Publikace pepsinových testů (leden 2010)

Publikace
pepsinových
testů
Leden 2010
technostics Konzultanti pro zdravotnický průmysl a inovátoři v oblasti vývoje produktů
The Deep Business Centre, Hull, HU1 4BG
Tel: +44 (0) 1482 382860
Fax: +44 (0) 1482 382869
Obsah
Publikace pepsinových testů
Strugala V, Faruqi S, Dettmar PW, Morice AH. Detekce pepsinu ve sputu a
exhalovaném kondenzátu dechu: může pepsin sloužit jako užitečný marker pro
refluxní respirační choroby? Eur Resp J 2009(abstrakt v tisku) .......... 3
2. Strugala V, Dettmar PW, Morice AH. Detekce pepsinu ve sputu a exhalovaném
kondenzátu dechu: může pepsin sloužit jako užitečný marker pro refluxní
respirační choroby? Gastroenterology 2009: 136(5 (Suppl 1)): S1895
4
3. Hong S-KS, Dettmar PW, Slaughter JC, Strugala V, Goutte M, Vaezi MF. Slinný
pepsin u pacientů trpících refrakterním GERD: dvojitě slepá studie hodnocení
citlivosti testu, přesnosti, pozitivních a negativních predikčních hodnot.
Gastroenterology 2009: 136(5 (Suppl 1)): 382 .................................. 5
4. Strugala V, McGlashan JA, Morice AH, Dettmar PW. Použití neinvazivního
pepsinového diagnostického testu na reflux: série případových studií. J Clin
Gastroenterol 2008: 42(Suppl 1): S8 ................................................. 6
5. Strugala V, Printza A, Triaridis S, Dettmar PW. Detekce pepsinu po
dlouhodobém vzorkování sputa u pacientů s extraezofageální refluxní
chorobou. Gut 2007: 56(Suppl III): A212 ............................................. 7
6. Strugala V, McGlashan JA, Watson MG, Morice AH, Granier B, Dettmar PW.
Detekce pepsinu pomocí neinvazivního lateral-flow
testu pro diagnózu
extraezofageálního refluxu - výsledky pilotní studie. Gut 2007: 56(Suppl III):
A212 .................................................................................................. 8
7. Strugala V, McGlashan JA, Watson MG, Morice AH, Calderone G, Dettmar PW.
Vyhodnocení neinvazivního lateral-flow testu pro diagnózu extraezofageálního
refluxu - výsledky pilotní studie. Gastroenterology 2007: 132(4 (Suppl 2)):
A99-A100 ........................................................................................... 9
8. Strugala V, Leonard JC, Dettmar PW. Vliv skladovacích podmínek na stabilitu
lidského pepsinu. Gut 2007: 56(Suppl III): A233 ................................ 10
9. Strugala V, Farndale AJ, Jacob J, Dettmar PW. Diagnóza refluxu pomocí
pepsinu jako markeru. Logopedics Phoniatrics Vocology 2005: 110(Suppl 1):
16-17 ................................................................................................ 12
10. Farndale AJ, Dettmar PW, Strugala V. Vliv cetrifugace na vzorky lidských slin
při snižování variability vzorků u specifického měření pepsinu. Logopedics
Phoniatrics
Vocology
2005:
30(Suppl
1):
36-37
……………………………………………………………………………………………
…………………14
Vyžádané ústní a plakátové prezentace.
11. Vyžádaná ústní prezentace. Dettmar P.W., Strugala V (2008). Pepsin - agresor.
Extraezofageální refluxní choroba. Budoucnost: Diagnóza a léčba v souvislosti s
8. Mezinárodním sympóziem na téma lidský pepsin (ISHP), Milwaukee, USA,
2008 ................................................................................................. 15
12. Vyžádaná ústní prezentace. Dettmar P.W., Strugala V. (2008). Neinvazivní
diagnostický nástroj pro detekci pacientů s rizikem vzniku GERD. 9. Světový
kongres. Gastro-ezofageální refluxní choroby (OESO). Monako Duben 2008 18
13. Vyžádaná ústní prezentace. Strugala V., McGlashan, J.A., Morice, A.H.,
Watson, M.G., Dettmar P.W. (2006). Detekce pepsinu pro diagnózu
extraezofageálního refluxu. Extraezofageální reflux. Za hranice současného
stavu vývoje v souvislosti s 7. Mezinárodním sympóziem na téma lidský pepsin
(ISHP),
Nottingham,
VB
2006.
…………………………………………………………………………………. 19
14. Vyžádaná plakátová prezentace. Strugala, V., Dettmar, P.W. (2006).
Tvorba and charakteristika monoklonálních protilátek proti lidskému
pepsinu. Extraezofageální reflux. Za hranice současného stavu vývoje v
souvislosti s 7. Mezinárodním sympóziem na téma lidský pepsin (ISHP),
Nottingham,
VB
2006
…………………………………………………………………………………...21
1.
2
1.
Eur Resp J 2009 (abtrakt dostupný v tisku)
Detekce pepsinu ve sputu a exhalovaném kondenzátu dechu: může
pepsin sloužit jako užitečný marker pro refluxní respirační choroby?
Strugala, V 1., Faruqi, S 2., Dettmar, P.W1, Morice, A.H2.
1Technostics
Limited, Hull, UK, 2Academic Medicine, Castle Hill Hospital,
Cottingham, UK
Pozadí: Extraezofageální reflux (EOR) je obvyklou příčinou neobjasněného
chronického kašle. Bylo prokázáno, že pro diagnózu EOR je přínosem
neinvazivní diagnostický test na lidský pepsin prováděný pomocí speciálního
rychlého diagnostického zařízení pro provádění lateral-flow (LF) testu in vitro .
Tento test je schopen detekovat pepsin jako marker předchozího refluxu u
řady klinických vzorků. Prezentujeme údaje využívající sputum/sliny nebo
kondenzát exhalovaného dechu (EBC) pacientů s chronickým kašlem a bez
symptomů v nedávné době.
Metody: Vzorky byly odebírány od pacientů, u kterých existovalo klinické
podezření na kašel související s refluxem. Sputum/sliny byly získány tak, že
byli pacienti požádáni o zakašlání a odplivnutí do trubičky obsahující 0 ,1 M
kyseliny citrónové. Po centrifugaci (pro odebrání nerozpustného materiálu)
byl supernatant uchován pro analýzu. Zařízení pro sběr EBC se skládalo z
polypropylénové hadičky připojené k Drechselově lahvi uložené v drceném
ledu. Jednosměrné dýchání v klidu přibližně po dobu 10 minut vedlo k odběru
1-2 ml EBC. 30 μl odebrané tekutiny bylo na přítomnost pepsinu otestováno in
vitro pomocí nového diagnostického zařízení se dvěma monoklonálními
protilátkami na lidský pepsin 3.
Výsledky: Sputum/sliny byly odebrány od 12 pacientů (2 muži, průměrný věk
47 let ) s nedávným výskytem symptomů (n=15) nebo bez výskytu symptomů
(n=7). 93% symptomatických vzorků bylo z pohledu výskytu pepsinu
pozitivních, zatímco u asymptomatických vzorků by pozitivní pouze 1 (14%)
(p<0,001). EBC byl získán od 4 pacientů (2 muži, průměrný věk 50 let).
Chemická analýza na pepsin byla pozitivní u 2 pacientů s nedávnými
symptomy a negativní u těch 2 pacientů, kteří nedávné symptomy neměli.
Závěr:
Diagnostický test pepsinu LF in vitro, provedený na řadě neinvazivně
získaných vzorcích je schopen potvrdit, že symptomy jsou důsledkem refluxu.
