Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Transkript

Identifikace proteinů v proteomice
Identifikace proteinů
Molekulovou hmotnost nativního proteinu separovaného ELFO
lze potvrdit hmotovou spektroskopií MALDI TOF, ESI TOF.
Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.
Sekvenční analýza se provádí způsoby:
1.Edmanovou degradací (přímé sekvencování) a 2. hmotovou
spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, „de
novo“ sekvencování).
) V obou p
případech
p
pak na základě
p
získaných sekvencí následuje hledání v databázích proteinů
Pro přímé
P
ří é sekvencování
k
á í je
j nutný
ý blotting
bl i
nativního
i íh proteinu
i
nebo jeho peptidových fragmentů (připravených in-solution
štěpením a následně separovaných ELFO Schäger/von Jagow)
na PVDF membránu. Po obarvení membrány amidočerní 10B
se vyříznou příslušné pásy (1D) nebo skvrny (2D) a fragmenty
membrány se vloží do reakční cely proteinového sekvenátoru.
sekvenátoru
„Fingerprint“
DIGE
Diferenční 2D elektroforéza
 Proteinové mapy
 (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE
spektra)
 Peptidové mapy
 (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE
spektra, MS spektra)
 Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků –
„otisky
otisky prstů“ pro každý např.
např buněčný proteom
nebo pro každý protein
Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s
konkrétním onemocněním a zdraví pacienti).
Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.
Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců
Edmanovo odbourávání
Po odštěpení PTC
PTC--derivátu následuje jeho analýza (zjištění
retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm.
Běžně je takto možné získat 30 - 40 aminokyselin z N
N-konce,
konce,
samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za
ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin.
V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např.
y Applied
pp
Biosystems,
y
Shimadzu)) jje analyzovaný
y
ýp
protein či
firmy
peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken
(kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF
(ProSorb patrony nebo po blottingu).
blottingu)
Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné
ffázi.
i Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí
č
30
30--60 min.
min Je
třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run.
Pro analýzu Edmanovou degradací jsou nutná množství
vzorku 2020-50 pmol,
pmol nejlépe však 200 pmol, konkurenční MS
nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS), dosud však není
tolik rozšířená.
ro šířená
Podmínkou pro úspěšnou sekvenční analýzu Edmanovou
cestou je volný N-konec peptidu či proteinu.
proteinu
Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace,
acetylace,
pyroglutamová kyselina).
kyselina Nevýhodou i výskyt glykosylačních
míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu.
cyklu
Automatizace
Hmotnostní spektrometrie (mass spectometry, MS)
MS)
Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS
 Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m
(m) a náboje (z
(z) s
využitím elektrického a magnetického pole.
 Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti
náboje
j umožňuje
j určit molekulovou hmotnost.
 Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu,
poměr m/z může být stanoven s přesností 10
10-4.
4
 Původně aplikována pro malé těkavé látky, či derivatizované netěkavé
látk (i
látky
(ionizace
i
paprskem
k
elektronů
l kt ů - EI,
EI chemická
h i ká ionizace
i i
s nosným
ý
plynem).
 S objevem šetrnějších technik ionizace (ESI, MALDI) je možné
měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy,
polysacharidy).
y
y)
Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)
Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice
Metoda MALDI MS (od 1988)
1988) je rozšířeným nástrojem pro
separaci přírodních látek
látek, peptidů,
peptidů proteinů a dalších biobiomakromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy)
lipidy)..
Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici
(kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5dihydroxybenzoová.
Vzorek (1 mg/mL) se nanese v 0.5 l na nerezovou destičku a
nechá se vysušit.
vysušit Pak se aplikuje 0.5
0 5 l matrice a opět se nechá
vysušit. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový
p
paprsek
p se („
(„fire“),
(„fire“)
e ),
) transfer
s e eenergie
e g e způsobí
působ ionizaci.
o
c.S
Směrovaný
ě ov ý
energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního
analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity.
SELDI – surface enhanced laser desorption
desorption/ionisation
/ionisation
array chip
hmotová spektrometrie
výhody
jednoduchost
rychlost
hl t
selektivita
nevýhody
nízká citlivost
nízká přesnost urč. m/z
nízké rozlišení
Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS
MS je často propojena s jinými analytickými technikami
technikami:
ať už separačními nebo bez separace. Vznikají tak systémy GCMS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS.
K
Kromě
ě tandemové
t d
é MS (MS-MS)
(MS MS) mohou
h být spojeny
j
ažž tři i více
í
analyzátorů („multiple“ MS). První vybírá studované látky ze
směsi, druhý je fragmentuje, třetí analyzuje vzniklé fragmenty. Pro
identifikaci látek ve složitých směsích; nikoli na základě m/z, ale
podle fragmentačních obrazů („patterns“).
Ve spojení s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s
vysokým rozlišením.
rozlišením Taková on-line
on line analýza pak dává okamžité
výsledky na rozdíl od off-line detekce. Klíčové je propojení
přístrojů. LC
LC-MS
MS v biochemii pro peptidy a proteiny, GC
GC-MS
MS pro
těkavé LMW látky, CE-MS široký záběr od LMW po proteiny,
DNA, viry etc.
vyříznout proužek
rozřezat
omýt
Příprava
(redukce)
(alkylace)
štěpení proteasou
rozvolnění
l ě í S-S
S S vazeb
b
DTT, dithiothreitol
IAA, jódoctová kys.
2 5 kD
2,5
3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD)
2. Separace peptidů chromatografií (HPLC)
m/z
UVabs
4. MS/MS spektrum
d lší
další
fragmentace
Time (min)
m/z
5 Určení části sekvence .. M G A D D H D K L ..
5.
6. Srovnávání s databázemi, identifikace
vzorku
proč redukce a alkylace?
KONTAMINACE! – keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna)
– detergenty
d
(SDS
(SDS, T
Triton
i
atp.))
3. MS vybraného štěpu
protein II (16 kD)
Hledáním v databázi je pak proteinový vzorek identifikován,
nebo se zjistí, že jde o protein, který dosud v databázi není.
není.
trypsin
denaturace > lepší proteolýza
ochrana oxidovaných reziduí Cys
agresivní proteasa
vysoká
ká primární
i á í specificita,
ifi it
nízká sekundární
prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kDa
štěpí:
arginyl-X, lysyl-X; ale ne
X=prolyl
1. Štěpení proteinu trypsinem
Předpodkladem pro vyhledávání jsou naměřené přesné m/z
hodnoty peptidových fragmentů, použítí specifické proteasy a
přesná m/z intaktního p
p
proteinu.
Pro štěpení se používají endoproteasy
endoproteasy, tedy proteolytické
enzymy, které
k é štěpí
š ě í uvnitř
i ř proteinové
i é molekuly.
l k l Důraz
ů
se klade
kl d
na specifitu použité proteasy, používají se proto vysoce
specifické enzymy,
enzymy jako je trypsin z hovězího či vepřového
pankreatu (EC 3.4.21.4) nebo Lys C proteasa z Bacillus
licheniformis ((EC 3.4.21.50).
) Trypsin
yp štěpí
p za bazickými
ý zbytky
y y
Arg a Lys, proteasa Lys C za zbytkem Lysinu. Podobně Glu C
proteasa ze Staphylococcus aureus V8 (EC 3.4.21.19) štěpí za
Gl Specificky
Glu.
S ifi k lze
l štěpit
š ě i chemicky
h i k použitím
ži í CNBr.
CNB
Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting”
Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS
štěpení
p
proteázou
p
((trypsinem)
yp
)
protein I (12 kD)
DNA (i EST), proteinová databáze
2 fragmenty (4 kD, 8 kD)
protein II (16 kD)
generování teoretických trypsinových
štěpů ze známých či předpokládaných
proteinových
i
ý h sekvencí
k
í
masses (m/z)
940.421 - ELSDIAR
1093.477 - QLLLTADDR
1341.556 - PHSHPALTPEQK
1469.633 - PHSHPALTPEQKK
1488.645 - GILAADESTGSIAKR
1646.650 - LQSIGTENTEWENRR
2122 975 - IGENHTPSALAIMENANVLAR
2122.975
2241.903 - YTPSGQAGAAASESLFISNHAY
MALDI ToF
protein I
4000
8000
m/z
8000
m/z
protein a: 3
3, 5,
5 9,
9 12 kD
protein b: 2, 7, 9 kD
protein c: 4, 8 kD
protein d: 3, 9, 12 kD
protein e: 2, 6, 8 kD
protein II
2000
6000
Srovnání experimentálně stanovených
velikostí peptidů s teoretickými štěpy
Bioinformatika pro MS
oorganismy
ga s y se se
sekvenovaným
ve ova ý ge
genomem
o e
PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů
(i silico
(in
ili digest)
di
) s experimentálními
i
ál í i
PC programy
p g
y MASCOT ((firma Matrixscience),
), SEQUEST,
Q
,
ProteinProspector
organismy s nesekvenovaným
ne
genomem
hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí
MS BLAST
BLAST:: MS driven Best Local Alignment Search Tool
MultiTag
ulti ag (S. Sunyaev
Su yaev et al.,
al., Anal.
a.C
Chem.
e . 2003,
003, in ppress)
press
ess)
ess)
Charakterizace koko- a posttranslačních modifikací
v proteinech s použitím MS
fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace
Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce a modulaci
funkcí p
proteinů. Př. fosforylace
y
- p
přenos signálu
g
v buňce,,
glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické
vlastnosti proteinů.
Výhoda MALDI MS analýzy v tomto případě spočívá ve velké
přesnosti určení molekulové hmotnosti,
hmotnosti citlivosti a rozlišení.
rozlišení
Typický protokol pro analýzu proteinové modifikace začíná
p
vzorku,, enzymobe
y
modifikaci. Pak se analyzuje
y j rozdíl
štěpením
v molekulové hmotnosti určitého peptidu spočítané na
základě sekvence a odečtené z MS spektra
spektra.. Pro složitost
některých
ěk ý h směsí
ě í je
j výhodnější
ýh d ější použít
ží MALDI PSD MS/MS nebo
b
LC MS.
MALDI MS p
pro studium vyšší
y struktury
y proteinů
p
Studium prostorové struktury proteinů (zvl. terciární a kvarterní)
má význam z důvodu těsného vztahu struktura - funkce.
funkce Poznání
struktury tedy může poskytnout informace o funkci proteinu.
Pro studium struktury proteinů se běžně používá řada spektro
spektro-skopických metod (Krystalografie - difrakce paprsků X, NMR
spektroskopie a další). Dávají poměrně jasné výsledky, ale jejich
nevýhodou může být zejména časová náročnost a nároky na vyšší
množství materiálu.
materiálu Poskytují rovněž značná množství dat,
dat
jejichž vyhodnocování je opět náročné.
Technikou MS je možné studovat například přístupnost určitých
povrchových regionů proteinů s použiím metody zvané protein
mass fingerprinting (PMF).
Ověření účinnosti separace,
čistoty a charakterizace
produktů
Purifikace biopolymerů
 Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství)
 Vstupní podmínky:
 Nároky na čistotu:
Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich
charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní
chromatografie, hydrofobní)
Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí
elektroforézy
Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost,
nabohacení)
 srážení, vysolování – na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká
((> 1mg/ml)
g )
 IEC – separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace),
zakoncentrování? (objem eluentu), optimalizace podmínek separace,
kapacita kolon přiměřená
přiměřená, relativně levná
 GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze
(equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci
produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita
kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování
 HIC – metoda silně závislá na experimentálních podmínkách,
optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku
pouze 1 – 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená
 AC (IAC) – vysoce
soce specifická metoda
metoda, vysoká
soká kapacita
kapacita, sniž
snižuje
je počt
počty
separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony
dostupnost materiálu,
typ vstupního materiálu
stabilita produktu
nároky na čistotu
terapeutické účely (>
(> 99%)
farmaceutický průmysl
diagnostické testy (20 – 90%)
výzkum, katalýza reakcí
potravinářství
kosmetický průmysl (70 – 90%)
ultračisté
lt či té analytické
l ti ké standardy
t d d (95 – 99%)
 Počet purifikačních kroků:
minimali ace ztrát,
minimalizace
trát časová
časo á a finanční náročnost by
b měla
odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost
automatizace
Řazení separačních kroků
 techniky s vysokou kapacitou → techniky s nízkou kapacitou
 za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj,
povrchové vlastnosti apod
apod.))
 produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další
(po
(p vysolování
y
nejde
j IEC bez GPC))
(IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze)
 předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů
 vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)
Podmínky kolonové separace
Kontrola stupně purifikace
 typ náplně (bobtnání, stabilita, chemická inertnost),
parametry kolony,
kolony (s rostoucím průměrem a klesající délkou
kolony klesá rozlišení, u LPLC vliv difúze na rozmývání zón)
 zapojení kolon v sérii
 recyklace vzorku
 rychlost průtoku (flow rate, s rostoucí rychlostí roste rozmývání zón
x čas, stabilita produktu x NK)
 pracovní tlak, teplota
 ekvilibrace náplně
 min. mrtvé objemy
 objem nanášeného vzorku (flow adaptor)
 regenerace kolony
kolon
 skladování, konzervace, sterilizace




Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty

2 parametry – výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik
balastu se odstranilo)


výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy)
vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin

kritéria čistoty – homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC
neznamená vždy homogenitu) – ověřit si různými metodami
u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita,
přítomnost izoforem (pI), pozor na proteázy

 hodnocení homogenity
1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě
nasycení roztoku)
2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky)
3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas)
4. SDS
SDS--PAGE a další elektroforetické metodyy
5. Imunochemické metody
prvotní
průběžná (tzv
(tzv. postupná eliminace)
finální včetně strukturní charakterizace produktu
celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost,
stupeň obohacení (koncentrace)
 Požadavky na čistotu
podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované)
Technické – frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou
Purifikované – vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za
sebou
Vysoce purifikované – vysoká cena
cena, výzkum – strukturní studie
studie, klinická
diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ)
Koncentrace produktů a jejich konečná úprava
 zakoncentrování přečištěného produktu
 odpařováním (x stabilita)
 mrazová sublimace (lyofilizace) – hygroskopický prášek
(sole ∆pH,
(sole,
∆pH organická rozpouštědla) – denaturace,
denaturace
fragmentace
 precipitace a resolubilizace
 ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha)
 krystalizace (náročné,
(náročné zdlouhavé)
SDS--PAGE
SDS
Charakterizace produktů
molekulová hmotnost celé molekuly,
molekuly dílčích podjednotek
(SDS--PAGE, SEC)
(SDS
• tvar a Mr – ultracentrifugace
• izoelektrický bod pI - IEF
• spektrální vlastnosti (UV
(UV--VIS, cirkulární dichroismus, NMR
spektroskopie
• analýza primární struktury, sekvence monomerů
• peptidové mapování s MS analýzou
• rentgenostrukturní analýza
•
Prokázání identityy
 reakcí se specifickou Ab imunoblot
 uvolnit elektroelucí a následně
MS analýzu
Eluo
ované pro
oteiny
Nenav
vázané prroteiny
Stan
ndardy
Půvo
odní vzorrek
Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě
Sledování čistoty proteinů
 Elektroforéza dokumentuje
průběh purifikačního procesu
 Při použití standardů o známé
molekulové hmotnosti je možno
zhruba
h b stanovit
t
it molekulovou
l k l
hmotnost izolovaného proteinu
(SDS elektroforézou)
 metoda pro sledování čistoty produktu – průběžné,
konečné
 citlivost metody – μg až ng! podle typu vizualizace
 vizualizace všech,
všech i kontaminujících složek
 široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu
gelu nejlépe gradientové gely
gelu,
 detekce kontaminace NML problematická
 průkaz
ů
produktu ve směsi (Mr, standard)
 průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot)
 kvantifikace (denzitometricky) omezená
 možnost následné MS analýzy
ý y „„bandů“
Izolace IgG1 - hyperimunní sérum
Porozita gelu a Mr separovaných látek
Afinitní chromatografie
MPC
MPC-protein
t i A
10% gel SDS-PAGE
barveno Coomasie Blue
Mr
Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu
Homogenát
Frakční
vysolování
1
2
Iontoměničová Molekulové síto
chromatografie (gelová filtrace)
3
4
Afinitní
chromatografie
5
serum
E1
E2
Mr
Purifikace
u
ace trypsinu
t yps u na
a koloně
o o ě s pp-a
aminobenzamidinem
obe a d e
Detekce konkrétního proteinu
Western blot s imunochemickou detekcí
Identifikace antianti-CA I protilátek izolovaných afinitní
chromatografií
Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE)
transfer
f proteinů
i ů z gelu
l na membránu
bá
= Western blot
detekce proteinu protilátkou
(k
(komplexu
l
primární
i á í a sekundární
k dá í protilátky)
tilátk )
vizualizace pomocí barevné reakce
nebo chemiluminiscence
W. blot
Sekundární protilátky konjugované
s enzymem či flfluorescenční
č í značkou
čk
Primární
protilátka
membrána s navázanými proteiny
Hodnocení čistoty výchozího materiálu před
enzymovou fragmentací
Porovnání Laemmli versus Schäger/von Jagow
- separace trypsinů -
Tris–Tricine–SDS-PAGE: gel—16,5% T, 3% C
((MW 1–70 kDa),
), detection with silver staining,
g,
positions: (1) non-digested native CA I, (2)
non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I
digested
g
3 h by
y immobilized trypsin,
y
((4))
molecular marker (10–250 kDa)
Zleva standardy 29,
29 45,
45 66,
66 97,
97 116 a 200 kDa; hovězí trypsin;
vepřový trypsin; cytochrom c (12 kDa); standardy, hovězí trypsin;
vepřový trypsin; křenová peroxidasa (40 kDa). Proteiny
naneseny po 7 mg.
mg
Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické
barvení ProQ Diamond II
Tris--Tricine
Tris
Tricine--SDS
SDS--PAGEPAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting
M1
1
2
3
4
5
6
7
8 9 10
APP alfa
1-37
1-38
1-39
1-40
1-42
Abeta
standards
Čísla udávají množství proteinu v mg/band
D il í í k l b
Detailní snímek gelu barveného 180 minut a odbarvovaného přes noc
éh 180 i
db
éh ř
Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio‐Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm
Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu
Original CSF
Eluting fraction
Lane 1, 2 and 10: synthetic
y
Abeta Standard mix 1-37,, 1-38,, 1-39,, 1-40,, 1-42
Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice
Lane 4: Original sample (CSF UPCE)
Lane 5: Eluting fraction IP 1
g fraction IP 1 (1:4
(
Lane 6: Eluting
diluted))
Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted)
Western blot, University of Duisburg (Hermann)
Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted)
HA štěpená Hyaluronidázou v čase
Z Bílk
Z.
Bílková
á et al.,
l Proteomics
P
i 5, 639 – 647, 2005
200
4
SDS-PAGE
5
6
4
7
5
6
25 kDa
Eluce pH 3
6
37 kDa
Myelinový bazický
protein !! (MS analýza)
PAAG gely reprezentují eluční
frakce z imunosorbentu
Ademtech 5B2 Ab.
7
5 4
25 kDa
Eluce pH 2,5
25
2 1
PrP
Imunoblot
37 kDa
25 kDa
a
PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr pH 8,4. Separace 20 min při
125 V a 20 mA/1 gel a potom do konce 200 V a 40 mA/1 gel
7
37 kDa
b
Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2
Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-PrPHRP 3F4 (imunoblot).
HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů





Gelová permeační chromatografie
Iontově výměnná chromatografie
Hydrofóbní interakční chromatografie
R
Reverzní
í HPLC
Gelová permeační chromatografie v HPLC módu
 Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní)
 Semirigidní nosič PS
 Modifikované povrchy – biokompatibilita
(Silikagel modif. hydrofilním polymerem)
 Částice 5 – 10 µm, sférické
 Částice s uniformní porozitou
 Průtoky do 0,5 ml
 Teplota 4°C – 37°C
HPLC – analytické uspořádání
Preparativní
Analytické
 Částice 5 – 10 µm
Č
1,8 – 3,5 µm
• Částice
 Kolona 30,0 – 21,2 mm x 250
mm
• Kolona 2,5 – 4,6 mm x 150 –
250 mm
 (semiprep. 7,8 mm)
• Průtoky 10ky µl/min
 Průtoky 10tky ml/min
Obj
vzorku
k µll
• Objem
 Objem vzorku ml
• Kapacita kolony - µg
 Kapacita kolony – mg
• Předkolona
 Recyklace vzorku
• Monolitické kolony
 Sériové řazení kolon
• Kapilární kolony
 Předkolona
• Nano-HPLC
Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu
První typ v HP módu (HPIEC)
Silikagelové ionexové pryskyřice
Nové materiályy - PS-DVB, alumina, PES-PA
Pelikulární hydrofilní polymery
Odolnost vůči tlaku
Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40%
hydratace)
 Anal. uspoř. – částice 5 – 10 µm, menší stupeň
hydratace (10
( – 20%)
%)
 Separace x eluce – pH a iontová síla mob. fáze






