elichrom fungi en 2010-11 Ref 44328.qxp

ELIchrom FUNGI
Identifikace hlavních patogenních kvasinek
25 testů (kat.č. 44328)
Verze: EN-2010-11
1 – ZAMÝŠLENÉ POUŽITÍ
Souprava ELIchrom FUNGI umožňuje identifikaci hlavních humánních patogenních kvasinek zejména použitím
chromogenních substrátů. Umožňuje odlišení Candida albicans od Candida dubliniensis.
2 - ÚVOD
Plísňové infekce a hlavně ty, které způsobují kvasinky, významně narůstají v posledním desetiletí. Kvasinky jsou
oportunními organismy. Většina z nich jsou saprofyti, ale za příznivých podmínek u hostitele se mohou stát
patogeny. Tyto podmínky zahrnují fyziologické faktory (novorozenci, starší lidé, těhotné ženy), místní faktory
(odřeniny, macerace), patologické faktory (rakovina, imunitní deficience, metabolické poruchy…), faktory
terapeutické (antibiotika, antikoncepční pilulky, imunosupresiva, ionizující záření, chirurgické výkony…). Klinické
znaky způsobené kvasinkami jsou rozličné: kožní potíže (intertrigo, zarostlý nehet…), podkožní poškození (orální
kandidiáza, ezofagitida, kolitida, vaginitida…) viscerální a septické stavy.
Kvasinky jsou jednobuněčné houby, které se množí pučením. Mezi hlavní patogenní rody patří: Candida,
Cryptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces, Trichosporon. Rod Geotrichum jsou vláknité houby, jejichž mycelium
produkuje pravé hyfy, které segmentují do obdélníkových arthrokonidií rozličné velikosti a kulaté distální části.
3 - PRINCIP
Identifikace kvasinek je založena na přítomnosti různých enzymů, vizualizovaných barevnou změnou. Enzymatické
aktivity se projeví třemi druhy reakcí.
• Hydrolýza 7 chromogenních substrátů:
Oxidázová a peptidázová aktivita kvasinek hydrolyzuje chromogenní substráty za uvolnění para-nitroanilinu, paranitrofenolu nebo ortho-nitrofenolu, které jsou charakterizované žlutým zbarvením (X-NAG, PRO, ONPG, SGL,
GLY) nebo modrým zbarvením (a-GLU, PHOS).
• Asimilace 10 přírodních substrátů:
-Využití cukrů se odhalí barevnou změnou bromkresolového purpuru (BCP) z fialové na žlutou nebo absencí barvy
(MDG, TRE, GAL-SAC, MAL, CEL, RAF, LAC)
-Rezistence k aktidionu je odhalena na stejném principu (ACT)
-Hydrolýza močoviny uvolňuje amoniak, který alkalizuje médium, což mění barvu fenolové červeně (PR) na
fuchsiově růžovou. (URE).
- Redukce eskulinu na eskuletin enzymem eskulinázou (ESC) produkuje hnědo-černý komplex v přítomnosti citrátu
železitého.
• Oxidace syntetického substrátu: Aktivita fenoloxidázy v přítomnosti kyseliny kávové produkuje hnědou barvu
(POX).
Každá vanička ELIchrom FUNGI také obsahuje jamku pozitivní kontroly (jamka T+), která odhalí asimilaci glukózy
a negativní kontrolu (C-) kvůli pomoci při odečtu jamek SGL a GLY.
4 - REAGENCIE
Balení:
Souprava obsahuje 25 testů:
1 TC FUNGI lahvička
27 SUSPENSION FUNGI lahviček
25 ELIchrom FUNGI vaniček
Popis :
TC FUNGI: 4 ml lahvička roztoku síranu barnatého pro kontrolu turbidity.
SUSPENSION FUNGI: 4 ml lahvička agarového roztoku obsahujícího Bacto Agar (0.5 g/l), kolimycin (2.5 mg/l) a
vankomycin (0.05 g/l).