Jedná se o první důkaz, že EMC, běžná neinvazivní technika získávání
vzorků, může být použita pro odběr refluxátu v horních cestách dýchacích a
detekci pepsinu v případě nedávného výskytu symptomů. Tento test by se
mohl prokázat jako vysoce cenný nástroj pro stanovení diagnózy u kašle
souvisejícího s refluxem.
Reference
1- Strugala et al. 2007 Gastroenterology 132(4Suppl1):A99-A100
3
2.
1)): S1895
Gastroenterology 2009: 136(5 (Suppl
Detekce pepsinu ve sputu a exhalovaném kondenzátu dechu: může pepsin
sloužit jako užitečný marker pro refluxní respirační choroby?
Strugala, V1., Dettmar, P.W1., Morice, A.H2.
1Technostics
Limited, Hull, UK, 2Academic Medicine, Castle Hill Hospital,
Cottingham, UK
Pozadí: Extraezofageální reflux (EER) je obvyklou příčinou neobjasněného
chronického kašle. Bylo prokázáno, že pro diagnózu EER1 je přínosem
neinvazivní diagnostický test na lidský pepsin prováděný pomocí
speciálního rychlého diagnostického zařízení pro provádění lateral-flow (LF)
testu in vitro . Tento test je schopen detekovat pepsin jako marker
předchozího refluxu u řady klinických vzorků. Prezentujeme údaje
využívající sputum/sliny nebo kondenzát exhalovaného dechu (EBC)
pacientů s chronickým kašlem a bez symptomů v nedávné době.
Metody: Vzorky byly odebírány od pacientů, u kterých existovalo klinické
podezření na kašel související s refluxem. Sputum/sliny byly získány tak, že
byli pacienti požádáni o zakašlání a odplivnutí do trubičky obsahující 0,1 M
kyseliny citrónové. Po centrifugaci (pro odebrání nerozpustného materiálu)
byl supernatant uchován pro analýzu. Zařízení pro sběr EBC se skládalo z
polypropylénové hadičky připojené k Drechselově lahvi uložené v drceném
ledu. Jednosměrné dýchání v klidu přibližně po dobu 10 minut vedlo k odběru
1-2 ml EBC. 30 μl odebrané tekutiny bylo na přítomnost pepsinu otestováno in
vitro pomocí nového diagnostického zařízení se dvěma monoklonálními
protilátkami na lidský pepsin 3.
Výsledky: Sputum/sliny byly odebrány od 12 pacientů (2 muži, průměrný věk
47 let) s nedávným výskytem symptomů (n=15) nebo bez výskytu symptomů
(n=7). 93% symptomatických vzorků bylo z pohledu výskytu pepsinu
pozitivních, zatímco u asymptomatických vzorků by pozitivní pouze 1 (14%)
(p<0,001). EBC byl získán od 4 pacientů (2 muži, průměrný věk 50 let).
Chemická analýza na pepsin byla pozitivní u 2 pacientů s nedávnými
symptomy a negativní u těch 2 pacientů, kteří nedávné symptomy neměli.
Závěr: Diagnostický test pepsinu LF in vitro, provedený na řadě neinvazivně
získaných vzorcích je schopen potvrdit, že symptomy jsou důsledkem refluxu.
Jedná se o první důkaz, že EMC, běžná neinvazivní technika získávání
vzorků, může být použita pro odběr refluxátu v horních cestách dýchacích a
detekci pepsinu v případě nedávného výskytu symptomů.
Tento test by se mohl prokázat jako vysoce cenný nástroj pro stanovení
diagnózy u kašle souvisejícího s refluxem.
Reference 1.
Strugala et al. 2007 Gastroenterology 132(4Suppl1):A99-A100
4
3.
Gastroenterology 2009: 136(5 (Suppl 1)): 382
Slinný pepsin u pacientů trpících refrakterním GERD: dvojitě slepá studie
hodnocení citlivosti testu, přesnosti, pozitivních a negativních predikčních
hodnot.
Hong, S-K.S1., Dettmar, P.W2., Slaughter, J.C 1., Strugala, V.2, Goutte,
M1., Vaezi, M.F1.
1Vanderbilt
University, Medical Center, Nashville, Tennessee, USA,
Limited, Hull, UK
2Technostics
Pozadí: Dochází ke vzrůstajícímu výskytu pacientů s gastroezofageální
refluxní chorobou (GERD), kteří jsou refraktorní vůči agresivní supresi kyselin.
Pepsinový lateral flow test (LFT) je neinvazivní chemickou analýzou pro
detekci pepsinu ve slinách. Test má 2 unikátní protilátky specifické pro lidský
pepsin. V této dvojitě slepé studii jsme se zaměřili na zjištění následujících
klíčových testovacích charakteristik dané zkoušky: 1) senzitivita and přesnost
na základě zjištěné přítomnosti nebo nepřítomnosti pepsinu, 2) výskyt
slinného pepsinu u členů běžné kontrolní skupiny oproti pacientům s
ezofageální refluxí (EERD), a 3) pozitivní a negativní prediktivní hodnoty (PPH
a NPH) u symptomatických pacientů (GERD+EERD) u kterých probíhá ši
neprobíhá PPI terapie.
Metody: Pomocí LFT bylo analyzováno 239 vzorků, veškeré testy byly z
pohledu zdroje dvojitě slepé. Citlivost a přesnost byly odhadovány pomocí 54
vzorků s čistou vodou and 51 vzorků s žaludeční šťávou. Sliny byly odebrány
od 51 zdravých dobrovolníků, kteří sloužili jako kontrolní skupina. U výpočtu
PPH a NPH u symptomatických pacientů byly sliny odebrány od 58 pacientů s
gastroezofageálním syndromem (dle Motrealské definice) a 16 pacientů s
extraezofageálním syndromem. Výskyt slinného pepsinu byl diagnostikován u
kontrolní skupiny, i skupin s GERD a EERD. U těchto dvou skupin pacientů
došlo k provedení EGD, bezdrátového zjištění pH a vyplnění dotazníku na
téma refluxe u skupiny, u které nyní neprobíhá terapie. PPH a NPH byly
vypočteny na základě dvojice pravdivě pozitivních definic: A) pozitivní pH
nebo ezofagitida nebo B) pozitivní pH nebo ezofagitida nebo výskyt pálení
žáhy.
Výsledky: 1) Na základě vzorků se známou přítomností pepsinu ROC analýza
odhalila citlivost 88% a přesnost ve výši 87%. 2) Pozitivní testy mělo 6/51
(12%) kontrolních subjektů, 13/58 (22%) u skupiny s GERD , a 4/16 (25%) v
případě EERD (p=NS). Neexistoval žádný rozdíl v pozitivním výskytu
pozitivního pepsinu u skupiny, kde právě probíhala PPI terapie (16%), nebo
kde neprobíhala (14%) (p=NS). Pacienti s ezofagitidou nebo neobvyklým pH
měli vyšší pozitivní výskyt slinného pepsinu (45%, respektive 33%). PPH a
NPH na základě každé z pravdivě pozitivních definic a výskytu choroby jsou
zobrazeny v Tabulce 1.
Tabulka
Závěr: 1)1Test na slinný pepsin byl pozitivní pouze u 45% subjektů trpících
ezofagitidou a u 33% subjektů neobvyklým pH . 2) Za níže uvedeného výskytu
choroby dle definice ezofagitidou nebo neobvyklým pH (48%, Def. A), pokud
PPH NPH Sensitivit Přesnost
má pepsinový test pozitivní výsledek, pravděpodobnost výskytu choroby
vzrůstá na 65%, na rozdíl od definice choroby přidáním pálení
žáhy, jež
a
zvyšuje výskyt choroby na 84% (Def. B), což odstraňuje potřebu jakéhokoli
Def. A (48%
Výskyt choroby)
65% 58% 37%
81%
doplňujícího
testu.
Def. B (84% Výskyt choroby)
94%
19%
26%
92%
5
4.
