Protilátky třídy IgG proti viru Epstein-Baarové

Protilátky třídy IgG proti viru Epstein-Baarové
Návod na použití WESTERNBLOT testu
Objednací číslo
Protilátky proti Třída Ig
DY 2790-1601 G Virus Epstein- IgG
DY 2790-3001 G Baarové
(kompletní
antigeny)
Substrát
Formát
Westernblotové 16 x 01 (16)
proužky potažené 30 x 01 (30)
antigeny
Indikace: Infekce virem Epstein-Baarové (infekční mononukleosa, Burkittův lymfom,
karcinom nosohltanu).
Princip testu: WESTERNBLOT test umožňuje kvalitativní in-vitro stanovení lidských
protilátek proti antigenům viru Epstein-Baarové (EBV). Test obsahuje proužky
s elektroforeticky rozdělenými extrakty antigenů z EBV. V prvním reakčním kroku se
proužky blotu inkubují s ředěnými vzorky séra pacientů. V případě pozitivních vzorků, se
specifické protilátky třídy IgG (také IgA a IgM) navážou na antigeny. K detekci navázaných
protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským IgG značenou
enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci.
Obsah kitu:
- Testovací pružky s elektroforeticky rozdělenými antigeny EBV: 16 proužků
Enzymový konjugát: 10 x koncentrované alkalickou fosfatasou značené kozí anti-lidské
IgG protilátky; 1 x 3 ml, které po na ředění poskytnou 30 ml konjugátu připraveného
pro užití
Koncentrovaný pufr: 1 x 50 ml 10 x koncentrovaného pufru pro přípravu 500 ml
universálního pufru Plus
- Substrátový roztok : 1 x 30 ml 10 x koncentrovaného nitroblutetrazoliumchlorid/5-brom4-chlor-3-indolylfosfátu (NBT/BCIP)
- Vyhodnocovací matrice
- Vyhodnocovací protokol: 1 list
- Inkubační komůrky: 2 x 8 kanálků
- Plastová folie
- Návod k použití
Uskladnění: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až
+ 8 oC.
Poznámka: Používejte vždy jen součásti, které mají stejné lot číslo.
Upozornění: Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se
kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava reagencií
Upozornění: Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou
(+18 °C až 25 °C) teplotu.
Potažené testovací proužky: Připravené pro užití. Neotvírejte balení s proužky dříve, než
jsou pružky membrány vytemperované na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí
jednotlivých proužků. Ihned po vyndání proužků, které budete užívat, přemístěte zbylé
1
proužky zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé
proužky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě
v rozmezí teplot +2 oC až + 8 oC.
Universální pufr (10 x koncentrovaný): Pro přípravu universálního pufru Plus pro použití
řádně protřepejte lahvičku (50 ml) a odeberte z lahvičky potřebné množství koncentrovaného
pufru čistou pipetou a zřeďte je 1:10 deionizovanou, nebo destilovanou vodou. Na inkubaci
jednoho proužku je potřeba 2 ml koncentrovaného pufru, který se naředí 18 ml deionizované,
nebo destilované vody. Naředěný pufr je stabilní maximálně dva dny za teploty + 2°C až 8°C.
Enzymový konjugát: Anti-lidské IgG jsou 10 x koncentrované. K přípravě enzymového
konjugátu pro užití v testu odebereme z lahvičky potřebné množství konjugátu čistou
pipetou a zředíme je 1:10 univerzálním pufrem. Na otestování jednoho proužku je potřeba
0,15 ml koncentrátu anti-lidského IgG, který se naředí 1,35 ml universálního pufru Plus.
Substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý
na světlo.
Příprava vzorků: Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 51 universálním pufrem Plus.
Například, přidejte 30 µl séra k 1,5 ml naředěného universálního pufru a dobře promíchejte.
Inkubace
Blokování: Naplňte žlábky v inkubační komůrce podle počtu vzorků séra, které mají být
testovány, a to tak, že do každého žlábku napipetujte 1,5 ml universálního pufru. Vyjměte
potřebný počet testovacích proužků ze sáčku a vložte po jednom do žlábků. Číslo na proužku
musí být dobře viditelné. Inkubujte 15 minut při pokojové teplotě na třepačce. Poté odsajte ze
žlábků veškerou kapalinu.
Inkubace vzorků:
(1.krok)
Promývání:
Naplňte každý žlábek naředěným vzorkem séra a inkubujte při
pokojové teplotě po dobu 30 minut na třepačce.
Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte 3 x 5 minut
každý žlábek 1,5 ml universálního pufru za stálého třepání.
