SpermFlowEx Kit

SpermFlowEx® Kit
(25 tests / testů / testov)
h
ENGLISH
4. Principle
Sperm count and leukocyte count
Measurement of the sperm count and leukocyte count is based
on the addition of an internal standard (fluorescent beads with
known concentration) to the semen sample. Detection of
leukocytes in the sample is performed by staining with labeled
antibody against human CD45 antigen (CD45 PE-Cy™5).
1. Manufacturer
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz
Sperm viability
Sperm viability is examined using propidium iodide which
permeates through damaged membranes of dead cells and
binds to their DNA.
Acrosome integrity
Measurement of acrosome integrity is based on the detection of
an intra-acrosomal protein (IAP), which can be found inside the
acrosome. If the sperm acrosome is intact, it is unable to detect
IAP. Sperm with damaged membrane has IAP exposed and
therefore accessible to the antibody against IAP, hence the
protein is detected.
2. Intended use
The SpermFlowEx® Kit is designed for analysis of following
parameters in human semen using flow cytometry:





ED7079
Sperm count
Leukocyte count
Sperm viability
Sperm acrosome integrity
Presence of intra-acrosomal protein in sperm
Presence of intra-acrosomal protein
After permeabilization of sperm membrane, intra-acrosomal
protein is exposed to the antibody against intra-acosomal
protein (IAP) and thus is detected. In case, that sperm does not
contain intra-acrosomal protein (IAP), the protein is not
detected after permeabilization.
The analysis should be completed by the examination of sperm
motility and morphology using a light microscope in accordance
to WHO recommendation [1].
5. Precautions
3. Introduction


Lately, infertility of human population is a growing problem.
Nearly 20 % of couples suffer from infertility, which is in 1/3
causes attributed to a male factor. Therefore, analysis of semen
should play a role in basic non-invasive examination, which
could verify or negate andrological cause of infertility.




Sperm examination is carried out mainly using the light
microscope and obeys the WHO criteria from 2010 [1]. Such
examination is subjective and depends on the personal
experience of the examiner. When using the flow cytometry the
analysis is balanced and objective, since the amount of
measured sperms is much greater and detection of cells is
provided via specific staining [2]. Main parameters having great
impact on the ability of sperm to fertilize are: sperm count,
sperm viability, acrosome integrity and presence of an intraacrosomal protein (IAP) [3]. The acrosome contains digestive
enzymes (including hyaluronidase and acrosin). These
enzymes breakdown the outer membrane of the ovum called
the zona pellucida, allowing the haploid nucleus of the sperm
penetrate into the ovum. Presence of leukocytes in semen is a
mark of an actual inflammation or a venereal disease.

Intended for research use only.
The flow cytometer should be calibrated on a routine basis
using fluorescent microbeads to ensure stable sensitivity
of detectors.
Do not use reagents after expiration date stated on vial
labels.
Avoid prolonged exposure of the reagents to light.
Avoid contamination of the reagents.
Any non-performance of assay procedure may produce
false results.
Semen samples are considered as potentially infectious
and must be handled with care.
Warning: The Permeabilizing Solution (ED7079-5) contains
ethanol.
Warning
H-phrases
H226: Flammable liquid and vapour.
1/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
11. Assay procedure
P-phrases
P210: Keep away from heat/sparks/open flames/hot surfaces.
No smoking.
P260: Do not breathe vapours/spray.
P280: Wear protective gloves / eye protection / face protection.
P301+P312: IF SWALLOWED: Call a POISON Center or
doctor/physician if you feel unwell.
P302+P352: IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water.
P305+P351+P338: IF IN EYES: Rinse cautiously with water for
several minutes. Remove contact lenses, if present and
easy to do. Continue rinsing.
P501 Dispose of contents/container to authorized facility for
dangerous wastes.
Check the sperm count using a light microscope. Dilute the
semen 1:1 or 1:9 with PBS according to the sperm count (the
greater the count the greater the dilution).
Sperm and leukocyte count
1. Pipette 50 l of diluted semen to a sample tube.
Add 10 l of CD45 PE-Cy™5 reagent.
2. Mix the sample and incubate for 20 minutes at room
temperature.
3. Add 50 l of Fluorescent Count Standard (first drop well
mixed standard in an empty microtube and then pipette
the exact volume of the standard to the sperm sample).
4. Add 0.5 ml of PBS, mix the sample and analyze using a
flow cytometer.
6. Reagents provided