J. Clin Gastroenterol 2008: 42(Suppl 1):
S8
Použití neinvazivního pepsinového diagnostického testu na reflux: série
případových studií.
Strugala, V 1., McGlashan J.A 2., Morice, A.H3., Dettmar, P.W1.
1Technostics
3Academic
Limited, Hull, UK, 2Queens Medical Centre, Nottingham, UK,
Medicine, Castle Hill Hospital, Cottingham, UK
Pozadí: Bylo prokázáno, že pro diagnózu extraezofageálního refluxu (EOR) 1
je přínosem neinvazivní diagnostický test na lidský pepsin prováděný pomocí
provádění lateral-flow (LF) testu. Tento test je schopen detekovat pepsin jako
marker předchozího refluxu ve slinách pacienta, obzvláště v případě výskytu
symptomů. Pro pokračující klinické ověření LFT pepsinu byla vyhodnocena
řada zajímavých pacientů s podezřením na EOR.
Případ 1: Muž ve věku 29 let s chrčením spuštěným při vypití vína. Po vypití
vína byly odebrány 3 vzorky sputa (1 asymptomatický, 2 symptomatické).
Asymptomatický vzorek byl negativní, ale oba symptomatické vzorky byly z
pohledu výskytu pepsinu silně pozitivní.
Případ 2: Žena ve věku 19 let s kašlem způsobovaným cvičením (během).
Byly poskytnuty 3 vzorky (základní čára, po cvičení - jízda na kole, po cvičení běh). Po běhu byly zaznamenány závažné symptomy a tento vzorek byl na
pepsin pozitivní, zatímco zbývající dva byly negativní.
Případ 3: Žena ve věku 18 let s chronickým kašlem, u kterého se symptomy
zhoršovaly v různých časových bodech menstruačního cyklu. Byly poskytnuty
2 vzorky (Den 4 závažné symptomy, den 21 bez symptomů). Testovací vzorek
na pepsin 21 dne byl negativní, ale vzorek ze 4 dne by pozitivní.
Případ 4: Muž ve věku 51 let s hlasovými obtížemi z důvodu EOR. I přes PPI
terapii (lansoprazol a později esomeprazol) symptomy přetrvaly a
impedanční/pH test prokázal, že reflux nadále přetrvává. Symptomatický
vzorek vykázal přítomnost pepsinu.
Případ 5: 3 letá dívka s přetrvávající regurgitací a podezřením na reflux.
Symptomatický vzorek vykázal přítomnost pepsinu.
Závěr: Neinvazivní LFT testování pepsinu je v diagnostice EOR užitečné u
široké řady pacientů, včetně dětských. Byli jsme schopni dojít k závěru, že
symptomy u všech pacientů ve výše uvedených případech byly důsledkem
refluxu. Po PPI terapii bylo stále možné detekovat pepsin, což poskytlo další
důkaz o roli refluxu "slabé kyseliny" ve způsobování symptomů.
Reference:
1Strugala et al. 2007 Gastroenterology 132(4Suppl1):A99-A100
6
A212
5.
Gut 2007: 56(Suppl III):
Detekce pepsinu po dlouhodobém vzorkování sputa u pacientů s
extraezofageální refluxní chorobou.
Strugala, V.1, Printza, A. 2, Dettmar P.W.1
1Technostics
Limited, Hull, UK, 2Medical School, University of Thessalonika,
Thessalonika, Greece
Úvod: Detekce pepsinu u klinických vzorků může být použita jako marker
refluxu obsahu žaludku. Pepsin byl detekován u středoušních výtoků 1,
výplachu bronchoalveolární tekutiny 2, laryngální bioptické tkáni 3 a sputu4.
Názorně jsme ukázali pepsin ve vzorcích sputa a pacientů s
extraezofageálním refluxem (EOR) a tento diagnostický poznatek je dále
zvýrazněn, když byl vzorek poskytnut v době, kdy pacient vykazoval
symptomy5.
Cíle & metody: Cílem této studie bylo zdokumentovat a sledovat hodnoty
pepsinu ve vzorcích pravidelně odebíraných u pacientů v průběhu dne a v
době výskytu symptomů.
Vzorky sputa byly od pacientů s extraezofageálním refluxem poskytovány v
pravidelných intervalech (RSI vyšší než 20). Přítomnost pepsinu byla určena
pomocí přímé sendvičové ELISA metody se dvěma unikátními monoklonálními
protilátkami na lidský pepsin. Koncentrace pepsinu byla vyhodnocena proti
standardní křivce lidského pepsinu 3.
Výsledky: U pravidelných vzorků byl pepsin přítomný u 10/37 vzorků (27%).
Vzorky pozitivní na pepsin byly často seskupeny dohromady. U pozitivních
vzorků se koncentrace pepsinu pohybovala v rozsahu od 0,5-4,5 ng/ml se
střední hodnotou (SD) 1,8 (1,5) ng/ml. Vzorky s nejvyšší koncentrací pepsinu
se vyskytovaly v době výskytu epizod regurgitace. Po období regurgitace bylo
možno pepsin detekovat ještě 15 minut po epizodě. Vzorky pozitivní na pepsin
byly také nalezeny v případech, když pacient nepociťoval symptomy (tichý
reflux), ale poskytoval pravidelně vzorky. Závěr: Pepsin lze detekovat u
neinvazivně získaného sputa a lze jej použít jako marker refluxu. Výsledky této
studie indikují, že ve sputu je pepsin přítomen tehdy, když nedávno došlo k
refluxní epizodě. Data ukazují, že tyto refluxní epizody mohou mít důsledek ve
formě symptomů pociťovaných pacienty. Vykytují se nicméně i epizody
"tichého refluxu", kdy si pacient není refluxu vědom. Tato studie jasně ukazuje,
že pokud má být pepsin používán jako marker refluxu, musí pacienti
poskytovat vzorky buďto pravidelně (pacienti s tichým refluxem), nebo v době
výskytu symptomů.
Reference:
1 Tasker
et al. (2002) Laryngoscope 112:1930
Ward et al. (2005) Thorax 60:87
3 Gill et al. (2005) Ann Otol Rhinol Laryngol 114:913
4 Knight et al. (2005) Laryngscope 115:1473
5 Strugala et al. (2007) Gastroenterology 132 (4 Suppl2):A99
2
7
6.
Gut 2007: 56(Suppl III): A212
Detekce pepsinu pomocí neinvazivního lateral-flow testu pro diagnózu
extraezofageálního refluxu - výsledky pilotní studie.
Strugala, V.1, McGlashan, J.A.2, Watson M.G.3, Morice, A.H.4, Granier, B. 5,
Dettmar, P.W.1
1Technostics
Limited, Hull, UK, 2Otorhinolaryngology, Queen's Medical
Centre, Nottingham, UK, 3General Surgery, Doncaster Royal Infirmary,
Doncaster, UK, 4Academic Medicine, Castle Hill Hospital, Cottingham, UK, 5,
Unisensor s.a., Liege, Belgium
Úvod: Diagnostika extraezofageálního refluxu (EOR) je nadále obtížná.
24-hodinová pH-metrie nebo impedanční monitoring jsou invazivní a
nedostatečně citlivé pro použití při EOR a laryngoskopické příznaky EOR
mohou být nepřesné. Je zapotřebí objektivního, neinvazivního testu na
přítomnost EOR. Cíle & metody: Prezentujeme data z pilotní studie
realizované v několika centrech s cílem zjistit, zdali je neinvazivní test in vitro
schopen rozlišit refluxní pacienty od kontrolní skupiny pomocí přítomnosti
pepsinu ve sputu/slinách. Studie získala etický souhlas a subjekty podepsaly
písemný informovaný souhlas. Nábor subjektů byl prováděn na základě jejich
skóre ověřeného indexu refluxních symptomů (RSI) 1. Kontrolní skupina - RSI
0 - 3 bez příznaků pálení žáhy. Pacienti - RSI 20 + s viditelnými důkazy refluxu
při laryngoskopii. Subjekty byly požádány o poskytnutí vzorku obsahu krku
vykašláním a plivnutím do odběrné nádoby. Pacienti byli také požádáni o
poskytnutí vzorku doma v době výskytu symptomů. Vzorky byly testovány na
přítomnost pepsinu pomocí lateral flow testu (účinný až do 3 ng pepsinu) a
pomocí sendvičové ELISA metody (účinná až do 2 ng/ml) se dvěma unikátními
monoklonálními protilátkami na lidský pepsin.
