Proč a jak analyzovat minimální reziduální

Setkání uživatelů Průtokové cytometrie Beckman Coulter v Mikulově, 8.-10.5.2016
Proč a jak analyzovat
minimální reziduální
nemoc (MRN)
u mnohočetného myelomu
Říhová L, Všianská P, Bezděková R
Oddělení klinické hematologie, FN Brno, Brno
Babákova myelomová skupina, UPF, LF MU, Brno
Mnohočetný myelom
2. nejčastější hematologická malignita
přítomnost klonu plazmocytů (PC) v kostní
dřeni (KD) produkujících monoklonální Ig (MIG)
kombinace nových léčiv s autologní
transplantací periferních kmenových buněk
▫ zásadní prodloužení přežívání pacientů
▫ nízce rizikoví pacienti chronické on.
▫ dřeňový relaps je stále častý kratší trvání remise
Hajek 2013, Pour 2014
Proč stanovovat MRN u MM I.
Detekce minimální reziduální nemoci (MRN)
- standardní procedura u potenciálně
vyléčitelných hematologických malignit (ALL)
Mnohočetný myelom (MM) - nevyléčitelné
onemocnění, relaps navzdory dosažení CR
Pokroky v léčbě MM - nová léčiva a léčebné
strategie zvýšily počet dosažených remisí
Paiva 2015; Brando 2015; Munshi and Anderson 2013; Oldaker 2015
Proč stanovovat MRN u MM II.
Citlivý přístup pro porovnání efektivity
rozdílných léčebných strategií
Individualizované monitorování léčby s cílem
zabránění pře- či nedo-léčenosti
Biomarker nezbytný pro včasnou a spolehlivou
předpověď přežívání pacientů, který může
urychlit uvolnění nových léčiv na trh (OS, PFS)
Paiva 2015; Brando 2015; Munshi and Anderson 2013; Oldaker 2015
Vývoj definice CR u MM
Historicky - snížení MIG až o 75% (menšina pac.)
Nepřítomnost měkkotkáňového plasmocytomu,
< 5% PC, negativní imunofixace v moči a séru
(až 30% pac.)
▫
Přísná (stringent) CR = CR + normalizace sFLC +
absence fenotypově aberantních PC
pacienti v CR (jejíž kvalita se velmi liší) přesto
relabují, tedy výše uvedené parametry neodrážejí
klinický význam MRN
Munshi and Anderson 2013
Dosažení CR
Nedávné studie s novými léčivy (s/bez ASCT)
vysoký počet CR u pac. starších 65 let, vysoce
rizikových a relabujících/refrakterních MM
Dosažení nejhlubší remise je předpokladem k
prodloužení OS a k vyléčení
▫
10% suboptimálních odpovědí (blízká CR, VGPR) je bez
relapsu 10 let (MGUS-like základní profil)
▫
12% neudržitelných CR (přetrvávající FC-MRD +
vysoce-rizikový cytogenetický základní profil)
Paiva 2012 and 2015a, b; Barlogie 2014
Celkový počet nádorových buněk
Hloubka léčebné odpovědi
A. MGUS-like pacienti
B. neudržitelná vs. udržitelná CR
C. kontrolovaná hladina detekovatelné MRN
MRN
D. pozdní relaps při nedetekovatelné MRN
nedetek. MRN
E. dlouhodobá kontrola nemoci při nedetekovatelné MRN
operační léčba
stanovení dg konec léčby
doba do progrese onemocnění (TTP)
Paiva 2015
Citlivost MRN
Počet nádorových buněk
10%
Rezistence (Morfologie…)
0.01%
0.001%
0.0001%
10-1
10-2
1%
0.1%
Detekční limit
Kompletní remise (FISH)
Imunologická CR (MFC)
Molekulární CR (PCR)
Terapie
10-3
10-4
10-5
10-6
Techniky dostupné pro MRN
MFC
(≥8colours)
ASO-PCR
NGS
PET/CT
aplikovatelnost
~100%
60-70%
~90%
~100%
reprodukovatelnost
vysoká
vysoká
?
střední
dostupnost
vysoká
střední
omezená
střední
diag. vzorek
není nezbytný
nezbytný
nezbytný
není nezbytný
doba analýzy
2-3h
≥5dní
≥7dní
2h
cena analýzy
~350 USD
~500 USD
~700 USD
~2000 USD
citlivost
10-5-10-6
10-5-10-6
10-6
vysoká
standardizace
Euroflow
EuroMRD
?
ne
Paiva 2015
Vývoj FC-MRN
Standardní multiparametrová FC (MFC)
▫
<1 MM PC mezi 104 PC v 3x105 buněk, 3x4 znaky
Imunophenotypová odpověď (iCR = sCR+)
▫
absence myelomových PC mezi 2x106 dřeňových
buněk analyzovaných MFC (≥4 znaky = 3x4)
Pokročilá MFC (kvantifikace MRN)
▫
Log deplece (<0.01% MRN), 5x105 buněk, 6 znaků
Euroflow přístup - 2x8 znaky, Infinicyt SW
Next Generation Flow - 2 Euroflow zkumavky spoj.