RP--HPLC
RP
RP--HPLC
RP
 Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů
 podmínky,
podmínk kdy
kd nedochází
nedochá í k denaturaci
denat raci
 Závislost retence peptidů na malé změně obsahu
organického modifikátoru
 Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými
řetězci – endcapping,
endcapping omezená chemická stabilita!
 Polymerní kolony PS-DVB – pH 2 – 12
 Zirkoniové – výborná chemická a tepelná stabilita
 Monolitické materiály
 Částice 5 – 8 µm (lze až 40 µm)
 Velikost p
pórů 90 Å 300 Å 4000 Å
 Detekce UV-VIS
(205 nm,
nm 215 nm,
nm 252 nm,
nm 280 nm)
 Průtoky do 1 ml/min
 Teplota
 Stacionární fáze – pro silně hydrofobní – C4, C5
pro hydrofilní peptidy – C8,
C8 C18
 Organický modifikátor – acetonitril, metanol,
isopropanol (gradient)
Příklady
 Alternativní stacionární fáze
f
– monolitické kolony,
kapilární kolony – 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm,
průtok 3 µl/min
Purifikace biopolymerů
Shrnutí…….
Shrnutí
 Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství)
 Vstupní podmínky:
 Nároky na čistotu:
dostupnost materiálu,
typ vstupního materiálu
stabilita produktu
nároky na čistotu
terapeutické účely (>
(> 99%)
farmaceutický průmysl
diagnostické testy (20 – 90%)
výzkum, katalýza reakcí
potravinářství
kosmetický průmysl (70 – 90%)
ultračisté
lt či té analytické
l ti ké standardy
t d d (95 – 99%)
 Počet purifikačních kroků:
minimali ace ztrát,
minimalizace
trát časová
časo á a finanční náročnost b
by měla
odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost
automatizace
Volba separační metody
(výtěžek časová náročnost,
(výtěžek,
náročnost nabohacení
nabohacení))
 srážení, vysolování – na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká
((> 1mg/ml)
g )
 IEC – separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace),
optimalizace
ti li
podmínek
d í k separace, kkapacita
it kkolon
l přiměřená,
ři ěř á relativně
l ti ě
levná
 GPC - separace
p
látek podle
p
Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné
p
fáze
(equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci
produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita
kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování
 HIC – metoda silně závislá na experimentálních podmínkách,
optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku
pouze 1 – 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená
 AC (IAC) – vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty
separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony
Řazení separačních kroků
 techniky s vysokou kapacitou → techniky s nízkou
kapacitou
 za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr
(Mr,,
náboj, povrchové vlastnosti apod.)
 produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro
další
(po vysolování nejde IEC bez GPC)
(IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze)
 předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů
 vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)
Praktické příklady
Sledování průběhu separace
 Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve
vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí
 Ionexová chromatografie
g
((eluce vysokou
y
iontovou silou)) 
chromatografie s hydrofóbní interakcí
Metoda
Celková
bílkovina
Celková
aktivita
Specifická
aktivita
Přečištění
Výtěžek
extrakt
100
100
1
-
100 %
 Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační
sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)
HIC
50
99
1
1.99
99
1
1.99
99
99 %
IEX
25
75
3
3.0
75 %
NEVHODNÉ
Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie
(nutno zařadit odsolovací krok  dialýza,
dialýza ultrafiltrace)
Ověření účinnosti separace,
čistoty a charakterizace
produktů
Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich
charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní
chromatografie, hydrofobní)
Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí
elektroforézy
Kontrola stupně purifikace




prvotní
průběžná (tzv
(tzv. postupná eliminace)
finální včetně strukturní charakterizace produktu
celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost,
stupeň obohacení (koncentrace)
 Požadavky na čistotu
podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované)
Technické – frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou
Purifikované – vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za
sebou
Vysoce purifikované – vysoká cena
cena, výzkum – strukturní studie
studie, klinická
diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ)
Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty

2 parametry – výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik
balastu se odstranilo)


výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy)
vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin

kritéria čistoty – homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC
neznamená vždy homogenitu) – ověřit si různými metodami
u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita,
přítomnost izoforem (pI), pozor na proteázy

 hodnocení homogenity
1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě
nasycení roztoku)
2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky)
3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas)
4. SDS
SDS--PAGE a další elektroforetické metodyy
5. Imunochemické metody
Charakterizace produktů
molekulová hmotnost celé molekuly,
molekuly dílčích podjednotek
(SDS(SDS-PAGE, SEC)
• tvar a Mr – ultracentrifugace
• izoelektrický bod pI - IEF
• spektrální vlastnosti (UV(UV-VIS, cirkulární dichroismus, NMR
spektroskopie
• analýza primární struktury, sekvence monomerů
• peptidové mapování s MS analýzou
• rentgenostrukturní analýza
•
Zakoncentrování produktů a jejich konečná úprava
 zakoncentrování přečištěného produktu
 odpařováním (x stabilita)
 mrazová sublimace (lyofilizace) – hygroskopický prášek
(sole ∆pH,
(sole,
∆pH organická rozpouštědla) – denaturace,
denaturace
fragmentace
 precipitace a resolubilizace
 ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha)
 krystalizace (náročné,
(náročné zdlouhavé)
Elektromigrační
g
metody
y
Princip elektroforézy
Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých
iontů ((složek směsi)) ve stejnosměrném
j
((homogenním)
g
)
elektrickém poli.
Pohyblivost
P
h bli
t separovaných
ý h iiontů
tů závisí
á i í také
t ké na:
 použitém elektrolytu (kapalné fázi)
 chemické vlastnosti a porozita nosiče
Většinu biologicky zajímavých látek lze ve vodném prostředí
převést
ř é t na elektricky
l kt i k nabité
bité čá
částice
částice.
ti .
Metodika:
Metodika: disociace
disociace, změna pH
pH, adsorpce iontů jiného
druhu, chemickou vazbou - tvorbou tzv. ionogenních
komplexů.
Jevy doprovázející elektroforézu
Elektroendoosmóza
Produkce Jouleova tepla
S rostoucím napětím (Ohm
Ohmův
ův zákon) roste elektrický proud
proud:: I = U/R
U/R..
práci,, energie
Pokud el.
el. proud nekoná mechanickou nebo chemickou práci
• na vnitřním povrchu kapiláry v místě
styku s vodivým roztokem vzniká
elektrická dvojvrstva
přeměňuje
j na teplo
teplo:
p : Jouleovo
se bez užitku p
• p
pevná část ((stěna kapiláry)
p y) je
j nabitá
nepohyblivým plošným záporným
elektrickým nábojem
teplo
p
Chlazení g
gelů u vysokonapěťové
y
p
– voda, termostat, led
elektroforézy
y
Elektroendoosmóza
Uplatňuje u kapilární elektroforézy
elektroforézy.. Stěny kapilár jsou vyrobeny z
kkremičitého
ičitéh skla
kl a vlivem
li
di
disociace
i
silanolových
il
l ý h skupin
k i mají
jí záporný
á
ý
náboj.
náboj. K záporným nábojům se váží pozitivně nabité ionty
(“counterions
((“
counterions”),
counterions
”),
), vytváří stacionární vrstvu (Sternova)
Sternova). V následující
vrstvě jsou však tyto ionty již mobilní (Guy(Guy-Chapmanova vrstva)
vrstva).
• z kapalné části se kladné ionty připojí
ke stěně kapiláry (dvojvrtva), ionty se
pohybují k anodě
• pohyblivá vrstvička se žene kapilárou
a strhne
t h sebou
b celý
lý průřez
ůř kapaliny
k
li v
kapiláře
• roztok putuje kapilárou celý najednou
(u elektroforézy putují jen ionty).
Typy elektroseparačních metod




Volná elektroforéza
Zónová elektroforéza
Isoelektrická fokusace
p
elektroforéza
Kapilární




