Procházková D.

PŘÍPRAVA
ÍPRAVA VZORKŮ,
VZORK , CHROMATOGRAFICKÉ
KOLONY A CERTIFIKOVANÉ REFERENČNÍ
REFEREN NÍ
MATERIÁLY PRO ANALYTICKOU
TOXIKOLOGII
Dana Procházková
Sigma-Aldrich spol. s r.o., součást Merck KGaA, Praha
1
Merck Millipore a Sigma-Aldrich od 18.11.2015 jedna společnost
2
Zasílání e-mailů s informacemi o novinkách v následujících oblastech:
Sigmaaldrich.com/newson
1. Ovzduší
2. Potraviny
3. Voda
4. Standardy
3
SPME
4
SPME
•
Metodu poprvé publikoval prof. Janusz Pawliszyn (University of Waterloo, Canada) v 1990 [1]
•
Komerčně se prodává od roku 1993
•
Mikro extrakce na pevnou fázi, je jednoduchá a účinná sorpčně - desorpční technika za koncentrování analytu, která
nevyžaduje rozpouštědla nebo komplikované aparatury. Principem je expozice malého množství extrakční fáze
nadbytkem vzorku. Analyty jsou sorbovány na SPME vlákně dokud není dosaženo rovnováhy. Množství extrahovaného
analytu záleží na hodnotě rozdělovacího koeficientu.
•
Metoda je použitelná ve spojení s plynovou i kapalinovou chromatografií. Dává lineární výsledky v širokém
koncentračním rozsahu. Volbou vhodného typu vlákna se dosáhne reprodukovatelných výsledků i pro nízké
koncentrace analytů. Doporučuje se zachovávat shodné doby vzorkování a další extrakční parametry - hodnotu pH,
iontovou sílu apod.
•
Zmiňována v řadě oficiálních metod
•
SPME – další výzkum
[1] C. Arthur, J. Pawliszyn, Anal. Chem. 62 (1990) 2145
5
Janusz Pawliszyn - US Patent
6
SPME
•
Metodu poprvé publikoval prof. Janusz Pawliszyn (University of Waterloo, Canada) v 1990 [1]
•
Komerčně se prodává od roku 1993
•
Mikro extrakce na pevnou fázi, je jednoduchá a účinná sorpčně - desorpční technika za koncentrování analytu, která
nevyžaduje rozpouštědla nebo komplikované aparatury. Principem je expozice malého množství extrakční fáze
nadbytkem vzorku. Analyty jsou sorbovány na SPME vlákně dokud není dosaženo rovnováhy. Množství extrahovaného
analytu záleží na hodnotě rozdělovacího koeficientu.
•
Metoda je použitelná ve spojení s plynovou i kapalinovou chromatografií. Dává lineární výsledky v širokém
koncentračním rozsahu. Volbou vhodného typu vlákna se dosáhne reprodukovatelných výsledků i pro nízké
koncentrace analytů. Doporučuje se zachovávat shodné doby vzorkování a další extrakční parametry - hodnotu pH,
iontovou sílu apod.
•
Zmiňována v řadě oficiálních metod
•
SPME – další výzkum
[1] C. Arthur, J. Pawliszyn, Anal. Chem. 62 (1990) 2145
7
Rozšiřování nabídky SPME vláken 1993-2004
8
8
SPME instruktážní videa na webu
9
9
Potažené (OC) SPME vlákno
Potažené vlákno
Conventional
Fiber
− Zvýšená robustnost
− Zvýšená odolnost při přímé expozici v ve vzorcích džusů,
zeleninových omáček apod.
