Rok 2016

Diplomové práce absolventů studijních oborů „Biotechnologie“ a „Biotechnologie léčiv“,
obhájené na Fakultě potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha
v akademickém roce 2015/2016
prof. Ing. Jan Masák, CSc., Ústav biotechnologie, VŠCHT Praha
V akademickém roce 2015/2016 se konaly na Ústavu biotechnologie Fakulty
potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha státní závěrečné zkoušky včetně
obhajob diplomových prací posluchačů magisterského studijního programu „Biochemie a
biotechnologie“ studijního oboru „Biotechnologie“ a studijního programu „Syntéza a výroba
léčiv“ studijního oboru „Biotechnologie léčiv“. Státní zkouška se v souladu se statutem
VŠCHT Praha a FPBT skládala z ověření znalostí z tématických okruhů Mikrobiologie a
buněčná biologie, Bioinženýrství, Molekulární biologie a genové inženýrství, Biotechnologie,
Bioinženýrství a inženýrské základy procesů a Farmakologie a farmakochemie. Státní
zkoušku a obhajobu diplomové práce úspěšně složilo a tím zakončilo vysokoškolské studium
celkem 26 studentů 2. ročníku magisterského studia.
Následující přehled obhájených diplomových prací na jednotlivých zaměřeních je
řazený abecedně podle jména diplomanta a dále zahrnuje název diplomové práce, v závorce
jméno vedoucího diplomové práce s pracovištěm, kde byla diplomová práce vypracována a
stručnou charakteristiku řešeného témat.
Obhajoby konané dne 8. a 9. 6. 2016
studijní obor „Biotechnologie“
Bc. Hana Bahounková: Kutinázy v nových průmyslových aplikacích (prof. Ing. Jan Páca,
DrSc., ÚB VŠCHT Praha)
Kutináza z Thermobifida cellulosilytica byla rekombinantně exprimována v Escherichia coli
BL21 (DE3) a porovnána s kutinázou z Humicola insolens pro různé aplikace. Hlavním cílem
bylo nalezení potenciálu pro průmyslové využití. Byla prokázána schopnost kutinázy
recyklovat syntetické polymery. Vysoký enzymsubstrátový poměr vedl při hydrolýze ke
vzniku TA se vzůrstající inkubační dobou. S nízkými poměry byly pozorovány změny po
delší inkubační době. Účinek přídavku dimethylsulfoxidu na hydrolýzu byl patrný po delším
čase. Polyethylentereftalátový film byl kutinázou funcionalizován. Bylo prokázáno, že
kutinázy vykazuje rozdílné vlastnosti při formování povrchových reaktivních skupin. Zvýšení
hydrofility bylo stanoveno kontaktními úhly. Nejvyšší dosažený úbytek byl 28.4°. Kutináza
má rovněž potenciál pro hydrolýzu kyseliny poly-L-mléčné, při které bylo dosaženo
nejvyššího úbytku kontaktního úhlu 45,82° po 24 h a po delší době hodnoty již nebyly
detekovatelné z důvodu vysoké hydrofility. Kutináza byla také z 99,84 % úspěšně
imobilizována a poté katalyzovala polyesterovou syntézu, poly(1,4-butylen-adipátu) s Mn 137
g/mol. Výsledky byly na závěr porovnány s dostupnou literaturou.
Cutinases in novel industrial applications
Cutinase from Thermobifida cellulosilytica recombinantly expressed in Escherichia coli BL21
(DE3) was produced and compared with Humicola insolens cutinase for different
applications. The main aim was assesing the potential for industrial use. Ability of cutinase to
recycle synthetic polymers was confirmed. High substrate-enzyme ratio led to a change of the
1
hydrolysis pattern towards TA with longer incubation time. With the low ones only small
changes were detectable after longer incubation time. Effect of dimethyl sulfoxide addition on
the hydrolysis was seen after longer time. Poly(ethylene terephthalate) film was
functionalized by cutinase. It was shown, each of cutinase has different properties in terms of
formed reactive groups on the surface. An increase in hydrophilicity was demonstrated by
water contact angle. The best decrease of 28.4° was achieved. Cutinase has potenical in
hydrolysis of poly-L-lactic acid too. The highest water contact angle decrease of 45,82° was
gained after 24 h and then it was not detectable anymore due to high hydrophilicity. Cutinase
was also succesfully covalently immobilized with the highest bounding activity 99.84 % and
it catalyzed polyester synthesis that gave poly(1,4- butylene adipate) with Mn 137 g/mol. The
results were also discussed with an available literature.
Bc. Tomáš Bártek: Vliv rozpouštědel na změny genové exprese u solventogenních
klostridií (doc. Dr. Ing. Petra Patáková, ÚB VŠCHT Praha)
Butanol je organické rozpouštědlo patřící mezi alkoholy. Jedná se o látku s širokým spektrem
využití, kterou mohou produkovat solventogenní druhy bakterií rodu Clostridium, například
druh Clostridium pasteurianum. Největším problémem biotechnologické produkce
biobutanolu je jeho vysoká toxicita vůči produkčním organismům. V této práci byla
zkoumána exprese genů, které by se teoreticky mohly podílet na aktivní exkreci butanolu. V
experimentální části této práce byl nalezen vhodný referenční gen pro relativní kvantifikaci
genové exprese (gen malé ribozomální podjednotky-rpsJ) a měřen průběh exprese dvou
studovaných genů EF1 (NCBI: ALB45939.1) a EF2 (NCBI: ALB46316.1). Podařilo se nám
zjistit, že relativní exprese studovaných genů EF1 a EF2 koreluje s tvorbou rozpouštědel jak
za standardních podmínek, tak i za podmínek stresových.
Influence of solvents on gene expression changes in solventogenic slostridia
Butanol is an organic solvent which belongs to the alcohols. Butanol is substance with a wide
spectrum of use and can be produced by solventogenic bacterial species of genus Clostridium,
for example Clostridium pasteurianum. The most significant problem of biotechnological
production of biobutanol is its high toxicity to production organisms. In this study we
investigated the expressions of genes which could theoretically participate in the active
excretion of butanol. In the experimental part of this study a suitable reference gene for
relative quantification of gene expression (the gene of the small ribosomal subunit-rpsJ) was
found and expression of two genes EF1 (NCBI: ALB45939.1) and EF2 (NCBI: ALB46316.1)
were measured. We managed to determine that the relative expressions of the studied genes
EF1 and EF2 correlated with formation of solvent under standard condition as well as under
stress condition.
Bc. Jan Chalupa: Porovnání různých režimů provozu termofilního bioreaktoru pro
odstraňování těkavých organických látek (doc. Ing. Martin Halecký, Ph.D., ÚB VŠCHT
Praha)
Tato práce se zaměřuje na degradaci různorodé směsi polutantů (aceton, dimetylsulfid,
etylacetát, propionová kyselina, trietylamin a α-pinen) v kombinovaném reaktoru, který
vznikl spojením submerzního reaktoru a biofiltru, pomocí termofilních mikroorganismů.
První část práce se zabývá vlivem teploty, průtoku a složení média na přestup kyslíku
v submerzní části reaktoru s cílem zjistit, zda může za termofilních podmínek docházet u
mikroorganismů k limitaci kyslíkem. Druhá část práce se zaměřuje na provoz reaktoru při
pracovní teplotě 55 °C. V náplňové části byla jako nosič použita biodegradovatelná pěna na
bázi lehčených polyuretanů a byla zkoumána možnost jejího využití jako náplně biofiltru.
V průběhu experimentů byl zkoumán vliv vstupní koncentrace a průtoku vzduchu na účinnost
2
degradace polutantů. Hodnoty organické zátěže během provozu reaktoru, se pohybovaly
v rozmezí 61,5 - 292,3 g∙m-3∙h-1. Nejlépe degradovanými látkami byl etylacetát a propionová
kyselina. V submerzní části reaktoru byly kromě vstupujících látek detekovány také
metabolity a to zejména etanol a kyselina octová, dále pak isopropanol, kyselina isomáselná,
kyselina valerová, myrtenol, cis-carveol, trans-pinocarveol.