Vertikální x Horizontální
1D nebo 2D rozměrná
Nativní x Denaturační podmínky
Analytická x Preparativní
Zónová elektroforéza - Elektroforéza na nosiči
provádí se na hydrofilních porézních nosičích, nerozpustných ve vodě,
s minimální
i i ál í adsorpční
d
č í schopností,
h
tí zabraňuje
b ň j zpětnému
ět é
mísení
í
í
rozdělených složek
Nosiče
P í
Papírová
á elektroforéza
l kt f é – nosičem
ič
elektrolytu
l kt l t jje chromatografický
h
t
fi ký papír
í
– analýza bílkovin; dělení nízkomolekulárních látek, aminokyselin
Elektroforéza na tenké vrstvě – nosičem elektrolytu (H2O + pufr) je
vrstva silikagelu nebo škrobu na skleněné podložce.
Gelová elektroforéza – agar, agaróza,
agaróza, PAAG, porozita gelu
gradient porozity
gradient pH
Provedení:
Gelová elektroforéza
Aparatury pro trubičkové gely
horizontální
vertikální
plošné, v trubičkách, vertikální , horizontální
Kombinovaná elektroforéza
dělení je využito (kromě.el.náboje) ještě dalších odlišností – např. velikosti
a molární hmotnosti iontů
iontů. Nosičem elektrolytu je obvykle gel (porozita
SDS-PAGE elektroforéza – dělení látek podle Mr
gelu) př. SDS(zvýšení účinnosti separace, citlivosti detekce)
Použití
1. pro účely analytické i preparativní (méně)
2 k separaci velkých molekul (proteiny nebo NK)
2.
3. k separaci menších molekul (cukry, peptidy nukleotidy)
2D elektroforéza – kombinace izoleektrické fokuzace s gelovou
chromatografií
Elektrochromatografie – dvourozměrná – jeden směr chromatografie, druhý
směr elektroforéza,
Elektrodialýza,
Elektroultrafiltrace,
Elektroultrafiltrace
Faktory ovlivňující pohyblivost látky
1.
2
2.
3.
4.
Celkový povrchový náboj separované látky
Velikost a tvar molekuly
Porosita gelu
pH a složení elektrolytu
Elektrodesorpce – eluce složek afinitní chromatografie elektrickým polem.
Blotting (Western blotting, Immunoblotting)
Dva hlavní typy PAAG elektroforézy
Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza
• Probíhá bez denaturačních činidel.
• Proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a
tvaru a podle velikosti pórů v gelu.
gelu
Proteiny jsou tepelně denaturov
denaturová
ány ve vzorkovém pufru
obsahujícím dodecyl sulf
sulfá
át sodný (SDS)
(SDS)-- zachována je tak
pouze jejich primární struktura (var 2 – 3 min.)
Denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný
náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí
závisí pouze na jejich
molekulové
l k l é hmotnosti
h t
ti
SDS gelová elektroforéza
• Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a βmerkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby).
• Pohyblivost
P h bli
závisí
á i í na molekulové
l k l é hmotnosti
h
i polypeptidových
l
id ý h řetězců
ř ě ů
(Mr)
Mr)
• Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů.
•
•
Akrylamid
rylamidový
ový gel
gel:: pevná a inertní matrix ide
deá
ální pro separaci
protein
proteinů
ů
Menší velikost pórů než u agarosy
agarosy
Aniontový detergent,
detergent, solubilizuje
solubilizuje a denatur
denaturuje
uje protein
proteinyy
Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru
poměru, asi 1
1,4
4g
SDS/g proteinu
PAA gelová elektroforéza - PAGE
Gel z polymerovaného akrylamidu
Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě)
Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji).
Laemmliho diskontinuální systém
Používá se dvou gelů tzv. zaostřovacího („stacking“) gelu nahoře a
separačního („running
(„running“)) gelu dole. Liší se hodnoty pH 6, 8 a 8, 3
elektrodový pufr se pak liší od obou gelových pufrů.
Mobilita separovaných proteinů mezi
a) mobilitou iontu ve stacking gelu
Cl--, tzv. leading ion = vedoucí
Cl
b) mobilitou iontu v katodovém pufru
(glycin, pK 9.6,
tzv. trailing ion = zakončující).
Ionty i proteiny migrují do
zaostřovacího gelu (5%)
koncentrují se do velmi úzké zóny
Co obsahuje vzorkový pufr pro SDSSDS-PAGE?
Tris pufr utváří vhodné pH
Barvení proteinových gelů


SDS (dodecyl sulf
sulfá
át sodný
sodný)) detergent poskytující proteinům negativní náboj
Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí
vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení
Bromophenol Blue
Blue““ barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy
(pohyb čela v gelu)
2-ME (DTT)



stříbrem
Coomassie blue
Fluorescenční
luorescenční barviva
RI
Specifické barvení pro
fosfo--, glykofosfo
glyko-
Molekulová hmotnost proteinů
Gel – 10%, Mr marker pozice 5
velikost měřena v daltonech (Da) či kilodalton
kilodaltonech
ech (kDa)
D
Dalton
lt = jednotka
j d tk atomové
t
é hmotnosti
h t
ti
=p
přibližně se rovná hmotnosti atomu H
(1,66 x 10 -24 g)
= definován
d fi
á ttaké
ké jjako
k 1/16 h
hmotnosti
t
ti atomu
t
O
Průměrná amino
aminokyselina
kyselina = 110 Da
Průměrný nu
nukkleotidový
leotidový pár = 649 Da
Nanesení vzorku
Separace
látek podle
jejich Mr
Určování molekulové hmotnosti proteinů
Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě
Porozita gelu a Mr separovaných látek
PAGE elektroforézy - modifikace
PAGE elektroforéza – preparativní verze
1) Nativní (různé pH, pufry – Tris, MES, MOPS, HEPES)
2) SDS-PAGE – tris/tricine– pro proteiny menší než 14 kDa
(urea)
3) SDS-PAGE – tris/borát/EDTA – elektroforéza pro gp, SDS
se neváže
áž na cukerné
k é složky
l žk
4) Afinoforéza – polymer modifikovaný látkou vykazující
afinitu k jedné ze separovaných složek (např. lektinová,
chelatační)
5)) Imunoelektroforéza,
I
l k f é
IImunofixace
fi
Izoelektrická fokuzace
Izoelektrická fokuzace
Isoelektická fokusace se provádí buď v trubičkách nebo v
plochých
p
ý
gelech,, stripech.
g
stripech
p
. Hotové IEF g
gely
y s amfolyty
yy
nebo immobiliny se dodávají komerčně spolu s přístroji pro
auomatizovanou IEF
IEF..
Vzorky se obvykle nanášejí na katodové straně
straně..
Denaturující podmínky při IEF - 9 M močovina nebo
neionogenní
g
detergenty
g y ((Triton X-100
100)).
Využití:: stanovení pI, kontrola homogenity, isoenzymy
Využití
Preparativní IEF
Provádí se v chlazených vertikálních skleněných kolonách
kolonách,, které
jsou naplněny roztokem amfolytů - stabilizováno gradientem sacharosy
(viz centrifugace), Ficol
Ficol,, Perkol
Perkol..
Na konci separace se kolona vypustí do zkumavek ve sběrači frakcí
frakcí..
Zařízení Rotofor (Bio
(Bio--Rad)
membranový
b
ý systém
té zón
ó brání
bá í
smísení separovaných vzorků
Separace izoenzymů ( ∆pI
pI))
Dvojrozměrná
j
((2D)) elektroforéza p
proteinů
2D gelová elektroforéza
Kombinuje použití IEF a SDS-PAGE pro účely studia proteomu,
vypracováno O´Farrellem
O Farrellem v 70. letech. , Umožňuje rozlišení až 10 000
proteinů.
Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů
P t i jsou
Proteiny
j
rozprostřeny
tř
na ploše
l š
Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pI v gradientu pH
pH.
Po separaci v prvním rozměru je provedena elektroforéza v gelu.
Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti.
Separace izoforem ( ∆pI
pI))
Blotting proteinů a nukleových kyselin
blotting (angl. blot = skvrna, kaňka, česky přenos)
pásy separované látky (např. SDS-PAGE) se přenášejí elektroforézou na
membránu (NC, PVDF), kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní
vazbou.
vazbou
DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975)
RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977)
PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979)
1. fáze:
fáze: klasická SDS
SDS--PAGE
(separace podle Mr
Mr))
2. fáze
fáze:: blotování
působením elektrického p
p
proudu dojde
j kp
přeblotování p
proteinů z g
gelu do
membrány
3. fáze
fáze:: vyvíjení
vizualizace přenesených proteinů, nespecifické nebo specifické barvení
Ponceau S, Fast Green nebo Amidočerni10 B.
Rozdělení metod blottingu podle provedení
Sestava při blotování
Difúzní blotting - prostá difúze v tanku s přenosovým pufrem, dlouhá
doba 36-48 hodin, velkou nevýhodou
ý
difuze do stran - zhoršení
rozlišení vlastní elektroforetické separace.
Kapilární blotting - celá jednotka je zatížena, suchý papír nasává
kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá
zhruba 12 hodin.
Vakuový blotting - místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem.
Podstatně rychlejší (30 min). Výhodou též ostřejší pásy (potlačení
difuze).
difuze)
Elektroblotting - nejrychlejší a nejúčinnější metoda. Hnací silou je v
tomto případě
ří dě síla
íl elektrického
l k i kéh pole.
l Podle
P dl provedení
d í se rozlišuje
liš j tzv.
„tankový (tank, wet)“ blotting a „polosuchý (semi-dry)“ blotting. Jediný
pro vysokomolekulární biopolymery.
Detekce konkrétního proteinu
Western blot s imunochemickou detekcí
Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE)
transfer
f proteinů
i ů z gelu
l na membránu
bá
= Western blot
detekce proteinu protilátkou
(k
(komplexu
l
primární
i á í a sekundární
k dá í protilátky)
tilátk )
vizualizace pomocí barevné reakce
nebo chemiluminiscence
W. blot
Primární
protilátka
membrána s navázanými proteiny
Sekundární protilátky konjugované
s enzymem, fluor.
fl
značkou,
čk
ale
l
i
koloidním
zlatem,
zlatem,
radioaktivně,,
radioaktivně
luminiscenčně.
luminiscenčně. Detekce glykoproteinů
Schiffovou reakcí,, alcianovou modří,,
vazbou lektinů
lektinů..
Elektroblotting
SDS--PAGE – široké uplatnění
SDS
p
 detekce kontaminace NML problematická
 průkaz produktu ve směsi (Mr, standard)
 průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot)
 kvantifikace ((denzitometricky)
y) omezená
Eluo
ované pro
oteiny
Nenav
vázané prroteiny
porozitu g
gelu,,
 široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou p
nejlépe gradientové gely
Stan
ndardy
 citlivost metody – μg až ng! podle typu vizualizace
 vizualizace všech, i kontaminujících složek x imunoblott
(identifikace)
 Elektroforéza dokumentuje
průběh purifikačního procesu
 Při použití standardů o známé
molekulové hmotnosti je možno
zhruba
h b stanovit
t
it molekulovou
l k l
hmotnost izolovaného proteinu
(SDS elektroforézou)
Půvo
odní vzorrek
Sledování čistoty proteinů
 čistota produktu – průběžné, konečné monitorování
Prokázání identity
y
 reakcí se specifickou Ab imunoblot
 uvolnit elektroelucí a následně
MS analýzu
 možnost následné MS analýzy „bandů“
Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu
Homogenát
Frakční
vysolování
1
2
Iontoměničová Molekulové síto
chromatografie (gelová filtrace)
3
4
Afinitní
chromatografie
5
Izolace IgG1 - hyperimunní sérum
MPC
MPC-protein
t i A
10% gel SDS-PAGE
barveno Coomasie Blue
Mr
serum
E1
E2
Mr
Purifikace
u
ace trypsinu
t yps u na
a koloně
o o ě s pp-a
aminobenzamidinem
obe a d e
Identifikace antianti-CA I protilátek izolovaných afinitní
chromatografií
Hodnocení čistoty výchozího materiálu před
enzymovou fragmentací
Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické
barvení ProQ Diamond II
Tris Tricine SDS PAGE
Tris–Tricine–SDS-PAGE:
gel—16,5% T, 3% C (MW 1–70 kDa),
detection with silver staining,
positions:
(1) non-digested native CA I,
(2) non-digested unfolded CA I,
(3) unfolded CA I digested 3 h by
immobilized trypsin,
(4) molecular
molec lar marker (10–250
(10 250 kDa)
Čísla udávají množství proteinu v mg/band
D il í í k l b
Detailní snímek gelu barveného 180 minut a odbarvovaného přes noc
éh 180 i
db
éh ř
Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio‐Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm
TrisTris-Tricine
Tricine--SDS
SDS--PAGE
PAGE--urea pro Abeta peptidy + blotting
M1
1
2
3
4
5
6
7
Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu
8 9 10
4
APP alfa
SDS-PAGE
5
6
4
7
5
6
7
37 kDa
25 kDa
1-37
1-38
1-39
1-40
1-42
37 kDa
Myelinový bazický
protein !! (MS analýza)
PAAG gely reprezentují eluční
frakce z imunosorbentu
Ademtech 5B2 Ab.
25 kDa
Eluce pH 3
7
Abeta
standards
Original CSF
Eluting fraction
5 4
Eluce pH 2,5
25
2 1
PrP
Imunoblot
37 kDa
25 kDa
Lane 1, 2 and 10: synthetic
y
Abeta Standard mix 1-37,, 1-38,, 1-39,, 1-40,, 1-42
Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice
Lane 4: Original sample (CSF UPCE)
g fraction IP 1 ((1:4 diluted))
Lane 6: Eluting
Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted)
Western blot, University of Duisburg (Hermann)
Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted)
HA štěpená Hyaluronidázou v čase
6
a
b
Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2
Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-PrPHRP 3F4 (imunoblot).
HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů
PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr pH 8,4. Separace 20 min při
125 V a 20 mA/1 gel a potom 200 V a 40 mA/1 gel