ED7079-1 Intra-acrosomal protein FITC – 1 vial
containing 0.5 ml of mouse monoclonal antibody against
intra-acrosomal protein, FITC labeled.
ED7079-2 CD45 PE-Cy™5 – 1 vial containing 0.25 ml of
mouse monoclonal antibody against CD45, PE-Cy™5
labeled.
ED7079-3 Fluorescent Count Standard – 1 vials
containing 2 ml of fluorescent beads, 1×106 particles/ml
ED7079-4 Propidium Iodide – 1 vials containing 0.25 ml
of propidium iodide solution.
ED7079-5 Permeabilizing Solution – 1 vials containing
25 ml of the reagent.
Sperm viability
1. Pipette 50 l of diluted semen to a sample tube.
2. Add 10 l of Propidium Iodide solution.
3. Mix the sample and incubate for 20 minutes at room
temperature.
4. Add 0.5 ml of PBS, mix the sample and analyze using a
flow cytometer.
Acrosome integrity
1. Pipette 50 l of diluted semen to a sample tube.
2. Add 1 ml of PBS.
3. Mix well and centrifuge for 5 minutes at 150 g.
4. Wash the pellet twice (repeat the 2nd and 3rd step).
5. Add 10 l of Intra-acrosomal protein FITC antibody to
the pellet.
6. Mix the sample and incubate for 20 minutes at room
temperature.
7. Add 0.5 ml of PBS, mix well and analyze using a flow
cytometer.
7. Storage
Store the SpermFlowEx® Kit at 2-8 °C. Expiration date is stated
on vial labels and on the box.
8. Evidence of deterioration
Presence of intra-acrosomal protein
1. Pipette 50 l of diluted semen to a sample tube.
2. Add 1 ml of Permeabilizing Solution which was allowed
to warm up to room temperature (20-25 °C).
3. Mix the sample and incubate for 15 minutes at room
temperature.
4. Centrifuge for 5 minutes at 150 g.
5. Add 1 ml of PBS to the pellet, mix and centrifuge for
5 minutes at 150 g.
6. Wash the pellet twice (repeat the 5th step).
7. Add 10 l of Intra-acrosomal protein FITC antibody to
the pellet.
8. Mix well and incubate for 20 minutes at room temperature.
9. Add 0.5 ml of PBS, mix well and analyze using a flow
cytometer.
In case of reagents deterioration or if data obtained show any
performance alteration, please contact manufacturer using
following e-mail address: [email protected]
9. Necessary material not supplied







Suitable 5ml test tubes for blood staining
(e.g. 12 × 75 mm)
PBS buffer
Automatic pipettes with disposable tips
Vortex mixer
Light microscope
Centrifuge with rotor suitable for test tubes
Flow cytometer - blue laser excitation at 488 nm and
proper emission filters.
12. Flow cytometry
10. Specimen
Analyze stained samples using flow cytometer equipped with a
488 nm excitation laser and appropriate filter set-up.
Treat semen samples within 8 hours after ejaculation. Store
semen samples at room temperature.
Fluorescent Count Standard is detected in FITC fluorescence
detector as well as monoclonal antibody against intraacrosomal protein. Fluorescence of propidium iodide and
PE-Cy™5 label is detected in PC5 or PerCP fluorescence
detector.
2/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
13. Data analysis
14. Expected values
Sperm and leukocyte count
Visualize measured data as a dot-plot, where FITC
fluorescence intensity is on the X-axis and forward-scatter
(FSC) is on the Y-axis (Fig.1). Set gates as shown in figure 1:
gate A for all cells, gate B for sperms and gate C for
Fluorescent Count Standard (fluorescent beads). Then visualize
events from the gate A as a dot-plot (Fig. 2), where the X-axis
represents fluorescence intensity of PE-Cy™5 dye and the
Y-axis represents side-scatter (SSC). On the contrary to the
sperms, leukocytes are CD45 positive. Separate the bright
population of leukocytes using gate D as shown in figure 2.
Calculate sperm and leukocyte count using following formulas:
Normal values according to WHO [1]
Sperm count in semen
> 15×106 /ml
Leukocyte count in semen
< 1×106 /ml
Sperm viability
> 58 %
S
gateB
 dilution
gateC
gateD
L
 dilution
gateC
S
L
Gate B
Gate C
Gate D
Normal acrosomal values
Acrosome integrity of sperms
Presence of intra-acrosomal protein
< 30 % pathological
> 90 % sperms
15. Limitations

[106 sperm/ml]

6
[10 leukocytes/ml]
Composition of components was optimized to offer the
best specific signal/non-specific signal ratio. Therefore, it
is important to adhere to the reagent volume/sample
volume ratio in every test.
Flow cytometer may produce false results if the device
has not been aligned and maintained appropriately.
16. Trademarks
represents sperm count in ejaculate
represents leukocyte count in ejaculate
represents event count in gate B
represents event count in gate C
represents event count in gate D
Cy™ and CyDye™ are registered trademarks of GE
Healthcare.
Sperm viability
Visualize measured data as a forward-scatter (FSC) versus
side-scatter (SSC) dot-plot. Set the gate around sperm cells as
shown in figure 3. Then visualize sperm cells in a histogram
(Fig. 4), where the X-axis represents fluorescence intensity of
propidium iodide in PE-Cy5 or PerCP channel. Separate
positive and negative sperm cells using appropriate gate.
Negative population represents viable sperms, while PI-positive
population represents non-viable sperms. Viability of sperms is
represented by the percentage of viable sperms from all sperm
cells.
Acrosome integrity and presence of intra-acrosomal protein
Visualize permeabilized and non-permeabilized samples
stained using antibody against intra-acrosomal protein as a
forward-scatter (FSC) versus side-scatter (SSC) dot-plot and
set the gate around sperm events as shown in figure 3. Then
visualize sperm events in a histogram (see Fig. 5-7), where the
X-axis represents fluorescence intensity in FITC fluorescence
detector. Separate positive and negative sperms using
appropriate gates.
Figure 5 shows non-permeabilized non-pathological sperms
events with low content (< 30 %) of positive sperms. Negative
ones represent sperms with intact acrosome and positive ones
represent sperms with damaged acrosome.
Figure 6 shows permeabilized non-pathological sperms with
dominant content of positive sperm events. Positive sperm
events indicate the presence of the intra-acrosomal protein.
Figure 7 shows non-permeabilized pathological sperms with
high content (> 30 %) of positive sperm events with damaged
acrosome.
3/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
ČESKY
Přítomnost intra-akrozomálního proteinu
Po narušení či permeabilizaci membrány spermií se intraakrozomální protein (IAP) stává dostupným pro protilátku proti
IAP a je detekován. V případě, že spermie intra-akrozomální
protein (IAP) neobsahují, není po permeabilizaci spermií
protilátkou proti IAP detekován.
1. Výrobce
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz
5. Upozornění