Comparison of different operation modes of thermophilic bioreactor treating volatile
organic compounds
This thesis deals with a degradation of diverse mixture of pollutants (acetone, dimethyl
sulfide, ethyl acetate, propionic acid, trimethylamine and α-pinene) by thermophilic
microorganisms in reactor, which was created by combining bubble column and biofilter. The
first part of the thesis focuses on effect of temperature, air flow rate and media composition
on oxygen transfer in bubble column to determine possibility of microorganism limitation by
oxygen under thermophilic conditions. The second part focuses on operation of the reactor at
operation temperature of 55 °C. The biofilter was packed with biodegradable foam based on
expanded polyurethanes and the possibility of using this material as biofilter packing was
investigated. During experiments, the effect of inlet pollutant concentrations and air flow rates
on removal efficiency was monitored. The organic load values during the operation of reactor
varied in range 61.5 - 292.3 g∙m-3∙h-1. Ethyl acetate and propionic acid were degraded with
highest removal efficiencies. Besides the entering substances, the dissolved metabolites were
detected in the bubble column medium, namely ethanol and acetic acid followed by
isopropanol, isobutyric acid, valeric acid, myrtenol, cis-carveol and trans-pinocarveol.
Bc. Jan Chmelík: Produkcekyseliny mléčné jako prekurzoru pro výrobu bioplastů (Dr.
Ing. Leona Paulová, ÚB VŠCHT Praha)
Cílem práce bylo pro vybraný bakteriální kmen nalézt nejvhodnější způsob kultivace, který by
umožňoval produkci kyseliny mléčné jako prekurzoru pro výrobu polymléčnanu,
biodegradovatelného bioplastu. Po screeningu 16 bakteriálních kmenů a stanovení vlivu
kultivačních podmínek na produkční vlastnosti kmene byl pro další experimenty vybrán
Lactobacillus casei CCM 198. Pro nalezení vhodného způsobu kultivace byla porovnána
produkce kyseliny mléčné ve vsádkovém, přítokovaném a kontinuálnímu spořádání. Pro
vsádkovou kultivaci byla stanovena nejvhodnější počáteční koncentrace zdroje uhlíku a
energie (glukosy) 60 g/l, za těchto podmínek bylo vyprodukováno 59 g/l kyseliny mléčné,
výtěžnost byla 97 % vztaženo na spotřebovanou glukosu a produktivita 4,86 g/l/h. Pro
přítokovanou kultivaci byl určen jako nejvhodnější způsob konstantní přítokování
koncentrovaného roztoku glukosy, za těchto podmínek bylo vyprodukováno 91 g/l kys.
mléčné s výtěžností 93 % a produktivitou 5,41 g/l/h. V režimu kontinuální kultivace byly
porovnány kultivace suspenzní populace a populace imobilizované na částicích kukuřičného
oklasku. Nejvyšší vyprodukované koncentrace (20,54 g/l) kys. mléčné bylo dosaženo
imobilizovanou populací při zřeďovací rychlosti 0,1 1/h.
Production of lactic acid as a precursor for manufacture of bioplastics
The aim of this study was to find cultivation condition, which enables the maximum
production of of lactic acid as a precursor for polylactate manufacturing. Firstly, 16 bacterial
strains was screened and the effect of cultivation condition on the production characteristics
was evaluated. Based on these experiments, the strain Lactobacillus casei CCM 198 was
selected for furter experimental work. Secondly, the batch, fed-batch and continuous
cultivation arrangements for lactic acid production were compared. For batch cultivation an
optimum initial concentration of carbon and energy source (glucose) 60 g/l was found; at this
condition 59 g/l of lactic acid, yield of 97 % with respect to glucose consumed and volmetric
3
producitvity 4,86 g/l/h were achieved, respectively. For fed-batch a constant feeding rate of
concentrated glucose solution was found to be the best strategy; 91,4 g/l of lactic acid, 93 %
yield and 5,41 g/l/h productivity were achived in this case. Finally, the production of lactic
acid in continuous culture using free and immobilized lactic acid bacteria was compared. The
highest concentration of the lactic acid (20,5 g/l) was produced by immobilized culture at
dilution rate 0.1 1/h.
Bc. Petr Cviner: Možnosti využití odpadních surovin ze zpracování vinných hroznů (Ing.
Irena Kolouchová, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Vitis vinifera (réva vinná) je jednou z nejpěstovanějších plodin světa. Při výrobě vína tvoří
odpad až 20 % (w/w) celkového množství vstupních surovin. Vedlejší odpadní produkty
vznikají také během prací na vinohradu, tj. při osečkování vinohradu v průběhu vegetace a při
řezu révy v zimních měsících. Vinařský průmysl se tak stává jedním z hlavních producentů
bioodpadu. Skutečnost, že tyto odpadní suroviny disponují vysokým obsahem
polyfenolických látek (resveratrol, polydatin) s antioxidační aktivitou, které mohou být
využité nejen ve formě potravinových doplňků, ale také jako účinná směs látek s
antimikrobiální aktivitou, zůstává často opomíjena. Předložená práce se zabývá možností
využití odpadu z vinařského průmyslu jako potenciálního zdroje antioxidantů. Byly
analyzovány vzorky odpadů ze zpracování modrých a bílých odrůd Vitis vinifera poskytnuté
Vinicí sv. Kláry v Tróji a Vinicí Grébovka v Praze. Jednalo se o vzorky třapin, matolin a
letorostů. Zvolená jednoduchá extrakční metoda je vhodná pro následné využití fenolických
látek jak pro potravinářské tak medicínské účely. Byl sledován inhibiční účinek vybraných
extraktů Vitis vinifera na mikrobiální růst gram negativní bakterie Escherichia coli.
The possibilities of waste winemaking material utilization
Vitis vinifera (vine) is one of the most widely grown crops throughout the world. During the
winemaking process the waste forms up to 20 % (w/w) of the total entry feedstock. The byproducts accumulate also during work on the vineyard, i.e. during the thinning in the
vegetation period and during the pruning in winter. This is the reason why the winery
becomes one of the main producers of biowaste. On the contrary, the fact that the waste byproducts are source of many valuable substances is still ignored - the biggest potential of the
waste is its utilization as a new source of polyphenols (resveratrol, polydatin) having
antioxidant activity. The phenolics could be used as an addition into food supplements as well
as an effective mixture of the antimicrobiological active substances. The thesis deals with the
possibilities of the winemaking waste utilisation as a potential source of the antioxidants. The
waste samples from white and blue cultivar of Vitis vinifera provided by Saint Claire
Vineyard in Trója and Vineyard Grébovka in Prague were analyzed. The analyzed samples
were grape stems, marc and canes. The used simple extraction method is suitable for the
subsequent utilisation of phenolics for food and medicinal purposes. The inhibiting effect of
the chosen extract Vitis vinifera on microbial growth of gram negative bacterium Escherichia
coli was studied.
Bc. Josef Červený: Změny obsahů volných a vázaných polyfenolů v průbhu sladování
(Ing. Marcel Karabín, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Tato diplomová práce byla věnována studiu změn profilu frakcí volných, vázaných
rozpustných a vázaných nerozpustných polyfenolů v průběhu sladování. Bylo zjištěno, že
vázané polyfenoly tvoří až 90 rel. % všech ječných a sladových polyfenolů, a stejně jako
polyfenoly volné procházejí během sladování významnými změnami obsahu. Z tohoto
pohledu jsou nejvýznamnějšími technologickými kroky klíčení, při kterém byl zaznamenán
nárůst obsahu vázaných fenolových kyselin v některých případech až na trojnásobek, a
4
předsoušecí fáze hvozdění, při které došlo naopak k výraznému poklesu obsahu. V návaznosti
na tyto poznatky byl dále prozkoumán vliv teploty klíčení, při jejímž zvýšení došlo k
intenzifikaci přeměn polyfenolů a dalšímu nárůstu obsahu vázaných fenolových kyselin, a
teplotního programu předsoušecí fáze hvozdění, který byl upravený pro omezení
enzymatických pochodů v této fázi. To způsobilo u téměř všech polyfenolů napříč frakcemi
větší nárůst obsahu případně zpomalení jeho poklesu. Zvýšení teploty klíčení mělo také
pozitivní vliv na obsah polyfenolů získaných ve sladině, což vedlo také k vyšší antioxidační
kapacitě sladiny.