Výsledky: bylo zajištěno 32 subjektů. 15 kontrolních subjektů [7M 8Ž,
průměrný věk (SD) 43,2 (19)let; hodnota RSI 0,9(1)]. 16/17 vzorků sputa
získaných od kontrolních pacientů bylo z pohledu obsahu pepsinu
negativních. 17 subjektů pacientů [11M 6Ž, střední věk 56,2 (16) let (p=0,0472
por. kontrolní); hodnota RSI 28,5(5) (p<0,001 por. kontrolní)]. Všichni poskytli
vzorek v klinice, 35% bylo pozitivní z pohledu obsahu pepsinu. 11 pacientů
poskytlo druhý vzorek v době výskytu symptomů, ze kterých bylo 82%
pozitivních na výskyt pepsinu. Přinejmenším jeden pozitivní vzorek byl
zaznamenán u 71% pacientů ve srovnání s pouhými 7% u kontrolní skupiny
(p=0,0003 Fisherova exaktního testu). Všechny vzorky byly testovány pomocí
sensitivní ELISA metody a 91% vzorků bylo shodných.
Závěr: Výsledky této pilotní studie ukazují, že pepsin lze detekovat u
neinvazivně získaného sputa/slin a lze jej použít pomocí lateral flow testu jako
marker refluxu. U 93% pacientů kontrolní skupiny nebyl ve vzorku nalezen
pepsin. U 82% symptomatických pacientů s podezřením na výskyt EOR byl ve
vzorku nalezen pepsin, což představuje jasný objektivní důkaz o přítomnosti
refluxu v hrtanu, hltanu a horních cestách dýchacích. Poskytnutí vzorku
pacientem v době výskytu symptomů prokazatelně zlepšilo diagnostickou
hodnotu testu v porovnání s odběrem vzorku v klinice.
Reference:
1Belafsky
et al (2002) J Voice 16:274
8
7.
A99-A100
Gastroenterology 2007: 132(4 (Suppl 2)):
Vyhodnocení neinvazivního lateral-flow testu pro diagnózu extraezofageálního
refluxu - výsledky pilotní studie.
Strugala, V 1; McGlashan, J.A. 2; Watson, M.G. 3; Morice, A.H.4;
Calderone, G 5; Dettmar, P.W. 1
1Technostics
Limited, Hull, UK, 2Queen's Medical Centre, Nottingham, UK,
Royal Infirmary, Doncaster, UK, 4Castle Hill Hospital, Cottingham,
UK, 5. Unisensor S.A., Liege, Belgium.
3Doncaster
Pozadí: Diagnostika extraezofageálního refluxu (EOR) je nadále obtížná.
24-hodinová pH-metrie nebo impedanční monitoring jsou invazivní a
nedostatečně citlivé pro použití při EOR a laryngoskopické příznaky EOR
mohou být nepřesné. Je zapotřebí objektivního, neinvazivního testu na
přítomnost EOR. Cíl: Zde prezentujeme data z pilotní studie realizované v
několika centrech s hlavním cílem zjistit, zdali je neinvazivní test in vitro
schopen diagnostikovat pacienty s EOR pomocí detekce přítomnosti trávicího
enzymu pepsinu ve sputu/slinách. Druhým cílem bylo určit odpovídající časový
rámec, ve kterém získávat vzorky od subjektů v případě návštěvy kliniky, nebo
v případě výskytu symptomů.
Metody: Etické schválení této studie bylo uděleno MREC. Nábor subjektů byl
prováděn na základě jejich skóre ověřeného indexu refluxních symptomů
(RSI). Kontrolní skupina měla RSI 0 < 3 bez nedávných příznaků pálení žáhy.
Pacienti měli RSI > 20 s viditelnými důkazy refluxu při laryngoskopii. Subjekty
poskytli písemný souhlas a byly požádány o poskytnutí vzorku obsahu krku
vykašláním a plivnutím do odběrné nádoby. Pacienti byli také požádáni o
poskytnutí vzorku doma v době výskytu symptomů. Vzorky byly testovány na
přítomnost pepsinu pomocí lateral flow dipstick testu se dvěma unikátními
monoklonálními protilátkami na lidský pepsin.
Výsledky: Pro tuto studii bylo zajištěno 20 subjektů. K dispozici bylo 10
kontrolních subjektů [5M 5Ž, průměrný věk (SD) 36,9 (20)let; se střední
hodnotou RSI 0,4. 9 z 10-ti vzorků sputa získaných od kontrolních pacientů
bylo z pohledu obsahu pepsinu negativních. K dispozici bylo 10 pacientů [7M
3Ž, průměrný věk (SD) 56,5 (19,7)let (p=0.0402 ve srovnání s kontrolní
skupinou)); se střední hodnotou RSI 27. Všichni poskytli vzorek v klinice, 40%
bylo pozitivní z pohledu obsahu pepsinu. 6 pacientů poskytlo druhý vzorek v
době výskytu symptomů, ze kterých bylo 67% pozitivních na výskyt pepsinu.
Celkově byl přinejmenším jeden pozitivní vzorek zaznamenán u 70% pacientů
ve srovnání s pouhými 10% u kontrolní skupiny (p=0.0062 Testu dobré shody).
Závěr: Výsledky této pilotní studie ukazují, že pepsin lze detekovat u
neinvazivně získaného sputa/slin a lze jej použít pomocí lateral flow dipstick
testu jako marker refluxu. U 90% pacientů kontrolní skupiny nebyl ve vzorku
nalezen pepsin. u 70% symptomatických pacientů s podezřením na výskyt
EOR byl ve vzorku nalezen pepsin, což představuje jasný objektivní důkaz o
přítomnosti refluxu v hrtanu, hltanu a horních cestách dýchacích. Poskytnutí
vzorku pacientem v době výskytu symptomů prokazatelně zlepšilo
diagnostickou hodnotu testu v porovnání s odběrem vzorku v klinice.
9
A233
8.
Gut
2007:
56(Suppl
III):
Vliv skladovacích podmínek na stabilitu lidského pepsinu.
Strugala, V., Leonard, J.C., Dettmar, P.W.
Technostics Limited, Hull, UK
Úvod: Pepsin je hlavním agresorem žaludeční šťávy a přítomnost tohoto
enzymu u klinických vzorků je stále častěji používána jako marker pro refluxní
chorobu 2. Bylo prokázáno, že skladovací podmínky hrají zásadní roli pro jeho
aktivitu s doporučením skladovat v tlumicím roztoku acetátu pH 4.1 3, s
přídavkem glycerolu 4 nebo albuminu 5 před zmrazením, nebo skladováním při
4 ºC 6.
Cíle & metody: Zde si klademe za cíl prozkoumat skladovací podmínky
pepsinu, jež jsou relevantní z pohledu sběru a zasílání klinických vzorků pro
diagnostiku refluxu. 100 μg/ml čištěného lidského pepsinu 3 bylo připraveno
buď v kyselině citrónové pH 2,2; kyselině citrónové pH 4,1; nebo 55 mM
octanu sodného/55 mM NaCl tlumicího roztoku pH 4,1. Pepsinové roztoky
byly uskladněny buď v pokojové teplotě (PT); v chladničce (4ºC); nebo v
mrazáku (-20ºC) jako alikvótní části, ale navíc v jedné nádobě pro simulaci
podmínek zmrznutí-rozmrznutí (Z-R). Stejné podmínky byly nastaveny s
přídavkem lidských slin, jak by se dalo očekávat v případě sběru klinických
vzorků. Aktivita pepsinu byla měřena testem N-terminálů v pravidelných
intervalech po dobu 12 týdnů.