2. Použití soupravy




SpermFlowEx® Kit umožňuje vyšetřit v ejakulátu následující
parametry metodou průtokové cytometrie:





počet spermií
počet leukocytů
vitalita spermií
integrita akrozomu spermií
přítomnost intra-akrozomálního proteinu ve spermiích

Výrobek je určen pouze pro výzkumné účely.
Průtokový cytometr pravidelně kalibrujte pomocí
fluorescenčních kuliček, aby byla zajištěna stabilní citlivost
detektorů.
Nepoužívejte reagencie po uplynutí doby použitelnosti.
Reagencie nevystavujte dlouhodobému působení světla.
Chraňte obsah vialek před kontaminací.
Nedodržení doporučeného postupu analýzy může ovlivnit
výsledky testů.
Vzorky sperma jsou považovány za potenciálně infekční
materiál, a proto s nimi musí být náležitě nakládáno.
Varování: reagencie
obsahuje etanol.
Vyšetření spermií je vhodné ještě doplnit o měření pohybu
a analýzu morfologie pomocí světelného mikroskopu podle
doporučení WHO [1].
Permeabilizing Solution
(ED7079-5)
Varování
3. Úvod
V současné době je uváděno, že až 20 % párů trpí poruchami
plodnosti. Z toho asi u 1/3 je příčina na straně muže.
Neinvazivní vyšetření ejakulátu by proto mělo patřit mezi
základní metody sloužící k vyloučení nebo potvrzení
andrologické příčiny neplodnosti.
H-věty
H226: Hořlavá kapalina a páry.
P-věty
P210: Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami,
otevřeným plamenem a jinými zdroji zapálení. Zákaz
kouření.
P260: Nevdechujte páry/aerosoly.
P280: Používejte ochranné rukavice/ochranné brýle/obličejový
štít.
P301+P312: PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte
TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo
lékaře.
P302+P352: PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím
vody a mýdlem.
P305+P351+P338: PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně
vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li
nasazeny, a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve
vyplachování.
P501: Odstraňte obsah/obal v autorizovaném místě sběru
nebezpečných odpadů.
Vyšetření ejakulátu je nejčastěji prováděno pomocí světelného
mikroskopu a řídí se kriterii WHO z roku 2010 [1]. Takto
provedené vyšetření je subjektivní a závisí na osobní
zkušenosti. Při využití průtokové cytometrie se vyšetření
objektivizuje, jelikož dochází k měření velkého počtu spermií
a také k detekci buněk na základě specifického značení [2].
Významnými parametry, které ovlivňují schopnost oplodnění,
jsou počet spermií, jejich životnost, integrita akrozomu
a přítomnost intra-akrozomálního vazebného proteinu (IAP) [3].
Akrozom obsahuje enzymy hyaluronidasu a acrosin, které
natráví vnější membránu vajíčka zvanou zona pellucida, čímž
umožní průnik haploidního jádra spermie do vajíčka. Přítomnost
leukocytů v ejakulátu může upozornit na eventuálně probíhající
zánět či infekci pohlavního ústrojí.
4. Princip
Počet spermií a počet leukocytů
Měření počtu spermií a leukocytů je založeno na přidání
vnitřního standardu (fluorescenčních kuliček o známém počtu)
ke vzorku ejakulátu. Detekce leukocytů ve vzorku je prováděna
pomocí protilátky anti-CD45 PE-Cy™5.
6. Obsah soupravy
Vitalita spermií
Vitalita spermií je měřena pomocí propidium jodidu, který
proniká narušenou membránou mrtvých buněk a váže se na
DNA.

Integrita akrozomu
Měření integrity akrozomu je založeno na detekci intraakrozomálního proteinu (IAP), který je přítomen v akrozomu.
Pokud akrozom spermie není narušen, není tento protein
možno detekovat. U spermií s narušenou membránou je tento
protein dostupný pro protilátku proti IAP a je detekován.




