Vyšetření neznámých typů mutací v omezené oblasti genu (do cca

2.4.2012
Sekvenování DNA chemickou degradací 1977
Allan Maxam a Walter Gilbert
(Nobelova cena W.G. 1980)
Sekvenování PCR produktů
Walter Gilbert
Vyšetření neznámých typů
mutací v omezené oblasti genu
(do cca 1O kb)
Sekvenování DNA chemickou degradací 1977
ÚKOL 1: Zakresli do gelu pozice fragm entů Maxam-Gilbert sekvenování
Allan Maxam a Walter Gilbert
5´tattgcgtagaagc gt ´3
5´tattgcgtagaagc gt ´3
Restrikční štěpení chromosomové DNA a denaturace
A>G
Defosforylace 5´ konců DNA fragmentů (ALP)
G>A
C
C+ T
A>G
G>A
C
C+ T
Značení 5´ konce fragmentů P-dATP (polynukleotidová kinasa)
32
PARCIÁLNÍ DEGRADACE DNA
1
2
Metylace N7 guaninu
dimethylsulfátem
Metylace N3 adeninu
dimethylsulfátem
Porušení glykosidové
Vazby při pH 7
Porušení glykosidové
Vazby při pH 5-6
Vyštěpení cukru z fosfodiesterové vazby
v místě G při pH>7 a 90°C
Vyštěpení cukru z fosfodiesterové vazby
v místě A při pH >7 a 90°C
3
Reakce thyminu
s hydrazinem
4
Reakce cytosinu
s hydrazinem a NaCl
Vzniklá ribosylmočovina + piperidin
vyštěpí cukry z fosfodiesterové vazby
ELFO na akrylamidovém gelu
/1000V, 40 cm, 20% PAGE s 7M močovinou/
> Southern blotting
Detekce RA značených fragmentů DNA
Sekvenování DNA enzymaticky 1977
(Nobelova cena 1980)
Sangerovo enzymatické
sekvenování
Modifikace se značenými ddNTPs a separací
na kapilární elektroforese
Frederick Sanger
Vlastnosti analýzy:
•DNA pol I (Klenow fragment)
•Primer
•32P-dATP
•Denaturační akrylamidový gel
•4 dráhy
•Chem ické reakce pro ddNTPs
•Sekvenování úseků 100-200 bp
•Delší úseky DNA nutno restrikčně
štěpit (Alu sekvence A-G-C-T)
1
2.4.2012
5´
3´
3´
5´
Asymetrická
amplifikace
produktů
Řetězce budou zakončeny dideoxynuleotidem, je proto nutno mít
k dispozici všechny 4 z nich, ve stejné koncentraci
OH 2HC O
Pro Sangerovo sekvenování použijeme jako templát sense
vlákno templátu (po denaturaci) a antisense primer (či naopak)
Polymerací vznikají částečné kopie antisense (sense) vlákna
3´
3
OH
Poměr koncentrací
~100:1
2
β-D-2,3-dideoxyribosa
5´
OH 2HC
3´
OH
H
O
5´
3´
2
5´
3´
OH
5´
β-D-2-deoxyribosa
Sangerovo původní sekvenování s RA značením
(nukleotidu či primeru) ve 4 zkumavkách na PAGE
Sekvenování DNA enzymaticky 1977
Frederick Sanger
3´
Restrikční štěpení chromosomové DNA a denaturace
AT T G C A T C A G C C A T
Separace na akrylamidovém gelu, extrakce, denaturace
Asymetrická amplifikace Klenow, P-dATP značení
32
G
Specifická terminace tvorby DNA řetězce
1
2
3
4
Reakční směs
0,1 mM dNTPs
0,005 mM dGTP
0,5 mM ddGTP
Reakční směs
0,1 mM dNTPs
0,5 mM dATP
0,5 mM ddATP
Reakční směs
0,1 mM dNTPs
0,005 mM dTTP
0,5 mM ddTTP
Reakční směs
0,1 mM dNTPs
0,005 mM dCTP
0,25 mM ddCTP
T
A
C
T
ELFO na akrylamidovém gelu
/1000V, 40 cm, 12% PAGE s močovinou/
> Southern blotting
G
5´
A
A
C
G
T
A
G
T
dNTP >> ddNTP ve 4 zkumavkách
Značení dATP (tedy přirozeného nukleotidu) 32P
Denaturační akrylamidový gel
Nezbytné 4 dráhy v gelu (je stejný typ značení)
dle typu neznačeného ddNTP
Detekce RA značených fragmentů DNA
Sangerovo původní sekvenování s RA značením
(nukleotidu či primeru): zkumavka č. 1
3´
A C C AT T T G C G G A C T
Sekvenační primer
Polo-automatické sekvenátory (polovina 80. let)
A.L.F. Amersham (jeden či více fluoroforů)
5´
ddGTP
G
G
G
G
ddGTP >> dGTP v 1. zkumavce
Značení dATP (tedy přirozeného nukleotidu) 32P
Denaturační akrylamidový gel