Výsledky: U kyseliny citrónové byla po uplynutí 12 týdnů aktivita pepsinu
podobná, pokud byl skladován v PT nebo v chladničce se 60%, resp. 55%
zbývající aktivity. Nicméně, pokud byl skladován v mrazáku, došlo k rychlému
poklesu aktivity pepsinu (26% původní aktivity po 3 týdnech). Z-R nezpůsobilo
žádnou zásadnější ztrátu aktivity oproti zmrazení (24%, resp. 15% původní
aktivity po 12 týdnech). Když byl pepsin uchován při pH 4,1, nedošlo k
žádným rozdílům v teplotách skladování. Porovnání tří skladovacích
podmínek v tlumicím roztoku ukázalo, že po 12 týdnech byla zaznamenána
podobná aktivita u kyseliny citrónové pH 2,2 (55%) a acetátu pH 4,1 (54%),
jež byly větší než u kyseliny citrónové pH 4,1 (29%). Ztráta aktivity byla
nicméně nižší u kyseliny citrónové pH 2,2. Přídavek slin do vzorků nemělo na
aktivitu pespinu vliv.
Závěr: Ukázali jsme, že lidský pepsin zůstává při pokojové teplotě dostatečně
stabilní na to, aby umožňoval odesílání klinických vzorků do laboratoře
poštou. Podmínky pro sběr vzorků do kyseliny citrónové s pH 2,2 1-2 jsou
opodstatněné vzhledem k tomu, že aktivita pepsinu zůstává vyšší, než u
ostatních dříve doporučených podmínek. Vzorky by nicméně měly být
skladovány v chladničce a nikoli zmrazovány. Přítomnost lidských slin nemá
žádný škodlivý efekt. Závěrem lze konstatovat, že podmínky obvykle
používané pro sběr lidského sputa/slin pro analýzu na přítomnost pepsinu
snášejí před analýzou podmínky při zasílání poštou a dlouhodobé chlazení.
10
Reference:
1
Knight et al (2005) Laryngoscope 15:1473
2
Strugala et al (2007) Gastroenterol 132:Suppl
3
Newton et al (2004) Dig Dis Sci 49:1103
4
De Gara et al (1986) Scand J Gastro 21:650
5
Whitecross & Piper (1975) Scand J Gastro
10:395
6
Roberts & Taylor (1978) Biochem J 169:607
11
9.
Logopedics Phoniatrics Vocology 2005: 110(Suppl
1): 16-17
Diagnóza refluxní choroby pomocí pepsinu jako markeru.
Strugala, V.1, Farndale, A.J1, Jacob, J. 2, Dettmar, P.W.1
1
Technostics Limited, Hull, UK,
2
Reckitt Benckiser Healthcare, Hull, UK
Úvod: Laryngofaryngeální reflux (LFR) je refluxem žaludečního obsahu nad
vrchní ezofageální svěrač a do hrtanu, hltanu a horních cest dýchacích.
Symptomy zahrnují dysfunkci hlasivek, chrapot, chronický kašel a dysfagii.
Reflux je spojován se řadou chorob cest dýchacích, například zánětem
středního ucha s výtokem 1, sinusitidou, odmítnutím plicního aloštěpu, astma
2, dětským syndromem náhlého úmrtí 3 a rakovinou hrtanu 4.
Současným zlatým standardem diagnostiky refluxní choroby je 24-hodinový
ambulantní monitoring pH dvojicí sond. Jedná se o invazivní techniku, jež
detekuje změny v pH pod hodnotu 4 v ezofagu a laryngofarynxu. Důkazy
ukazují, že kyselina není tou součástí refluxátu, jež způsobuje poškození.
Mnoho studií prokázalo, že pepsin způsobuje značné poškození
ezofageální 5-8 a laryngální sliznice 9' 10.
Cíle: Cílem tohoto projektu je vyvinout řadu neinvazivních, komerčně
proveditelných diagnostických testů na refluxní chorobu. Tyto testy budou
detekovat pepsin, jenž je jako marker refluxu vhodnější, než pH.
Metody: Vzorky sputa/slin byly sbírány (do 0,5 ml 100 mM kyseliny citrónové)
při návštěvě kliniky od pacientů s chronickým kašlem, u něhož je podezření,
že je způsobován refluxní chorobou.
Aktivita pepsinu byla hodnocena pomocí modifikované kolorimetrické
analýzy na detekci nově formovaných N-konců peptidů z proteolytického
trávení substrátu proteinu 11 pomocí mikrotitrových destiček pro zajištění
vysoké kapacity.
Hladiny pepsinu byly hodnoceny pomocí nepřímé sendvičové ELISA metody
se dvěma specifickými protilátkami na lidský pepsin 3b. Tato metoda
detekuje přítomnost aktivního a neaktivního pepsinu.
Výsledky: V úvodní studii bylo 10 z 19 vzorků (53%) od pacientů s
chronickým kašlem významně pozitivních na aktivitu pepsinu v rozsahu od
0,4 -4,2 μg/ml se střední hodnotou (±SE) 1,6 (±0,4) μg/ml.
Ve větší studii bylo 23 ze 107 vzorků (21,5%) významně pozitivních na
aktivitu pepsinu v rozsahu 0,1 - 3,7 μg/ml se střední hodnotou (±SE) 1,0
(±0,2) μg/ml.
84 vzorků bylo testováno na bílkovinu štěpenou pepsinem pomocí citlivější
pepsinové ELISA metody. Na pepsin bylo pozitivních 17 vzorků (20,2%).
Závěry: Pepsin lze v laboratorním měřítku s velkou kapacitou úspěšně
měřit a kvantifikovat ve vzorcích lidského sputa/slin. Pomocí dvojice
metodik je možné měřit jak aktivní (a škodlivý) pepsin, tak
12
přítomnost bílkoviny štěpené pepsinem (dříve poškozující). Vzorky byly
odebrány neinvazivně a výsledky jsou pro patologii refluxní choroby
relevantnější, než měření pH pomocí invazivní pH-metrické techniky.
Existuje předpoklad, že pokud jsou vzorky získány v době výskytu refluxu,
tak bude identifikováno více vzorků pozitivních na pepsin, jež tak poskytnou
efektivní diagnostický test.
Reference:
1.
Tasker A, Dettmar PW, Panetti M, Koufman JA, Birchall JP, Pearson JP.
Reflux of gastric juice and glue ear in children. The Lancet
2002;359:493.
2.
Stein MR. Gastroesophageal reflux disease and asthma in the adult.
Immunol Allergy Clin North Am 2001 ;21:449-471.
3.
Puntis JWL. 'Apparent life threatening events' in sleeping infants: is
gastroesophageal reflux ever to blame? J Clin Forensic Med
2003;10:97-101.
4.
Koufman JA, Burke AJ. The etiology and pathogenesis of laryngeal
carcinoma. Otolaryngol Clin North Am 1997;30:1-19.
5.
Goldberg HI, Dodds WJ, Gee S, Montgomery C, Zboralske FF. Role of
acid and pepsin in acute experimental esophagitis. Gastroenterology
1969;56:223- 30.
6.
Johnson LF, Harmon JW. Experimental esophagitis in a rabbit model.
Clinical relevance. J Clin Gastroenterol 1986;8 Suppl 1:26-44.
7.