4/11
ED7079-1 Intra-acrosomal protein FITC – 1 vialka
obsahující 0,5 ml myší monoklonální protilátky proti
intra-akrozomálnímu proteinu, značená FITC.
ED7079-2 CD45 PE-Cy™5 – 1 vialka obsahující 0,25 ml
myší monoklonální protilátky proti CD45, značené
PE-Cy™5.
ED7079-3 Fluorescent Count Standard – 1 vialka
obsahující 2 ml fluorescenčních kuliček, 1×106 částic/ml.
ED7079-4 Propidium Iodide – 1 vialka obsahující
0,25 ml roztoku propidium jodidu.
ED7079-5 Permeabilizing Solution – 1 lahvička
obsahující 25 ml roztoku.
ED7079_EN_CZ_SK_151222
7. Skladování soupravy
Přítomnost intra-akrozomálního proteinu
1. Do zkumavky napipetujte 50 l naředěných spermií.
2. Přidejte 1 ml Permeabilizing Solution, který byl předem
vytemperován na laboratorní teplotu (20-25 °C).
3. Směs promíchejte a inkubujte 15 minut za laboratorní
teploty.
4. Směs centrifugujte 5 minut při 150 g.
5. K sedimentu přidejte 1 ml PBS a centrifugujte 5 minut
při 150 g.
6. Sediment 2x promyjte (2x opakujte 5. bod postupu).
7. K sedimentu přidejte 10 l protilátky Intra-acrosomal
protein FITC.
8. Směs promíchejte a inkubujte 20 minut za laboratorní
teploty.
9. Přidejte 0,5 ml PBS, vzorek promíchejte a změřte
průtokovým cytometrem.
SpermFlowEx® Kit skladujte při teplotě 2-8 °C. Doba
použitelnosti je vyznačena na jednotlivých reagenciích i na
krabici soupravy.
8. Změny kvality produktu
V případě pozorování jakéhokoliv zhoršení vlastností produktu,
prosíme, neprodleně informujte výrobce prostřednictvím
e-mailové adresy: [email protected]
9. Potřebné vybavení a materiál, který není
dodáván







Vhodné 5ml zkumavky pro barvení buněk
(např. 12 × 75 mm)
PBS pufr
Sada automatických pipet s jednorázovými špičkami
Vortex
Světelný mikroskop
Centrifuga s rotorem pro zkumavky
Průtokový cytometr - excitace modrým laserem 488 nm
a vhodné emisní filtry.
12. Cytometrické měření
Analyzujte obarvené vzorky pomocí průtokového cytometru
vybaveného excitačním laserem 488 nm a vhodnými filtry.
Fluorescence vnitřního standardu (Fluorescent Count Standard)
stejně jako značené protilátky proti intra-akrozomálnímu
proteinu je detekována v kanále pro FITC. Fluorescence
propidium jodidu (FL1) a fluorescenční značky PE-Cy™5 je
detekována v kanále pro PC5 nebo PerCP.
10. Testovaný vzorek
13. Analýza dat
Vzorky spermatu zpracujte do 8 hodin po odběru. Před
měřením skladujte vzorky při laboratorní teplotě.
Počet spermií a počet leukocytů
Naměřená data zobrazte v dot-plotu, kde na ose X je intenzita
fluorescence ve FITC kanálu a na ose Y forward-scatter (FSC)
(Obr. 1). V grafu nastavte regiony (gate) jak je uvedeno
na obrázku 1. Gate A ohraničuje populaci všech buněk, gate B
ohraničuje spermie a gate C vnitřní standard (Fluorescent
Count Standard). Leukocyty v ejakulátu zobrazte vynesením
buněk z gate A do dot-plotu (Obr. 2), kde na ose X je intenzita
fluorescence PE-Cy™5 a na ose Y je side-scatter (SSC).
Populaci leukocytů, která je označena protilátkou
CD45 PE-Cy™5, ohraničte pomocí gate D. Výpočet počtu
spermií a leukocytů ve spermatu proveďte podle následujících
vzorců:
11. Postup testu
Vzorek ejakulátu orientačně prohlédněte v mikroskopu a podle
počtu spermií (malý počet nebo velký počet) nařeďte buď 1:1
nebo 1:9 do PBS.
Počet spermií a počet leukocytů
1. Do zkumavky napipetujte 50 l naředěných spermií.
2. Přidejte 10 l CD45 PE-Cy™5 reagencie.
3. Směs promíchejte a inkubujte 20 minut za laboratorní
teploty.
4. Ke vzorku přidejte 50 l Fluorescent Count Standard
(nejprve odkapejte potřebné množství dobře
promíchaného standardu z kapátka a pak pipetujte přesné
množství ke vzorku spermií).
5. Přidejte 0,5 ml PBS, vzorek promíchejte a změřte
průtokovým cytometrem.
Vitalita spermií
1. Do zkumavky napipetujte 50 l naředěných spermií.
2. Přidejte 10 l roztoku Propidium Iodide.
3. Směs promíchejte a inkubujte 20 minut za laboratorní
teploty.
4. Přidejte 0,5 ml PBS, vzorek promíchejte a změřte
průtokovým cytometrem.
S
gateB
 ředění
gateC
[106 spermií/ml]
L
gateD
 ředění
gateC
[106 leukocytů/ml]
S
L
gateB
gateC
gateD
Integrita akrozomu
1. Do zkumavky napipetujte 50 l naředěných spermií.
2. Přidejte 1 ml PBS.
3. Směs promíchejte a centrifugujte 5 minut při 150 g.
4. Sediment 2x promyjte (opakujte 2. a 3. bod postupu).
5. K sedimentu přidejte 10 l protilátky Intra-acrosomal
protein FITC.
6. Směs promíchejte a inkubujte 20 minut za laboratorní
teploty.
7. Přidejte 0,5 ml PBS, vzorek promíchejte a změřte
průtokovým cytometrem.
představuje počet spermií v ejakulátu
představuje počet leukocytů v ejakulátu
představuje počet událostí v gate B
představuje počet událostí v gate C
představuje počet událostí v gate D
Vitalita spermií
Naměřená data zobrazte v grafické podobě jako forward-scatter
(FSC) versus side-scatter (SSC). V grafu nastavte gate E
ohraničující spermie jak je uvedeno na obrázku 3. Události
z gate E poté zobrazte v histogramu (Obr. 4), kde na ose X je
vynesena intenzita fluorescence propidium jodidu (PE-Cy5
nebo PerCP kanál). Pomocí vhodně umístěného gate oddělte
v histogramu pozitivní a negativní populace spermií. Negativní
populace jsou živé spermie, zatímco pozitivní populace jsou
5/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
mrtvé spermie. Vitalitu spermií spočítejte jako procento živých
spermií z celkového počtu všech spermií.
Integrita akrozomu a přítomnost intra-akrozomálního proteinu
Naměřená data permeabilizovaného a nepermeabilizovaného
vzorku obarveného protilátkou proti intra-akrozomálnímu
proteinu zobrazte v grafické podobě jako forward-scatter (FSC)
versus side-scatter (SSC). V grafu nastavte gate E ohraničující
spermie jak je uvedeno na obrázku 3. Události z gate E poté
zobrazte v histogramu (Obr. 5-7), kde na ose X je vynesena
intenzita fluorescence FITC. Pomocí vhodně umístěného gate
oddělte v histogramu pozitivní a negativní populace spermií.
Nepermeabilizované normální spermie (Obr. 5) vykazují nízké
zastoupení (< 30 %) spermií s poškozeným akrozomem, které
jsou pozitivní po obarvení protilátkou proti intra-akrozomálnímu
proteinu.
Permeabilizované normální spermie (Obr. 6) jsou pozitivní po
obarvení protilátkou proti intra-akrozomálnímu poteinu, což je
důkaz přítomnosti intra-akrozomálnímu proteinu ve spermiích.
Nepermeabilizované patologické spermie (Obr. 7) vykazují
vysoké zastoupení spermií s poškozeným akrozomem
(> 30 %), které jsou pozitivní po obarvení protilátkou proti intraakrozomálnímu proteinu.
14. Očekávané hodnoty
Normální hodnoty dle WHO [1]
Počet spermií v ejakulátu
Počet leukocytů v ejakulátu
Vitalita spermií
Normální hodnoty akrozomu
Integrita akrozomu spermií
Přítomnost intra-akrozomálního
proteinu
> 15×106 /ml
< 1×106 /ml
> 58 %
< 30 % poškozených
> 90 % spermií
15. Omezení metody