ELIchrom FUNGI: 20-jamková vanička připravena k použití, která obsahuje:
C +: pozitivní kontrolu obsahující glukózu a BCP.
li-NAG: obsahuje chromogenní substrát pro a-D-glukosaminidázu
PRO: obsahuje chromogenní substrát pro L-prolin-amidázu
ACT: obsahuje aktidion, glukózu a BCP
MDG: obsahuje methyl-alfa-D-glukopyranosid
ESC: obsahuje eskulin
a-GLU: obsahuje chromogenní substrát pro a-D-glukopyranosidázu
PHOS: obsahuje chromogenní substrát pro fosfatázu
TRE: obsahuje trehalózu a BCP
ONPG: obsahuje chromogenní substrát pro I-D-galaktosidázu
C -: negativní kontrola pro odečet SGL a GLY
SGL: obsahuje chromogenní substrát pro peptidázu
GLY: obsahuje chromogenní substrát pro glycin-amidázu
URE: obsahuje ureu a PR
POX: obsahuje substrát pro fenoloxidázu
SAC/GAL: obsahuje galaktosidázu, sacharózu a BCP
MAL: obsahuje maltózu a BCP
CEL: obsahuje celobiózu a BCP
RAF: obsahuje rafinózu a BCP
LAC: obsahuje laktózu a BCP
5 – BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ

Reagencie jsou určeny pouze pro použití in vitro a musí s nimi manipulovat pouze školený personál.

Vzorky od pacientů a inokulované reagencie jsou potenciálně infekční, musí se s nimi zacházet opatrně
v souladu s hygienickými pravidly a aktuálními předpisy pro daný typ produktu a zemi jeho použití.

Některé jamky ELIchrom FUNGI obsahují neopracovaný materiál živočišného původu a musí se
s nimi zacházet opatrně.

Nepoužívejte reagencie po datu exspirace.

Nepoužívejte reagencie, které jsou poškozené, nebo které byly před použitím špatně uchovávané.
6 – SBĚR VZORKŮ A JEJICH OŠETŘENÍ
Kolonie použité pro provedení identifikace kvasinek musí být čerstvé (24 až 48 hodin staré) a dobře izolované na
agarovém médiu na Petriho misce. Doporučuje se, aby izolace byla provedena na médiu specifickém pro kvasinky.
7 – PŘÍPRAVA REAGENCIÍ A JEJICH UCHOVÁVÁNÍ
Souprava a její obsah při skladování při 2-8 °C v originálním obalu je stabilní do data exspirace vyznačeného na
obalu. Reagencie jsou připraveny k použití.
Lahvičky se SUSPENSION FUNGI a vaničky se musí použít ihned po otevření.
8 – POŽADOVANÉ, ALE NEDODÁVANÉ REAGENCIE A MATERIÁL
• ELIchrom FUNGI kódová knížka (kat.č. 44329)
• Inkubátor na 30 °C
• Pasteurovy pipety.
• Nádoba na kontaminovaný odpad
9 - POSTUP
Nechejte před použitím reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu (18-25 °C).
9.1. Vyšetření izolovaných kolonií
Před inokulací vaničky proveďte makroskopické a mikroskopické zkoumání kolonií.
9.2. Příprava inokula
Odeberte dvě nebo tři stejné kolonie pomocí drátěné kličky nebo zavřené Pasteurovy pipety.
Inokulujte koloniemi lahvičku SUSPENSION FUNGI. Dobře promíchejte.
Standardizace inokula může být provedena různými způsoby:
• Ve srovnání s TC FUNGI
Nastavte zákal inokulovaného média vzhledem k TC FUNGI zákalové kontrole s pomocí černých linií vytištěných na
štítku lahvičky.