Changes in the content of free and bound polyphenols during malting
This thesis is focused on changes in polyphenol content and composition during the malting
process, especially on the changes of individual polyphenol fractions (free, soluble–bound and
insoluble – bound). It was shown that the bound polyphenols made up to nearly 90 rel. % of
all phenolics and during the malting process went through significant changes. The major
importance of some technological steps was observed, e.g. during germination the content of
some bound phenolic acids increased up to 300 rel. % and during the initial stages of kilning
the content of most bound phenolics decreased significantly. It was also found, that the
increase of germination temperature led to increase in bound phenolic acids content as well as
intensification of all enzymatic changes of polyphenols. The enzymatic processes were
restricted by modification of the initial stages of kilning, which resulted in higher polyphenol
content in the final malt. Increase of germination temperature also led to better extraction of
polyphenols during mashing and higher antioxidant activity of sweet wort as well.
Bc. Marek Drahokoupil: Sledování průběhu ABE fermentace s využitím mikroskopie a
průtokové cytometrie (Ing. Barbora Branská, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Tato práce se zabývá sledováním průběhu ABE fermentace u rodů Clostridium pasteurianum
a Clostridium beijerinckii a optimalizací podmínek stanovení jejich viability pomocí
fluorescenčního značení. Viabilita spolu s fyziologickými změnami obou populací byly
sledovány pomocí propidium jodidu v kombinaci s karboxyfluorescein diacetátem nebo
SYTO 9 a dále byl testován bis-oxonol. Všechny zvolené kombinace fluorescenčních sond
odrážely aktuální viabilitu populace, přičemž při použití karboxyfluorescein diacetátu s
propidium jodidem bylo navíc možné stanovit zastoupení zralých spor. Dále byl u kmene C.
pasteurianum sledován vliv stresových podmínek vyvolaných přídavkem butanolu, etanolu
nebo kyseliny máselné o různé koncentraci. Přídavek 5 g/l ethanolu nebo 0,5 g/l butanolu
neměl na průběh fermentace ani viability výrazný vliv, ale navýšení na dvojnásobné hodnoty
(10 g/l a 1 g/l) vedlo k usmrcení celé populace. Inhibiční vliv kyseliny máselné se nepodařilo
jednoznačně prokázat, protože kultura byla zřejmě inhibována samotným poklesem pH. V
závěru práce byla pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie charakterizována
populace mutantního kmene C. pasteurianum NRRL B-598 (pMTL83253-OESpo0A) s overexpresí genu pro regulační protein sporulace Spo0A.
Monitoring of ABE fermentation using microscopy and flow cytometry
The study is focused on monitoring of ABE fermentation process in Clostridium
pasteurianum and Clostridium beijerinckii species and on optimization of their vialibility
determination using fluorescence staining. Vialibility as well as physiological changes of both
species were measured by a combination of propidium iodide with carboxyfluorescein
diacetate or SYTO9, bis-oxonol was also tested. Selected combinations of fluorescent probes
reflected the actual vialibility, while combination of carboxyfluorescein diacetate and
propidium iodide also enabled to determine representation of mature spores. Furthermore,
influence of stress conditions induced by addition of butanol, ethanol, butyric acid at various
5
concentrations were studied. Addition of ethanol (5g/l) and butanol (0.5 g/l) had no significant
influence on the fermentation processor on vialibility. When conditions changed and
concentrations of ethanol and butanol were increased twice (10 g/l ethanol, 1 g/l butanol), the
whole population died. The inhibitory effect of butyric acid was not demonstrated, because
the culture was probably inhibited by the actual pH drop. Finally, the population of mutant
strain C. pasteurianum (pMTL83253-OESpo0A) with gene of regulatory sporulation protein
overexpression was characterised by fluorescence microscopy and flow cytometry.
Bc. Lucia Gharwalová: Využití zemědělských a průmyslových odpadních surovin jako
substrátu pro výrobu kyseliny mléčné (doc. Dr. Ing. Leona Paulová, ÚB VŠCHT Praha)
Předmětem práce bylo využít odpadní a zemědělské suroviny jako základ médií pro produkci
kyseliny mléčné pomocí mléčných baktérií. Nejprve byl proveden screening možných
producentů kyseliny mléčné, během kterého byla sledována škála využívaných zdrojů uhlíku
a energie na modifikovaných MRS médiích, nárůst biomasy a produkce kyseliny mléčné.
Kmen Lactobacillus casei CCDM 198 dosáhl nejlepší produkci kyseliny mléčné na glukóze,
laktóze a xylóze, kmen Lactobacillus reuteri LHR14 dosáhl nejlepší produkci kyseliny
mléčné na sacharóze, arabinóze a celobióze. Tyto kmeny byly dále použity pro sledování
produkce kyseliny mléčné na následujících odpadních a zemědělských surovinách: pšeničná
sláma, pivovarské mláto, pšeničné lihovarské výpalky, cassava a melasa. Byla též testována
možnost náhrady zdroje dusíku odpadními surovinami a vedlejšími produkty z potravinářské
výroby, konkrétně byl použit alkalický hydrolyzát kuřecího peří, syrovátkový protein a
melasové lihovarské výpalky. Tyto suroviny byly využity pro produkci kyseliny mléčné v
laboratorním bioreaktoru v režimu vsádkové a přítokované kultivace. Nejlepší výtěžnost ve
vsádkové kultivaci dosáhl kmen L. reuteri LHR14 na médiu z cassavy (79,1%). Jako vhodná
náhrada dusíku v médiu se osvědčil hydrolyzát kuřecího peří a syrovátkový protein.
Exploitaition of agriculture and industrial wastes as substrates for production of lactic
acid
The potential of use of waste and agriculture materials as substrates for production of latic
acid were investigated in frame of this diploma thesis. Firstly, screening tests of selected
strains of lactic acid bacteria were carried out to determine the scale of utilized carbon
sources, biomass growth and lactic acid production in modified MRS broths. The strain
Lactobacillus casei CCDM 198 reached the best production of lactic acid on glucose, lactose
and xylose with a yield of 116,6%, 77,7%, 43,0%, respectively. With the strain Lactobacillus
reuteri LHR14 the highest production of lactic acid on sucrose, arabinose and cellobiose with
a yield of 111,0%, 49,3%, 81,3% was achieved, respectively. These strains were further used
in flasks experiments for the production of lactic acid using wastes and agriculture materials
such as wheat straw, spent grain, wheat distillery stillage, cassava, and molasses. As a
substitute of nitrogen in the medium following materials were tested: hydrolyzed chicken
feather, whey protein and molasses distillery stillage. Raw materials selected on the basis of
these experiments were then used for the production of lactic acid in the laboratory bioreactor
in batch and fed-batch arrangements. The best yield in batch cultivations was reached with the
strain L. reuteri LHR14 grown in medium containing cassava (79,1%). Suitable nitrogen
replacement in the medium proved to be hydrolyzed chicken feathers or whey protein.
Bc. Vojtěch Hanko: Využití odhořčených chmelových materiálů v pivovarství (Ing. Lukáš
Jelínek, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Cílem této práce bylo navrhnout a experimentálně podložit možnosti využití odhořčených
chmelových zbytků bohatých na polyfenoly v pivovarské technologii. Pro tyto účely byly
použity tři zbytky po CO2 extrakci a jeden zbytek po výrobě pelet T45. Bylo zjištěno, že
6
zmíněné materiály mohou představovat lukrativní zdroj prenylflavonoidů a flavan-3-olů.
Kvůli relativně vysokému obsahu senzoricky aktivních látek bylo ovšem nezbytné některé
materiály převést do formy takzvaného taninového extraktu obsahujícího převážně
technologicky významné polyfenoly. Taninový extrakt byl nejprve úspěšně použit jako
preparát urychlující scezování sladiny a na základě výsledků z modelových filtračních
experimentů byl částečně poodhalen mechanismus jeho působení. Dále byly zkoumány
možnosti využití taninového extraktu, coby přípravku pro urychlení sedimentace kvasinek
spodního i svrchního kvašení. Navzdory výsledkům publikovaným v odborné literatuře
nebylo v této části práce dosaženo přesvědčivých výsledků. Poslední část práce byla věnována
problematice zlepšení stability pěny prostřednictvím chmelových zbytků po CO2 extrakci. Z
tohoto hlediska se velmi slibným ukázal zbytek vysokoobsažného Taurusu.