Složení komponent soupravy bylo optimalizováno s cílem
dosáhnout nejlepšího poměru specifického signálu k
nespecifickému signálu. Z tohoto důvodu je důležité
dodržovat doporučený poměr objemu reagencie a objemu
vzorku v každém testu.
Průtokový cytometr může poskytovat špatné hodnoty,
pokud není dobře seřízen a udržován.
16. Trademarks
Cy™ a CyDye™ jsou registrovanými značkami společnosti GE
Healthcare.
6/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
SLOVENSKY
prítomnosť tohto proteínu. U spermií s narušenou membránou
je tento proteín dostupný pre protilátku proti IAP a je
detekovaný.
2. Výrobca
Prítomnosť intra-akrozomálneho proteínu
Po narušení či permeabilizácii membrány spermií sa intraakrozomálny proteín (IAP) stáva dostupným pre protilátku proti
IAP a je detekovaný. V prípade, že spermie intra-akrozomálny
proteín (IAP) neobsahujú, nie je po permeabilizácii spermií
protilátkou proti IAP detekovaný.
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz
5. Upozornenie
2. Použitie súpravy


SpermFlowEx® Kit umožňuje vyšetriť v ejakuláte nasledujúce
parametre metódou prietokovej cytometrie:





počet spermií
počet leukocytov
vitalitu spermií
integritu akrozómu spermií
prítomnosť intra-akrozomálneho proteínu v spermiách





