosaminových struktur“
Ing. Kristýna Slámová, VŠCHT, PGS, školitel: V.Křen, téma disertační práce „β-Nacetylhexosaminidasa z Talaromyces flavus“
Mgr. Kateřina Purchartová, PřF UK, PGS, školitel: V.Křen, téma disertační práce:
„Metabolismus silybinu a isosilybinu“
Mgr. Adam Pavlík MSc. PřF UK, PGS, školitel M. Pátek: Analýza regulace exprese genů pro
konverze nitrilů u Rhodococcus erythropolis
19
Pregraduální studenti a studenti bakalářských programů:
Alicja Barbara Veselá, Bc., PřF UK v Praze, 2. ročník mag. studia – biochemie; školitelka:
L.Martínková; téma „Nové možnosti aplikace nitrilas v biokatalýze a bioremediaci“
Anna Rinágelová, VŠCHT, 3. ročník bakal. studia – analýza potravin; praxe v Lab.
biotransformací – téma „Heterologní exprese a charakterizace nitrilas z vláknitých hub“
Diplomant: Martin Kracík PřF UK, školitel M. Pátek
Zuzana Matějčková, VŠCHT, 3. ročník bakal. studia; školitel: V.Křen; téma „Glykomimetika
pro modifikaci proteinů“
Aleksandra Golovkova, VŠCHT, školitel: V.Křen, téma bakalářské práce „Syntéza
monoesterů 2,3-dehydrosilybinu s karboxylovými kyselinami“
Lucie Husáková, 2. r. bak. studia školitel: M. Kotik
Kateřina Adamcová, PřF UK, 2. r. bak. studia školitel: L.Weignerová
Obhájené disertační práce:
Mgr. Vojtěch Vejvoda PhD., PřF UK v Praze, „Nitrile-hydrolysing enzymes: Fungal
nitrilases“; obhajoba 18.6.2010; školitelka L. Martínková
Odevzdané disertační práce před obhajobou:
Ing. David Kubáč, VŠCHT, PGS, školitelka: L.Martínková, téma disertační práce
„Mikrobiální enzymy transformující dusíkaté látky a jejich aplikace v organické chemii“
odevzdáno - obhajoba pravděpodobně v lednu 2011
Ing. Ondřej Kaplan, VŠCHT, PGS, školitelka: M.Macková, téma disertační práce „Hydrolýza
nitrilů pomocí vláknitých hub“ dokončuje - odevzání do konce r. 2010
Obhájené magisterské práce:
Mgr. Kateřina Purchartová, PřF UK, školitelé: R.Gažák, M.Stiborová, téma diplomové práce
„Využití chemoenzymových metod pro preparativní separaci diastereoisomerů silybinu“
Obhájené bakalářské práce:
Michaela Novotná, VŠCHT, školitelé: V.Křen, J.Moravcová, téma bakalářské práce „Studium
kysele katalyzované isomerace silybinu pro syntézu 10,11-cis-silybinu“
Zuzana Ježková, PřF UK, školitelka: L. Weignerová: Sulfáty silybinu
Martin Fiala, VŠCHT, školitel: V.Křen, téma bakalářské práce „ Fungální glukosidasy a jejich
využití pro syntézu glykomimetik s modifikovanými substráty“
Petra Kolářová, PřF UK, školitelé: D.Biedermann, V.Křen, téma bakalářské práce
„Preparativní dělení diastereoisomeru separace silybinu a jeho sulfátů pomocí RP-HPLC“
20
Daniela Gerstorferová, Bc., VŠCHT, školitel: M. Macková, téma bakalářské práce
„Purifikace a charakterizace fungální α-L-rhamnosidasy“
Na řešení úkolů Centra se podílejí též další pracovníci Laboratoře biotransformací - Ing.
Bronislava Uhnáková PhD, Ing. Petr Marhol, RNDr. David Biedermann, PhD.