Inkubace konjugátu: Napipetujte 1,5 ml ředěného enzymového konjugátu ( anti-lidské IgG
(2. krok)
kojugované s alkalickou fosfatasou) do každého žlábku a inkubujte při
pokojové teplotě po dobu 30 minut na třepačce.
Promývání:
Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte 3 x 5 minut
každý žlábek 1,5 ml universálního pufru za stálého třepání.
Inkubace substrátu: Napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do každého žlábku a
(3. krok)
inkubujte při pokojové teplotě po dobu 10 minut na třepačce.
Zastavení:
Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte
každý žlábek 3 x deionizovanou nebo destilovanou vodou.
2
Vyhodnocení a interpretace výsledků testu Anti-EBV-WESTERNBLOT (IgG)
Postup zpracování výsledků: Proužky blotu po inkubaci položte na filtrační papír a opatrně
je vysušte. Pomocí čisté lepící pásky je přilepte na plastovou folii, která je dodávána spolu
s vyhodnocovacím protokolem. Položte vyhodnocovací matrici na nalepené bloty tak, že
černý pružek nad čísly blotů je v jedné linii se značením ve vyhodnocovací matrici. Číslo
šarže na vyhodnocovací matrici musí být identické s číslem na balení, ze kterého byly
vyjmuty blotovací proužky. Jasně rozpoznatelné proužky na blotu, které zaujímají stejnou
pozici jako vyznačené proužky na vyhodnocovací matrici, se zaznamenají do
vyhodnocovacího protokolu.
Pod číslem na proužku blotu je kontrolní proužek. Správné provedení inkubace je
potvrzeno intenzivním vybarvením kontrolního proužku.
Antigeny: Zdrojem antigenů pro EUROIMMUN Anti –EBV WESTERNBLOT je celkový
extrakt z P3HR1 buněk. Virový extrakt se rozdělil podle molekulové hmotnosti na
diskontinuální elektroforeze na polyakrylamidovém gelu a proteiny se přenesly na
nitrocelulosovou membránu. Z každé soupravy (kitu), se odeberou dva proužky a inkubují se
s referenčním sérem Jeden z těchto proužků je součástí testu, druhý zůstává u EUROIMMUN
pro potřeby dokumentace.
Specifikace antigenů EBVna testovacích proužcích (číslo=molekulová hmotnost v kDa).
VCA
(kapsidový EA (časný antigen) EBNA (EB-jaderný Další antigeny
protein viru)
antigen)
p125,
EA-R p93, EA-D p45, EBNA –1 p79
p27
p65,p42,p41,p40,p33, EA-D p43
p22 (p22 je markerem
pro pozdní fázi EBV
infekce)
Interpretace výsledků: Ze zkušenosti víme, že výsledky EBV-WESTERNBLOT
testu lze rozdělit do tří kategorií: negativní, nerozhodné a pozitivní výsledky.
Třída IgG protilátek
VCA
Negativní
Žádný z VCA proužků není pozitivní
Nerozhodný
Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se střední intenzitou
Pozitivní
Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se silnou intenzitou
EA
Negativní
Žádný z EA proužků není pozitivní
Nerozhodný
Alespoň jeden EA proužků je pozitivní se střední intenzitou
Pozitivní
Alespoň jeden EA proužků je pozitivní se silnou intenzitou
EBNA-1
Negativní
EBNA-1 proužek je negativní
Nerozhodný
EBNA-1 proužek je se střední intenzitou
Pozitivní
EBNA-1 proužek je se silnou intenzitou
3
Třída IgM protilátek
VCA
Negativní
Žádný z VCA proužků není pozitivní
Nerozhodný
Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se střední intenzitou
Pozitivní
Alespoň jeden VCA proužků je pozitivní se silnou intenzitou
Vztah mezi průběhem infekce a výsledky Anti-EBV-WESTERNBLOT testu
Stav infekce
Negativní
Primární
infekce
Anti-EBV-WESTERNBLOT
Žádný proužek, nebo jen velmi slabé signály
Alespoň jeden silný VCA-proužek je pozitivní při detekci IgG- a IgM
protilátek
Poznámky: Asi u 5% pacientů se netvoří IgM protilátky proti VCA. Studie
s klinicky charakterizovanými séry ukázaly, že v těchto případech protilátky
třídy IgG proti VCA v kombinaci s protilátkami třídy IgM proti EBNA-1 a
p27 ukazují na primární infekci.
Pozdní fáze Při detekci IgG je pozitivní a alespoň jeden silný VCA- proužek.
Poznámky: Asi u 5% pacientů se netvoří protilátky IgG proti EBNA-1, nebo
infekce
je jejich titr zanedbatelný. Studie s klinicky charakterizovanými séry ukázaly,
že v těchto případech protilátky třídy IgG proti VCA- proužek p22 ukazují na
pozdní fázi infekce.