Application of bitter-free hop materials in brewing
The aim of this thesis was to suggest and experimentally underlay possibilities of application
of polyphenol rich hop materials in brewing technology. For that purpose, three spent hop
materials remaining after CO2 extraction and one spent hop material remaining after
pelletisation were used. These materials were found to be potentially a rich source of
prenylflavonoids and, in some cases, also flavan-3-ols. However, because of the relatively
high content of sensorically active compounds, some of these materials had to be transformed
into so-called “tannin extract” containing mainly technologically important phenolics. Firstly,
tannin extract was successfully used as a substance accelerating sweet wort lautering and the
mechanism of its effect was partly revealed based on the results from model filtration
experiments. Possible use of tannin extract as a fining agent for acceleration of bottom- and
top-fermenting brewing yeasts was then explored. Unlike the results published in literature,
the results obtained within this part of work were not convincing. The last part of this thesis
was dedicated to improvement of foam stability through spent hop materials remaining after
CO2 extraction. From this point of view, promising results were shown by bitter-free highalpha variety Taurus.
Bc. Lucie Kolářová: Exprese a charakterizace lidských enzyme hemové dráhy (Ing. Olga
Maťátková, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Hem je porfyrinový makrocyklus, který se účastní jako prostetická skupina proteinů
základních biologických procesů jako respirace, fotosyntéza, metabolismus a transport
kyslíku. Biosyntézy hemu se účastní celkem osm enzymů. Tato práce je zaměřena na enzym
účastnící se předposledního kroku biosyntézy hemu, oxidázu protoporfyrinogenu. Cílem práce
bylo připravit v dostatečném množství a čistotě nativní protein oxidázu protoporfyrinogenu a
k ní vybrané mutantní formy A466E, R168L, H333R, W227G, u který je známo, že způsobují
snížení aktivity enzymu a vedou k onemocnění nazývané variegata porfyrie. V bakteriálních
kmenech E. coli byla oxidáza protoporfyrinogenu produkována společně s jejími mutanty.
Purifikačními kroky byla získána nativní oxidáza protoporfyrinogenu ve vysoké čistotě a
koncentraci pro charakterizaci proteinu a jeho krystalizaci. Mutantní formy oxidázy
protoporfyrinogenu se nepodařilo získat produkcí v bakteriálních kmenech E. coli. Mutantní
forma W227G nebyla exprimovaná v dostatečném množství. Mutantní formy A466E, R168L,
H333R byly exprimovány, ale při purifikačních krocích docházelo k jejich agregaci.
Expression and characterization of human enzymes of the heme pathway
Heme processes such as respiration, photosynthesis, metabolism and oxygen transport as a
prosthetic group of proteins. Eight enzymes are involved in the heme biosynthesis pathway.
This thesis focuses on an enzyme involved in the penultimate step of heme biosynthesis,
protoporphyrinogen oxidase. The aim of this work was to prepare native protein
7
protoporphyrinogen oxidase and selected mutant A466, R168L, H333R, W227G in sufficient
quantity and purity. The selected mutants are known to cause a decrease in enzyme activity
and lead to a disease called variegate porphyria. Protoporphyrinogen oxidase and selected
mutants were produced in the bacterial strains of E.coli. Protoporphyrinogen oxidase was
purified in high purity and concentration for characterization and crystallization. The
production of mutants in bacterial strain of E.coli. was unsuccessful. Mutant W227G was not
expressed in sufficient quantities. Mutants A466, R168L, H333R were expressed, but during
purification steps aggregates were formed.
Bc. Kristýna Lokočová: Vliv N-acetylcysteinu a cinnamaldehydu na stabilitu biofilmu
oportunně patoenních mikroorganismů (prof. Ing. Jan Masák, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
Biofilm můžeme definovat jako společenství mikroorganismů adherující k různým povrchům,
obklopených ochrannou matrix exopolymerních látek. Buňky jsou podstatně odolnější proti
vlivům okolního prostředí a vykazují rezistenci vůči antibiotikům a dezinfekčním
prostředkům. Ve snaze nalézt vhodná činidla působící na tyto velice odolné struktury, byly
testovány látky z nesčetného množství rostlin a živočichů. Tato diplomová práce se zabývá
schopností přírodních látek, N-acetylcysteinu (prekurzor glutathionu) a cinnamaldehydu
(složka esenciálního oleje z kůry skořicovníku), ovlivňovat stabilitu biofilmu gramnegativní
bakterie Pseudomonas aeruginosa, grampozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis a
kvasinek Candida parapsilosis, Candida krusei a Candida albicans. Práce si také klade za cíl
potvrdit vliv těchto látek na mezibuněčnou komunikaci bakterie P. aeruginosa. Zřetelný
pokles metabolické aktivity vlivem obou sledovaných přírodních látek byl zaznamenán u
buněk biofilmu C. parapsilosis v rámci testovaných kvasinek. Rovněž se prokázal pozitivní
účinek cinnamaldehydu na eradikaci biofilmu obou sledovaných kmenů P. aeruginosa. Na
základě působení cinnamaldehydu na stabilitu biofilmu P. aeruginosa bylo pozorováno také
ovlivnění systému quorum sensing.
Influence of N-acetylcysteine and cinnamaldehyde on biofilm stability of opportunistic
pathogenic microorganisms
Biofilm can be defined as a community of microorganisms stored in a protective matrix of
EPS adhering to various surfaces. The cells are significantly more resistant to environmental
influences and show resistance to antibiotics and disinfectants. To find suitable agents
affecting the stability of these very resistant structures, substances from the numerous plants
and animals were tested. This diploma thesis is focused on the ability of natural substances,
N-acetylcysteine (precursor of glutathione) and cinnamaldehyde (component of an essential
oil from the bark of cinnamon), to affect the biofilm stability of gram-negative bacteria
Pseudomonas aeruginosa, gram-positive bacteria Staphylococcus epidermidis and yeast
Candida parapsilosis, Candida krusei and Candida albicans. The aim of this study is also to
confirm the effect of these substances on the intercellular communication of P. aeruginosa.
Within the tested yeasts, we observed obvious inhibition of metabolic activity, due to the both
natural substances application, in C. parapsilosis biofilm. The results obtained in this diploma
thesis also show a positive effect of cinnamaldehyde on biofilm eradication both investigated
strains of P. aeruginosa. Based on the effect of cinnamaldehyde on the stability of P.
aeruginosa biofilm, interference to the quorum sensing system was also observed.
Bc. Lucie Marková: Vliv chitonasu na tvorbu a stabilitu biofilmu (prof. Ing. Alena
Čejková, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
Tvorbou biofilmu dochází obecně ke zvýšení odolnosti mikrobiálních buněk, které jsou tak
často rezistentní k běžně používaným antibiotikům. Pokud se biofilm vytvoří na povrchu
lékařského zařízení, jako je katétr či kloubní náhrada, jedinou možností léčby je v mnoha
8
případech vyjmutí implantátu z těla pacienta. Kvasinky rodu Candida jsou považovány za
stále více virulentní. Jednu z alternativních možností ovlivnění tvorby a stability biofilmu
představují přírodní látky. Mezi tyto látky patří například polysacharid chitosan, který může
být díky svým antimikrobiálním vlastnostem a biologické odbouratelnosti vhodným
kandidátem pro prevenci vzniku či léčbu kandidóz. Cílem této práce bylo sledování ovlivnění
tvorby a stability biofilmu kvasinek Candida albicans DBM 2164, Candida krusei DBM
2163, Candida parapsilosis DBM 2165 a Trichosporon cutaneum CCY 30.5.10 působením
chitosanu, biosurfaktantu rhamnolipidu a komerčně dostupného antibiotika amfotericinu B.
Byl sledován anti-biofilmový účinek těchto látek, a následně jejich společný vliv při inhibici
biofilmu ve vzájemné kombinaci. V diplomové práci byl potvrzen významný synergistický
účinek chitosanu a amfotericinu B při inhibici tvorby a stability biofilmu vybraných kvasinek
a synergistický účinek chitosanu a rhamnolipidů při inhibici tvorby a stability biofilmu
vláknité kvasinky T. cutaneum.