Hydrofóbní interakční chromatografie
RP HPLC
RP-HPLC
HPLC – analytické uspořádání
Preparativní
Analytické
 Částice 5 – 10 µm
Č
1,8 – 3,5 µm
• Částice
 Kolona 30,0 – 21,2 mm x 250
mm
• Kolona 2,5 – 4,6 mm x 150 –
250 mm
 (semiprep. 7,8 mm)
• Průtoky 10ky µl/min
 Průtoky 10tky ml/min
Obj
vzorku
k µll
• Objem
 Objem vzorku ml
• Kapacita kolony - µg
 Kapacita kolony – mg
• Předkolona
 Recyklace vzorku
• Monolitické kolony
 Sériové řazení kolon
• Kapilární kolony
 Předkolona
• Nano-HPLC
Gelová permeační chromatografie v HPLC módu
 Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní)
 Semirigidní nosič PS
 Modifikované povrchy – biokompatibilita
(Silikagel modif. hydrofilním polymerem)
 Částice 5 – 10 µm, sférické
 Částice s uniformní porozitou
 Průtoky do 0,5 ml
 Teplota 4°C – 37°C
Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu
 První typ v HP módu (HPIEC)
 Silikagelové ionexové pryskyřice
 Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA
 Pelikulární hydrofilní polymery
 Odolnost vůči tlaku
 Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace)
 A
Anal.
l uspoř.
ř – částice
čá ti
5 – 10 µm, menší
ší stupeň
t
ň hydratace
h d t
(10 – 20%)
 Separace x eluce – pH a iontová síla mob. fáze
Kombinace SEC (IEC) + ELFA
RP--HPLC
RP
RP--HPLC
RP
 Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů
 Detekce UV-VIS
(205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm)
 podmínky, kdy nedochází k denaturaci
 Závislost retence peptidů na malé změně obsahu
organického modifikátoru
 Průtoky do 1 ml/min
 Teplota
g modifikovaný
ý různě dlouhými
ý alkylovými
y ý řetězci –
 Silikagel
endcapping, omezená chemická stabilita!
 Stacionární fáze – p
pro silně hydrofobní
y
– C4,, C5
pro hydrofilní peptidy – C8, C18
y
kolony
y PS-DVB – p
pH 2 – 12
 Polymerní
 Organický
g
ý modifikátor – acetonitril,, metanol,, isopropanol
p p
(gradient)
 Zirkoniové – výborná chemická a tepelná stabilita
 Monolitické materiály
 Částice 5 – 8 µ
µm ((lze až 40 µ
µm))
 Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å
 Alternativní stacionární fáze – monolitické kolony,
kapilární kolony – 150 x 0
0,32
32 mm; průměr 3
3,5
5 µm,
µm
průtok 3 µl/min
Výsledek purifikace
Identifikace proteinů
Březen 2011
Identifikace proteinů v proteomice
„Fingerprint“
A) Molekulovou hmotnost a identifikace analytu
 Proteinové mapy
 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra
B)) Identifikace – tzv. sekvenční analýza
ý
 Peptidové mapy
 2D elektroforeogramy
elektroforeogramy, HPLC spektra
spektra, CZE
spektra, MS spektra
ELFO (Imunoblot) + MS (MALDI TOF, ESI TOF)
1. Edmanovou degradací (přímé sekvencování)
2. Hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování,
fingerprinting, „de novo“ sekvencování)
DIGE
+ Informační databáze
 Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků –
„otisky prstů“
ů“ pro každý např. buněčný proteom
nebo pro každý protein
Diferenční 2D elektroforéza
Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců
Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s
konkrétním onemocněním a zdraví pacienti).
Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.
množství vzorku min
min.. 20
20--50 pmol
pmol, opt. 200 pmol
konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF
MS)
Podmínkou je volný N-konec peptidu či proteinu.
proteinu
Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace,
acetylace,
pyroglutamová kyselina
kyselina).
Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký
výtěžek v daném cyklu.
Automatizace
možné získat 30 - 40 aminokyselin z N-konce,
N konce samozřejmě s
narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek
maximálně 100 aminokyselin.
V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy
Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid
imobilizován Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba
imobilizován.
nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po
blottingu).
Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi.
Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí 3030-60 min.
min Je třeba připočítat
eluci standardů aminokyselin
y
a tzv. p
prázdný
ý run.
Po odštěpení PTC
PTC--derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního
času na HPLC koloně)) s detekcí při 270 nm.
Hmotnostní spektrometrie (MS)
 Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m
(m) a
náboje (z
(z) s využitím elektrického a magnetického pole.
 Určovanou fyzikální
y
veličinou jje p
podíl hmoty
y a náboje
j ((m/z),
)
při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost.
 Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání
měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s
přesností 10-4.
 techniky ionizace (ESI, MALDI) - lze měřit i velké
molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy,
polysacharidy).
l
h id )
Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS
Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)
Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice
Metoda MALDI MS (od 1988)
1988) je rozšířeným nástrojem pro
separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších biobiomakromolekul (oligonukleotidy
oligonukleotidy,
g
y, sacharidy,
y lipidy).
lipidy)
p y).
Vzorek na nerezové destičce ukotven v netěkavé
matrici
t i i (kokrystalizace).
(k k t li
) Používá
P ží á se např.
ř kyselina
k
li
nikotinová nebo 2,5-dihydroxybenzoová.
Destička se vloží do přístroje,
j
zacílí se laserový
ý
paprsek („
(„fire
fire“)
“), transfer energie způsobí ionizaci.
SELDI – surface enhanced laser desorption
desorption//ionisation
array chip
hmotová spektrometrie
výhody
jednoduchost
rychlost
hl t
selektivita
nevýhody
nízká citlivost
nízká přesnost urč. m/z
nízké rozlišení
MS je často propojena s jinými analytickými technikami
technikami:
GC-MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS (Interphase)
Kromě tandemové MS (MS-MS) mohou být spojeny až tři i
více analyzátorů („multiple
( multiple“ MS).
MS)
1) Výběr studované látky ze směsi
2) Fragmentace
3) Analýza fragmentů
Kombinace s chromato či elfo metodou slouží MS jako
detektor s vysokým rozlišením - on-line analýza (x offline detekce).
detekce) Klíčové je propojení přístrojů.
přístrojů LC-MS
LC MS v
biochemii pro peptidy a proteiny.
Spřažení - ESI x MALDI
Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS
1. Štěpení proteinu trypsinem
3. MS vybraného štěpu
2 5 kD
2,5
protein II (16 kD)
vyříznout proužek
rozřezat
omýt
Příprava
(redukce)
(alkylace)
štěpení proteasou
vzorku
proč redukce a alkylace?
rozvolnění
l ě í S-S
S S vazeb
b
2. Separace peptidů chromatografií (HPLC)
m/z
UVabs
4. MS/MS spektrum
d lší
další
fragmentace
trypsin
denaturace > lepší proteolýza
ochrana oxidovaných reziduí Cys
agresivní proteasa
vysoká
ká primární
i á í specificita,
ifi it
nízká sekundární
prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kDa
štěpí:
arginyl-X, lysyl-X; ale ne
X=prolyl
Time (min)
m/z
5 Určení části sekvence .. M G A D D H D K L ..
5.
DTT, dithiothreitol
KONTAMINACE! – keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna)
– detergenty
d
(SDS
(SDS, T
Triton
i
atp.))
IAA, jódoctová kys.
6. Srovnávání s databázemi, identifikace
Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting”
Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS
štěpení
p
p
proteázou ((trypsinem)
yp
)
protein I (12 kD)
DNA (i EST), proteinová databáze
2 fragmenty (4 kD, 8 kD)
protein II (16 kD)
generování teoretických trypsinových
štěpů ze známých či předpokládaných
proteinových
i
ý h sekvencí
k
í
MALDI ToF
protein I
4000
8000
m/z
8000
m/z
protein a: 3
3, 5,
5 9,
9 12 kD
protein b: 2, 7, 9 kD
protein c: 4, 8 kD
protein d: 3, 9, 12 kD
protein e: 2, 6, 8 kD
protein II
2000
6000
Srovnání experimentálně stanovených
velikostí peptidů s teoretickými štěpy
masses (m/z)
940.421 - ELSDIAR
1093.477 - QLLLTADDR
1341.556 - PHSHPALTPEQK
1469.633 - PHSHPALTPEQKK
1488.645 - GILAADESTGSIAKR
1646.650 - LQSIGTENTEWENRR
2122 975 - IGENHTPSALAIMENANVLAR
2122.975
2241.903 - YTPSGQAGAAASESLFISNHAY
SEC + Q TOF MASS
Bioinformatika pro MS
Charakterizace ko
ko-- a posttranslačních modifikací
fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace
organismy
o
ga s y se se
sekvenovaným
e o a ý ge
genomem
o e
PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů
(i silico
(in
ili digest)
di
t) s experimentálními
i
tál í i
PC
programy
p g
y
MASCOT
((firma
SEQUEST, ProteinProspector
Matrixscience
Matrixscience),
),
organismy s nesekvenovaným
ne
genomem
hledání na základě evoluční homologie proteinových
sekvencí
Charakterizace koko- a p
posttranslačních modifikací
Význam: důležité
Vý
důl žité pro regulaci
l i buněčné
b ěč é distribuce
di t ib
a modulaci
d l i
funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce,
glykosylace - vliv na funkční,
funkční strukturní a imunologické
vlastnosti proteinů.
Výhoda MALDI MS (FT ICR MS) analýzy v tomto případě
spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti,
citlivosti
itli
ti a rozlišení.
liš í
Protokol pro analýzu proteinové modifikace
1) štěpením vzorku
2) enzymové modifikaci.
Pak se analyzuje rozdíl v Mr určitého peptidu spočítané na
základě sekvence a odečtené z MS spektra
spektra..
Děkuji za pozornost
Zuzana Bilkova@upce cz
[email protected]
Metody izolace a
purifikace produktů
obrazová příloha
Škola molekulárních biotechnologií Profession,
Ol
Olomouc,
březen
bř
2011
Bílková Zuzana
Zdroje proteinů, polysacharidů a jiných ….
 mikroorganismy (bakterie, kvasinky, plísně, řasy)
 živočišné tkáně (myši,
(myši krysy,
krysy králíci,
králíci jateční zvířata
orgány, krev, člověk – tělní tekutiny (krev 
plasmin
plasmin,, thrombin,
thrombin, specifické protilátky ...;; moč 
urokinasa ...)
 rostlinná pletiva
 tělní tekutinyy savců
Cíl izolace