Reaktivace Při detekci protilátek třídy IgG je pozitivní proužek odpovídající EBNA-1 a
alespoň jeden silný VCA- proužek a alespoň jeden silný EA proužek, nebo
alespoň jeden silný VCA- proužek při detekci protilátek třídy IgM.
Při detekci protilátek IgG je proužek EBNA-1 negativní a alespoň jeden VCA
proužek při detekci IgG je pozitivní a VCA proužky při detekci IgM
protilátek jsou negativní a alespoň jeden EA-proužek při detekci IgG je
pozitivní.
Následující kombinace výsledků jsou průkazné pro reaktivaci infekce, stejně
tak pro primární infekci se ztrátou protilátek proti EBNA-1: EBNA-1 proužek
je negativní a alespoň jeden silný VCA proužek při detekci IgG protilátek je
pozitivní. Při detekci protilátek třídy IgM jsou EA-proužky negativní a VCAproužky jsou také negativní.
Klinické studie
Pomocí testu EUROIMMUN Anti- EBV WESTERNBLOT bylo zkoumáno 143 klinicky
charakterizovaných sér pacientů (Dr. Gaertner, University Hospital Saarland, Homburg/Saar,
Německo).
Stav infekce
Negativní
(n=12)
Reaktivace
(n=30)
WESTERN
BLOTvýsledky
Pozitivní
Nerozhodné
Negativní
Pozitivní
Nerozhodné
Anti -VCAIgM (%)
Anti-VCAIgG (%)
0 (0)
0 (0)
12 (100)
4 (13)
2 (7)
0 (0)
2 (17)
10 (83)
30 (100)
0 (0)
4
Anti-EAIgG
(%)
0 (0)
3 (25)
9 (75)
Anti-EBNA-1IgG (%)
0 (0)
0(0)
12 )100)
22 (73)
4 (13)
Primární
infekce
(n=15)
Pozdní fáze
infekce
(n=86)
•
•
Negativní
Pozitivní
Nerozhodné
Negativní
Pozitivní
Nerozhodné
Negativní
24 (80)
8 (53)
2 (13)
5 (33)*
0 (0)
13 (87)
2 (13)
0 (0)
85 (99)
1 (1)
0 (0)
20 (67)
3(10)
7 (13)
4 (13)
4 (27)
2 (13)
9 (60)
76 (88)
7(8)
3(3)**
Pět sér s primární infekcí EBV nevykázalo žádné anti-VCA protilátky typu IgM. Dvě
z těchti sér obsahovala kromě anti-VCA protilátek typu IgG ještě protilátky typu IgM
proti EBNA-1 a p27.
Tři séra od pacientů v pozdní fázi infekce nevykázala žádné protilátky typu IgG proti
EBNA-1, ale tři séra vykázala protilátky IgG proti VCA-proužku p22. Všechna séra
pacientů s pozdní fází infekce vykázala protilátky typu IgG proti VCA-p22, zatímco žádné
sérum pacientů v primární fázi infekce neobsahovalo protilátky typu IgG proti VCA-p22
proužku.
Klinický význam
Virus Epstein-Baarové způsobuje infekční mononukleosu, horečnaté onemocnění se zánětem
hltanu a lymfadenopathií, které je často doprovázené hepatosplenomegalií a zřídka vyrážkou.
Avšak infekce EBV se často dávají do spojitosti i Burkittovým lymfomem a karcinomem
nosohltanu. Infekční mononukleosa se musí odlišit od cytomegalie a toxoplasmosy a
v případě atypického vývoje i od HIV a dalších infekcí.
Imunitní odpověď na EBV-CA patří mezi heterofilní protilátky a se zvýšením titru protilátek
IgG se uplatňuje při indikaci primárního ranného stadia infekce EBV. Jsou-li přítomné
protilátky proti jadernému antigenu viru Epstei-Baarové (EBNA), jedná se obvykle o pozdní
fázi infekce EBV. Ačkoli se jaderné antigeny EBV, označované EBNA 1 až 6 syntetizují
dříve, než další EBV antigeny (časné antigeny a antigeny kapsidového proteinu) v průběhu
infekce, jsou presentovány imunitnímu systému až po zničení B-buněk. Chronologicky se
proto detekují dříve protilátky proti kapsidovým antigenům a časným antigenům EBV, než
proti EBNA.