Effect of chitosan on the biofilm formation and stability
Biofilm formation leads to enhanced resiliency of microbial cells and thus they are often
resistant to commonly used antibiotics. If the biofilm is formed on the surfaces of medical
devices such as catheters or joint replacements, the only option of treatment in many cases is
the removal of the implant from the patient’s body. The yeasts of the Candida genus have
been regarded as more virulent. Natural substances are one of the new possibilities of
affecting the biofilm formation and its stability. For example the polysaccharide chitosan may
be a suitable candidate for the prevention or treatment of candidiasis due to its antimicrobial
properties and biodegradability. The aim of this study was to investigate the biofilm formation
and stability of the yeast Candida albicans DBM 2164, Candida krusei DBM 2163, Candida
parapsilosis DBM 2165 and Trichosporon cutaneum CCY 30.05.10 influenced by chitosan,
biosurfactant rhamnolipid and commercially available antibiotic amphotericin B. The antibiofilm effect of these substances was evaluated independently and then in their mutual
combination. This diploma thesis confirmed the significant synergistic effect of chitosan and
amphotericin B in inhibition of selected yeasts biofilms formation and their stability and also
the synergistic effect of chitosan and rhamnolipid in inhibition of biofilm formation and
stability of filamentous yeast T. cutaneum.
Bc. Mariia Mitrofanova: Stanovení olova a mědi ve vínech (prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc.,
ÚB VŠCHT Praha)
Víno je jedním z nejdéle známých alkoholických nápojů, který obsahuje velké množství
organických a minerálních látek. Ionty ve víně hrají důležitou roli. Jsou nezbytné pro proces
alkoholového kvašení, hrají roli ve funkci řady enzymů a v neposlední řadě ovlivňují chuť a
barvu vína. Jejich velké koncentrace jsou však nežádoucí, a proto je nutné stanovovat jejich
obsah a dodržovat limity pro jejich maximální přípustné koncentrace. V této diplomové práci
byla popsána a optimalizována elektrochemická metoda průtokové chronopotenciometrie pro
stanovení olova a mědi ve vínech. Byl eliminován vliv kyslíku na měření jeho vytěsněním
dusíkem nebo heliem. Byly stanoveny meze detekce a stanovitelnosti metody v závislosti na
použitém plynu, na základě čehož byl pro další postupy vybrán dusík. Měřením během tří dnů
byly v závislosti na druhu vína stanoveny změny signálů pro elektrody typu E 53C a E
56LMF. Ze získaných výsledků byly spočítány koncentrace sledovaných kovů ve víně.
Sledovaná metoda byla porovnána s metodou atomové absorpční spektrometrie. Ve srovnání s
AAS byla tato metoda přesnější pro stanovení olova, avšak pro stanovení mědi nevykazovala
spolehlivé výsledky.
Determination of lead and copper in wines
9
Wine is one of the most popular alcohol drink, which contains big amount of organic and
mineral substances. Ions in wine are really important. They are needed for process of
alcoholic fermentation, makes functioning of enzymes and it gives the taste and color of wine
as well. Their large concentration is undesirable, so that's why you must define their content
in wine and keep the limits for the maximum permissible concentrations. In this thesis has
been described and optimized electrochemical method of flow chronopotentiometry for the
determination of lead and copper in wines. There was eliminated the influence of oxygen on
the measurement by the displacement with nitrogen or helium. Additionally were set limits of
detection and quantification of methods depending on the use of gas on the basis of which
nitrogen was selected for additional procedures. Measurement during the three days,
depending on the type of wine set changes signal electrode type E 53C and E 56LMF. From
obtained results were counted concentrations of metals in wine. Monitored method was
compared with atomic absorption spectrometry. In comparison with the AAS method it was
more accurate for determination of lead, but for determining of copper showed nonreliable
results.
Bc. Jakub Nešpor: Studium profilu těkavých látek v ciderech a obdobných nápojích (Ing.
Marcel Karabín, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Tato diplomová práce byla věnována studiu proměnlivosti profilu těkavých látek v ciderech,
jejichž obliba na tuzemském trhu stále stoupá. Na základě optimalizace analytického postupu
složeného z izolačního kroku SPME a GC-MS stanovení, prostřednictvím centrálně
kompozičního návrhu experimentu, byly stanoveny obsahy 23 těkavých látek, které se
významně podílí na celkovém senzorickém profilu hotových výrobků. Analyzován byl 1
jablečný mošt, 33 ciderů a 1 perry dostupné na českém trhu. Metodou faktorové analýzy byla
prokázána odlišnost v analytických profilech související zejména s rozdíly v obsazích vyšších
větvených alkoholů a esterů. Ze získaných dat byla prokázána statisticky průkazná odlišnost
výrobků malo a velkoproducentů vycházející z používaných surovin i konkrétních
technologií. Výsledky chemických analýz byly doplněny o deskriptivní senzorickou analýzu 6
ciderů, která potvrdila převahu základních chutí (sladkost, hořkost, kyselost) nad specifickými
aroma při hodnocení celkové obliby.
Study of the profile of volatile compounds in ceders and similar beverages
This master thesis was focused on the study of the profile of volatile compounds in cider and
similar beverages, whose popularity in the domestic market continues to increase. Twentythree volatile substances (VOCs), that are significantly contributing to the total sensory profile
of the finished products, were identified by SPME-GC-MS. The method was optimized using
design of experiments, specifically central composite design. Analyzed beverages included an
apple juice, thirtythree ciders, and one perry commonly available on the Czech market. The
analytical profiles of VOCs differed due to the varying composition of higher alcohols and
esters. The obtained data showed statistically signifficant differences between the products of
small and industrial suppliers based on the raw materials used and their specific fermentation
procedures. The results of chemical analyses were supplemented by a descriptive sensory
analysis of six ciders, which confirmed the dominance of basic tastes (sweet, bitter, sour) over
their specific aroma when evaluating overall popularity of the beverages.
Bc. Aleš Potěšil: Praktické možnosti zvýšení trvanlivosti piva z minipivovarů (prof. Ing.
Pavel Dostálek, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
Nízká trvanlivost nefiltrovaného piva z minipivovaru je v současné době hlavní překážkou při
snaze prodat dané pivo i mimo jeho výrobní region. Prozatím neexistuje v praxi minipivovaru
žádná aplikovatelná stabilizační metoda, která by měla za následek prodloužení doby
10
trvanlivosti nefiltrovaného piva s ohledem na zachování jeho typického charakteru. Hlavním
cílem této práce bylo porovnání a zhodnocení procesů mikrobiální stabilizace ve výrobní
praxi minipivovaru. Pro účely této práce byly vybrány tři druhy pasterace piva: průtoková
pasterace, pasterace piva v lahvi ve vodní lázni (suplující pasteraci tunelovou) a metoda
vysokého hydrostatického tlaku. Po zprovoznění prototypu průtokové pasterační jednotky v
provozu minipivovaru a nalezení vhodné pasterační dávky, bylo pivo jedné šarže danými
metodami ošetřeno a po dobu půl roku byla zkoumána především jeho senzorická stabilita.
Výsledek této práce by se měl nabízet jako jedna z ideálních alternativ využití dané
problematiky v praxi.
Practical possibilities of increasing shelf life of beer the microbrewery
The biggest hurdle when attempting to export a non-filtered beer from a microbrewery outside
bits manufacturing region is short shelf-life. Currently, there is no practical approach that
would maintain the basic characteristics of the beer, especially its sensory stability which is
dependent on microbiological stability. The goal of this work was to compare and evaluate
methods for microbiological stabilization of non-filtered beer in a microbrewery. The thesis
considers flash pasteurization, bottled beer heated in water (simulating tunnel pasteurization)
and high hydrostatic pressure method. A flash pasteurization prototype was installed at a
microbrewery and the optimal pasteurization dose was determined. The other two
stabilization methods were also applied on the same batch of beer and its quality was
monitored during the following six months, with the main focus on the sensory stability. The
result of this thesis establishes a new practical method for the stabilization of non-filtered beer
in microbreweries.
Bc. Hana Skoupá: Příprava 8-prenalnaringeninu ze zbytku po extrakci chmele (prof. Ing.
