Využití AAS s plamenovou a elektrotermickou atomizací k

VYUŽITÍ AAS S PLAMENOVOU A
ELEKTROTERMICKOU ATOMIZACÍ K
MÉNĚ OBVYKLÝM VYŠETŘENÍM
KOVŮ A METALOIDŮ V PODMÍNKÁCH
KLINICKÉ LABORATOŘE
Jiří Kukačka
FONS 2010
PARDUBICE 20.9.2010
KOVY a POLOKOVY LIDSKÉM
ORGANIZMU
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Makroprvky (makrobiogenní kovy a metaloidy)
Jejích podíl na celkové hmotnosti organizmu > 0,005 %.
Na, Ca, Mg, K.
přijímáme je většinou v potravě v požadovaném množství
větších než 100 mg/den
Mikroprvky (mikrobiogenní kovy a metaloidy)
Jejích podíl na celkové hmotnosti organizmu < 0,005
dostateční množství pro organizmus je menší než 100
mg/den
ESENCIÁLNÍ STOPOVÉ KOVY a METALOIDY
STOPOVÉ KOVY a METALOIDY s neznámou fyziologickou funkcí
TOXICKÉ KOVY a METALOIDY
KOVY a METALOIDY jako xenobiotika
využívané v medicíně (léčiva a diagnostika)
KOVY a METALOIDY
VOLBA BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU
• dle vlastností analytické metody
• podle charakteru metabolizmu prvku, akumulace
• dle účelu vyšetření (toxikologické, farmakokinetické)
• dle možné invazivity atd.
NESRÁŽLIVÁ KREV, PLAZMA, SÉRUM
MOČ, SBĚR MOČI za 24 hodin
LIKVOR
SPERMA, SEMINÁLNÍ TEKUTINA
MATEŘSKÉ MLÉKO
VLASY, NEHTY, MEKONIUM
JATERNÍ TKÁŇ, TVRDÉ TKÁNĚ
•
KOVY a METALOIDY
1. Indikace k vyšetření – poruchy z
nedostatku
prvek
porucha
Fe
Anemie, infekce, tumory
F
Zubní kaz, osteoporóza
Co
Makrocytická anemie
Cu
Mikrocytická anemie, Wilsonova choroba, Menkesova choroba,
Mn
Deformace kostí a chrupavky, pokles tvorby protrombinu
Mo
Porucha xanthinoxidasy, hypourikémie
Se
Retardace růstu, kardiomyopatie, Keshanova choroba, poruchy
osifikace, m. Kaschin-Beck
Zn
Dermatitidy, zhoršené hojení ran, růstová retardace, náklonnost k
infekcím, průjmy, talasémie, hypogonadismus, rheumatitis,
vypadávání vlasů
KOVY a POLOKOVY LIDSKÉM ORGANIZMU
Vztah mezi tkáňovou koncentrací a příjmem esenciálního prvku
Biologická funkce
100 %
OPTIMUM
DEFICIT
Tkáňová koncentrace a příjem prvku
TOXICITA
KOVY a METALOIDY
2. Indikace k vyšetření – nadbytek prvku, intoxikace
K potvrzení diagnózy je nutno prokázat všechny tyto
rysy intoxikace kovem:
•zdroj intoxikace musí být evidentní
•u pacienta musí být přítomny klinické známky a projevy otravy
•abnormální koncentrace toxinu musí být prokazatelná v některé ze tkání
Laboratorní vyšetření hraje nenahraditelnou úlohu
v diferenciální diagnostice .
V klinické praxi by mělo být indikováno vyšetření na některý z toxických kovů nebo
metaloidů vždy u pacientů s:
•renálním onemocněním neznámého původu
•bilaterální periferní neuropatií
•náhlými změnami mentálních funkcí
•akutnímu záněty nosní nebo krční sliznice
•s předchozí historií intoxikace
Intoxikace olovem
Terapie EDTA
700
MT
250
Pb
600
400
150
300
100
200
50
concentration (μM)
500
200
Lead
Metallothionein content (μM)
300
100
0
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13 20 34 35
Time (d)
Stuchlíková H., Dvořák P., Remešová S., Procházka J., Kukačka J., et al. Závažná intoxikace olovem z keramické čajové konvice u
desetileté dívky. Čes.-slov. Pediat 2006; 61 (12) : 692-696.