− Prodloužení životnosti (2-3x)
“Overcoated”
Fiber
− První vlákno PDMS/DVB (Stableflex)
− 57439-U SPME-OC FIBER,65UM,PDMS/DVB*
Common Fiber End
*Conventinal Equivalent: 57293-U
Overcoated
Fiber End
10
Kovová SPME vlákna
2004
11
•
Slitina nikl-titan
•
Mechanicky odolná
•
Speciální postup pokrývání stacionární fází
•
Vlákna jsou krimpována
SPME vlákna pro LC bioSPME
Vlákno musí mít reprodukovatelný a odolný povrch, který nebobtná ve vodě a v organických rozpouštědlech
HPLC sorbent – částice (3µm nebo 5µm)
− C18
Inertní polymer
− Vhodný pro retenci i eluci analytů
− Biokompatibilní (in vivo aplikace)
− Rezistentní k velkým molekulám (proteiny a fosfolipidy)
12
12
SPME vlákna pro LC bioSPME
57234-U
Bio SPME
57281-U
13
13
Aplikace
SPME in-vivo aplikace z plné krve myší
Dávkování: 2mg/kg
10000
SPME
CBZ Conc. (ng/mL)
Farmakokinetická studie
(PK) na myších
Carbamazepin (CBZ)
Klasické odběry
1000
100
10
1
0
60
120
180
240
300
Time (min)
F.M. Musteata et al., Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis 47 (2008) 907–912
14
14
Slide Courtesy of Ines de Lannoy-NoAb BioDiscoveries
Application Example bioSPME LC-Tips
Forensic - Drugs in Urin
O
O
O
CH3
CH3
O
OH
O
H3C
N
H3C
O
N
O
H3C
O
N
O
O
Cocaine
Monoisotopic Mass = 303.147058 Da
O
O
Benzoylecgonine
Cocaethylene
Monoisotopic Mass = 317.162708 Da
Monoisotopic Mass = 289.131408 Da
CH3
CH3
CH3
N
N
CH3
CH3
CH3
H3C
N
CH3
Methadone
Monoisotopic Mass= 309.209264 Da
15
15
O
+
EDDP
Monoisotopic Mass = 278.190326 Da
N
H
Norfentanyl
Monoisotopic Mass= 232.157563 Da
Application Example bioSPME LC-Tips
Forensic - Drugs in Urine
Parameter:
bioSPME:
SPME Tips - C18
Calibration:
20,50, 100, 200, 500, and 1000 ng/mL in
matrix matched Urin; deuterierte IS 200 ng/mL
Sample volume:
500µL + 50µL 2M Ammoniumformiat buffer to pH 3,7
Compounds
SPME Protokoll
1. Conditioning: for 10min in Methanol
2. Equilibrate:
for10min in Water
3. Extraction:
for 10min from sample in microcentrifuge vial
4. Desorption:
for 30min. on shaker in 200µL 20mM
Ammoniumformiat in 90:10 methanol:water
5. Analysis:
Fiber got removed and vial directly transferred to
HPLC
16
16
Norfentanyl
EDDP
Benzoylecgonine (BZE)
Cocaine
Methadone
Cocaethylene
Application Example bioSPME LC-Tips
Forensic - Drugs in Urin
MS/MS Transitions
No.
4
3
Name
tR
1
Norfentanyl
0.7
2
Benzoylecgonine
0.9
3
Cocaine
4
5
6
Compound
Precursor
Product
Norfentanyl
233
84
d5 Norfentanyl
238
84
1.4
EDDP
278
234
Cocaethylene
1.9
d3 EDDP
281
234
EDDP
4.1
BZE
290
168
Methadone
7.5
d3 BZE
293
171
Cocaine
304
182
d3 Cocaine
307
185
6
1
0
17
17
5
2
1
2
3
4
5
6
Retention Time (min)
7
8
9
Methadone
310
265
d3 Methadone
313
268
Cocaethylene
318
196
d3 Cocaethylene
321
199
10
Conditions:
column:
Ascentis Express RP Amide, 10cm X 2.1mm I.D., 2,7 µm
(53913-U)
mobile phase:
10 mM ammonium formate (75:25
water:acetonitrile)
flow:
0.2mL/min
temp:
35ºC
injection:
2 µL
detection:
ESI+, MRM
Instrument: Agilent 1100, ABI-3200Qtrap
Application Example bioSPME LC-Tips
Forensic - Drugs in Urin
DESI Drugs of Abuse 092409.rdb (Cocaine): Regression y = 0.87 x (r = 0.9996)
2.2
2.0
1.8
Analyte Area / IS Area
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
18
18
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Analyte Conc. / IS Conc.