Rozvoj mezinárodních spoluprací:
Evropské projekty
Pokračovala spolupráce Laboratoře biotransformací s ostatními účastníky akce EU COST
CM0701 („Cascade chemoenzymatic processes – New synergies between chemistry and
biochemistry“). V pracovní skupině „Cascade reactions on the nitrile group“ jsme v tomto
období spolupracovali hlavně s Universitou ve Stuttgartu na přípravě a studiu mutantních
nitrilas (Prof. Andreas Stolz). Součástí této spolupráce je současný tříměsíční studijní pobyt
Mgr. Aleny Petříčkové v této skupině.
V rámci skupiny „Combined use of oxidoreductases for the selective modification of natural
products” absolvovala Ing. Bronislava Uhnáková PhD. dvouměsíční studijní pobyt na univ.
BOKU ve Vídni (prof. D. Haltrich). Náplní práce byla studie cellobiosa dehydrogenasy a
dalších ligninolytických enzymů v basidiomycetách rodu Trametes a jejich uplatnění pro
biotransformace tetrabromobisfenolu A. Připravuje se společná publikace.
Dále naše skupina pokračovala na spolupráci na COST projektu D34 “Molecular Targeting
and Drug Design in Neurological and Bacterial Diseases” - v lednu 2010 jsme uspořádali
spolu s Prof. D. Haltrichem v Semmeringu (A) konferenci “Biocatalysis and Medicinal
Chemistry: Crossroads and Synergies”, které se účastnilo celkem 64 účastníků a pozvání k
plenárním přednáškám přijali význační odborníci jako M. Mihovilovic, Dan S. Tawfik, Don
Hilvert a další. V rámci tohoto projektu byl na stáži v Grenoble (Dr. O. Renaudet) Ing. K.
Křenek, který se zde zabýval syntézou analogů imunoaktivních LELTE peptidů.
Pokračuje spolupráce na EU COST CM0602 projektu „Inhibitors of angiogenesis: design,
synthesis and biological exploitation“ „Angiokem“ (2007-2011).
Pokračuje spolupráce na EU COST CM0804 Chemical Biology with Natural Products,
konkrétně s dr. Patrickem Trouillas, Limoges (viz stáž dr. D. Biedermanna tamtéž) na in silico
modelování streomerů silybinu a výpočtech QSAR parametrů.
Pokračuje spolupráce s Prof. R. Agarwalem v rámci bilaterálního CZ-USA projektu AMVIS
na testování nových derivátů silybinu jako protinádorových látek.
Bilaterální spolupráce s prof. L. Ellingem (Univ. Aachen, DE) na enzymové syntéze
glykomimetik (stáže studentů Drozdová, Bojarová).
Uděleny dva nové kolaborativní evropské projekty 7. FP (od ledna 2011)
NOVOSIDES "Novel Biocatalysts for the Production of Glycosides" [call: KBBE.2010.3.301 -Robust and novel biocatalysts for industrial applications]
BIONEXGEN "Developing the Next Generation of Biocatalysts for Industrial Chemical
Synthesis " [call: KBBE.2010.3.3-02 Biotechnology for 'greening' the chemical industry Industrial bioprocesses for fine and speciality chemicals and intermediates]
Zahraniční hosté na pracovišti
21
Marcela Múdra (Univ. Komenského Bratislava) 1. - 31. 3. 2010 v rámci mezinárodního
projektu COST EU COST CM0602 projektu „Inhibitors of angiogenesis: design, synthesis
and biological exploitation“ „Angiokem“
Nguyen Hoang Anh (BOKU, Vídeň) 1. 11. - 17. 12. 2010 v rámci mezinárodního projektu
ESF/COST CM0701 („Cascade chemoenzymatic processes...“)
Stáže pracovníků Centra a studentů v zahraničí:
Bronislava Uhnáková 10.1. – 26. 2. University of Natural Resources and Applied Life Science
(BOKU), Vídeň, Rakousko
Mgr. Alena Petříčková 3.9. - 3.12.2010 Univ. Stuttgart, Německo; COST-STSM-CM07016664 “Mutations of fungal nitrilases”
Mgr. Anna Drozdová, 11.10.-21.11.2010, Dept. of Biotechnology and Helmholtz-Institute for
Biomedical Engineering, Aachen, Německo, COST- STSM-CM0701-6716, “Glycosylation
with mutant His6-Tag-propeptide-catβ4GalT1“
Ing. Karel Křenek, 3.5.-29.5.2010, Univerzita Jean Fourier, Grenoble, Francie, COST D34,
“New LELTE analog synthesis”
RNDr. David Biedermann, PhD., 11.4.-27.4.2010, Limoges, Faculté de Pharmacie, Francie,
COST action CM0804 STSM , „In silico conformational analysis of silybin stereomers“
RNDr. David Biedermann, PhD., 5.6.-20.6.2010, University of Colorado, Denver, USA,
AMVIS ME10027, „Testy protinádorové aktivity derivátů silybinu“
RNDr. David Biedermann, PhD., 1.9.2010-dosud, Wien, Technical University Wien,
Rakousko, Stipendium der Stipendienstiftung der Republik Österreich für Post docs,
„Preparation of chiral lactones and anhydrides using whole – cell Baeyer-Villiger
biooxidation“
RNDr. Pavla
glykomimetik.