Lanas AI, Blas JM, Ortego J, Soria J, Sainz R. Adaptation of esophageal
mucosa to acid- and pepsin-induced damage: role of nitric oxide and
epidermal growth factor. Dig Dis Sci 1997;42:1003-12.
8.
Tobey NA, Hosseini SS, Caymaz-Bor C, Wyatt HR, Orlando GS, Orlando
RC. The role of pepsin in acid injury to esophageal epithelium. Am. J.
Gastroenterol. 2001 ;96:3062-70.
9.
Koufman JA. The otolaryngologic manifestations of gastroesophageal
reflux disease (GERD): a clinical investigation of 225 patients using
ambulatory 24hour pH monitoring and an experimental investigation of
the role of acid and pepsin in the development of laryngeal injury.
Laryngoscope 1991 ;101:1 -78.
10.
Ludemann JP, Manoukkian J, Shaw K, Bernard C, Al-Jubab A.
Effects of simulated gastroesophageal reflux on the
untraumatised rabbit larynx. J. Otolaryngol. 1998;27:127-131.
Hutton DA, Allen A, Pearson JP, Ward R, Venables CW. Biochem.
Soc. Trans. 1986;14:735.
11.
13
10.
1): 36-37
Logopedics Phoniatrics Vocology 2005: 30(Suppl
Vliv centrifugace na vzorky lidských slin při snižování variability vzorků u
specifického měření pepsinu
Farndale, A.J., Dettmar, P.W., Strugala V.
Technostics Limited, The Deep Business Centre, Hull, UK.
Úvod: Reflux obsahu žaludku je kauzativním faktorem u onemocnění jako je
chronický kašel a laryngofaryngeální reflux. V současnosti je zlatým
standardem diagnostiky refluxní choroby je 24-hodinový ambulantní
monitoring pH, invazivní technika, jež ovlivňuje životní styl pacienta a četnost
výskytu refluxu. Nicméně, pepsin je hlavní škodlivou látkou obsaženou v
gastrickém refluxátu (1-2) a je tudíž vhodnější pro použití jako marker, než
kyselina.
Cíl: Zde prezentujeme zlepšení originálního, neinvazivního diagnostického
testu na refluxní chorobu pomocí pepsinu jako markeru ve vzorku sputa/slin.
Metody: Lidské sputum/sliny byly sbírány do 0,5 ml 100 mM kyseliny citrónové
od pacientů s chronickým kašlem. Aktivita pepsinu byla měřena pomocí testu
N-terminálů (3). Vzorky byly rozmrazeny, míchány vortexem a analyzovány bez
dalšího zpracování. Poté byly vzorky odstřeďovány po dobu 10 minut při
rychlosti 10 000 ot. a supernatant byl analyzován. Všechny vzorky byly
trojnásobně testovány a variabilita těchto trojitých hodnot vyhodnocená
pomocí výpočtu variačního koeficientu CV, určeného vzorcem (SD/průměr) x
100. Statistická hodnota byl měřena pomocí dvouvýběrového t-testu a
výsledky byly považovány za signifikantní v případě p < 0,05.
Výsledky: Bez zpracování bylo otestováno 86 vzorků slin. Variabilita
opakování byla vysoká s průměrem (±SE) CV ve výši 39 (±9)% 131 vzorků slin
bylo otestováno za využití centrifugační metody zpracování. Variabilita
opakování byla značně snížena na průměr (±SE) CV ve výši 20 (±2)%, tedy
přibližně polovinu hodnoty necentrifugovaných vzorků.
Závěr: Podařilo se nám významně zlepšit metodologii detekce specifické
aktivity pepsinu v lidských slinách pomocí rozboru N-terminálů, a to pomocí
jednoduchých metod zpracování. Z tohoto důvodu jsme schopni spolehlivěji
detekovat a kvantifikovat aktivitu pepsinu pro diagnózu refluxní choroby.
Reference:
Salo et al. (1983). Morphological alterations in experimental
esophagitis. Light microscopic and scanning and transmission electron
microscopic study. Dig. Dis. Sci. 28:440-448
(1)
Tobey et al. (2001). The role of pepsin in acid injury to esophageal
epithelium. Am. J. Gastroenterol. 96:3062-70
(2)
Hutton et al. (1986). Separation of pepsins in human gastric juice:
analysis of proteolytic and mucolytic activity. Biochem. Soc. Trans.
14:735
(3)
14
11.
Extraezofageální refluxní choroba. Budoucnost: Diagnóza a léčba v
souvislosti s 8. Mezinárodním sympóziem na téma lidský pepsin (ISHP),
Milwaukee, USA, 2008
Pepsin - agresor
Dettmar, P.W., Strugala, V.
Technostics Limited, The Deep Business Centre, Hull, UK,
Ačkoli byl pepsin jako entita objeven a pojmenován až v roce 1836
(Schwann), etymologie tohoto slova je mnohem starší. Slova pepsis, peptos
a peptein mají původ v roce 1694 a jsou odvozena od řeckého výrazu pro
trávení, kde dyspepsia znamená "špatné trávení". Slovo Peps-in tudíž
znamenají "týkající se trávení". Tudíž ačkoli nebyl enzym objeven, slovní
zásoba se vyvíjela tak, aby popsala proces trávení a problémy, jež se v této
souvislosti vyskytovaly.
Zajímavé je, že pepsin je vysoce konzervovanou molekulou a je přítomen u
všech živočišných druhů rodu savců včetně koně, psa, prasete a nižších
druhů, jako jsou ryby. To zvýrazňuje význam pepsinu pro trávení. Enzym
představuje první fázi trávení potravy, kdy jsou bílkoviny rozkládány na
peptidy s cílem zlepšit účinnost trávení dále v trávicím traktu. Sliznice
žaludku je proti samo-trávení pepsinem chráněna rozsáhlou vrstvou hlenu.
Průtok pepsinu do střeva také není podstatný vzhledem k tomu, že jej
zásadité pH deaktivuje a tkáně jsou ochráněny vrstvou hlenu. Naopak, pokud
je pepsin refluxován do ezofágu a výše, způsobuje poškození, protože zde
není přítomna žádná ochranná vrstva hlenu a dlaždicová tkáň je citlivější.
Důkazu prokazují, že v porovnání s kyselinou je pepsin škodlivý pro
ezofágus[1-3] a tkáně hrtanu [4, 5]. Dokonce, i když nedojde k poškození, je
pepsin schopen rozvrátit obranné mechanismy [6-8], čímž zvyšuje
pravděpodobnost poškození v případě další expozice.
Jako marker refluxu byl pepsin detekován ve mnoha rozličných tkáních za
hranicí ezofageálního svěrače včetně středního ucha [9], plic [10], průdušnice
[11] a hrtanu [12]. Klinické měření pepsinu je důležité, jelikož může poskytnout
objektivní hodnocení přítomnosti refluxu u pacienta a napomoci se
stanovením diagnózy.
Díky diagnostickému zařízení pro měření lidského pepsinu metodou lateral
flow in vitro , za využití dvojice jedinečných monoklonálních protilátek na
lidský pepsin, je proces detekce rychlý, citlivý (20 ng/ml) a semi-kvantitativní.
Vyhodnocení několika rozdílných typů klinických vzorků, jako je žaludeční
šťáva, sliny/sputum a exhalovaný koncentrát dechu bylo doposud provedeno
u stovek pacientů a je zapotřebí pouze 30 μl vzorku.
V případě pozitivní indikace refluxu je možno zahájit odpovídající léčení.
Nicméně, PPI terapie nezabraňuje refluxu a pouze mění pH [13, 14]. Ve
skutečnosti jsme detekovali pepsin u klinických pacientů, u nich právě PPI
terapie probíhala. Efektivní alternativa léčení je k dispozici ve VB a Evropě
ve formě supresivní látky proti refluxu
15
na bázi alginátu [15, 16]. Sukralfát může také představovat alternativní léčbu,
zatímco
fundoplikace představuje vhodnou variantu pro mladé pacienty se závažným
refluxem.