Získání biopolymeru (proteiny,
polysacharidy glykoproteiny….)
polysacharidy,
glykoproteiny )
definované čistoty
Zachování biologické aktivity
Získat p
produkt o patřičné
p
čistotě s vynaložením
y
přiměřeného (optimálního) úsilí a
přiměřeného množství peněz
Výchozí materiál - úskalí
 Komplexnost biologické matrice
( elké množství
(velké
množst í doprovodných
dopro odných bílkovin
bílko in a jiných
látek)
 Malá množství cílového produktu
 Labilita biologické aktivity produktu
 Strukturní
S
labilita
Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace
Zásady pro práci s biologickým materiálem
1.
Pokud možno zpracovat co nejdříve
2.
V případě potřeby zmrazit (–
(– 20;C, – 80 oC)
3.
Rozmražování – co nejrychleji
jy
j x postupně
p
p zvyšovat
y
teplotu?
Separační metody
y
A. Separace založené na velikosti molekul
(dialýza a ultrafiltrace,
ultrafiltrace centrifugace v hustotním
gradientu, gelová filtrační chromatografie)
B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti
p
proteinů
(izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními
solemi, frakcionace organickými rozpouštědly)
C. Separace založené na základě povrchového
náboje
(elektroforetické metody, iontově výměnná
chromatografie, afinitní chromatografie)
4
4.
Nízká teplota při izolaci
5.
Vhodné pH + iontová síla
6.
Vhodná koncentrace bílkoviny
7.
Zabránit pěnění
p
8.
Omezení proteolytické aktivity (směs inhibitorů)
9
9.
Přídavek
Příd
k specifických
ifi ký h lát
látek
k ((např.
ř ME
ME, EDTA ...))
Separační metody
 Centrifugace a ultracentrifugace
 Membránové separace (ultrafiltrace, dialýza)
 Selektivní precipitace
 Iontově výměnná chromatografie (IEC)
 Chromatografie na molekulových sítech (SEC)
 Hydrofóbní
y
chromatografie
g
(HIC)
(
)
 Afinitní chromatografie (AC, IAC, HPIAC)
 Preparativní elektromigrační techniky
Selektivní precipitace
Separace založené na rozdílné rozpustnosti
proteinů
Rozpustnost proteinu
prudce stoupá,
p
p , jjeje-li v
roztoku o pH nižším
nebo v pH vyšším než
pI proteinu
i
(molekuly mají stejné
náboje a odpuzují se)
se).
1) rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje pH
2) při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se
shlukovat – mají 0 náboj
3) protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný
(NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v
proteinu)
t i )
4) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se
ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI
pI..
pH roztoku je nižší
pI
náboj proteinu
+
Frakcionovaná precipitace - vysolování
pH roztoku je vyšší
náboj proteinu
-
Precipitace
Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a
vytvářejí s ní vodíkové můstky
(čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný)
 Bílkoviny aktivní v nativním stavu, srážením ke změnám
konformace molekuly (porušení fyz
fyz..-chem.vlastností
chem
chem.vlastností),
vlastností)), musí
vlastností)
biol.. aktivita zajištěna návratem do fyziol
biol
fyziol.. Podmínek
 Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť
 Nezaměňovat s denaturací - Ireverzibilní precipitace ––
sole těžkých
ý kovů,, koncentrované minerální kyseliny,
y
y, orga
orgag nické kyseliny, teplo
 Interakce protein/protein
je silnější než protein/roztok
rozpustn
nost
Selektivní precipitace
vysolování
vsolování
 Molekuly
M l k l proteinu
t i koagulují
k
l jí
(agregují) díky hydrofóbním
interakcím
I
Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %).
 Látky používané pro separaci bílkovin – EtOH
EtOH,, NaCl,
NaCl,
 ((NH4)2SO4 - rozpustnost se málo mění s teplotou, saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci
agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3), levný, čistý
 Filtrace nahrazena centrifugací
Srážení organickými polymery a sloučeninami
Srážení organickými rozpouštědly
 Kompletně mísitelné s vodou
 Musí mít dobrý precipitační efekt
 Srážení za nízké teploty (< 0 °C)
C)!!!
!!! X denaturace proteinu
Princip identický jako srážení s org.
org. rozpouštědly
 DEAE d
dextran,
t
PEG
PEG, Polyakrylová
P l k l á kyselina
k
li
 Rivanol (2
(2--ethoxyethoxy-6,9
6,9--diaminoakridinlaktát)
 Kaprylová kyselina
 EtOH
EtOH,, aceton, MetOH,
MetOH, propanol, dioxan
1) etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda)
2)) sníží se stupeň
p ionizace a zvýší
ý p
přitažlivé síly
y mezi opačnými
p
ý
náboji, tím se sníží rozpustnost.
 Přídavky
Příd k některých
ěkt ý h látek
lát k
(substráty, koenzymy,
inhibitory) zvyšují stabilitu
cílových bílkovin
 pH při tepelné denaturaci
musí být přesně
definováno
 Při vyšší teplotě může více
probíhat proteolýza
 Při této metodě denaturujeme a souč
souč.. precipitujeme
y cílová bílkovina ((enzym)
y ) musí zůstat z
balastní bílkoviny,
85 - 90 % v nativním stavu.
 Denaturační vlivy – T, pH, org
org.. rozpouštědla
Kapalinová chromatografie
v nízkotlakém uspořádání
Tepelná denaturace
%
Srážení selektivní denaturací
Low pressure liquid chromatography LPLC
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Bílkovina 1
Bílkovina 2
Nízkotlaká (LPLC), střednětlaká (FPLC) a
vysokotlaká (HPLC) chromatografie
Kolonová (CC), na tenké vrstvě (TLC), na
papíře (PC), vsádková (batch-wise)
teplota
Preparativní
p
účely
y …..
Gelová chromatografie
Ionexová chromatografie
g
Chromatografie s hydrofóbní interakcí
Chromatografické metody – základní charakteristika
 Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a
stacionární fáze
 M
Mobilní
bil í fá
fáze  kapalina
k
li (k
(kapalinová
li
á chromatografie);
h
t
fi ) plyn
l
(plynová chromatorafie)
chromatorafie)
 Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva
kapaliny na částicích
částicích, kapalina v pórech chrom
chrom. nosiče
nosiče,
film kapaliny na vnitřní straně kapiláry
 Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do
fáze mobilní
Instrumentace pro LPLC








Pumpa – peristaltická nebo gravitace
Gradient – směšovač mob. fází
Podmínky separace – izokratické
izokratické,, gradientové
přímo p
pumpou
p na kolonu
Dávkování – p
Kolony – skleněné, plastové, kovové (nerezové)
Detekce – spektrofotometrická 254,
254 280 nm
nm,, …nm
…nm
Vyhodnocování – zapisovač
Sběrač frakcí – programovatelný
Terminologie
Eluční objem
Mrtvý objem
Retenční poměr
Kapacitní poměr
Účinnost kolony
y
(teoretické patro)
 Rozlišení elučních křivek
(selektivita, kapacitní poměr, účinnost)
 ………