Bojarová,
PhD.,
11.10.-27.10.2010,
Německo:
Enzymová
syntéza
Aktivní účast studentů na konferencích:
Alicja Barbara Veselá, 62. sjezd asociací českých a slovenských chemických společností.
Pardubice 28.-30.6.2010.
Alicja Barbara Veselá, Biocat 2010, Hamburg, Německo; 29.8.-2.9.2010.
Alicja Barbara Veselá, Workshop of COST Action CM0701 CASCAT (WG1, WG3, WG4),
Vilnius (Lithuania), 8.9.-11.9.2010.
Mgr. Alena Petříčková, Biocat 2010, Hamburg, Německo; 29.8.-2.9.2010.
Anna Rinágelová, Workshop of COST Action CM0701 CASCAT (WG1, WG3, WG4),
Vilnius (Lithuania), 8.9.-11.9.2010.
22
Ing. Karel Křenek, Biocatalysis and Medicinal Chemistry: Crossroads and Synergies,
Semmering, Rakousko, 18.1.-21.1.2010.
Ing. Karel Křenek, COST ACTION D34, Florencie, Itálie, 13.10.-16.10.2010.
Ing. Kristýna Slámová, Biocatalysis and Medicinal Chemistry: Crossroads and Synergies,
Semmering, Rakousko, 18.1.-21.1.2010.
Ing. Kristýna Slámová, BIOCAT 2010, Hamburg, Německo, 29.8.-2.9.2010.
Ing. Petr Marhol, 4th Monolith Summer School&Symposium, Portoroz, Slovinsko, 29.5.3.6.2010.
Mgr. Anna Drozdová, Summer Course Glycosciences, Wageningen, Holandsko, 17.5.20.5.2010.
Mgr. Barbora Fliedrová, Summer Course Glycosciences, Wageningen, Holandsko, 17.5.20.5.2010.
RNDr. Pavla Bojarová, PhD., BIOCAT 2010, Hamburg, Německo, 29.8.-2.9.2010.
Mgr. Kateřina Purchartová, ESF-COST High-Level Research Conference on Natural Products
Chemistry, Biology and Medicine III, Acquafredda di Maratea, Itálie, 5.9.-10.9.2010.
23
Zpráva 2010 – MU Brno
Postup plnění úkolů 2010:
Byla izolována a biochemicky charakterizována nová dehalogenasa DhcA
z extremofilní bakterie Hahella chejuensis KCTC 2396. Tato dehalogenasa pochází
z halofilní bakterie a vykazuje významně vyšší aktivitu v pufru obsahujícím zvýšenou
koncentraci halogenidových iontů. Pokračováním projektu bude studium molekulárního
mechanismu zvýšené aktivity DhcA s využitím enzymové kinetiky a krystalografické
analýzy, která bude provedena ve spolupráci se skupinou Dr. I. Kuté Smatanové z ÚSBE
AVČR a ÚFB JU Nové Hrady.