Vyšetrenie spermií je vhodné ešte doplniť o meranie
pohyblivosti a analýzu morfológie pomocou svetelného
mikroskopu podľa doporučení WHO [1].
Výrobok je určený len pre výskumné účely.
Prietokový cytometer pravidelne kalibrujte pomocou
fluorescenčných guličiek, aby bola zaistená stabilná
citlivosť detektorov.
Nepoužívajte reagencie po uplynutí doby použiteľnosti.
Nevystavujte reagencie dlhodobému pôsobeniu svetla.
Chráňte obsah vialiek pred kontamináciou.
Nedodržanie odporúčaného postupu analýzy môže
ovplyvniť výsledky testov.
Vzorky ejakulátu sú považované za potenciálne infekčný
materiál, a preto sa s nimi musí náležite zaobchádzať.
Varovanie: reagencia Permeabilizing Solution (ED7079-5)
obsahuje etanol.
3. Úvod
Varovanie
V súčasnej dobe sa uvádza, že až 20 % párov trpí poruchami
plodnosti. Z toho asi u 1/3 je príčina na strane muža.
Neinvazívne vyšetrenie ejakulátu by preto malo patriť medzi
základné metódy slúžiace na vylúčenie alebo potvrdenie
andrologickej príčiny neplodnosti.
H-vety
H226: Horľavá kvapalina a pary.
Vyšetrenie ejakulátu sa najčastejšie realizuje pomocou
svetelného mikroskopu a riadi sa kritériami WHO z roku 2010
[1]. Takéto vyšetrenie je subjektívne a závisí od osobnej
skúsenosti. Pri využití prietokovej cytometrie sa vyšetrenie
objektivizuje, keďže počet nameraných spermií je dostatočne
veľký a detekcia buniek je uskutočnená na základe špecifického
značenia [2]. Významnými parametrami, ktoré ovplyvňujú
schopnosť oplodnenia, sú počet spermií, ich životnosť, integrita
akrozómu a prítomnosť intra-akrozomálneho väzbového
proteínu (IAP) [3]. Akrozóm obsahuje enzýmy hyaluronidázu
a akrozín, ktoré rozložia vonkajšiu membránu vajíčka nazývanú
zona pellucida, čím umožnia prieniku haploidného jadra
spermie do vajíčka. Prítomnosť leukocytov v ejakuláte môže
upozorniť na eventuálny prebiehajúci zápal či infekciu
pohlavného ústrojenstva.
P-vety
P210: Uchovávajte mimo dosahu tepla/iskier/otvoreného
ohňa/horúcich povrchov. Nefajčite.
P260: Nevdychujte prach/dym/plyn/hmlu/pary/aerosóly.
P280: Noste ochranné rukavice/ochranný odev/ochranné
okuliare/ochranu tváre.
P301+P312: PO POŽITÍ: Pri zdravotných problémoch volajte
Národné toxikologické informačné centrum alebo lekára.
P302+P352: PRI KONTAKTE S POKOŽKOU: Umyte veľkým
množstvom vody a mydla.
P305+P351+P338: PRI ZASIAHNUTÍ OČÍ: Opatrne niekoľko
minút oplachujte vodou. Ak používate kontaktné šošovky
a je to možné, odstráňte ich. Pokračujte vo vyplachovaní.
P501: Zneškodnite obsah/nádobu v autorizovanom mieste
zberu nebezpečných odpadov.
4. Princíp
6. Obsah súpravy
Počet spermií a počet leukocytov
Meranie počtu spermií a leukocytov je založené na pridaní
vnútorného štandardu (fluorescenčných guličiek so známou
koncentráciou) k vzorke ejakulátu. Detekcia leukocytov vo
vzorke
je
uskutočnená
pomocou
protilátky
anti-CD45 PE-Cy™5.


Vitalita spermií
Vitalita spermií je meraná pomocou propidium jodidu, ktorý
preniká narušenou membránou mŕtvych buniek a viaže sa na
DNA.


Integrita akrozómu
Meranie integrity akrozómu je založené na detekcii intraakrozomálneho proteínu (IAP), ktorý je prítomný v akrozóme.
Kým nie je akrozóm spermie narušený, nie je možné detekovať

7/11
ED7079-1 Intra-acrosomal protein FITC – 1 fľaštička
obsahujúca 0,5 ml myšacej monoklonovej protilátky proti
intra-akrozomálnemu proteínu, označenej FITC.
ED7079-2 CD45 PE-Cy™5 – fľaštička obsahujúca 0,25 ml
myšacej monoklonovej protilátky proti CD45, označenej
PE-Cy™5.
ED7079-3 Fluorescent Count Standard – 1 fľaštička
obsahujúca 2 ml fluorescenčných guličiek,
1×106 častíc/ml.
ED7079-4 Propidium Iodide – 1 fľaštička obsahujúca
0,25 ml roztoku propídium jodidu.
ED7079-5 Permeabilizing Solution – 1 fľaštička
obsahujúca 25 ml roztoku.
ED7079_EN_CZ_SK_151222
7. Skladovanie súpravy
Prítomnosť intra-akrozomálneho proteínu
1.
Do skúmavky napipetujte 50 l nariedených spermií.
2.
Pridajte 1 ml Permeabilizing Solution, ktoré bolo
predtým vytemperované na laboratórnu teplotu
(20-25 ºC).
3.
Zmes premiešajte a inkubujte 15 minút pri laboratórnej
teplote.
4.
Zmes centrifugujte 5 minút pri 150 g.
5.
K sedimentu pridajte 1 ml PBS a centrifugujte 5 minút
pri 150 g.
6.
Sediment 2x premyte (2x opakujte 5. bod postupu).
7.
K sedimentu pridajte 10 l protilátky Intra-acrosomal
protein FITC.
8.
Zmes premiešajte a inkubujte 20 minút pri laboratórnej
teplote.
9.
Pridajte 0,5 ml PBS, vzorky premiešajte a analyzujte
prietokovým cytometrom.
SpermFlowEx® Kit skladujte pri teplote 2-8 °C. Doba
použiteľnosti je vyznačená na jednotlivých reagenciách a na
krabici súpravy.
8. Zmeny kvality produktu
V prípade pozorovania akéhokoľvek zhoršenia vlastností
produktu, prosím, okamžite informujte výrobcu prostredníctvom
e-mailovej adresy: [email protected]
9. Potrebné vybavenie a materiál, ktorý sa
nedodáva