Reference
1.
Goldberg, H.I., Dodds, W.J., Gee, S., Montgomery, C., and Zboralske,
F.F. (1969). Role of acid and pepsin in acute experimental esophagitis.
Gastroenterology 56(2): p. 223-230.
2.
Johnson, L.F. and Harmon, J.W. (1986). Experimental esophagitis in a
rabbit model. Clinical relevance. J Clin Gastroenterol 8(Suppl 1): p.
26-44.
3.
Tobey, N.A., Hosseini, S.S., Caymaz-Bor, C., Wyatt, H.R., Orlando,
G.S., and Orlando, R.C. (2001). The role of pepsin in acid injury to
esophageal epithelium. Am. J. Gastroenterol. 96(11): p. 3062-3070.
4.
Koufman, J.A. (1991). The otolaryngologic manifestations of
gastroesophageal reflux disease (GERD): a clinical investigation of
225 patients using ambulatory 24-hour pH monitoring and an
experimental investigation of the role of acid and pepsin in the
development of laryngeal injury. Laryngoscope 101(4 Pt 2 Suppl 53):
p. 1-78.
5.
Ludemann, J.P., Manoukian, J., Shaw, K., Bernard, C., Davis, M., and
al- Jubab, A. (1998). Effects of simulated gastroesophageal reflux on
the untraumatized rabbit larynx. J Otolaryngol 27(3): p. 127-131.
6.
Johnston, N., Bulmer, D., Gill, G.A., Panetti, M., Ross, P.E., Pearson,
J.P., Pignatelli, M., Axford, S.E., Dettmar, P.W., and Koufman, J.A.
(2003). Cell biology of laryngeal epithelial defenses in health and
disease: further studies. Annals of Otology, Rhinology &
Laryngology 112(6): p. 481 -491.
7.
Johnston, N., Dettmar, P.W., Lively, M.O., Postma, G.N., Belafsky,
P.C., Birchall, M., and Koufman, J.A. (2006). Effect of pepsin on
laryngeal stress protein (Sep70, Sep53, and Hsp70) response: role in
laryngopharyngeal reflux disease. Ann Otol Rhinol Laryngol 115(1):
p. 47-58.
8.
Johnston, N., Knight, J., Dettmar, P.W., Lively, M.O., and Koufman, J.
(2004). Pepsin and carbonic anhydrase isoenzyme III as diagnostic
markers for laryngopharyngeal reflux disease. Laryngoscope 114: p.
2129-2134.
9.
Tasker, A., Dettmar, P.W., Panetti, M., Koufman, J.A., Birchall, J.P.,
and Pearson, J.P. (2002). Is gastric reflux a cause of otitis media with
effusion in children? Laryngoscope 112(11): p. 1930-1934.
Stovold, R., Forrest, I.A., Corris, P.A., Murphy, D.M., Smith, J.,
Decalmer, S., Johnson, G.E., Dark, J.H., Pearson, J.P., and Ward, C.
(2007). Pepsin, a biomarker of aspiration in lung allografts: a putative
association with rejection. Am J Respir Crit Care Med 175(12): p.
1298-1303.
10.
16
11.
Krishnan, U., Mitchell, J.D., Messina, I., Day, A.S., and Bohane, T.D.
(2002). Assay of tracheal pepsin as a marker of reflux aspiration. J
Pediatr Gastroenterol Nutr 35(3): p. 303-308.
12.
Knight, J., Lively, M.O., Johnston, N., Dettmar, P.W., and Koufman, J.A.
(2005). Sensitive pepsin immunoassay for detection of
laryngopharyngeal reflux. Laryngoscope 115(8): p. 1473-1478.
13.
Tamhankar, A.P., Peters, J.H., Portale, G., Hsieh, C.-C., Hagen, J.A.,
Bremner, C.G., and DeMeester, T.R. (2004). Omeprazole does not
reduce gastroesophageal reflux: new insights using multichannel
intraluminal impedance technology. J Gastrointest Surg 8: p. 888-896.
14.
Vela, M.F., Camacho-Lobato, L., Srinivasan, R., Tutuian, R., Katz, P.O.,
and Castell, D.O. (2001). Simultaneous intraesophageal impedance and
pH measurement of acid and nonacid gastroesophageal reflux: effect of
omeprazole. Gastroenterology 120(7): p. 1599-1606.
15.
McGlashan, J.A., Johnstone, L.M., Sykes, J., Strugala, V., and Dettmar,
P.W. (2008). The value of a liquid alginate suspension (Gaviscon
Advance) in the management of laryngopharyngeal reflux. Eur Arch
Otorhinolaryngol (in press): p. DOI 10.1007/s00405-008-0708-7.
16.
Strugala, V., Avis, J., Jolliffe, I.G., Johnstone, L.M., and Dettmar, P.W.
(2007). A role for alginate raft forming suspensions in the protection of
the oesophagus against damage by pepsin in the refluxate. Gut
56(Suppl III): p. A218.
17
12.
choroby (OESO).
9. Světový kongres. Gastro-ezofageální refluxní
2008
Monako, duben
Neinvazivní diagnostický nástroj pro detekci pacientů s rizikem vzniku GERD
Dettmar, P.W., Strugala, V. Technostics Limited, Hull, UK
Abstrakt není k dispozici
18
13.
Extraezofageální reflux. Za hranice
současného stavu vývoje
v souvislosti se 7. Mezinárodním sympóziem
na téma lidský pepsin (ISHP), Nottingham, VB
2006.
Detekce pepsinu pro diagnózu extraezofageálního refluxu.
Strugala, V.1, McGlashan, J.A.2, Morice, A.H 3, Watson, M.G 4, Dettmar, P.W. 1.
1Technostics
3Castle
UK
Limited, Hull UK, 2Queen's Medical Centre, Nottingham, UK,
Hill Hospital, Cottingham, UK, 4Doncaster Royal Infirmary, Doncaster,
Pozadí: Diagnostika extraezofageálního refluxu (EOR) se drží stejné
zavedené metody, používané pro chorobu gastroezofageálního refluxu ve
formě ambulantního 24-hodinového monitoringu pH (pH metrii) pomocí
dvojice sond, ačkoli s horní sondou umístěnou nad horním ezofageálním
svěračem v hrtanu 1. Stejné kritérium ezofagu je používáno u hrtanu, kde je v
případě více než 4% z 24-hodinové periody vykázané s pH pod 4,0 na horní
sondě klasifikováno za abnormální. Nicméně, existují názory, že jakákoli
refluxní epizoda v horním ezofageálním svěrači je neobvyklá a tudíž
indikativní pro patologicky reflux. Je jasně zapotřebí nové diagnostické
metody na přítomnost EOR.
Obsah žaludku je směsí kyseliny chlorovodíkové, pepsinu, pankreatických
enzymů a žlučových kyselin a důkazy prokazují, že hlavním agresorem je
pepsin 23. Vzhledem k tomu, že kyselina je neutralizována bikarbonátem a
jídlem, jeví se jako smysluplnější používat jako marker pro přítomnost
žaludeční šťávy pepsin. Testování pepsinu bylo provedeno v rámci řady studií
a prokázalo přítomnost refluxátu v extraezofageálních oblastech včetně
hrtanu 45, průdušnice, plic 9 a středního ucha 10-12.
Domníváme se, že vývoj spolehlivého, neinvazivního testu na detekci refluxu,
jenž by mohl být používán jako doplněk podrobného klinického vyšetření, má
potenciál stát se novou technikou "zlatého standardu" pro diagnózu refluxní
choroby. Důsledkem bude zásadní zlepšení péče o pacienta a značná úspora
nákladů na ZP.