Ve shodě s návrhem byl v roce 2010 studován vliv organických solventů na strukturu
a aktivitu halogenalkan dehalogenas. Bylo studováno celkem 13 různých s vodou-mísitelných
organických solventů. Na základě výsledků aktivitních měření a studia struktury proteinů
v roztoku promocí cirkulárního dichroismu a fluorescenční spektroskopie byly vybrány 3
solventy (formamid, aceton a isopropanol), u kterých byly provedeny detailní kinetické
analýzy a ve spolupráci se skupinou Doc. R. Ettricha počítačové simulace. Výsledkem
projektu je pochopení molekulárního mechanismu inaktivace enzymů organickými kosolventy, které je nezbytné pro design robustních katalyzátorů. Získané výsledky byly
prezentovány formou zvaného příspěvku na Gordon Research Conference on Biocatalysis,
Smithfield, USA (11.-16. července 2010) a v přípravě je jejich publikace.
V roce 2010 jsme dokončili studium strukturní podstaty enantioselektivity
halogenalkan dehalogenas s využitím enzymové kinetiky, proteinové krystalografie, místněcílené mutageneze, termodynamické analýzy a počítačového modelování. Prokázali jsme, že
modifikace
povrchové
smyčky
halogenalkan
dehalogenas
ovlivňuje
jejich
enantiodiskriminativní chování. Teplotní závislost enantioselektivity u β-bromoalkanů je po
odstranění smyčky převrácená, při vložení dodatečné bodové mutace se závislost selektivity
navrátí zpět. Toto chování nebylo pozorováno s α-bromoestery a dokládá rozdílnou strukturní
podstatu enantiodiskriminace těchto dvou skupin substrátů.
Obrázek 1. Dvě strukturní podstaty enantioselektivity halogenalkan dehalogenas: DbjA (zelená), DbjA Δ
(červená) a DbjA Δ + His139Ala (černá) s 2-methyl bromobutyratem (vlevo) a 2-bromopentanem (vpravo).
Mutace se smyčce mají výrazné účinky na aktivní místo, vazebné orientace a reaktivitu (R)-enantiomeru (černá)
a ( S)-enantiomeru (červená). N a W na obrázku představují Asn38 a Trp104 (Angewandte Chemie 49: 6111).
24
Počet registrovaných uživatelů programu CAVER vyvíjeného v rámci CBB dosáhl na
podzim letošního roku 3000 a práce prezentující výstupy z programu vyšly v renomovaných
vědeckých časopisech Nature Chemical Biology, Nature Methods, PNAS, JBC, aj. Program
byl doplněn o nový grafický interface umožňující flexibilní rozšiřování programu pomocí
modulů a vizualizaci tisíců struktur nezbytných pro studium dynamiky tunelů v čase.
Obrázek 2. Webové rozhraní k programu CAVER sloužícího k výpočtu a vizualizaci tunelů v proteinech
(http://loschmidt.sci.muni.cz/caver/).
Se skupinou Dr. I. Kuté Smatanové z ÚSBE AVČR a ÚFB JU Nové Hrady byly
krystalovány a vyřešeny struktury celé řady mutantních dehalogenas nesoucích mutace
v přístupových tunelech: DhaA04, DhaA13, DhaA14, DhaA15, DhaA31. Některé struktury
zachytily i přítomnost ligandů v aktivním místě enzymu. Vyřešené struktury poskytnou po
doplnění biochemických dat v roce 2011 informaci o molekulárním mechanismu výměny
ligandů mezi aktivním centrem a okolním solventem.
Akce pořádané v roce 2009:
Loschmidtovy laboratoře při Ústavu experimentální biologie MU organizovaly 5.-8.září 2010
první ročník Letní školy proteinového inženýrství. O účast na škole projevilo zájem 105
uchazečů, z nichž bylo k účasti vybráno 14 vysokoškolských a 6 středoškolských studentů.
