zde - AUC

Malé studentské projekty
Rozptyl primárních elektronů
na atomech zalévacího media
biologického materiálu
u nízkonapěťového transmisního
elektronového mikroskopu LV EM 5
 Vedoucí projektu:
 Autor projektu:
Mgr. David Kaftan, Ph.D.
Mgr. Tomáš Bílý
Cíl projektu
 Zjistit jakou vlastní strukturu vykazují jednotlivá zalévací media v
LV TEM (LV EM 5)
LV EM 5 vs rutinní standardní TEM:





Nominální urychlovací napětí 5 kV
Tloušťka řezu do 20 nm
Max zvětšení 145.000× (360× a 400×)
Rozlišovací schopnost 2,5 nm
Není potřeba kontrastovacích činidel
- dostatečný kontrast C pro C, N, O
- závislost σ, ρ, t
 N0 σ T   t 

A


n
I
n
 e 
C  1
kde
n0
n0 I 0

Malé rozměry, jednoduchý provoz
Cíl projektu
 Zjistit jakou vlastní strukturu vykazují jednotlivá zalévací
media v LV TEM (LV EM 5)
Příprava biologického materiálu:




Fixace – zastavení degradace
Dehydratace – vakuum
Prosycení zalévacím mediem
 EPON 812 (SPI), Spurr
 4 složkové, epoxidové
Krájení – LEICA Ultracut UCT




Diamantové nože
35º s vibracemi a bez vibrací
45º
Kontrast ~ Δt - změna povrchové morfologie
LV EM, AFM
Měřící přístroje:
 LV EM – Delong Instrument LV EM 5
– analogie zvětšeného stínu
– 2,5 nm v X, Y
 AFM
– Molecular Imaging Pico SPM
– povrchová morfologie
(přesné měření v ose XYZ)
– poklepový mód (tapping)
– 0,5 nm v ose X,Y a 0,05 v ose Z
 EPON a Spurr krájený 45º, 35º, 35º s vibr.

Statistika z 12 snímků
1. Zobrazení povrchové morfologie
v AFM
Postup měření povrch. morfologie:
 Řezy na slídě – muskovit drsnost pod 0,1 nm
 Označení řezů lihovým fixem – Olympus CX41
 Prohlížení AFM




Poloha – Zeiss Jena, objektiv 10×, USB mikroskop Ednet 10× – 50×
Poklepový mód, raménka E – 38 kHz a F – 125 kHz
Rychlost skenování 91.553 nms-1 (3,1 řádků za sekundu)
Plocha 3.072 × 3.072 nm na 1024 × 1024 px (1 px = 3 nm) 8 bit
1. Zobrazení povrchové morfologie
v AFM
 Reprezentativní snímky:
35º bez vibrací
EPON
Spurr
35º s vibracemi
45º
1. Zobrazení povrchové morfologie
v AFM
 Postup statistické analýzy obrazu (ImageJ a Matlab):
1. Odstranění šumu (despecle) – medián matice 3×3 (pepř a sůl)
2. Průměrování – matice 5×5 (eliminace vyšších frekvencí jasu)
3. Rotace obrazu
4. Výřez 900 × 500 px (1px = 3nm)
5. Analýza Matlabem (skript) – výšky a šířky výběžků
▪ průměr celého obrazu
▪ nalezení max. a min.
1. Zobrazení povrchové morfologie
v AFM - Statistika
100
100
50
0
1.
čtvrt.
4.
čtvrt.
Východ
Západ
Sever
50
0
1.
čtvrt.
4.
čtvrt.
Východ
Západ
Sever
Závislosti:
 Výška výběžků se zmenšuje s menším úhel břitu
 Šířka výběžků se zvětšuje s menším úhlem břitu
 Zkouška mikrotvrdosti dle Vickerse (vtlačování diamantového jehlanu)



Zatěžovací síla F = 0,4905 N, rychlost zatěžování v = 50 µms-1
Epon MHv= 124,83 ± 1,6 MPa, Spurr MHv= 110,90 ± 1,3 MPa
Tvrdší materiál, větší závislost výšky výběžků na úhlu břitu
2. Ultrastrukturální vzhled
v LV TEM
 Postup analýzy obrazu (ImageJ a Matlab):
1. Odstranění šumu (despecle) – výstup hodnota pozadí (Lmin)
2. Odstranění pozadí – metoda „rolujícího míče“ 250 px
3. Průměrování – matice 5×5
4. Rotace obrazu
5. Inverze barev – stín
4. Výřez 700 × 500 px (1px = 3nm)
5. Analýza Matlabem (skript) – šířky výběžků
6. Výpočet kontrastu podle Michelsona
L  Lmin
 s časem není expozice konstantní
K  max
Lmax  Lmin
 největší odchylka 0,021 (2,1 %)
Závislost kontrastu na expozičním čase a celkovém emisním proudu katody
Kontrast K
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0
20uA
23uA
26uA
29uA
31uA
y = 0,0161Ln(x) - 0,0188
32uA
34uA
36uA
1000
2000
3000
Expoziční čas [m s]
4000
Aproximace
2. Ultrastrukturální vzhled
v LV TEM
 Reprezentativní snímky:
 V klasickém TEM (> 100 kV) nelze zobrazit
35º bez vibrací
 EPON
 Spurr
35º s vibracemi
45º
3. Zhodnocení vlivu strukt. zalévacích
medií na kontrast v LV TEM
 Graf šířek – koreluje s AFM
– hodnoty jsou menší
(úpravy obrazu, odchylka, skládání výš.)
 Graf kontrastu
– nejednoznačná závislost
(proměnné, celková šířka řezu)
 Celý 62,2 %, A 42,8 %, 11,0 % (Spurr)
Graf šířek
Graf kontrastu
nm
1200
K [%]
20,0
18,0
1000
800
Šířka Min.
Šířka Prům.
600
Šířka Med.
400
Šířka Max.
200
16,0
14,0
Kontrast Min.
12,0
10,0
8,0
Kontrast Prům.
6,0
4,0
Kontrast Max.
Kontrast Med.
2,0
0,0
0
E 35°
E 35° Vibr.
E 45°
S 35°
Zalévací m edium
S 35° Vibr.
S 45°
E 35°
E 35° Vibr.
E 45°
S 35°
Zalévací m edium
S 35° Vibr.
S 45°
Děkuji za pozornost