Prezentujeme zde data z pilotní studie realizované v řadě center, kde byly
hodnocena účinnost in vitro diagnostického testu na reflux pomocí detekce
pepsinu.
Protokol studie: Primárním výsledkem této studie je zjistit, zdali nově vyvinutý
neinvazivní diagnostický test in vitro je schopen diagnostikovat pacienty s
extraezofageální refluxní chorobou. Cílem je zjistit, zdali je nový dipstick test
schopen spolehlivě rozlišovat pacienty s refluxní chorobou od normální
kontrolní skupiny pomocí detekce pepsinu ve slinách.
Druhým cílem bylo určit odpovídající časový rámec, ve kterém získávat vzorky
od subjektů. Z pohledu jednoduchosti provedení je snazší odebrat vzorek při
návštěvě kliniky pacientem, ale často tak pacient nemá za sebou nedávnou
refluxní
19
epizodu a test tak vykáže negativní hodnotu. Varianta, kterou si tento test
klade za cíl prozkoumat, je zdali lze zlepšené diagnostiky dosáhnout tehdy,
když je vzorek odebrán v domácích podmínkách, když pacient trpí symptomy.
Dalším sekundárním výsledkem této studie je zjistit, zdali lze in vitro
diagnostický test použít pro semi-kvantifikaci hladin pepsinu u těch pacientů,
u kterých byl pozitivně indikován pepsin ve vzorku a korelovat data s indexem
refluxních symptomů (RSI) 13.
V rámci této pilotní studie bylo získáno 20 subjektů ve dvou skupinách ze 3
lokalit, jak je popsáno níže:
•
Kontrolní skupina n=10
Pacienti navštěvující kliniku se zdravotním stavem, jenž dle názoru lékaře
nevykazuje extraezofageální reflux. Tito pacienti musí mít RSI < 3 za
předpokladu, že mají na pálení žáhy odezvu 0. U těchto pacientů bude v
době hodnocení požadováno poskytnutí jednoho vzorku slin/sputa.
•
Pacienti n=10.
Pacienti navštěvující kliniku se zdravotním stavem, jenž dle názoru lékaře
vykazuje klasické známky extraezofageálního refluxu. Tito pacienti musí mít
RSI > 20 za předpokladu, že mají na pálení žáhy odezvu > 2. U těchto
pacientů bude požadováno poskytnutí dvou vzorků slin/sputa; jednoho v
době hodnocení a jednoho v době, kdy budou doma vykazovat příznaky.
Vzorky slin/sputa byly testovány na přítomnost pepsinu pomocí přímého
sendvičového ELISA testu a také pomocí lateral flow dipstick testu, v obou
případech za využití nových monoklonálních protilátek na lidský pepsin.
V této prezentaci představíme a probereme výsledky získané v rámci této
pilotní studie.
Reference:
1.
Postma. Otol Rhinol Laryngol 2000; 109 (10 Pt 2 Suppl 184): 10-14.
2.
Johnson & Harmon. J Clin Gastroenterol 1986; 8 (Suppl 1): 26-44.
3.
Tobey et al. Am J Gastroenterol 2001; 96 (11): 3062-3070.
4.
Knight et al. Laryngoscope 2005; 115 (8): 1473-1478.
5.
Potlurri et al. Dig Dis Sci 2003; 48 (9): 1813-1817.
6.
Krishnan et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2002; 35 (3): 303-308.
7.
Meert et al. Pediatr Crit Care Med 2002; 3 (1): 19-22.
8.
Methany et al. Am J Crit Care 2002; 11 (2): 150-154.
9.
Ward et al. Thorax 2005; 60 (10): 872-874.
10.
Tasker et al. Lancet 2002; 359: 493.
11.
Tasker et al. Laryngoscope 2002; 112 (11): 1930-1934.
12.
Lieu et al. Otolaryngol Head Neck Surg 2005; 113: 357-361.
13.
Belafsky et al. J Voice 2002; 16 (2): 274-277.
20
14.
Extraezofageální reflux. Za hranice
současného stavu vývoje
v souvislosti se 7. Mezinárodním sympóziem
na téma lidský pepsin (ISHP), Nottingham, VB
2006.
Tvorba and charakteristika monoklonálních protilátek proti lidskému pepsinu
Strugala, V., Dettmar, P.W.
Technostics Limited, Hull, UK
Pozadí: Nepřímá sendvičová ELISA byla popsána jako metoda pro detekci
pepsinu pomocí polyklonálních protilátek na lidský pepsin 3b (králičí anti HU-3
peptid a kozí anti-lidský pepsin 3b). Tato metoda je použita pro hodnocení
přítomnosti pepsinu jako markeru gastrického refluxu v krčním sputu u LPR
pacientů [1]. Tato metoda byla prosazována jako diagnostický test na
extraezofageální reflux. Technologie monoklonálních protilátek produkuje
protilátky s vysokou přesností vázanosti na cílový antigen a homogenitu
přípravy, a lze je produkovat v neomezeném množství. Výše uvedené
vlastnosti jsou nezbytné pro rozvoj klinicky použitelného a opakovatelného
diagnostického testu. Navíc tyto metody umožňují rozvoj formátu lateral flow
(dipstick) testu. Zde diskutujeme produkci dvojice monoklonálních protilátek
(mAb) na lidský pepsin 3b a charakterizaci výsledného ELISA systému.
Metody: Vývoj monoklonálních protilátek:
Dvě mAb byly vyprodukovány imunizací BALBc myší pomocí antigenů
lidského pepsinu:
Byly získány splenocyty a sloučeny s myšími myelinovými buňkami, aby došlo
ke vzniku nesmrtelných somatických buněčných hybridů (hybridomů).
Hybridomy byly vyšetřovány na produkci lg a specifické rozpoznání cílového
antigenu. Vybrané pozitivní buňky byly dvojnásobně jednobuněčně klonovány
a protilátka vyloučená do ascitové tekutiny byla vyčištěna. Pro zachycení
protilátky byly použity mAb VDE 1.1. MAb 3D8 byl přímo označen křenovou
peroxidázou (HRP) pro použití jako detekční protilátka. Obě mAb spadaly do
subtypu lgG1.
Přímá sendvičová ELISA:
Pro detekci lidských pepsinů (komplexu 3, komplexu 1 a gastrin) a prasečí
pepsiny (prasečí pepsin A a prasečí pepsinogen). Reaktivita HRP byly
detekována pomocí TMB/H2O2 a absorbance vykázala hodnotu 414 nm.
21
Výsledky: Přímá sendvičová ELISA pomocí dvojice nových mAbs byla schopna
detekovat komplex pepsinu 3 s citlivostí1 ng/ml. Responze byla až do 2 μg/ml
takřka lineární. Vyskytovala se silná zkřížená reaktivita na lidský pepsin 1, ale
nikoli na gastrin (pepsin 5). Vyskytovala se zkřížená reaktivita na oba prasečí
antigeny.
Závěry: Pro vyvinutí ELISA metody na detekci pepsinu byly použity 2 mAb proti
lidskému pepsinu 3, jež budou opakovatelné díky dlouhodobě stálé
dostupnosti specifických protilátek. Citlivost je 1 ng/ml a lze detekovat řadu
odlišných izoformů pepsinu vzhledem k tomu, že mají konzervovanou strukturu
aminokyselin, jež zahrnuje HU3 peptidový řetězec (nebo homologickou formu,
jako v případě prasečích pepsinů). Naopak, gastrin, jenž má odlišný řetězec
aminokyselin, detekován není. Schopnost detekovat několik izoformů pepsinu
zlepšuje vhodnost pro použití jako diagnostický test refluxní choroby pomocí
přítomnosti pepsinu, jako markeru v žaludeční šťávě.
Reference:
1. Knight et al. Laryngoscope 2005; 15: 1473-1478
22