Účastnící Letní školy projevili spokojenost s odborným obsahem i organizačním zajištěním
akce. Příští ročník Letní školy bude organizován v roce 2012. Dále jsme připravili Dny
otevřených dveří pro laickou veřejnost (23. září 2011) a pro 26 středoškolských učitelů
z různých států Evropské Unie (26. Října 2010), navštěvujících Brno v rámci evropského
projektu zaměřeného na výuku biotechnologie.
25
Postgraduální studenti:
1.
Mgr. Pavel Dvořák
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
2.
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Biologie
2009/2010-dosud
Molekulární biologie a genetika
Design a konstrukce proteinů pro biomedicínské a enviromentální
aplikace
Probíhá
Mgr. Veronika Štěpánková
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Biochemie
2007/2008-dosud
Biochemie
Modifikace enzymů nekonvenčními solventy pro technologické aplikace
Probíhá
Mgr. Khomaini Hasan
3.
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
4.
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Biochemie
2006/2007-dosud
Biochemie
Isolation and Charakterization of Novel Dehalogenaliny Enzymes
Probíhá
Mgr. Šárka Bidmanová
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
5.
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Chemie
2006/2007-dosud
Chemie životního prostředí
Vývoj optických biosensorů pro monitoring kontaminantů v životním
prostředí
Probíhá
Mgr. Jan Brezovský
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Chemie
Chemie životního prostředí
Počítačové modelování enzymů
Probíhá
2006/2007-dosud
26
6.
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
7.
Mgr. Táňa Koudeláková
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Chemie
2004/2005-dosud
Chemie životního prostředí
Izolace a konstrukce biokatalyzátorů pro enviromentální aplikace
Probíhá
Mgr. Eva Chovancová
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
9.
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Chemie
2009/2010-dosud
Chemie životního prostředí
Počítačový design enzymů pro dehalogenaci enviromentálních polutantů
Probíhá
Mgr. Martin Klvaňa, Ph.D.
Fakulta / VŠ
Program
Obor(y)
Téma
Stav práce
Přírodovědecká fakulta / Masarykova univerzita
DSP Biologie
2005/2006-2009/2010
Mikrobiologie
Strukturně-funkční a dynamické vztahy halogenalkan dehalogenas
Obhájeno
Stav financí:
pro rok 2010 nebyly investice plánovány
mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem
neinvestiční prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem
Plán prací pro rok 2011:
V průběhu řešení projektu bylo získáno velké množství unikátních krystalografických dat v
podobě struktur divokých typů a variant proteinů vyřešených do atomárního rozlišení. Jedním
z důležitých cílů řešených v roce 2011 bude komplementace struktur daty z biochemických a
biofyzikálních měření, které umožní interpretaci struktur, detailní popis strukturně-funkčních
vztahů a publikování výsledků v renomovaných biochemických časopisech.
Publikace:
27
1. Bidmanová, S., Chaloupková, R., Damborský, J., Prokop, Z. (2010) Development
of Enzymatic Fiber-optic Biosensor for Detection of Halogenates Hydrocarbons.
Analytical and Bioanalytical Chemistry 398: 1861-1966. IF = 3.480
2. Martins dos Santos, V.A.P., Damborský, J. (2010) Systems Biology at Work.
Current Opinion in Biotechnology 21: 498-501. IF = 7.820
3. Stsiapanava, A., Dohnálek, J., Gavira, J.A., Kutý, M., Koudeláková, T.,
Damborský, J., Kutá Smatanová, I. (2010) Atomic Resolution Studies of Haloalkane
Dehalogenases DhaA04, DhaA14 and DhaA15 with Engineered Access Tunnels. Acta
Crystallographica D66: 962-969. IF = 2.943
4. Prokop, Z., Sato, Y., Brezovský, J., Mozga, T., Chaloupková, R., Koudeláková,
T., Jeřábek, P., Štěpánková, V., Natsume, R., van Leeuwen, J.G.E., Janssen, D.B.,
Florián, J., Nagata, Y., Senda, T., Damborský, J., 2010: Enantioselectivity of
Haloalkane Dehalogenases and its Modulation by Surface Loop Engineering.