Chromatografická sestava pro preparativní účely
KOLONY
HighHigh-through put system ……
MIKROKOLONY
KOLONA
pro prep
prep.. uspořádání
Částice sorbentu
Vzorový chromatogram pro LPLC
TVARY CHROMATOGRAFICKÝCH PÍKů
 Založena na silných elektrostatických silách mezi ionizovanými
funkčními skupinami měniče a ionty látek v okolním roztoku (analyt,
i t solí
ionty
lí apod.)
d)
 Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo
záporný
p ý náboj,j, afinita iontů k ionexu závisí na velikosti
náboje
 V případě proteinů hraje zásadní roli pH prostředí,
mobilní fáze!
Celulosové a dextranové nosiče
eluce prtoeinů vysokou iontovou silou
Katexy – záporný náboj  vazba kationtů
), sulfopropyl
sulfopropyl(SP)
p py ((SP)) OSO3
OSO3-silné – sulfo ((S),
slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO
COO-Anexy – kladný náboj  vazba aniontů
slab
sl
abé
é – diethylaminoethyl (DEAE)
silné – triethylaminoethyl (TEAE)
Stacionární fáze
organické polymery,
materiály na bázi silikagelu
 Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny
 pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu
 pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu
 pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou
chromatografii nebo tzv. negativní izolaci (např. IgG ze séra)
Typická
Typic
ká ionex
ionexová
ová chromatografie
 Nanášení vzorku – nízká iontová síla
 Eluce – gradientová
Zvyšováním iontové síly
Změnou pH
retenci lze ovlivnit i teplotou
p
nebo přídavkem
p
org
org.
g.
modifikátoru
Praktické využití
 purifikace a zakoncentrování proteinu,
 výměna pufru, separace látek s podobnou iontovou
povahou (silné i slabé elektrolyty)
 separace neiontových látek
Typická
Typic
ká IEC
Loading ends,
Low salt wash begins
1M
Salt gradient
0
Protein absorbance
II
Loading starts
Peak of
unbound
protein
Salt gradient
begins
III
Salt gradient
ends
I
Eluted peaks of weakly bound (I),
moderately bound (II)
and tightly bound (III) proteins
 Gelová filtrační chromatografie
 Molekulová vylučovací chromatografie
 Chromatografie
g
na molekulových
ý sítech
 SEC – size exclusion chromatography
Částice sorbentu
Optimální gel pro gelovou filtraci
Inertní matrice gelu - chemicky stabilní při různém pH, T
Pořadí eluce :
největší>
největší
>střední
střední>
>nejmenší
molekula
Jev stérického vyloučení (exkluze) větších molekul,
molekul malé molemolekuly pronikají do nitra částic gelu (permeace
permeace)) a zpožďují se.
Ke skutečné rovnováze mezi koncentrací látek vně a uvnitř částic nedochází.
Mechanicky stabilní gel (deformace při tlaku)
Velikost gelových částic nesmí být ani příliš malá (rozdělení
je přesnější, ale pomalejší) ani příliš velká (rozdělení je
rychlejší ale může být nepřesné)
rychlejší,
nepřesné).
Na rychlou chromatografii tedy použijeme gel s hrubšími zrny.
Na vysoký stupeň rozlišení použijeme gel s malými zrny.
Určení Mr z kalibrační křivky
Odsolování (rychlejší alternativa k dialýze)
 Záznam průběhu odsolování
Jednotlivé frakce proteinů
se detekují spektrofotometrem.
Rychlost průtoku proteinu
je přímo úměrná velikosti
molekuly
Rozlišení elučních křivek lze
ovlivnit pouze účinností a
správnou
p
volbou
molekulového síta
Parametry kolony
DEXTRANOVÉ GELY
 Objem vzorku < 2 % objemu kolony!!!
 Sephadex G-10, G-15 pro odsolování peptidů, AMK)
 Sephadex G
G-25,
25 G-50
G 50 pro odsolování proteinů
 Sephadex G-75 až G-200 separace proteinů podle Mr do
600 kDa
 Celkovýý objem
j
kolonyy VT = VM + Vs – VGM
 VGM - objem gelové matrice
 VM - mrtvý objem (aplikace inertní látky na kolonu, Blue dextran 2MDa) objem,
2MDa),
objem co zaujímá mobilní fáze (VM = MR pro inert)
 VS - objem stacionární fáze
 Kav = (VR + VM) / Vs
 Kav ~ Kd distribuční koeficient
 VR – retenční objem (eluční objem)
 Exclusion limit
 Exclusion volume
 Matrice hydroxypropylované – LH -20 pro separaci TG, MK,
Stab objem v prostředí ethanolu,
Stab.
ethanolu chloroformu
AGAROSOVÉ GELY




Přečištěný agar (zbaven polysacharidů)
Zesíťování 2
2,3
2,33-dibrompropanolem,
dibrompropanolem epichlorhydrinem
CL (cross(cross-linked) – stupeň zesíťování
S h
Sepharose
CL
CL--2B
POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY
• kopolymerací akrylamidu s N,NN,N-methylenbisakrylamidu
• Bio
Bio--Gel PP-2
Využití SEC (GPC) v praxi
 Skupinová separace (odsolení, odstranění extrakčního
činidla, detergentu, NML od ostatních, pro labilní proteiny
(x dialýza)
 Frakcionace (purifikační metoda) rozdělení látek podle Mr
 Stanovení molekulové hmotnosti
 U
Určení
č í di
distribuce
t ib
biopolymerů
bi
l
ů a syntetických
t ti ký h polymerů
l
ů
• Bi
BioBeads
B d S-X1 – na bázi
bá i polystyrenu
l t
((vhodné
h d é pro lilipofilní
fil í
polymery a velké organické látky v organických
rozpouštědlech
 Analýza a monitorování vazby ligandu na biopolymer
Hydrofóbní chromatografie (HIC)
Princip separace HIC
 Hydrophobic interaction chromatography
 adsorpční chromatografie
g
(hydrofóbní
(hydrofóbní
y
povrch))
 Separace na nepolární (obrácené) fázi ~ RP
RP--LC
 Nosiče pro HIC jsou méně hydrofóbní než pro RPRPLC – lze tak použít jemné eluční podmínky s cílem
zachovat biologickou aktivitu separované látky
 vhodná pro biopolymery
 - malá selektivita (separace
(
látek na základě
jejich rozdílné hydrofobicity
 + dostatečná kapacita
• sorpce molekul „zdánlivě“ hydrofilních
proteinů na nosič s hydrofóbními
p
y
klastry
y
• eluce potlačením hydrofóbních interakcí
(snížením iontové síly, přídavkem org
org..
rozpouštědla, detergentu)
• nebezpečí denaturace proteinu (v případě
silné
il é vazby)
b )
• interakci podporuje vysoká iontová síla
mobilní
bil í fáze
fá
Nosiče pro HIC
Hydrofobní chromatografie
 Matrice methakrylátové (silně hydrofóbní)
hydrofóbní)
 Matrice polysacharidové (spíše hydrofilní pro
hydrofilní proteiny s hydrofóbními kapsami)
 Stacionární fáze –
- C8, -fenyl
y s vysokou
y
koncentrací solí
 Mobilní fáze – vodné roztoky
(např. 1,7 M (NH4)2SO4)
 Eluce – snižováním iontové síly




Phenyl, Octyl,
Phenyl,
Octyl, Butyl Sepharose Fast Flow (FF)
Butyl + Methakrylátová báze
HEMA--co
HEMA
co--EDMA
Sepharon HEMA
Použití
purifikace a zakoncentrování
bílkovin, možno použít přímo po
vysolování síranem amonným
Hydrophobic interaction chromatography of ββ-glucosidase from
the digestive juice of the palm on PhenylPhenyl-Sepharose CLCL-6B.
Co to je HILIC chromatography
chromatography?
?
HIC x HILIC
 Hydrofilní interakční chromatografie
 (Hydrophilic interaction chromatography)
chromatography)
 pro velmi polární a hydrofilní látky (x RPRP-LC) – polární báze,
kyseliny, AMK, peptidy, sacharidy
Nízké pracovní tlaky
tlaky, vysoké průtoky
Dobrá symetrie píků polárních látek
Rychlá eluce hydrofóbních komponent
Stacionární fáze – velmi polární – silikagel, vázané polární
fáze
 Mobilní fáze – jako v RPRP-LC, voda, pufr, organická
rozpouštědla
p
 Retence – čím vyšší obsah organické složky, tím vetší retence




