Izolace bílkovin z přírodních zdrojů (izolace kaseinu z mléka)

Praktikum z biofyziky a chemické fyziky I
Úloha 2, RNDr. Eva Urbánková
Izolace bílkovin z přírodních zdrojů (izolace kaseinu z
mléka)
Izolace proteinů srážením
Při tomto typu izolace se využívá nastavení takových podmínek, při kterých je daný protein
nerozpustný a vzniklou sraženinu je možno od zbytku oddělit (centrifugací, filtrací). Při
srážení může, ale nemusí, dojít k denaturaci proteinu.
Způsoby srážení bílkovin:
• Vysolování - molekuly vody hydratující protein mají větší afinitu k iontům soli a
desolvatované molekuly proteinu se shlukují
• Převedení na izoelektrický bod - v IEB nenese molekula proteinu žádný náboj, je nejméně
rozpustná.
• Srážení organickými rozpouštědly s vodou mísitelnými (ethanol, aceton) - podobný
princip, jako u vysolování, rozpouštědla působí podobně jako ionty solí.
...
Kasein
Kaseiny tvoří hlavní složku mléka (asi 80% proteinů). Jsou to fosfoproteiny (tj. některé jejich
OH skupiny jsou esterifikovány kyselinou fosforečnou) Obsahují značné množství prolinu,
který způsobuje zlomy v řetězci proteinu a inhibuje vytvoření kompaktní struktury.
Neobsahují sulfidové můstky. Mají velice málo sekundární struktury (a téměř žádnou
terciární), takže je obtížné je denaturovat. V mléku se nachází v micelách, které drží
pohromadě díky vápenatým iontům a hydrofobním silám.
Izoelektrický bod (tj. pH, při kterém protein nese nulový výsledný náboj) je 4.6. Při tomto pH
je kasein nerozpustný, čehož se využívá při jeho izolaci.
tabulka 1 Skupiny kaseinů
α (s1)-casein
molecular weight 23,000; 199 residues, 17 proline
residues
α (s2)-casein
molecular weight 25,000; 207 residues, 10 prolines
ß -casein
molecular weight 24,000; 209 residues, 35 prolines
κ -casein
molecular weight 19,000; 169 residues, 20 prolines
Two hydrophobic regions, containing all the proline residues,
separated by a polar region, which contains all but one of eight
phosphate groups. It can be precipitated at very low levels of
calcium.
Concentrated negative charges near N-terminus and positive
charges near C-terminus. It can also be precipitated at very low
levels of calcium.
Highly charged N-terminal region and a hydrophobic Cterminal region. Very amphiphilic protein acts like a detergent
molecule. Self association is temperature dependant; will form
a large polymer at 20° C but not at 4° C. Less sensitive to
calcium precipitation.
Very resistant to calcium precipitation, stabilizing other
caseins. Rennet cleavage at the Phe105-Met106 bond
eliminates the stabilizing ability, leaving a hydrophobic portion,
para-kappa-casein, and a hydrophilic portion called kappacasein glycomacropeptide (GMP), or more accurately,
caseinomacropeptide (CMP).
Chemická analýza vzorku
Biuretová zkouška
Bílkoviny a peptidy poskytují v alkalickém prostředí s měďnatými ionty červenofialově
zbarvené komplexy. Název reakce je odvozen od biuretu (kondenzační produkt močoviny),
1
Praktikum z biofyziky a chemické fyziky I
Úloha 2, RNDr. Eva Urbánková
jednoduché látky obsahující peptidovou vazbu, která dává také pozitivní reakci.
Fialově zbarvený komplex biuretu s mědí.
Ninhydrinová zkouška
Ninhydrin se používá k detekci primární aminů a amoniového iontu. Výsledný produkt reakce
má fialové zbarvení.
Xanthoproteinová zkouška
používá se k detekci proteinů obsahujících fenylovou skupinu. Při reakci kyseliny dusičné s
fenylovým kruhem vzniká žlutě zbarvená aromatická nitro-sloučenina.
Materiál
mléko, ledová kyselina octová, 95% ethanol, koncentrovaná kyselina dusičná, 2% albumin,
tyrosin 1%, glycin 2%, 0.4 % ninhydrin v EtOH, 5% CuSO4, 10% NaOH
Pracovní postup
1. Pomocí pH papírku otestujte pH mléka
2. Do 50 ml centrifugační zkumavky dejte 40 g mléka, centrifugujte 20 min při 3000 RPM.
Opatrně odsajte tuk, který zůstal na povrchu, zfiltrujte přes gázu.
3. Filtrát zahřívejte na vodní lázni za průběžného míchání. Když teplota dosáne 40° C,
vyndejte z lázně a přidejte asi 10 kapek ledové kyseliny octové (za stálého míchání).
Pozorujte tvoření sraženiny. Znovu otestujte pH.
4. Filtrujte přes filtrační papír, filtrát přeneste do kádinky (nebo vymyté centrifugační
zkumavky)
5. Přidejte 25 ml ethanolu, míchejte 5 min.
6. Znovu zfiltrujte.
7. Kasein rozprostřete na filtrační papír, nechte uschnout (v exsikátoru, pokud bude k
dispozici). Zvažte usušený kasein a určete procentuální výtěžek.
2
Praktikum z biofyziky a chemické fyziky I
Úloha 2, RNDr. Eva Urbánková
8. Proveďte biuretovou, ninhydrinovou zkoušku a xanthoproteinovou zkoušku. Připravte si
testovací roztoky (pokud již nejsou k dispozici): 2% glycin, 2% albumin, 1% tyrosin,
kasein (zhruba polovinu špachtle + 45 kapek destilované vody). Od každého připravte 3
zkumavky po 15 kapkách.
9. Biuretová zkouška: k 15 kapkám zkoumaných roztoků přidejte 5 kapek 10 % NaOH a 2
kapky 5% CuSO4, míchejte.
10. Xanthoproteinová zkouška (v digestoři!) přidejte 10 kapek koncentrované HNO3,
míchejte. Zahřívejte opatrně na vodní lázni.
11. Ninhydrinová zkouška: K testovacím roztokům přidejte 5 kapek ninhydrinu a zahřívejte
ve vroucí lázni 5 min.
Literatura:
Je třeba, abyste měli základní znalosti o složení a struktuře proteinů - např. z www.
wikipedia.org.
více o složení mléka: http://www.foodsci.uoguelph.ca/dairyedu/chem.html#protein1
Pozn. V některé z internetových databází (např. na www.ncbi.nlm.nih.gov) můžete zkusit najít
sekvence některého z kaseinů a hovězího sérového albuminu (BSA) a podívat se na to, kolik
obsahují prolinů, aminokyselin obsahujících primární aminovou skupinu a aromatických
amino kyselin.
Protokol z praktika
Skupina:
Datum:
Výtěžek izolace:
Hmotnost mléka:
Hmotnost sušiny (kasein):
Procentuální výtěžek:
g
g
%
Chemická analýza:
(zaznamenejte barvu, případně další pozorování)
Glycin
Tyrosin
BSA
Kasein
Biuretová zkouška
Xanthoproteinová zk.
Ninhydrinová zk.
3