Pavel Dostálek, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
8-Prenylnaringenin je složka chmele, které jsou připisovány silné estrogenní účinky. Cílem
této práce bylo připravit 8-prenylnaringenin biotransformační cestou pomocí mikroorganismů
ze zbytku po extrakci chmele. První část práce byla zaměřena na přípravu suroviny –
isomerovaného vodného výluhu z chmelového materiálu. Důraz byl kladen na konverzi
xanthohumolu z chmelového materiálu na isoxanthohumol, výchozí látku pro následnou
biotransformaci, přičemž dosažená konverze činila 82,2 %. Poté následoval výběr vhodného
mikroorganismu, který je schopen přeměny isoxanthohumolu na 8-prenylnaringenin. Jediným
dostatečně efektivním biologickým činitelem se prokázala bakterie Eubacterium limosum. V
druhé části práce byla provedena série kultivací Eubacterium limosum na chmelovém výluhu
v bioreaktoru. Bylo testováno, zda lze použít vstupní chmelový materiál i jako surový, což
sice bylo potvrzeno, k dosažení nejvyšší výtěžnosti 8-prenylnaringeninu (58,2 %) však bylo
nutné isomerovaný výluh naředit na počáteční koncentraci 20,8 μM isoxanthohumolu v
médiu.
Preparation of 8-prenylnaringenin from the hops extraction residue
8-Prenylnaringenin is a hop component to which strong estrogenic effects are credited. The
aim of this thesis was to prepare 8-prenylnaringenin from the spent hops by biotransformation
using microorganisms. The first part of the thesis is focused on preparation of the ingredient isomerized aqueous extract from the hop material. Emphasis was put on the conversion of
xanthohumol to isoxanthohumol which is the starting compound for the following
biotransformation; the achieved conversion ranked 82,2 %. Subsequently a suitable
microorganism able to transform isoxanthohumol to 8-prenylnaringenin was chosen. The only
sufficiently effective biological agent was the bacterium Eubacterium limosum. In the second
part of the thesis a series of cultivations of E. limosum was carried out on the aqueous extract
11
from hops in bioreactor. It was tested whether the input hop material can also be used in raw
state, which was confirmed, however to reach the highest yield (58,2 %) of 8prenylnaringenin it was necessary to dilute the isomerized extract to the initial concentration
of 20,8 μM isoxanthhumol in the medium.
Bc. Vojtěch Štěpánek: Degradace persistentních uhlovodíků v přítomnosti
rhamnolipidového aditiva (prof. RNDr. Vladimír Jirků, DrSc., ÚB VŠCHT Praha)
Zmírnění vlivu znečištění životního prostředí v důsledku činnosti ropného průmyslu patří
mezi nejvýraznější zájmy environmentální biotechnologie. Bioremediace oblastí znečištěných
těžbou ropy, nebo míst havárií v dopravě ropných produktů je důležitým úkolem pro
plnohodnotné zachování životního prostředí a udržitelného rozvoje. Tato práce se zaměřuje na
sledování vlivu vícesložkových rhamnolipidových biosurfaktantů na účinnost procesu
biodegradace persistentních uhlovodíků. Součástí práce byla izolace a identifikace buněčných
populací schopných degradace persistentních uhlovodíků. Stěžejní částí je přiblížení vztahu
polutantu, taxonu biodegradéra a vícesložkových rhamnolipidových biosurfaktantů. Získané
výsledky ukazují pozitivní vliv přítomnosti rhamnolipidů na proces biodegradace. Během
práce se podařilo získat buněčné populace nesoucí schopnost degradace persistentních
uhlovodíků. Ze získaných výsledků vyplívá, že vliv vícesložkových rhamnolipidových
biosurfaktantů na procesy biodegradace závisí na jejich velmi specifickém vztahu k taxonu
degradéra a charakteru polutantu.
Degradation of persistent pollutants under the effect a rhamnolipid additive
Mitigation of the pollution generated as a result of activities of the oil industry is part of the
most significant interests of environmental biotechnology. Bioremediation of areas polluted
by oil extraction, or places of accidents in transportation of petroleum products is an
important task for preservation of the environment and sustainable development. This study
focuses on monitoring the effects of multicomponent rhamnolipid biosurfactants on the
efficiency of the process of biodegradation of persistent hydrocarbons. This work included
isolation and identification of cell populations capable of degradation of the persistent
hydrocarbons. A pivotal part of this study is description of relations between pollutant,
biodegraders and multicomponent rhamnolipid biosurfactants. The findings of this study
shows the positive influence of rhamnolipids on the process of biodegradation. During this
work we were able to obtain cell populations with ability to degrade persistent hydrocarbons.
Obtained results reveals that the effect of multicomponent rhamnolipid biosurfactants depends
on their very specific relationship to taxon of the biodegraders and the nature of the pollutant.
Bc. Filip Ulmann: Zlepšení stability pivní pěny pomocí sorbentů (doc. Ing. Tomáš Brányik,
Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
V práci byl zkoumán vliv lipidů, bílkovin, iso-α-hořkých kyselin a etanolu na stabilitu
modelové pivní pěny. Ze získaných výsledků měření pěnivé schopnosti matrice modelového
piva byl pomocí statistických metod vyhodnocen vliv komponent modelového piva. Ukázalo
se, že bílkoviny a lipidy mají největší vliv na stabilitu pěny. Vliv sorbentů na stabilitu pivní
pěny byl testován za použití různých koncentrací sorbentů a měnila se také doba působení
sorbentů. Bylo zjištěno, že aktivní uhlí organosorb 200 Wi zvyšuje stabilitu pivní pěny
nejvíce. Stabilita pěny se zvýšila až pětkrát po přidání 5 g.hl-1 aktivního uhlí a době působení
24 hodin. Po použití ostatních sorbentů (florisil, poly(tetrafluoroethylen) a acetylovaná
celulosa) se stabilita pivní pěny zvýšila za stejných podmínek až třikrát, což lze považovat
také velmi dobrý výsledek. Zároveň podle provedených testů nemají sorbenty negativní vliv
na barvu, hořkost ani chuť piva.
12
Improvement of beer foam stability using sorbent
The effect of lipids, proteins, iso-α-bitter acids and ethanol on the beer foam stability was
studied in this work. The results obtained from matrix foaming potential measurements were
evaluated by statistical methods and the effect of components of model beer was estimated. It
was found that proteins and lipids have the greatest impact on foam stability. The influence of
sorbents on beer foam stability was tested using various concentrations of sorbents at different
exposure time. It was found that activated carbon organosorb 200 Wi increased the foam
stability the most effectively. The foam was five times more stable after addition of 5 g.hl -1
active carbon and 24 hours. After addition of other sorbents (florisil, poly(tetrafluoroethylen)
and acetylcellulose) the foam stability was prolonged three times, which can be considered
also as a very good result. Simultaneously, according to the performed tests, the sorbents do
not have negative effect on the color, taste or bitterness of beer.
Obhajoby konané dne 9. a 10. 6. 2016
studijní obor „Biotechnologie léčiv“
Bc. David Antonio Chena Aldao: Použití škrobu s upravenou stravitelností pro
farmaceutické aplikace (doc. Ing. Evžen Šárka, CSc., ÚSaC VŠCHT Praha)
Tato diplomová práce se zabývá modifikací škrobu pro následné použití jako pomocné látky
ve farmaceutickém průmyslu. V této studii byl pšeničný škrob modifikován pomocí acetylace
a následné extruze směsi s cílem upravit jeho stravitelnost. Acetylovaný škrob byl
charakterizován stupněm substituce a obsahem rezistentního škrobu (stanoveno pomocí
metody AOAC 2002.02.). Acetylovaný škrob a pšeničný škrob byly použity jako pomocné
látky při extruzním tabletování s paracetamolem, který byl modelovou účinnou látkou.
Extrudované tablety byly připraveny postupem vlhké granulace a dále lisovány extruzí.
Paracetamol v extrudátech byl charakterizován pomocí funkční skupiny (CONH2),
krystalinita pomocí FT-IR a XRD a termické vlastnosti pomocí DSC. Mimo to byly
zaznamenány parametry extruze, stanoven obsah rezistentního škrobu a byla testována
disoluce tablet.
Use of starch with modified digestibility for pharmaceutical applications
This thesis focuses on the application of modified starches as an excipient in the
pharmaceutical industry. In this study, wheat starch was modified by means of acetylation,
combined with pure wheat starch and the mixture was fed through an extruder to modify its
digestibility. Acetylated starch was characterized by the degree of substitution and percentage
of resistant starch (determined by AOAC method 2002.02). Acetylated starch and/or native
wheat starch after extrusion were used as an excipient; and paracetamol served as an active
substance. Extrudated tablets were prepared by wet granulation and stamping extrusion.