Pokud je médium slabší (nedostatečné inokulum), je třeba lahvičku inokulovat znovu, dokud nedosáhnete stejného
zákalu, jako má kontrola. Pokud je médium příliš zakalené (příliš silné), nařeďte jej čerstvou SUSPENSION FUNGI
z nově otevřené lahvičky až do dosažení správného zákalu.
• S pomocí Denzitometru
Pomocí denzitometru ověřte, že zákal inokulovaného média je roven 2. stupni Mac Farlanda. Pokud je to nezbytné,
postupujte dle výše uvedených instrukcí pro nastavení turbidity.
9.3. Inokulace vaničky
Sundejte adhezivní pásku překrývající vaničku.
Inokulujte 20 jamek s 100 µl inokulované SUSPENSION FUNGI.
Znovu uzavřete vaničku páskou.
9.4. Inkubace
Inkubujte v maximálně 30 °C po dobu 24 až 48 hodin.
Vaničku odečítejte, když je jamka pozitivní kontroly změněná z fialové na žlutou nebo je bezbarvá.
10 – ODEČET A INTERPRETACE
10.1 Odečet vaničky
Odečtení C+ jamky
Odečtěte jamku C+; pokud je stále fialová, prodlužte dobu inkubace.
Pokud se jamka C+ změní na žlutou nebo je bezbarvá, odečítejte vaničku podle barevného diagramu přiloženého
k soupravě.
Odečtení C- jamky a interpretace SGL a GLY jamek
Po inkubaci je C-jamka žlutá nebo někdy i bezbarvá. Objevení žlutého zbarvení u jamek SGL a/nebo GLY vyšší
intenzity než u jamky C- značí pozitivní reakci. Pokud je barva slabší nebo rovná intenzitě C- jamky, dokonce
v případě zakalení v jamkách SGL a/nebo GLY, jsou tyto jamky považovány za negativní.
10.2 Identifikace
Interpretace vaničky ELIchrom FUNGI se provádí buď pomocí kódového systému, nebo pomocí identifikační
tabulky. Pokud po 24 hodinové inkubaci není získaný kód uveden v knize, pokračujte v inkubaci po dalších 24
hodin. Pokud po 48 hodinách stále nemáte kód s odkazem, nahlédněte do identifikačního diagramu. Pro danou
kvasinku musí být všechny hlavní charakteristiky uvedené v tabulce jednoznačně pozitivní. Kvůli práci s kódem
jsou charakteristiky seskupeny do tripletů, čtveřice nebo pětice:
- I-NAG, PRO, ACT
- MDG, ESC, a-GLU
- PHOS, TRE, ONPG
- SGL, GLY, URE, POX
- GAL-SAC, MAL, CEL, RAF, LAC
Každá charakteristika je označena hodnotou nula, pokud je negativní. Pokud je pozitivní, její hodnota závisí na
pozici ve skupině:
- 1 pro pozici 1
- 2 pro pozici 2
- 4 pro pozici 3
- 8 pro pozici 4
- 16 pro pozici 5
Ve stejné skupině sečtěte dohromady hodnoty kvůli získání 7 číselného čísla. Potom se na toto číslo podívejte do
kódové knížky.
Např.: Kód 7-5-2-00-03, tento kód odpovídá na seznamu Candida albicans.
11 – KONTROLA KVALITY
Doporučuje se, abys standardizace metody byla čas od času ověřena s použitím referenčních kmenů Candida
albicans ATCC 90028 (1) a Candida krusei ATCC 6258 (2). Odečet během 24 hodin:
12 – PŘÍČINY CHYB
• Manipulace v nesterilním prostředí.
• Příprava inokula ze smíšené kultury.
• Inokulum menší než 2 Mac Farland může vést k falešně negativnímu výsledku zvláště u ESC a RAF.
• Vypařování obsahu jamek během inkubace jako výsledek špatného utěsnění vaničky adhezivní páskou.
• Inkubace vaničky při 37 °C místo 30 °C.