Obsah zkumavky po reakci pipetován do 1. dráhy gelu
2
2.4.2012
Základem automatizace sekvenování DNA od
poloviny 80. let byl výzkum a syntéza fluoroforů
ddATP – JOE (550 nm)
ddCTP – FAM (520 nm)
ddGTP- TAMRA (585 nm)
ddTTP – ROX (620 nm)
Sangerovo sekvenování na poloautomatickém sekvenátoru
(značení ddNTP či primeru)
3´
A C C AT T T G C G G A C T
5´
A
C
G
T
ddNTP >> dNTP ve zkumavkách
Značení ddNTP dle zkumavky
Denaturační akrylamidový gel
Obsah zkumavek pipetován do 4 drah gelu
ROX-2' 3'- dideoxyCTP
TMR-2' 3'- dideoxyTTP
Princip separace makromolekul
na kapilární elektroforéze
ÚKOL: Najdi v přiložených záznamech elektroforeogramů mutaci v abl genu
(horní elektroforeogram považuj za referenční, od leva poté rozděl nukleotidy do
tripletů a popiš mutaci podle znalostí z minulého semináře symbolem AK)
Elektrický proud zapojený mezi dvě
opačně nabité elektrody ponořené
do elektrolytu způsobí m igraci iontů
z roztoku.
Triplet
311
Díky fosfátům negativní DNA
fragmenty putuj í k anodě (+).
Krátké DNA fragm enty putují v síti
makromolekulárního polymeru
rychleji než fragmenty delší.
Přirozený negativní náboj kapilár na bázi silikagelu
způsobující elektroendoosmotický efekt je omezen
tzv. kótováním kapilár inertním polymerem
Sangerovo sekvenování na automatickém sekvenátoru
Automatické sekvenátory (od 90. let)
princip kapilární elektroforézy
(značení ddNTP či primeru)
3´
AT T G C A T C A G C C A T
5´
3´
A T T G C A T C A G C C A T
primer
5´
5´
5´
5´
5´
G
G
G
G
G
T
C
T
ddGTP >> dGTP ddGTP – Dye (450 nm)
ddATP, ddTTP a ddCTP neznačeno
A
5´
5´
5´
5´
5´
G
5´
A
A
C
G
T
A
G
-
T
Detektor
L
+
5GGGG3
ddATP – JOE (550 nm)
ddCTP – FAM (520 nm)
ddGTP- TAMRA (585 nm)
ddTTP – ROX (620 nm)
A
C
G
T
3
2.4.2012
+
Stručná charakteristika
sekvenačních metod
•
•
•
•
•
•
Potřeba DNA pacienta, nikoliv rodiny
PCR amplifikace a asymetrická PCR
Nutná elektroforéza s vysokým rozlišením
Doba analýzy: týden
Náklady: 1000 - 2000 Kč / PCR produkt
Počet analýz v sérii: 4-8
-
Výhody kapilárního sekvenování
Nedostatky kapilárního sekvenování
- standardizovaný a ověřený způsob
sekvenování
- templátem PCR nebo zaklonovaný
insert
- flexibilita při nastavení podmínek
separace a detekce
- maximální délka produktu 700 bp
- chybovost 1,5%
- výstup ve formě elektroforeogramu
- kapacita <2 miliony nukleotidů denně
- fragmentační analýzy
- manipulace během analýzy
- genotyping, SSCP, HD analýzy
Pyrosekvenování (1996)
Templátem PCR produkt do 200 bp
Sekvenační analýza kratších
úseků (okolo 10 nukleotidů)
Princip pyrosekvenování
Krok 1: Vazba biotinylovaného produktu na
magnetické částice se streptavidinem, denaturace v NaOH, hybridizace sekvenačního primeru
Krok 2: Připojení nukleotidu č.1
a uvolnění pyrofosfátu (PPi)
Krok 3: PPi se enzymaticky mění na ATP, který
aktivuje přeměnu luciferinu na oxyluciferin,
jenž produkuje adekvátní množství světla
Krok 4: Apyrasa degraduje nespotřebovaný
nukleotid č.1 a ATP
Krok 5: Připojení nukleotidu č. 2 a kroky 3 a 4
(místo dATP dATPalfaS kvůli luciferase)
A G C T A G C T A G C T......
Výsledek pyrosekvenování (pyrogram)
Next generation sekvenování
SOLID 3 Plus System
Applied Biosystems
Pyrosekvenování = biochemický kvíz,
kdy
přístroj „stereotypně“ hádá následující
nukleotid a DNA templát označuje
každou správnou odpověď
„pyrotechnicky“…
Illumina Genom e Analyzer IIx
Genome Sequencer FLX System
Roche Diagnostics
4