Crystallinity of the tablets was characterized by FT IR and XRD, while DSC characterized
their thermal properties. Paracetamol content was specifically characterized by the functional
group (CONH2). Furthermore, each tablet´s parameters of extrusion, content of RS were
recorded and also the dissolution characteristics were examined.nešpor
Bc. Michaela Hanáková: Produkce sekundárních metabolitů houbou Monascus purpureus
(doc. Dr. Ing. Petra Patáková, ÚB VŠCHT Praha)
Houba Monascus purpureus je známá spíše po kultivaci na rýži jako Red Yeast Rice. Tato
houba může produkovat sekundární metabolity, a to především monakoliny, pigmenty a
mykotoxin citrinin. Diplomová práce je zaměřena na produkci žlutých pigmentů. Houba
Monascus purpureus byla kultivována v tekutém médiu i na pevných substrátech. Byla
13
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci žlutých a oranžových pigmentů. Jako nejlepší
zdroj dusíku v tekutém médiu pro produkci žlutých pigmentů byl vyhodnocen (NH4)2SO4 při
době kultivace 12 dní. V ethanolovém extraktu z houbových mycelií narostlých v tomto
médiu bylo detekováno 15,43 g/l monascinu a 37,07 g/l ankaflavinu, citrinin v extraktu nebyl
detekován. Nejvyšší produkce žlutých pigmentů při kultivaci na pevném substrátu s
minimální produkcí citrininu bylo dosaženo při kultivaci na bulguru. V příslušném extraktu
bylo detekováno 28,89 mg/g monascinu a 71,55 mg/g ankaflavinu. Při testování biologické
aktivity pigmentů byla pozorována inhibice klíčení spór klostridií extraktem z kultivace na
rýži. Vzorek obsahující současně žluté i oranžové pigmenty vykazoval při Amesově testu
pravděpodobně mutagenní chování na rozdíl od žlutých a oranžových pigmentů, testovaných
samostatně.
Production of secondary metabolites by the fungus Monascus purpureus
The fungus Monascus purpureus is better known after the rice cultivation as Red Yeast Rice.
The fungus can produce secondary metabolites- monacolins, pigments and a mycotoxine
citrinin. This thesis is focused on a production of yellow pigments. The fungus was cultivated
in a liquid medium and on solid substrates. For detection and quantification of yellow and
orange pigments, there was developed a new method. (NH4)2SO4 was evaluated as the best
nitrogen source in the liquid medium for production of yellow pigments with optimal
cultivation time - 12 days. 15.43 g/l of monascin and 37.07 g/l of ankaflavin were detected in
the ethanol extract of mycelia grown on the medium with this nitrogen source while citrinin
was not detected. The highest production of yellow pigments during cultivation on solid
substrates with a minimal production of citrinin was achieved by cultivation on bulgur. 28.89
mg/g of monascin and 71.55 mg/g of ankaflavin were detected in the extract. Inhibition of
Clostridium spores’ germination by the ethanol extract of rice was observed when testing the
pigments’ biological activity. A sample containing yellow and orange pigments together
probably evinced mutagenic behavior in Ames test unlike separate yellow and orange
pigments.
Bc. Kristýna Heroudková: Studium složení a užití listové části odrůd konopí setého (doc.
Ing. Marie Hrušková, CSc., ÚSaC VŠCHT Praha)
Předložená práce se specializuje na potravinářské využití listových částí konopí setého. Byly
porovnány čtyři odrůdy konopí sklizené v roce 2014 a 2015 z hlediska analytického složení a
technologického uplatnění s ohledem na obsah kanabinoidních látek. Jako aplikace byly
zvoleny máslové sušenky fortifikované konopnými rostlinnými částmi. Zvolená forma
zajišťuje rychlé vstřebání kanabinoidních látek do organismu a je vhodnou alternativou užití.
Pro připravené sušenky byl hodnocen senzorický profil, obsah kanabinoidních látek a nutriční
přínos zahrnující stanovení bílkovin a vlákniny.
Composition study and using of leaf part from Cannabis sativa varieties
This thesis focuses on utilization of leaf parts of Cannabis sativa plants. Four varieties of
hemp harvested in years 2014 and 2015 have been compared from the perspective of
analytical composition and technological application with respect to cannabinoid contents.
Butter biscuits fortified with hemp plants parts have been chosen as the main means of
application. Such form ensures fast absorption of cannabinoids in an organism and is
considered to be suitable for consumption. Senzorial biscuits profile has been determined
along with the level of cannabinoids content and nutrition benefits, particularly protein and
dietary fiber content.
14
Bc. Filip Kaufman: Studium exprese a charakterizace proteinu CotJC ze sporového
pláště Clostridium pasteurianum (Dr. Ing. Michaela Rumlová, ÚB VŠCHT Praha)
Mikroorganismus C. pasteurianum je využíván pro biotechnologickou produkci organických
rozpouštědel, která probíhá souběžně se sporulací. Z tohoto důvodu je důležité použití
jednoduchého a přesného způsobu detekce a kvantifikace spor. Cílem této diplomové práce
bylo ověřit možnost využití proteinu CotJC, přítomného pouze ve sporách C. pasteurianum,
jako marker pro sporulaci. Během měření byly testovány a optimalizovány tři metody: ELISA
test, imunochemické fluorescenční barvení preparátu pro průtokovou cytometrii
a semikvantitativní Western blot. Z důvodu špatné dostupnosti proteinu CotJC ve sporách,
jehož předpokládaná lokalizace na povrchu spor se nepotvrdila, nebylo stanovení ELISA
testem ani fluorescenčním barvením průkazné. Nejlepších výsledků bylo dosaženo
semikvantitativním Western blotem. Touto metodou bylo stanoveno, že 105 spor obsahuje
přibližně 100 ng proteinu CotJC. Imuno-transmisní elektronovou mikroskopií bylo zjištěno,
že protein CotJC se, oproti očekávání, nachází uvnitř spor. Protein CotJC je na základě
aminokyselinové podobnosti a přítomnosti vazebných domén predikován jako manganová
katalasa, ale námi naměřená data jasně ukazují, že protein CotJC nevykazuje katalasovou
aktivitu.
Expression and characterization of Clostridium pasteurianum CotJC protein
The microorganism C. pasteurianum is used for the biotechnological production of organic
solvents, which occurs concurrently with sporulation. For this reason it is important to use a
simple and accurate method for the detection and quantification of spores. The aim of this
work was to verify the possibility of using CotJC protein, which is present only in the spores
of C. pasteurianum, as a sporulation marker. During the measurement of this diploma thesis
we tested and optimized three different methods: ELISA, fluorescence immunochemical
staining for flow cytometry and semi-quantitative Western blot. Despite its predicted
localization on the spore surface, we were not able to detect CotJC protein either by ELISA or
flow cytometry. The best results were obtained using semi-quantitative Western blot. Using
this method we determined that the amount of CotJC protein in 105 spores is about 100 ng.
Using immune- transmission electron microscopy we found that CotJC protein is in the
contrary to expectations, localized inside the spores. CotJC protein is predicted to be a
member of a manganese-containing catalases family. However, our data clearly showed that
neither the recombinant nor CotJC protein isolated from spores had a catalase activity.
Bc. Oleksandra Khobta: Vztah kompozice a funkce rhamnolipidových směsí (prof. RNDr.
Vladimír Jirků, DrSc., ÚB VŠCHT Praha)
Velká pоzоrnоst dnešníhо průmyslu je věnоvánа mоžnоstem náhrаdy chemických surfаktаntů
bezpečnějšími látkаmi. Pоtenciálně zаjímаvоu skupinоu předstаvují rhаmnоlipidy, které pаtři
mezi bаkteriálně prоdukоvаné surfаktаnty. Jednа se о termоstаbilní látky, které jsоu schоpné
půsоbit jаk emulgátоry, účinně snižují mezifázоvé nаpětí nа rоzhrаní nemísitelných kаpаlin.
Hlаvní výhоdоu rhаmnоlipidů je jejich bezpečnоst prо živоtni prоstředí а mоžnоst syntézy z
оbnоvitelných mаteriálů. Prоducenti rhаmnоlipidů využívаjí tytо látky jаkо аntimikrоbiální
аgens prоti kоnkurenčním mikrооrgаnismům, které prоti nim nemаjí přirоzenоu оchrаnu.