Petrlova J., Blastik O., Prusa R., Kukacka J., et al. Using of electrochemical methods for studying of metallothionein content in the human
blood serum of a patient poisoned by lead and treated by platinum.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2005
Dec;149(2):485-8.
Co je v benzínu, když ne olovo ?
antidetonátor
MMT
metylcyklopentadienyltrikarbonylmangan
Mangan a „šílenství“
ƒ
ƒ
1837 Couper poprvé popsal manganizmus u dělníku pyrolusitového mlýna
Manganové šílenství – 40.- 50. léta doly v Chile:
fáze: malátnost, somnolence, apatie, emoční labilita, sexuální disfunkce, slabost,
letargie, anorexie a bolesti hlavy
2)
Fáze: zhoršená paměť a rozhodování, úzkost, halucinace (30-90 dní)
3)
Fáze: progresivní bradikinezie, dystonie, paréza, poruchy chůze, třes (záměrný) ,
zhoršená koordinace, ztuhlost tváře
Chronické expozice →manganizmus = psychiatrické onemocnění (locura manganica),
připomíná schizofrenii (agresivní chování, emoční labilita, halucinace).
1)
Zdroje Mn intoxikace
Parentrální expozice
Úplná parenterá
parenterální
lní výživa (UPV) = velké riziko Mn intoxikace
Obvyklá koncentrace Mn ve výživách 5,6-8,9 μg/l, standardní
dávka není stále známá (0,1-2,2 mg), popsány případy intoxikací
UPV vždy vyšší než 0,1 mg/den, zvláště nebezpečné u
osob s jaterní insuficiencí
Pacienti (n=10) s celkovou parenterální výživou
bez suplementace manganem
0,9
(OCHRIP FN MOTOL 2005, doc. Drá
Drábková
bková)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1. měsíc
2. měsíc
3. měsíc
Zdroje manganu
ƒ
ƒ
ƒ
•
•
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
VZDUCH
průměrně 0,01-0,07 μg Mn/m3 ,garáže 0,25 μg Mn/m3
VODA
sladkovodní 1-200 μg/L, mořská 2 μg/L, hygienický limit v ČR (ČSN 757111)
0.1 mg/L
PŮDA
40-900 mg Mn/kg (Mn horniny nad 7000 mg)
POTRAVA
denní příjem 2- 6 mg Mn, vegeteriáni nad 11 mg, vyšší příjem pijáci čaje !
nejvíce ořechy (18-46 ppm), obiloviny (2,2-6,7 ppm), málo maso, mléko (0,2-0,5
ppm)
VÝROBKY
1) MnCl2: baterie, veterinární suplementa
2) MnO2: sklo, baterie, zápalné bomby
3) MnSO4: keramika, fungicidy, nutriční dopňky
4) KMnO4: desinfekce, čištění kovů, odbarvovače,ochranné postřiky ovoce a
rostlin
5) organokovové sloučeniny: antidetonanty (CMT, MMT), aditiva motorových
olejů, fungicidy
Mn esencialita
•Rodina Mn dependentních enzymů: argináza, glutaminsyntetáza,
fosfoenolpyruvátdekarboxyláza, Mn-superoxiddizmutáza
•Důležitý pro normální imunitní funkce, regulace krevní glukózy a
buněčné energie, reprodukci, trávení, růst kostí, antioxidační procesy,
srážení krve
Mn deficience
•Dobře popsaná u zvířat, u lidí velmi vzácná, patobiochemicky irelevantní a
klinicky nepostřehnutelná, většinou při generalizované malnutrici
•Poruchy růstu, vývoje a formací kostí, skeletární deformace, neplodnost,
abnormální glukózová tolerance, změny v lipidovém metabolizmu
•Suboptimální Mn koncentrace pozorována u lidí s epilepsií, osteoporózou,
exokrinní pankreatickou nedostatečností, na chronické hemodialýze, dětí s
Perthesovou chorobou nebo fenylketonurií
Neurotoxicita
manganu
Časné projevy Mn neurotoxicity: bolesti hlavy, ochrnutí svalů, ztráta chuti, apatie, insomnie, ztráta libida až