Vhodné 5ml skúmavky na značenie buniek
(napr. 12 × 75 mm)
Pufer PBS
Sada automatických pipiet s jednorazovými špičkami
Vortex
Svetelný mikroskop
Centrifúga s rotorom pre skúmavky
Prietokový cytometer - excitácia modrým laserom 488 nm
a vhodné emisné filtre.
12. Analýza prietokovým cytometrom
Označené vzorky analyzujte prietokovým cytometrom
vybaveným excitačným laserom 488 nm a vhodnými filtrami.
10. Testovaná vzorka
Fluorescencia vnútorného štandardu (Fluorescent Count
Standard), rovnako ako značenej protilátky proti intraakrozomálnemu proteínu je detekovaná detektorom pre FITC.
Fluorescencia propídium jodidu (FL1) a fluorescenčnej značky
PE-Cy™5 je detekovaná detektorom pre PC5 alebo PerCP.
Vzorky ejakulátu spracujte do 8 hodín od odberu. Pred
meraním skladujte vzorky pri laboratórnej teplote.
13. Vyhodnotenie testu
Počet spermií a počet leukocytov
Namerané dáta zobrazte v grafickej podobe tak, aby na osi X
bola intenzita fluorescencie FITC a na osi Y forward-scatter
(FSC) (Obr. 1). V grafe nastavte regióny (gate) ako sa uvádza
na obrázku 1. Región A ohraničuje populáciu všetkých buniek,
región B ohraničuje spermie a región C vnútorný štandard
(fluorescenčné guličky). Leukocyty v ejakuláte zobrazíte
vynesením buniek z regiónu A do dot-plotu (Obr. 2), kde na osi
X je intenzita fluorescencie PE-Cy™5 a na osi Y side-scatter
(SSC). Populáciu leukocytov, ktorá je označená protilátkou
CD45 PE-Cy™5, ohraničte pomocou regiónu D. Počet spermií
a leukocytov v ejakuláte vypočítajte podľa nasledujúcich
vzorcov:
11. Postup testu
Vzorku ejakulátu orientačne skontrolujte pod svetelným
mikroskopom a podľa počtu spermií (veľký počet alebo malý
počet) narieďte buď 1:9 alebo 1:1 do PBS..
Počet spermií a počet leukocytov
1.
Do skúmavky napipetujte 50 l nariedených spermií.
2.
Pridajte 10 l CD45 PE-Cy™5 reagencie.
3.
Zmes premiešajte a inkubujte 20 minút pri laboratórnej
teplote.
4.
K vzorke pridajte 50 l Fluorescent Count Standard
(najskôr si odkvapkajte potrebné množstvo dobre
premiešaného štandardu z kvapkadla do mikroskúmavky
a potom pipetujte presné množstvo k vzorke spermií).
5.
Pridajte 0,5 ml PBS, vzorku premiešajte a analyzujte
prietokovým cytometrom.
Vitalita spermií
1.
Do skúmavky napipetujte 50 l nariedených spermií.
2.
Pridajte 10 l roztoku Propidium Iodide.
3.
Zmes premiešajte a inkubujte 20 minút pri laboratórnej
teplote.
4.
Pridajte 0,5 ml PBS, vzorku premiešajte a analyzujte
prietokovým cytometrom.
S
regiónB
6
 riedenie [10 spermií/ml]
regiónC
L
regiónD
6
 riedenie [10 leukocytov/ml]
regiónC
S
L
región B
región C
región D
Integrita akrozómu
1.
Do skúmavky napipetujte 50 l nariedených spermií.
2.
Pridajte 1 ml PBS.
3.
Zmes premiešajte a centrifugujte 5 minút pri 150 g.
4.
Sediment 2x premyte (opakujte 2. a 3. bod postupu).
5.
K sedimentu pridajte 10 l protilátky Intra-acrosomal
protein FITC.
6.
Zmes premiešajte a inkubujte 20 minút pri laboratórnej
teplote.
7.
Pridajte 0,5 ml PBS, vzorku premiešajte a analyzujte
prietokovým cytometrom.
predstavuje počet spermií v ejakuláte
predstavuje počet leukocytov v ejakuláte
predstavuje počet udalostí v gate B
predstavuje počet udalostí v gate C
predstavuje počet udalostí v gate D
Vitalita spermií
Namerané dáta zobrazte v grafickej podobe ako forward-scatter
(FSC) proti side-scatter (SSC). V grafe nastavte región E
ohraničujúci spermie ako sa uvádza na obrázku 3. Udalosti
z regiónu E potom zobrazte ako histogram (Obr. 4), kde na osi
X je vynesená intenzita fluorescencie propidium jodidu (PI).
Pomocou vhodne umiestneného regiónu oddeľte v histograme
pozitívne od negatívnych populácií spermií. Negatívne
populácie sú živé spermie, PI-pozitívne populácie sú mŕtve
8/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
spermie. Vitalitu spermií spočítajte ako percento živých spermií
z celkového počtu všetkých spermií.
Integrita akrozómu a prítomnosť intra-akrozomálneho proteínu
Namerané dáta permeabilizovaného a nepermeabilizovaného
vzorku označeného protilátkou proti intra-akrozomálnemu
proteínu zobrazte v grafickej podobe forward-scatter (FSC) proti
side-scatter (SSC). V grafe nastavte región E ohraničujúci
spermie ako sa uvádza na obrázku 3. Udalosti z regiónu E
potom zobrazte ako histogram (Obr. 5-7), kde na osi X je
vynesená intenzita fluorescencie FITC. Pomocou vhodne
umiestneného regiónu oddeľte v histograme pozitívne od
negatívnych populácií spermií.
Nepermeabilizované normálne spermie (Obr. 5) vykazujú nízke
zastúpenie (< 30 %) spermií s poškodeným akrozómom, ktoré
sú pozitívne po ofarbení protilátkou proti intra-akrozomálnemu
proteínu.
Permeabilizované normálne spermie (Obr. 6) vykazujú pozitivitu
po ofarbení protilátkou proti intra-akrozomálnemu proteínu, čo
je dôkaz prítomnosti intra-akrozomálneho proteínu v spermiách.
Nepermeabilizované patologické spermie (Obr. 7) vykazujú
vysoké zastúpenie spermií s poškodeným akrozómom
(> 30 %), ktoré sú pozitívne po ofarbení protilátkou proti intraakrozomálnemu proteínu.
14. Očakávané hodnoty
Normálne hodnoty podľa WHO [1]
Počet spermií v ejakuláte
Počet leukocytov v ejakuláte
Vitalita spermií
Normálne hodnoty akrozómu
Integrita akrozómu spermií
Prítomnosť intra-akrozomálneho
proteínu
> 15×106 /ml
< 1×106 /ml
> 58 %
< 30 % poškodených
> 90 % spermií
15. Obmedzenia metódy