Prоtо jsоu zkоumány аntibаkteriální vlаstnоsti rhаmnоlipidů. Tаtо práce je zаměřenа nа
studium biоlоgickéhо efektu rhаmnоlipidů nа pаtоgenní mikrооrgаnismy Stаphylоcоccus
epidermidis, Pseudоmоnаs аeruginоsа а Cаndidа pаrаpsilоsis. Byl sledоván vliv
rhаmnоlipidů nа permeаbilizаci buněčných struktur а změnu hydrоfоbity pоvrchu buněčných
оbаlů. Krоmě tоhо bylа sledоvánа prоdukce rhаmnоlipidů zа různých pоdmínek v
biоreаktоru. Jаkо prоdukční mikrооrgаnismy byly využity kmeny Pseudоmоnаs аeruginоsа
DBM 3774, Pseudоmоnаs аeruginоsа DBM 3775, Pseudоmоnаs аeruginоsа DBM 3776,
15
Pseudоmоnаs аeruginоsа DBM 3777. Bylо оvěřenо, že rhаmnоlipidy prоdukоvаné různými
bаkteriálními kmeny vykаzují оdlišné vlаstnоsti.
Rhamnolipid mixtures: composition / function relationship
Greаt аttentiоn оf tоdаy´s industry is dedicаted tо substitutiоn оf chemicаl surfаctаnts by sаfer
substаnces. Pоtenciаlty interresting grоup is represented by rhаmnоlipids, which belоng tо
bаcteriаlly prоduced surfаctаnts. They аre thermоstаble substаnces thаt аre cаpаble оf аcting
аs emulsifiers, they effectively reduce the interfаciаl tensiоn аt the interfаce оf immiscible
liquids. Mаin аdvаntаge оf rhаmnоlipids is their envirоnmentаl sаfety аnd pоssibility оf
synthesis frоm renewаble mаteriаls. Rhаmnоlipid prоducers use these substаnces аs
аntimicrоbiаl аgents аgаinst cоmpetitive micrооrgаnisms thаt hаve nо nаturаl prоtectiоn
аgаinst them. Therefоre the аntibаcteriаl prоperties оf rhаmnоlipids аre investigаted. This
wоrk is fоcused оn the study оf the biоlоgicаl effect оf rhаmnоlipids оn pаthоgenic
micrооrgаnisms Stаphylоcоccus epidermidis, Pseudоmоnаs аeruginоsа а Cаndidа
pаrаpsilоsis. The rhаmnоlipid influence оn permeаbility оf cellulаr structures аnd the chаnge
in hydrоphоbicity оf the surfаce оf the cell envelоpes wаs mоnitоred. Besides thаt, the
prоductiоn оf rhаmnоlipids in biоreаctоr under different cоnditiоns wаs mоnitоred tоо.
Strаins Pseudоmоnаs аeruginоsа DBM 3774, Pseudоmоnаs аeruginоsа DBM 3775,
Pseudоmоnаs аeruginоsа DBM 3776, Pseudоmоnаs аeruginоsа DBM 3777 were used аs
prоductiоn micrооrgаnisms. It wаs verified, thаt rhаmnоlipids prоduced by different bаcteriаl
strаins exhibit different prоperties.
Bc. Šárka Linhartová: Kvantifikace proteinů v komplexních směsích pomocí
dimethylových značek (doc. Dr. Ing. Radovan Hynek, ÚBaM VŠCHT Praha)
V závislosti na podmínkách vnějšího i vnitřního prostředí se hladiny proteinů v organismu i
jejich zastoupení mění. Sledování a popis těchto změn jsou klíčové pro hlubší porozumění
procesům, které v organismech probíhají. Cílem této práce bylo ověření spolehlivosti metody
využívající značení proteinů kovalentními dimethylovými značkami pro identifikaci a
kvantifikaci směsí proteinů pomocí LC MS/MS. Metoda byla nejprve ověřena na modelovém
proteinu BSA, následně byly připraveny modelové směsi a komplexní vzorky. Modelové
směsi tvořilo pět proteinů s rostoucí koncentrací jednoho z nich až do pětinásobného
přebytku. Komplexní vzorky byly připraveny smícháním lyzátu Pichia pastoris, jehož
koncentrace se neměnila, s lyzátem Escherichia coli, jehož koncentrace rostla až do
pětinásobného přebytku. Byla dokázána linearita metody a u modelových směsí rovněž
přesnost a spolehlivost kvantifikace. Kvantifikace komplexních vzorků se ukázala jako méně
přesná při nízkých koncentracích studovaných proteinů. Metoda značení pomocí dimethylů
umožňuje spolehlivou kvantifikaci v případě, že je ve vzorku dostatečné množství peptidů
sledovaných proteinů.
Quantification of proteins in complex mixtures using dimethyl labels
The levels of proteins in an organism and their respective character change based on the
conditions of the internal and external environment. The monitoring and description of these
changes are fundamental for deeper understanding of the processes which take place inside
organisms. The aim of this work was to verify the reliability of the method which uses
covalent dimethyl labels for identification and quantification of proteins using LC MS/MS.
The method was first validated using the model protein BSA and subsequently model
mixtures and complex samples were prepared. Model mixtures were created using five
proteins; the concentration of one of these increased up to fivefold excess. Complex mixtures
were prepared by mixing the Pichia pastoris lysate, the concentration of which did not change,
with the Escherichia coli lysate, the concentration of which increased up to fivefold excess.
16
Linearity of the method was proved as well as the precision and reliability of quantification in
the case of model mixtures. The quantification of complex samples proved to be less precise
in the case of low abundant proteins. Stable isotope dimethyl labeling permits reliable
quantification when the amount of peptides of monitored proteins in a sample is sufficient.
Bc. Lucie Máčiková: Sledování vybraných skupin alkaloidů v rostlinných surovinách a
produktech (doc. Dr. Ing. Věra Schulzová, ÚAPaV VŠCHT Praha)
Sledování vybraných skupin alkaloidů v rostlinných surovinách a produktech Předmětem
řešení předkládané diplomové práce bylo v první řadě optimalizovat a validovat analytickou
metodu pro stanovení kalysteginů v matricích brambory a lilek. Součástí předkládané
diplomové práce bylo vyšetření obsahu kalysteginů v matricích brambory a lilek
pocházejících z tržní sítě různých částí Evropy v rámci projektu „Occurrence of tropane
alkaloids in food“, který je realizován ve spolupráci s Evropským úřadem pro bezpečnost
potravin. Provedeno bylo také stanovení obsahu kalysteginů a glykoalkaloidů ve vzorkách
brambor z tržní sítě. Za tímto účelem byla využita technika kapalinové chromatografie ve
spojení s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií (HPLC-HRMS). Byl sledován obsah
alkaloidů v závislosti na lokalitě a podmínkách pěstování, porovnávány byly také jednotlivé
odrůdy a druhy brambor a lilku. V rámci provedených experimentů bylo zjištěno, že žádný z
testovananých vzorků brambor z tržní sítě nepřekročil maximální doporučený limit pro
glykoalkalkaloidy 200 mg/kg. Byla dokumentována závislost mezi obsahem kalysteginů a
geografickými podmínkami, způsobem pěstování, sezónou a odrůdou či druhem rostlinné
matrice.
Monitoring of selected groups of alkaloids in plant mateials and products
Monitoring of selected groups of alkaloids in plant materials and products Subject of the
Master Thesis is to optimize and validate analytic method for the determination of
calystegines in matrices of potatoes and aubergines. The Thesis includes monitoring of
contents of calystegines in matrices of potatoes and aubergines coming from different regions
of Europe as part of the Project "Occurrence of Tropane Alkaloids In Food" that is
implemented in cooperation with the European Food Safety Authority. The determination of
contents of calystegines and glykoalkaloids in samples of commercially available table potato
cultivars was carried out as well. Therefore the method high performance liquid
chromatography coupled with high resolution mass spectrometry (HPLC-HRMS) was used.
There was monitored level of present alkaloids depending on region, growing conditions,
season, variety and kind of the plant matrix. The performed experiments found that no sample
of the tested table potatoes exceeded the maximum recommended limit 200 mg per kilogram
for glycoalkaloids. Further, connexion between contents of calystegines and geograpfic
conditions, way of growing, season and cultivar or kind of plant matrix was found.
17