Softwarové hodnocení poškození DNA kometovým

Softwarové hodnocení poškození DNA kometovým testem u poruch reprodukce
http://botanika.biologija.org/exp/comet/Comet-principles.pdf
P. Houska¹, B. Novotná², J. Diblík 1, M. Macek1
¹Ústav biologie a lékařské genetiky FN Motol, ²Ústav experimentální medicíny AVČR, v.v.i.
ÚVOD
leukocyty
Nestabilita DNA spermií byla identifikována jako jedna
z příčin dosud nevysvětlených poruch plodnosti u muže
[1].
Jednou z metod používaných při vyšetření integrity DNA
je kometový test (Comet Assay = CA) [2]. Klíčovou
součástí testu je softwarová (SW) analýza obrazu
zajišťující objektivní kvantifikaci rozsahu poškozené DNA
na úrovni jednotlivých buněk.
Výběr
3 nekomerčních a 4
hodnocení CA z údajů dostupných na internetu a
v odborné literatuře a kompatibilních s programovým
vybavením PC. Do hodnocení přiřazena i starší verze
programu Lucia pro srovnání vývoje SW v časové ose.
head tail
Analýza
buněk s různým stupněm poškození DNA
(materiál: spermie dobrovolného dárce) pomocí všech
vybraných programů. Bodové ohodnocení jednotlivých
programů (0-100 bodů) z hlediska programového
vybavení (import/export dat aj. - max 20b), obrazové
analýzy (měření pozadí, thresholding, informace
poskytované v průběhu měření aj. - max 60b) a
uživatelského rozhraní (komfort, automatizace aj. - max
20b) [3].
cíl práce
Srovnání dostupných programů pro SW hodnocení
kometového testu a výběr nejvhodnějšího z nich pro
klinické účely.
POSTUP ŘEŠENÍ
komerčních SW pro
Ověření nezávislosti
spermie
měření na použitém vybavení
(Olympus Vanox BHS + kamera Vosskühler CCD1300 a Zeiss AxioPlan2 + kamera AxioCam HR)
pomocí dvou nejlépe ohodnocených programů
(materiál: plná heparinizovaná krev dobrovolného
dárce). Stat. analýza: Kruskall-Wallisův test.
Porovnání
obou programů hodnocením buněk na
sytému Zeiss. Materiál: (a) plná heparinizovaná krev
dobrovolného dárce a (b) leukocyty izolované z
heparinizované krve dobrovolného dárce na gradientu
FicollPaque PLUS. Měřený parametr: Tail DNA (%), tj.
procento fragmentované DNA z celkového množství
DNA v jádře. Stat. analýza: Wilcoxonův párový test.
VÝSLEDKY
Srovnání různých sestav na snímání objektů
Srovnání testovaných programů
90
SW zpracování
obrazová analýza
*
60
uživatelské rozhraní
Srovnání Lucia 6 a CASP
30
80
60
50
40
30
Tail DNA (%)
Tail DNA (%)
počet bodů
70
40
20
20
10
***
***
20
10
0
0
CometScore
CellProfiler
Lucia 4
Komet 6
Lucia 6
(LIM) Comet Assay 4 (Andor) CometImager (LIM)
(Perceptive)
(MetaSystems)
- nekomerční programy
Z testovaných programů byly nejlépe ohodnoceny nekomerční CASP a
komerční Lucia 6.
Z hlediska dostupnosti vybavení je Lucia 6 univerzálnější vzhledem k
jednoduchému ovládání. Složitější nastavení obrazové analýzy u CASPu
může vést k různým výsledkům na různých uživatelských sestavách.
CASP
0
Olympus
CASP
“+” - aritmetický průměr;
Zeiss
Lucia 6
1/1
Olympus
Lucia 4
*p< 0,05
1/2
1/3 1/4
2/1
2/2
2/3
2/4
CASP
3/1
3/2
3/3 3/4
3/5
3/6
3/7
3/8
Lucia 6
*** p<0,001
ZÁVĚRY
Podrobné srovnání CASP a Lucia 6 v rámci téže sestavy
neprokázalo zásadní rozdíly ve výsledcích získaných
těmito programy. Pouze v případě preparátů s
nerovnoměrným pozadím má Lucia 6 tendenci podhodnocovat
měřené hodnoty.
CASP není závislý na používaném operačním systému, je dostupný zdarma
i se zdrojovým kódem [4] a umožňuje hodnotit preparáty i s nerovnoměrným
pozadím.
Naproti tomu Lucia 6 poskytuje možnost přímého ovládání mikroskopů zn.
Nikon a dokáže měřit více buněk najednou.
Reference:
[1]
[2]
N. Tarozzi, D. Bizzaro, C. Flamigni, and A. Borini, “Clinical relevance of sperm DNA damage in assisted reproduction,” Reproductive Biomedicine Online, vol. 14,
Jun. 2007, pp. 746-757.
J.S. Bus, L.G. Costa, E. Hodgson, D.A. Lawrence, and D.J. Reed, “Current Protocols in Toxicology,” Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2001.
[email protected]
[3]
[4]
B. Vilhar, “Help There is a comet in my computer,” 2004. http://botanika.biologija.org/exp/comet/Comet-principles.pdf (9.2.2009)
K. Końca, A. Lankoff, A. Banasik, H. Lisowska, T. Kuszewski, S. Góźdź, Z. Koza, and A. Wojcik, “A cross-platform public domain PC image-analysis program for
the comet assay,” Mutation Research, vol. 534, Jan. 2003, pp. 15-20.
Podpořeno MZ0FNM2005 a AVOZ 50390512.