Afinitní a imunoafinitní
chromatografie
Afinitní chromatografie - princip
 Využití schopnosti biologicky aktivních látek
specifick rozpoznat
specificky
ro po nat jinou
jino molekulu
molek l  látky
látk mají k
sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické)
 Typ adsorpční chromatografie využívající
specifické interakce (nekovalentní vazby)
AC,, IAC
Affinity Chromatography
Immunoaffinity Chromatography
 Látka navázaná na nosič  afinitní ligand
 Vazba ligandu přes raménko (spacer)
Afinitní páry
Reverzibilní
biospecifická
interakce
enzym
substrát
kompetitivní inhibitor
koenzym
protilátka
antigen
hapten
lektin
Glykoproteiny,
oligo(poly)sacharidy
histony
DNA
DNA
Kompl.
p NA
buněčný povrchový receptor, léčivo
hormon
Předpoklady pro vznik biospecifického komplexu
Princip afinitní chromatografie
 Sterické (spacer)
 Vazebné
(optimální pH, iontová síla)
 Konformační
Princip imunoafinitní chromatografie (IAC, HPIAC)
Eluční techniky
Eluce = disociace komplexu ligandligand-cílová látka, při ideální
eluci by se měli cílové molekuly úplně uvolnit z afinitního
ligandu elučním pufrem
Způsoby eluce:
1) eluce náhradou ligandu volným ligandem nebo jeho
analogem
2)) eluce kompeticí
p
cílové molekuly
y s jjejím
j analogem
g
3) eluce změnou pH (kroková či lineární gradientová eluce)
4) eluce změnou iontové síly
5) eluce přídavkem chaotropního iontu, detergentu (např.
y
amonný,
ý, močovina))
thiokyanát
Desorpce
ELUCE
Nosiče v afinitní chromatografii
Základní vlastnosti nosiče vhodného pro afinitníchromatografii:
velký specifický povrch, makroporézní struktura
mechanická stabilita
chemická stabilita
snadno derivatizovatelný
povrch snadno přístupný ligandu
cchemicky
e c y inertní
e t po
povrch
c zabraňující
ab a uj c nespecifické
espec c é so
sorpci
pc
dobré chromatografické vlastnosti (průtoková rychlost)
Typy nosičů:
jednosložkové x složené
vláknitá struktura x partikule
Dělení nosičů pro afinitní chromatografii:
Jednosložkové:
A) Organické nosiče:
nosiče:
celulosa
ce
u osa (Perloza
( e o a MT))
dextran (Sephadex)
agarosa (Sepharosa), aj.
Obr. 2: CNBr aktivovaná Sepharose
B) Anorganické nosiče:
nosiče:
křemičité nosiče
skleněné nosiče, aj.
C) Syntetické nosiče:
nosiče:
polyakrylamid (Enzacryl)
metakrylát (Spheron), aj.
Složené: polysacharidpolysacharid-polyakrylamid (Sephacryl HR)
magnetické částice (Magnogel)
Ligandy a jejich imobilizace
Volba nosiče: záleží na typu ligandu, průtokové rychlosti,
podmínkách separace,
p
p
, aplikaci
p
vlastnosti ligandu:
1) specifická a reverzibilní vazba na izolovanou látku
2) přítomnost chemicky modifikovatelné skupiny pro vazbu
na nosič
Nosič
Aplikace
Celulosa (vláknitá,
(vláknitá
granulární)
vsádkové uspořádání
Celulosa (partikule)
nízkotlaké kolonové uspořádání
Dextran
vhodný pro vazbu protein. a lektin. ligandů
Agarosa
nízko
nízko-- až střednětlaké kolonové
uspořádání
Polyakrylamid
nízko
nízko-- až střednětlaké kolonové
uspořádání
Magnetické nosiče
vsádkové a „on„on-line“ (MSFB) uspořádání
Kř ičité nosiče
Křemičité
ič
vysokoúčinné
k úči é chromatografické
h
t
fi ké separace
Skleněné nosiče
vysokoúčinné chromatografické separace
Ligandy a jejich imobilizace
Postup imobilizace ligandu: vazba ligandu na nosič musí být
pevná => aktivace nosiče před vazbou ligandu
Činidla užívaná pro aktivaci nosiče:
1) Kyan bromid (CNBr-act. Sepharose 4B)
2) Oxidace jodistanem
3) Karbodiimid (např. CDI, EDAC)+S-NHS
4) Thiol (Thiol
(Thiol-act.
act Sepharose 4B)
5) Triazin
6) Epoxy (Epoxy
(Epoxy-activated
activated Sepharose 6B)
7) Hydrazidem akt. nosič
používané ligandy:
1) proteiny (např. enzymy, koenzymy, Ab, Ag, protein A)
2) nukleové kyseliny (DNA i RNA)
3) lektiny (např. Concanavalin A)
4) te
textilní
tilní bar
barviva
i a (např
(např. Cibacron Bl
Blue,
e Orange A
A, Green A)
Orientované imobilizace ligandů – protilátek
Kovalentní vazba ligandu na COO
COO--částice
Orientovaná imobilizace
ligandu - glykoproteinů
Kovalentní vazba
ligandu
neorientovaně
i t
ě
Protein A (G, L) – dvojí využití
HPIAC
– high
g p
pressure immunoaffinityy chromatography
g p y
Izolace IgG
g molekul i jjejich
j
p
podtříd
Imobilizace IgG molekul
Protein A – Staphylococcus aureus
Protein G – rod Streptococcus
Protein L – ros Peptostreptoroccus
Fibrinogen
g in human
plasma, using an antifibrinogen immobilized
antibody
tib d column
l
Magnetické částice
Kolonové uspořádání
Macroporous bead cellulose
100 – 250 μm (750 x)
ø
Alginate acid-coated magnetite
particles (-COOH)
ø
7 -10
10 μm (zv.
(
4 000 x)
)
Vsádkové uspořádání
Poly(GMA) microparticles
2,9 μm (5 000 x)
ø
Magnetická separace
PolyNIPAM nanoparticles
(-COOH) 0,29 μm (electron.
microscopy, 50 000 x)
MSFB
Princip magnetické separace
Magnetické mikročástice
Magnetické
jjako integrální
g
součást
průtokového systému
MSFB (magnetically stabilized fluidized bad)
Výhody magnetických nosičů
Schematický diagram strategie analýzy
p
proteinů
 Vysoká rychlost separace (zkrácení doby reakce, separace,
prodloužení životnosti reaktorů)
 Vysoká reprodukovatelnost reakcí díky nulovým ztrátám
nosiče
 Snadná manipulace a práce se systémem

 Postup separace šetrný vůči fragilním bílkovinám a
bioaktivním látkám ((- centrifugace)
 Vše probíhá v jednom reakčním prostředí - snižuje se
pracnost, riziko kontaminace a inaktivace substrátu
Chromatografie na imobilizovaných barvivech
 Dye-binding chromatografphy
 Reaktivní barviva vázaná na chromatografických
nosičích
 Barviva částěčně podobná některým kofaktorům
 Izolace enzymů i neenzymových bílkovin (např.
albumin apod.)
 Cibacron Blue 3G pro NAD+ a NADP+
dependentní dehydrogenázy
 Procion Red HE 3B pro NADP+ dependentní
enzymy
Chelatační afinitní chromatografie
IMAC – immobilized metal affinity chromatography
Vzájemná interakce mezi biopolymerem v roztoku a ionty kovů
vázanými na pevné fázi
Chelatační ligand
g
– např.
p IDA ((iminodiacetát
iminodiacetát))
Ionty „měkkých“ kovů – Zn
Zn,, Cu,
Cu, Ni, Co, Fe,
Fe, Mn,
Mn, Mg
Nosiče – biopolymery ((agarosa
agarosa,, sepharosa)
sepharosa)
Stabilita x reverzibilita
(ligand--kov versus ligand
(ligand
ligand--peptid, protein)
Koordinační
K di č í vazba
b mezii
akceptorem elektronů
(kovem) a donorem elektr.
elektr.
(AMK – His, Cys,
Cys, Trp –
vysoká elektronová hustota R)
IMAC pro izolaci rekombinantních proteinů
 1 kroková purifikace rekombinantních proteinů
obsahujících tzv.
tzv histidinovou kotvu (His-tag)
Shrnutí…….
Shrnutí
 Interakce kovových iontů (Ni22+) s exponovanými
histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu
 Vhodné i pro nekorektní formy rek. Proteinů, tzv. inkluzní
j se rozpouštějí
p
j vysokou
y
koncentrací močovinyy
tělíska,, jež
nebo guanidinium chloridu, protože se IMAC dá provádět i
za denaturačních podmínek!!
 Renaturace (refolding) proteinů zachycených na koloně
postupným snižováním denaturačního činidla
Základní zásady purifikačních kroků
 Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým
výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního
materiálu
 Později metody s vysokým rozlišením a vyšším výtěžkem,
kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce,
množství cílového proteinu je menší
 Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti
mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace  možné snížení
výtěžku díky ztrátám)
 Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat
 Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu, polysacharidu!!
Praktické příklady
 Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve
vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí
 Ionexová chromatografie
g
((eluce vysokou
y
iontovou silou)) 
chromatografie s hydrofóbní interakcí
 Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační
sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)
NEVHODNÉ
Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie
(nutno zařadit odsolovací krok  dialýza,
dialýza ultrafiltrace)
Sledování průběhu separace
Metoda
Celková
bílkovina
Celková
aktivita
Specifická
aktivita
Přečištění
Výtěžek
extrakt
100
100
1
-
100 %
HIC
50
99
1
1.99
99
1
1.99
99
99 %
IEX
25
75
3
3.0
75 %
Membránové separační metody
Ultrafiltrace centrifugace a
Ultrafiltrace,
dialýza
Separační
p
metody
y založené na
rozdílné velikosti molekul
DIALÝZA – odstranění nízkomolekulárních látek
Dialyzační střívka
 Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod
malých molekul
(Cut off – limitní Mr)
 Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z
roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování
proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí).
y
tlaku
Probíhá za vyššího
 Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou;
oddělením solí po vysolování bílkovin
Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem
 Propustnost membrány pro rozpuštěné látky
 Velikost povrchu membrány
 Pohyb částic < 1000 Da

Elektrodialýza
Filtrace
Membránová filtrace
ULTRAFILTRACE
Membránová filtrace (ultrafiltrace)
speciální membrány s definovanou
velikosti pórů - tzv.
tzv cut-off limit
Afinitní ultrafiltrace –
funkcionalizace povrchu
membrán ligandem
Membrány
 Na základě chemického složení rozeznáváme membrány
organické (polymerní) a anorganické. Starší generace
polymerních membrán byla vyrobena na bázi přírodních
polymerů (celulosa a její deriváty)
 syntetické polymery, např. polysulfon, polyamid,
polyetherimid, polyethersulfon, polyvinylidenfluorid,
polytetrafluorethylen,
l t t fl
th l
kt é jsou
které
j
chemicky
h i k a fyzikálně
f ikál ě
stabilnější (odolnost vůči organickým rozpouštědlům, pH,
teplotě)
 Poslední generací jsou anorganické (keramické)
membrány vyrobené z oxidů hliníku
hliníku, zirkonu a titánu
titánu,
silikátových materiálů, karbidů, zeolitů apod., které vynikají
extrémní pevností a odolností
Typy membrán





a) isotropní membrána – homogenní vrstva
b) asymetrická membrána - aktivní vrstva (tloušťka < 1 μm
μm))
porézní nosná vrstva (~100 μm
μm))
c) kompozitní membrána - aktivní vrstva (tloušťka < 1 μm
μm))
porézní vrstva, nosná podložka (100 - 200 μm
μm))






selektivita, propustnost
ionaktivní membrána, afinitní membrána
jednosměrná filtrace, příčný tok
zanášení membrány („fouling
(„fouling““ efekt)
chemické nebo fyzikální metody regenerace
sterilace, životnost membrány
Filtrace – membrány NC
0,45 µm
0,20 µm ≤ 20 kDa
0
0,10
10 µm ≤ 7 kDa
kD
Filtrace – membrány NC
Centrifuga – výkyvný a úhlový rotor
Ultracentrifugace
Frakční centrifugace, ultracentrifugace
 Centrifugace se používá k oddělení hrubých směsí buněčných
komponent.
 Při kvantifikaci
k
tifik i rychlosti
hl ti pohybu
h b molekul
l k l v roztoku
t k v centrifugačním
t if
č í poli
li
používáme sedimentační koeficient (s) dle rovnice:
s = m(1
(1 – f
f
kde m je hmotnost částice,  je parciální specifický objem (reciproká
h d t hustoty
hodnota
h t t částice),
čá ti )  je
j hustota
h t t média,
édi
f frikční
f ikč í k
koeficient
fi i t
(závisí na tvaru molekuly)
 (1 – ) vyjadřuje schopnost prostředí nadnášet částice
 Sedimentační koeficient se obvykle vyjadřuje v jednotkách: Svedberg (S);
S = 10-13 s.
 Čím je hodnota S nižší,
nižší tím pomaleji částice sedimentuje.
sedimentuje
 Na tomto principu je založena gradientová nebo jinak zonální centrifugace
vedoucí k oddělení částic na základě hodnoty jejich sedimentačních
koeficientů.
Rychlostní gradientová centrifugace
Rovnovážná centrifugace

Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Transkript

Podobné dokumenty

Základy interpretace áklady interpretace hmotnostních spekter 1