1.8
2.0
2.2
2.4
Compound
Correlation
Norfentanyl
EDDP
BZE
Cocaine
Methadone
Cocaethylene
0.9978
0.9999
0.9908
0.9996
0.9936
0.9996
bioSPME
Supression of large Biomolecules
TOF-LC/MS of Bath Salts from Plasma
Comparison Protein Precipitation bioSPME
19
19
Interfacing bioSPME mit DESI-MS
Courtesy of Joseph
Kennedy/ Justin Wiseman
of Prosolia
20
20
SPME / DESI-MS: Time Demand
Coupling Desorption Electrospray Ionization with Solid-Phase Micro
Extraction for Screening and Quantitative Analysis of Drugs in Urine
Joseph H. Kennedy, Craig Aurand, Robert Shirey, Brian C. Laughlin, and Justin M. Wiseman
Prosolia, Inc., Indianapolis, IN, and Supelco/Sigma-Aldrich, Bellefonte, PA
Method:
Addition of internal standard (200 ng/mL) to urine sample
Extraction for15 min,
Wash with water,
Analysis by DESI-MS/MS in 1-2 min
Prep. / Extraction
21
21
15
Time (min)
W
as
h
0.5
Analysis
1-2
Literatura a další informace
22
SPE
23
SPE zařízení a doplňky
24
24
SPE Supelco kolonky
25
25
26
HPLC
27
27
Teorie a praxe
•Knox published in 1999 and 2002 that the contribution of the A term in the van Deemter
equation had probably been underestimated.
J. H. Knox, Band Dispersion in Chromatography- A New View of the A Term, Journal of Chromatography A, 831 (1999) 3–15.
J. H. Knox, A Universal Expression for Bandspreading in the Mobile Zone, Journal of Chromatography A, 960 (2002) 7–18.
•Kirkland commercialized a spherical Fused-Core silica in 2006 with very narrow size
distribution (PSD) and exceptional performance.
J. J. Kirkland, T. J. Langlois and J. J. DeStefano, Fused-Core Particles for HPLC Columns, American Laboratory, 39 (February 2007), 18-21
•Desmet, et. al. observed a strong trend between narrow silica particle size distribution (PSD)
and better column performance.
D. Cabooter, A. Fanigliulo, G. Bellazzi, B. Allieri, A. Rottigni, G. Desmet, Relationship between Particle Size Distribution and Chromatographic Performance, J. of Chromatography A, 1217 (2010)
7074–7081.
–“there is strong correlation between particle size distribution of the packings and the quality (of the
column)”
•Theory and evidence strongly indicated that columns with fully porous particles might also be
significantly improved by a very narrow PSD and become the new standard.
28
Patentovaná technologie Ecoporous™
•Nový postup umožňuje syntézu monodisperzního, vysoce čistého silikagelu
•Vyrábí se uniformní častice, snižuje se množství odpadu, což je ekologicky šetrné
29
29
Výhody silikagelových častic s pevným jádrem
30
30
Výhody silikagelových částic s pevným jádrem
31
31
Ascentis Express Fused-Coretm a BIOshellTM
• Sorbent:
vysoce čistý silikagel
▪ neporézní jádro, porézní vrstva jsou silikagel typu B
•
•
•
•
•
•
•
Velikost částic:
Distribuce velikosti částic:
Velikost pórů:
Velikost povrchu:
pH rozsah:
Limitní tlak:
Nabídka stacionárních fází
•
• LC-MS:
2,0 µm, 2.7 µm, 3.4 µm a 5.0 µm
6% standardní odchylka*
90 Å, 160 Å, 400 Å
150 m²/g (220-300 m²/g efektivní)
2 – 9, 1 – 8
600 barů (testováno na UHPLC)
C18, C8, F5, Cyano, RP-Amide, Phenyl-Hexyl, OH5, HILIC
Biphenyl - nová
BIOshell™ A160 Peptide C18, C8, CN, 2.7 µm, 5.0 µm
BIOshell™ A400 Protein C4, 3.4 µm
vysoce kompatibilní
* Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka.