• Odečet vaničky před objevením barevné změny růstového indikátoru.
• Vanička neodečtena po inkubaci 24 neb 48 hodin, ačkoliv růstový indikátor byl pozitivní.
• Obecně nerespektování doporučení obsažených v tomto návodu.
13 - LIMITACE
• Metoda ELIchrom FUNGI umožňuje pouze identifikaci druhů v přiloženém seznamu.
• U některých kmenů, by měla být identifikace s metodou ELIchrom FUNGI provedena paralelně s analýzou
morfologických charakteristik.
14 – CHARAKTERISTIKA PROVEDENÍ
Hodnocení funkčnosti bylo provedeno s použitím 10 referenčních kmenů a 190 kmenů z mykologických vzorků (43
Candida albicans, 27 Candida dubliniensis, 28 Candida glabrata, 5 Candida guillermondii, 7 Candida krusei, 7
Candida lusitaniae, 3 Candida kefyr, 21 Candida parapsilosis, 4 Candida rugosa, 13 Candida tro-picalis, 1 Candida
catenulata, 1 Candida colliculosa, 4 Candida famata, 1 Candida inconspicua, 1 Candida lipolytica, 1 Candida
membranifaciens, 1 Candida nivariensis, 1 Candida palmioleo-phila, 2 Candida pararugosa, 2 Candida pelliculosa,
2 Candida zeylanoi'des, 2 Cryptococcus albidus, 1 Cryptococcus laurentii, 5 Cryptococcus neoformans, 3
Rhodotorula mucilaginosa / rubra, 5 Saccharomyces cerevisiae, 3 Trichosporon asahii, 2 Trichosporon cutaneum /
mucoides, 1 Geotrichum candidum, 1 Geotrichum capitatum, 1 Pichia farinosa, 1 Rhodotorula glutinis).
Porovnávací studie byla provedena paralelně s metodou Auxacolor 2 (Biorad). Procento shody bylo 86%. Mezi
nesrovnatelnostmi byly pouze dvě potvrzeny pomocí metody ELIchrom FUNGI. Konečná citlivost testu byla 98.59
% a specifičnost byla 99 %.
93.5 % kmenů bylo identifikováno během 24 hodinové inkubace.
15 – LIKVIDACE ODPADŮ
Odpad likvidujte dle hygienických pravidel a aktuálních směrnic pro daný typ produktu a zemi použití.
16 - LITERATURA
CASAL M. and M.J. LINARES. 1983. Contribution to the study of the enzymatic profiles of yeast organisms with
medical interest. Mycopathol. 81: 155-159.
CONTANT G., C. CROUZIER and M. DEBRUYNE. 1993. A new colorimetric system: FUNGICHROM® for medical
yeast identification. In "C.E.M.M.", Paris, 26th november.
HEALY M.E., C.L. DILLAVOU and G.E. TAYLOR. 1977. Diagnostic medium containing inositol, urea, and caffeic
acid for selective growth Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol. 6:
387-391.
PERRY J.L. and G.R. MILLER. 1987. Umbelliferyl-labeled galac-tosaminide as an aid in identification of Candida
albicans. J. Clin. Microbiol. 25: 2424-2425.
PINCUS D. H. ,D. C. COLEMAN, W. R. PRUITT, A. A. PADHYE,
I. F. SALKIN, M. GEIMER, A. BASSEL, D. J. SULLIVAN, M. CLARKE, AND V. HEARN.1999. Rapid Identification
of Candida dubliniensis with Commercial Yeast Identification Systems. J. Clin. Microbiol. 37: 3533-3539.
WALLER J., G. CONTANT, C. CROUZIER, M. DEBRUYNE and
®
H. KOENIG. 1995. Evaluation of a new yeast identification system FUNGICHROM based on chromogenic
substrate hydrolysis and a carbohydrate assimilation. J. Mycol. Med. 5: 92-97.