Paiva 2008, 2011; Rawstron 2015
Vysoce citlivá FC-MRD
Pro potřebnou přesnost je vyžadován mnohabarevný
přístup (≥ 8 barev) a pro potřebnou citlivost je
požadován vysoký počet analyzovaných bb (106)
Kvantitativní analýza MRD se senzitivitou 10-5 je více
informativní než stanovení CR poz/neg a zlepšuje
předpověď chování on. u pacientů s MM
Vnitřní QC k odhadu kvality vzorku, interní kontroly
pro hodnoty cut-off
Brando 2015; Arroz 2015; Rawstron 2015
Kvalita FC-MRN u MM
Kvalita FC-MRD testování je vztažena a
dramaticky ovlivněna mnoha důležitými faktory:
množství a kvalita vzorku KD
proces zpracování (barvení)
použitá kombinace reagencií
proces získání vlastních dat vč. počtu analyzovaných
buněk
standardizace/harmonizace nezbytná!
Stetler-Stevenson 2011
Kvalita vzorku pro MRN
Nevhodný/nereprezentativní vzorek KD:
převaha kontaminace periferní krví
▫
přítomnost bazofilů, plazmablastů
▫
chybění HSC vč. B progenitorů, žírných buněk…
starý vzorek (48 hodin od odběru)
viditelné sraženiny
Arroz 2015; Brando 2015
Detekční/kvantifikační limity
celkový počet analyzovaných leukocytů
počet událostí neoplastických buněk
nejnižší počet událostí nezbytný k opakovatelné
detekci populace neoplastických PC:
25 events = LOD
nejnižší počet událostí nezbytný k opakovatelné
kvantifikaci populace neoplastických PC:
50 events = LOQ
Arroz 2015
LOD, LOQ a senzitivita
Leukocyty
% LOD
% LOQ
Senzitivity
50.000
0,05
0,1
10-3
100.000
0,025
0,05
10-4
500.000
0,005
0,01
10-4
1.000.000
0,0025
0,005
10-5
2.500.000
0,001
0,002
10-5
5.000.000
0,0005
0,001
10-5
PC fenotyp
Normální
Neoplastické
CD56
CD19
CD28
CD27
CD117
CD45
CD20
CD81
CD33…
CD44…
0.3 ≤ cκ
κ/λ ratio ≤ 3
0.3 ≥ cκ
κ/λ ratio ≥ 3
CD38 (+++ vs. ++)
CD138
Detekce PC
3.303.193 událostí ve 140ul plné KD
2.300.219 leukocytů (70% events)
9.155 PC (0,4%)
Detekce PC
vs. 50.000 událostí
vs. 35.000 leukocytů
vs. 200 PC
Negativní MRN
10.000.000 událostí ve 320 ul plné KD
7.141.637 leukocytů (74 %) a 27.850 PC (0,39 %)
aPCs = 0; senzitivita: 6,97x10-6
Pozitivní MRN
1.443.600 událostí v 500 ul plné KD
1.352.988 leukocytů (74 %) a 4.914 PC (0,36 %)
a-PCs = 40; % a-PC = 2,96x10exp-5 = 0,00296 %;
senzitivita: 3,68x10-5 = 0,0037 %
Euroflow Standardizace
8-barevná FC - Euroflow MoAb kombinace
▫
Euroflow nestavení
▫
min. 3x106 leukocytů a 500 PC
▫
detekce aberrantního fenotypu PC + analýza
klonality - v kalkulovaných datech
horší identifikace PC, proto proběhla výměna
fluorochromů a znaků zejména pro detekci
MRN - 2. generace panelu Euroflow
Vývoj panelu pro FC-MRN
PB
PO
FITC
PE
PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7
CD45 CD138 CD38 CD28
CD27
CD19
CD117
CD81
CD45 CD138 CD38 CD56
β2m
CD19
cIgκ
κ
cIgλ
λ
BV421 BV510 FITC
PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-C750
CD138 CD27 CD38 CD56
CD45
CD19
CD117
CD81
CD138 CD27 CD38 CD56
CD45
CD19
cIgκ
κ
cIgλ
λ
BV421 BV510 BV605 FITC PE PCP-Cy5.5 PC7 APC APCA700 APCC750
CD138 CD27 CD117 CD38 CD56 CD45
CD19 cIgλ
λ cIgκ
κ
CD81
Flores-Montero 2015
Problémy v detekci MRN
léčba MoAb anti-CD38 (Daratumumab)
▫
obsazení vazebných epitopů CD38
terapeutickou MoAb - nedostupné
pro vizualizační MoAb
využití multiepitopové CD38
v kombinaci s cyCD38
využití CD229 - slabá denzita
exprese
Problémy v detekci MRN
„Problémy“ s FC-MRN
vysoká finanční nákladnost
▫
nutno používat vyšší objemy MoAb - pracuje
se s 10x106 buněk (nestačí titrace na 1x106 bb)
časová náročnost
▫
vlastní příprava vzorku - předlyzační krok (bulk
lysis) + intracelulární analýza
▫
analýza vzorku na cytometru - 20-30 min sběr
▫
vyhodnocení vzorku - „hledání“ klonu PC
Závěr
Polychromatická FC je validním nástrojem pro
kvantifikaci MRN, standardizace zatím v
procesu příprav
Senzitivita - při analýze dostatečného počtu bb vzrostla na 10-6 a je srovnatelná s molekulárními
přístupy
Kvantifikace MRN by měla být využita jako nový
biomarker umožňující predikovat přežívání
pacientů
Poděkování
Prof. MUDr. Roman Hájek, CSc.
FC Lab, OKH, FN Brno a LF MU, Brno
BMG, ÚPF, LF MU, Brno
IHOK, FN Brno a LF MU, Brno
Děkuji za pozornost!