Zloženie komponent súpravy bolo optimalizované
s cieľom dosiahnuť čo najlepší pomer špecifického signálu
k nešpecifickému signálu. Z tohto dôvodu je dôležité
dodržiavať odporúčaný pomer objemu reagencie
a objemu vzorky v každom teste.
Prietokový cytometer môže poskytovať nepresné hodnoty,
ak nie je pravidelne kalibrovaný a udržiavaný.
16. Trademarks
Cy™ a CyDye™ sú registrované značky spoločnosti GE
Healthcare.
9/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
ENGLISH / ČESKY / SLOVENSKY
17. Example of data analysis / Vzorové
vyhodnocení / Vzorové vyhodnotenie
Fig. 1 Measurement of sperm count in semen
Obr. 1 Měření počtu spermií v ejakulátu
Obr. 1 Meranie počtu spermií v ejakuláte
Fig. 5 Non-permeabilized, non-pathological sperms
Obr. 5 Nepermeabilizované normální spermie
Obr. 5 Nepermeabilizované normálne spermie
Fig. 2 Measurement of leukocyte count in semen
Obr. 2 Měření počtu leukocytů v ejakulátu
Obr. 2 Meranie počtu leukocytov v ejakuláte
Fig. 6 Permeabilized, non-pathological sperms
Obr. 6 Permeabilizované normální spermie
Obr. 6 Permeabilizované normálne spermie
Fig. 3 Sperm gating
Obr. 3 Ohraničení spermií
Obr. 3 Ohraničenie spermií
Fig. 7 Non-permeabilized pathological sperms
Obr. 7 Nepermeabilizované patologické spermie
Obr. 7 Nepermeabilizované patologické spermie
Fig. 4 Measurement of sperm viability
Obr. 4 Měření vitality spermií
Obr. 4 Meranie vitality spermií
10/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222
18. References / Literatura / Literatúra
[1] WHO laboratory manual for the Examination and processing
of human semen. World Health Organization, 5th edition, 2010
[2] Gilan L, Evans G, Maxwell WM (2005) Flow cytometric
evaluation of sperm parameters in relation to fertility potential.
Theriogendogy. 63: 445-57
[3] Peknicova J, Chladek D, Hozak P (2005) Monoclonal
antibodies against sperm intra-acrosomal antigens as markers
for male infertility diagnostics and estimation of
spermatogenesis. Am J Reprod Immunol. 53(1): 42-9
[4] Leukocyte Typing IV., Knapp W. et al. (Eds.), Oxford
University Press (1989).
19. Explanation of symbols / Vysvětlení symbolů
/ Vysvetlenie symbolov
11/11
ED7079_EN_CZ_SK_151222