dystonie, hypokinezie, svalový třes
Poškození dopaminergních neuronů v mozkových strukturách kontrolující pohyb
U některých pacientů symptomy připomínající Parkinsonovu chorobu
Distribuce Mn do CNS: převládá přívod mozk. kapilárami, méně CSF a čichovým
nervem, přenos přes hematoencefalickou bariéru
Manganem vyvolaná neurotoxicita u uživatelů methamfetaminu
N=39 uživatelů MTF
(23 let – měsíc)
+ infekce HBV, HBC
Koncentrace S-Mn:
3,03±1,92 µg/l
Referenč
eferenční interval :(0,
(0,43–
43–0,76)
76) µg/l
g/l
Experimentální podávání čistého
MTF (1g/kg/den) u potkanů
potkanů
skupina
Mn
n
μg/l
Kontroly
12
3,6± 0,4
MTF
12
2,9± 0,3
Koncentrace Mn v pupečníkové krvi fyziologických a nezralých
novorozenců
* *
40
35
μg/L
30
* P<0,01, fyziologičtí vs. nezralý
25
20
15
10
5
0
véna
artérie
fyziologičtí
nezralí
Přestup placentou: placenta akumuluje Mn,
přestup je nízký, mechanizmus neznámý
Vliv věku – kojenci zadrží až 20 % z potravy
Diagnostický význam, indikace k
vyšetření
•Suspektní intoxikace
•Chronická cholestáza
•Biliární atrezie
•Dlouhodobá parenterální výživa
•Nutriční poruchy
•Chronická hemodialýza
•Neurologické symptomy podobné Parkinsonovským
•Epilepsie
KOVY a METALOIDY
3. Indikace k vyšetření – management a
bezpečnost terapie
20.století, rok 1965
cis-diamminedichloroplatina – u objevu E.
coli a elektrický proud
Platinové komplexy (analoga cisplatiny) –
více jak 35 let v klinické praxi,
nejrozšířenější, nejširší terapeutický záběr,
vysoký terapeutický efekt (např. cisplatina u
testikulárních nádorů >90%)
X
Vysoká toxicita, vznik rezistence,
problematická biologická dostupnost
20.let inovativního designu Pt komplexů
A
X
Snížení lability = snížení
toxicity
Pt
X
X = odštěpitelné skupiny (anionické)
A
A = aminový ligand
(neodštěpitelný)
Zvýšení stability = určuje
tvorbu aduktu DNA-PK
(=antitumorovou aktivitu)
20.let inovativního designu Pt komplexů
Komplexy
(II)
↓
Komplexy
(IV)
Komplexy
cis
↓
Komplexy
trans
Mechanizmus účinku Pt komplexů
Inhibice replikace
Inhibice transkripce
Narušení buněčného cyklu
Neadekvátní oprava DNA
Buněčná smrt
Pt komplexy – osud v organizmu
ƒ Spontánní chemické reakce (neenzymatické
transformace) - mnoho degradačních
produktů
ƒ Ireverzibilní vazba na proteiny a
nízkomolekulové nukleofily (methionin) –
nejsou cytotoxické pro nádorovou buňku,
ale přispívají k obecné toxicitě léku
ƒ Vylučování močí, kovalentní vazba ve
tkáních
Cisplatina
Aplikace
Sarkomy, některé karcinomy
(malobuněčný plic, ovaria), lymfomy,
germinální buněčné tumory, testikulární
tumory
Vedlejší účinky
Nefrotoxicita, neurotoxicita, silný
emetogen, ototoxicita, alopecie
Karboplatina
Aplikace
Nádory hlavy a krku, karcinom plic, ovárií,
neuroblastom, retinoblastom
Vedlejší účinky
Nausea, zvracení, hematotoxicita
(neutropenie, trombopenie)
Oxaliplatina
Aplikace
Kolorektální karcinom
(kombinace FOLFOX)
Vedlejší účinky
Periferní neuropatie, únava,
nausea, zvracení, diarhea,
neutropenie, ztráta vlasů
Nedaplatina+lobaplatina
Úskalí analytického stanovení a
farmakokinetického monitorování
ƒ Jaký biologický materiál ?
ƒ Stanovovat elementární Pt ? Intaktní
molekulu ? Profil degradačních produktů ?