32
32
33
HPLC separace - zlepšení selektivity na bifenylové fázi
34
Nabídka UHPLC a HPLC kolon
UHPLC
HPLC
5.0 µm
1.3 µm
1.7 µm
1.8 µm
Best UHPLC column
~ Value for performance
35
35
2.0 µm
3.0 µm
Fast HPLC on any
system
3.5 µm
Work horse
column
Analytické standardy, CRM a matricové standardy
www.sigmaaldrich.com/standards
36
Brožury se standardy
37
37
Autorizovaný distributor
IRMM / BCR
Od roku 2000 jsme
autorizovaným distributorem
– „The Institute for Reference
Materials and Measurements“
(IRMM) z Geel, Belgium. V
nabídce je 500 CRMs (BCR®)
38
NIST
Standards
Dále jsme autorizovaným
distributorem „The National
Institute of Standards and
Technology“ (NIST). Nabízíme
více než 1,300 různých typů
SRMs pro průmyslových
surovin, fyzikálních vlastností,
klinickou chemii, životní
prostředí, potraviny,
zemědělství.
European
Pharmacopeia
US Pharmacopoeia
Primární standardy jsou
vyráběny v „National Metrology
Institutes“ (NMIs) podle
European Pharmacopeia.
Primární standardy jsou
vyráběny v „National Metrology
Institutes“ (NMIs) podle US
Pharmacopoeia (USP).
Většina z nich je skladem.
Pokud ne, tak dodaní 2-3 týdny
dle možností EP.
Většina z nich je skladem. Pokud
ne, tak dodání 3-4 weeks podle
možností USP.
Standardy – obchodní značky pro farmakologický průmysl, farmakologické,
klinické, toxikologické a forenzní laboratoře v nemocnicích a výzkumných ústavech
Cerilliant
Cerilliant CRM pro farmakologický
průmysl, farmakologické, klinické,
toxikologické a forenzní laboratoře –
drogy a testování hladin
alkoholu, metabolitů léčiv,
rostlinné extrakty, vitaminů,
hormonů, výbušnin
39
RTC
RTC sekundární
farmaceutické standardy
jako alternativa k
primárním standardům
(USP, EP)
HWI
Analytik
Rostlinné extrakty od HWI Analytik
Cerilliant® přehled produktů
Od Androstenedione po Ziprasidone
2C Amines
Alcohol / Ethanol
AK (DNPH's)
Amphetamines
Anesthetics
Analgesics
Antibiotics
Anticonvulsants/Antiepileptics
Antidepressants
Antifungals
Antihistamines
Antipsychotics
Antivirals/Antiretrovirals
Barbiturates
Bath Salts/Synthetic
Cathinones
Benzodiazepines
Bile Acids
Cannabinoids
- Cannabis Testing
- Synthetic
- Traditional
Cardiac Drugs
2 Catecholamines
40
Chemical Warfare
Derivatizing Reagents
Dietary Supplements
Environmental Contaminants
Explosives
Fatty Acids
Glucuronides
Hallucinogens
- Dissociatives
- LSD
- NBOMe Analogs
- Plant-Based
- Tryptamines
Hormones
Narrow Therapeutic Index/NTI
Drugs
Nicotine/Tobacco
Nitroglycerins
Opioids
OTCs
P450 Standards
PAHs
Pain Management / RX Monitoring
PCBs
Performance Drugs/Sports Testing
Pesticides
Pharmaceuticals
Phytochemicals
Proteins
- Female
- Hydroxyvitamin D
- Male
- Neonatal
- Thyroid
iMethodTM
Immunosuppressants
Internal Standards
Multi-Component Drug Standards
Sedatives
Sleep Aids
Steroids
Stimulants
Therapeutics/TDM Drugs
Tricyclic Antidepressants (TCAs)
Veterinary
Vitamins
Weight-Loss Drugs
~100 nových
produktů ročně
Katalog obsahuje
farmaceuticky aktivní
látky, metabolity,
nečistoty, produktů
rozkladu, endogenní
biomarkery, interní
standardy včetně
izotopově značených
41
42
43
HWI Analytik Rülzheim (Germany)
44
Děkuji za pozornost
45