Protilátky proti časným antigenům EBV (EA) se vyskytují u 70 až 80 % pacientů s infekční
mononukleosou, ačkoli jen přechodně během akutní fáze infekce. Vysoké titry protilátek proti
EA označují chronickou infekci, nebo její reaktivaci. Avšak, tyto protilátky jsou také
nalézány ve spojitosti s Burkittovým lymfomem a rakovinou nosohltanu.
Sérologická diferenciace mezi primární infekcí EBV a reaktivací infekce není vždy možná.
Jestliže se určí protilátky pouze proti EBV-EA a nikoli proti EBV-CA nebo EBNA,
předpokládáme, že jde o primární infekci. Jestliže se v tomtéž čase detekuji protilátky proti
EBNA, jedná se o reaktivaci infekce.
Diferenciace mezi čerstvě probíhající infekcí a infekcí, která již nějakou dobu trvá, je velkou
výzvou sérologie. V současnosti je nejběžnějším prostředkem diferenciace určení hladiny
specifických protilátek třídy IgM, které by se měly obecně objevit vždy v počáteční fázi
infekce. Ale určení protilátek třídy IgM je velmi často nejisté a problematické.
Interferenčními faktory je přetrvávající odpověď IgM, nedetekovatelná, nebo zpožděná
tvorba IgM a nespecifická tvorba IgM způsobená polyklonální stimulací B-buněk. V 5 až
20 % všech případů čerstvé infekce EBV nelze detekovat IgM protilátky proti EBV
kapsidovému antigenu (EBV-CA), v 15% případů je tvorba IgM protilátek zpožděná, na
druhé straně u 4 % pacientů IgM odpověď přetrvává. Pro bezpečné určení časné primární
infekce se v posledních letech užívá určení avidity protilátek třídy IgG: První reakcí
5
organismu na infekci je tvorba nízkoaviditních protilátek. V průběhu infekce se tvoří stále
více IgG protilátek s vyšší adaptací k antigenům a avidita roste. Proto jakmile v séru nejsou
detekovány IgG protilátky s vysokou aviditou, předpokládá se, že infekce je stále
v počátečním stádiu (EUROIMMUN testovací systém pro určení avidity IgG protilátek proti
EBV-CA).
Literatura:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Koch H.G.: Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Deutsches Arzteblatt 7: 140 –
144 (1995).
Dopakte H.D., Schuy W.: Compact Epstein-Barr virus diagnosis based on defined
antigen mix and specific IgA. Res.Virol. 147: 53-66 (1996).
Selgneurin J.-M.: Diagnostik von Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Diagnose
und Labor 42: 83 –89 (1992).
Dolken G., Weitzmann U., Boldt C., Bitzer M., Brugger, Lohr W.: Enzyme-Linked
Assay for IgG Antiboduies to Epstein-Barr-Virus – Associated Early Antigens and
Viral Capsid Antigen. J. Immunol.Meth. 67: 225-233 (1984).
Porstmann T.: Epstein-Barr-Virus. Diagnostische Bibliothek 6/7 (1992).
Lennette E.T.: Epstein-Barr-Virus. Virology 74: 905-909 (1987).
6
Přehled diagnostiky EBV
EBNA-1-IgG
negativní
VCA-IgG
VCA-IgG
negativní
pozitivní
Není infekce
VCA-IgM pozitivní
nebo
EBNA-1 a p27-IgM pozitivní
VCA-IgM
negativní
Primární infekce
EA-IgG negativní
Reaktivace nebo
ztráta anti-EBNA-1
protilátek v pozdní
fázi infekce
EA-IgG silně pozitivní
Primární infekce, reaktivace nebo
ztráta anti-EBNA-1-protilátek
v pozdní fázi infekce
VCA-IgG p22 pozitivní
Ztráta anti-EBNA-1
protilátek v pozdní fázi
infekce
EBNA-1-IgG
pozitivní
Jen VCA-IgG pozitivní
VCA IgG pozitivní a EA-IgG silně
pozitivní
nebo
VCA-IgA silně pozitivní
nebo
VCA –IgM pozitivní
Pozdní fáze infekce
reaktivace
7
EUROIMMUN - Protilátky proti EBV
Návod na použití WESTERNBLOT testu
PROTOKOL PRO INKUBACE
Před upotřebením: vložte proužek blotu do inkubačního kanálku obsahujícího 1,5 ml
univerzálního pufru
15 min, třepat
1. Inkubace vzorku
Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml vzorku séra
(1:51)
30 min, třepat
Promývání: 3 x 5 min
2. Inkubace s konjugátem:
Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml enzymového
konjugátu (1:10)
30 min, třepat
Promývání: 3 x 5 min
2. Inkubace se substrátem:
Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu
10 min, třepat
Zastavení:
Odsajte všechnu kapalinu, promyjte vodou
Vizuální hodnocení
8