ƒ Jakou analytickou technologií ?
Úskalí analytického stanovení a
farmakokinetického monitorování
ƒ Rychlá tvorba velkého množství různě
reaktivních intermediátů →stanovuje se Pt
ƒ Rozlišení mezi biologicky dostupnou
platinou a vázanou-farm. nedostupnou v krvi
a plazmě → stanovujeme v ultrafiltrátu
(popř. plazmě)
Úskalí analytického stanovení a
farmakokinetického monitorování
ƒ Dostupné analytické techniky v klinické
laboratoři:
ƒ ET-AAS
ƒ HPLC-UV, MS
ƒ ICPMS
ET-AAS pro stanovení Pt na UKBP
VARIAN SpectrAA 220 Z
AAS
32
AAS – Grafitová pec a Ľvovova vložka
Vyhřívaný
grafitový
atomizér
Příčně
vyhřívaný
grafitový
atomizér
33
Terapeutické monitorování Pt
komplexů
PROČ ?
vytvoření a optimalizace individuálního
terapeutického konceptu = určení vhodné dávky a
předcházení nežádoucím účinkům léčby
JAK ?
výpočet AUC (plocha pod
křivkou koncentrace
versus čas)
Zavedení TDM KARBOPLATINY u dětí se
solidními tumory ve FN MOTOL (2007)
Koncentrace CPt v plazmě (mg/l)
30
Koncentrace karboplatiny v závislosti na
čase u stejného pacienta v různých cyklech.
25
Celková dávka CPt byla vždy 187 mg.
20
1.cyklus
2.cyklus
3.cyklus
15
10
5
0
0
5
10
15
Čas od začátku dávkování (h)
20
25
30
Terapeutické monitorování Pt
komplexů
Co musí být známo a zohledněno pro správnou
interpretaci ?
ƒ Věk, pohlaví, tělesný povrch, dávka, doba infuze, terapeutický cyklus
ƒ Biologický poločas Pt, Pt clearance, distribuční objem, akumulace,
vazba na plazmatické proteiny, vazba na buněčné elementy,
metabolizmus a biotransformace, eliminace močí a stolicí,
farmakokinetika u specifických skupin pacientů (s renálními nebo
hepatálními poruchami), interakce s jinými léčivy
Terapeutické monitorování Pt komplexů
Pt concentration (ug/L)
Aplikace karboplatiny perivitreálně a intravitreálně jako
možnost léčby retinoblastomu
6000
5000
4000
POI30
group
3000
POI15
group
2000
Pt concentration (ug/L)
1000
0
9000
3
8
13
TII group
18 23 28 33
Hours after dose
38
7000
5000
3000
1000
0
2
4
6
8
Days after dose
10
12
14
43
48
STRONCIUM
Struktura stronciumranelátu
KONTROLY
Efekt podávání stronciumranelátu 2 roky v dávce 900
mg/kg/den na proximální tibii u potkana. Snímek ze
statické kostní histomorfometrie, zvětšeno 10x, barvení
von Kossa (Ammann et al.2006)
STRONCIUMRANELÁT
Vliv koncentrace stroncia ve vodě (20, 50 a 100
mg Sr/l) na růst salátu po 25 dnech kultivace.
Hladiny stroncia v krvi u léčené
pacientky
•Žena, 59 let, 45 kg, 153 cm – gracilní
•Těžká osteoporóza , T skóre na krčku
femuru -2,9, páteř s výraznou skoliózou – T
skóre -2,9
•Funkce ledvin normální
•3 roky terapie bisfosfonáty bez zlepšení
•Změna terapie na stronciumranelát
2 g/den
•Od začátku terapie monitorování
koncentrace Sr v plazmě
•Dyspeptické potíže, snížena dávka na
1 g/den
2g SrR/den
10000
Poloviční dávka
9000
8782
8000
150
7000
6000
4835
5000
100
4000
87,2
3196
3000
2297
0
50
837 31
52
0
4115
2008
2000
1000
3870
100
200
300
400
dny terapie
500
600
700
Odpad Sr močí za 24 hodin (mg)
Koncentrace Sr v plazmě (ug/L)
Hladiny stroncia v průběhu terapie
stronciumranelátem