Angewandte Chemie 49: 6111-6115. IF = 11.829
5. Bidmanová, S., Pohanka, M., Cabal, J., Prokop, Z., Damborský, J., 2010: Early
Warning Biosensors for Detection of Chemical Warfare Agents. Chemicke Listy 104:
302-308. IF = 0.717
6. Malčíková, J., Tichý, B., Damborský, J., Kabáthová, J., Trbušek, M., Mayer, J.,
Pospíšilová, Š., 2010: Analysis of the DNA-Binding Activity of p53 Mutants Using
Functional Protein Microarrays and its Relationship to Transcriptional Activation.
Biological Chemistry 391: 197-205. IF = 3.226
7. Altmannová, V., Eckert-Boulet, N., Arneric, M., Kolesár, P., Chaloupková, R.,
Damborský, J., Sung, P., Zhao, S., Lisby, M., Krejčí, L. Rad52 SUMOylation Affects
the Efficiency of the DNA Repair. Nucleic Acids Research 38: 4708-4721. IF = 7.479
28
Přednášky:
Mozga, T., Prudniková, T., Chaloupková, R., Rezáčová, P., Sato, Y., Kutý, M., Prokop, Z.,
Nagata, Y., Kutá Smatanová, Damborský, J.: Biochemical and structural characterization of
novel haloalkane dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94 possesing two
halide binding sites, 8th Discussion in Structural Molecular Biology and Bioinformatics,
March 18-20, 2010, Nove Hrady CZ, (prezented by TM).
Štěpánková, V., Khabiri, M., Minofar, B., Prokop, Z., Ettrich, R., Damborský, J.: Effect of
organic solvents on structure and function of haloalkane dehalogenases, 8th Discussion in
Structural Molecular Biology and Bioinformatics, March 18-20, 2010, Nove Hrady CZ,
(prezented by VŠ).
Chovancová, E., Pavelka, A., Damborský, J.: Hotspot wizard: nástroj pro inženýrství enzymů,
Sigma-Aldrich, May 25-28, 2010, Milovy, CZ (presented by ECH).
Koudeláková, T., Chaloupková, R., Pavlová, M., Zimmer, Ch., Bornscheuer, U.T.,
Damborský J.: Zvýšení stability enzymu inženýrstvím přístupových tunelů, Sigma-Aldrich,
May 25-28, 2010 , Milovy, Czech Republic, (presented by TK).
Drienovská, I., Fořtová, A., Chaloupková, R., Damborský J.: Characterization of novel
haloalkane dehalogenase DhcA from extremophilic microorganism Hahella chejuensis KCTC
2396. GEM 2010, May 8-9, 2010, Brno, CZ (presented by ID).
Damborský, J., Prokop, Z., Chaloupková, R., Chovancová, E., Koudeláková, T., Brezovský,
J., Štěpánková, V., Pavelka, A., Dvořák, P.: Engineering of Enzymes by Modification of
Access Tunnels, GEM 2010, May 8-9, 2010, Brno CZ (presented by JD).
Prokop, Z., Fořtová, A., Chaloupková, R., Pavlová, M., Chovancová, E., Brezovský, J.,
Klvaňa, M., Koudeláková, T., Mozga, T., Pavelka, A., Dvořák, P., Straková, M., Damborský,
J.: Engineering of Enzymes by Modification of Access Tunnels, Novel Enzymes, April 14 17 2010, Exeter, UK (presented by ZP).
Prokop, Z., Sato, Y., Brezovský, J., Mozga, T., Chaloupková, R., Koudeláková T., Jeřábek,
P., Štěpánková, V., Natsume, R., van Leeuwen, J.E.V., Janssen, D.B., Florian, J., Nagata, Y.,
Senda, T., Damborský, J.: Enantioselectivity of Haloalkane Dehalogenases and its Modulation
by Surface Loop Engineering, Trends in Enzymology, June 13-17, Ascona, Switzerland
(presented by ZP).
Damborský, J., Koudelaková, T., Štěpánková, V.: Structure and activity of haloalkane
dehalogenases in organic co-solvents, Gordon Research Conference, July 11-16, 2010,
Smithfield, USA (presented by JD).
Damborský, J.: Protein Engineering of Biocatalysts, Hofmeisterfest, October 13-16, 2010,
Prague, CZ (presented by JD).
Hasan, K., Koudeláková, T., Fořtová, A., Chaloupková, R., Nagata Y., Damborský, J.,
Prokop Z.: Kinetics and enantioselectivity of haloalkane dehalogenase from Agrobacterium
tumefaciens c58, XIV. Setkání biochemiků a molekulárních biologů, 20.-21. dubna 2010,
Brno, CZ (presented by KH).
29
Štěpánková, V., Chaloupková, R., Brezovský, J., Khabiri, M., Ettrich, R., Damborský, J.:
How do organic solvents affect structure and function of haloalkane dehalogenases? XIV.
Setkání biochemiků a molekulárních biologů, 20.-21. dubna 2010, Brno, CZ (presented by
VŠ).
Postery:
Dvořák, P., Pavlová, M., Klvaňa, M., Brezovský, J., Chaloupková, R., Prokop, Z. and
Damborský, J.: Increasing activity of bacterial biocatalyst with toxic anthropogenic substrate
using methods of protein engineering. 25th International Symposium on Microscale
Bioseparations, March 21-25, 2010, Praha, CZ (presented by PD).
Bidmanová, Š., Prokop, Z., Chaloupková, R., Damborský, J: Construction and
characterization of fiber-optic biosensor based on haloalkane dehalogenase, Europt(r)ode X,
March 28-31, 2010, Prague,CZ (presented by ŠB).
Sýkora, J., Hof, M., Fořtová, A., Damborský, J,: Sensing hydration and mobility at the
vicinity of the active site of enzymes by means of fluorescence spectroskopy, Europt(r)ode X,
March 28-31, 2010, Prague, CZ (presented by JS).
Bidmanová, Š., Prokop, Z., Chaloupková, R., Damborský, J: Optical biosensor based on
haloalkane dehalogenase for detection of halogenated hydrocarbons in the environment.
Biosensors, 26-28 May 2010, Glasgow, UK (presented by ŠB).
Štěpánková, V., Chaloupková, R., Khabiri, M., Minofar, B., Prokop, Z., Ettrich, R.,
Damborský, J.: Struktura a funkce haloalkándehalogenas v organických rozpouštědlech,
Sigma-Aldrich, May 25-28, 2010, Milovy, CZ, (presented by VŠ).
Koudeláková, T., Chaloupková, R., Zimmer, Ch., Khabiri, M., Ettrich, R., Bornscheuer, U.T.,
Damborský, J.: Improvement of Haloalkane Dehalogenase Stability by Engineering of its
Access Tunnels, Trends in Enzymology, June 13-17, Ascona, Switzerland, (presented by TK).
Lahoda, M., Stsiapanava, A., Mesters, J., Koudeláková, T., Damborský, J., Kutá Smatanová,
I.: Structural analysis of DhaA12 mutant of the haloalkane dehalogenase from Rhodococcus
rhodochrous NCIMB 13064, International School of Crystallography, June 3-13, 2010, Erice,
Itálie (presented by ML).
Hasan, K., Koudeláková, T., Fořtová, A., Chaloupková, R., Nagata, Y., Damborský, J,
Prokop, Z.: Haloalkane dehalogenase from Agrobacterium tumefaciens C58 with new halidestabilising residues and unique kinetics, Trends in Enzymology, June 13-17, Ascona,
Switzerland (presented by KH).
Biedermannová, L., Prokop, Z., Chaloupková, R., Dvořák, P., Damborský, J., Wade, R.:
Investigation of Ligand Passage in Proteins Investigation of Ligand Passage in Proteins,
Computational Chemistry, August 29 - September 3, Les Diablerets, Switzerland (presented
by LB).
30