4. Neformální proteomické setkání PRAHA

4. Neformální proteomické setkání
PRAHA
1. Lékařská fakulta Univerzity Karlovy
26. – 27. 11. 2015
Program a sborník
Místo konání:
1. Lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze
Na Bojišti 3
120 00 Praha 2
GPS: 50°4'24.534"N 14°25'40.295"E
Cesta MHD:
Ze zastávky „Hlavní nádraží“ (vlak) nebo „Florenc“ (autobus) metrem trasou C směr „Háje“ na
zastávku „I. P. Pavlova“. Zde vystoupit a pak pěšky nejprve asi 100 m po třídě „Sokolská“, pak
doprava na ulici „Na Bojišti“ a po dalších 100 m se na pravé straně nachází budova 1. LF UK.
2
Čtvrtek, 26. listopadu 2015, 14:50 – 18:50
14:50 – 15:00 Zahájení
15:00 – 16:40 Přednášková sekce I (předsedající: Pavel Řehulka)
15:00 – 15:20 Petr Novák - Strukturní biochemie a hmotnostní spektrometrie
15:20 – 15:40 Pavel Bouchal - Vyhledávání a validace potenciálních biomarkerů
metastazování u nádorů prsu subtypu luminal A
15:40 – 16:00 Jiří Petrák - Od teček a čárek k optimalizaci terapie? Studium rezistence
nádorových buněk na antinukleosidy
16:00 – 16:20 Ondřej Vít - De profundis: Proteomická analýza transmembránových proteinů
na základě transmembránových peptidů
16:20 – 16:40 Tomáš Korba - OneOmics – spojení výsledků sekvenování nové generace a
kvantitativní protemiky využívající techniku SWATH
16:40 – 17:00 Přestávka na kávu
17:00 – 18:20 Sekce 333 - Jednička (předsedající: Jiří Petrák)
17:00 – 17:10 Eva Kotrčová – Huntingtonova choroba optikou hmotnostní spektrometrie
17:10 – 17:20 Eliška Doktorová – Imunodeplece mozkomíšního moku
17:20 – 17:30 Martin Ondrej – Radiosensibilizace nádorových buněk pomocí modulace
autofagie: fosfoproteomická analýza
17:30 – 17:40 Alena Fučíková – Cílená proteomická analýza vysoce rizikových toxinů
17:40 – 17:50 Marek Vrbacký – Studium mitochondriálních knockout modelů pomocí
kvantitativní proteomiky
17:50 – 18:00 Michaela Balášová – Proteomická analýza moči laboratorních potkanů u
experimentálního modelu renální denervace
18:00 – 18:10 Petr Přikryl – Studium močového proteomu pacientů s IgA nefropatií
18:10 – 18:20 Helena Řehulková - Porovnání vybraných kardiovaskulárních onemocnění
pomocí iTRAQ analýzy
18:20 – 18:30 Vyhlášení vítěze Ceny Josefa Chmelíka za rok 2014
18:30 – 18:50 Přednáška představující vítěznou práci
19:00 – 20:30 Večerní občerstvení - Fair Food Bistro, Albertov 6
20:30 - ??
Neformální setkání - Mrtvá ryba, Benátská 4
3
Pátek, 27. listopadu 2015, 9:00 – 13:10
9:00 – 10:20
Přednášková sekce II (předsedající: Marek Šebela)
09:00 – 09:20 Jana Uřinovská - Proteomická analýza buněčných jader ječmene izolovaných
průtokovou cytometrií
09:20 – 09:40 Jana Beinhauer - MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie intaktních spor a
proteomická analýza rostlinných patogenů rodu Puccinia
09:40 – 10:00 Ondrej Šedo - MALDI-TOF MS profilování bakterií a potravin
10:00 – 10:20 Michal Boháč - Proteomika není jen identifikace a kvantifikace aneb zajímavé
novinky a řešení Bruker
10:20 – 10:40 Přestávka na kávu
10:40 – 12:00 Přednášková sekce III (předsedající: Hana Kovářová)
10:40 – 11:00 Juraj Lenčo – Potřebujeme stále nanosprej?
11:00 – 11:20 Kristýna Pimková – „Label-free“ kvantifikace v proteomice za využití
softwaru MaxQuant a jeho LFQ algoritmu
11:20 – 11:40 Petr Halada – MALDI-TOF mass spectrometry-based typing of phlebotomine
sand flies
11:40 – 12:00 Jaroslav Pól – High resolution accurate mass in quantitative shotgun and
targeted proteomics
12:00 – 13:10 Sekce 333 - Dvojka (předsedající: Jiří Petrák)
12:00 – 12:10 Martina Žižková – Proteom nervových kmenových buněk a jeho studium v
průběhu cílené diferenciace
12:10 – 12:20 Marie Vajrychová – Velké nesnáze s malými peptidy
12:20 – 12:30 Karel Harant – Porovnání různých metod přípravy vzorku po
imunoprecipitaci
12:30 – 12:40 Denisa Petráčková – Studium vlivu ligninolytické houby Pleurotus ostreatus
na bakterii Rhodococcus erythropolis
12:40 – 12:50 Miloslava Ďuráčová – Výroba rekombinantního toxinu beta2 Clostridium
perfringens
12:50 – 13:00 Maksym Danchenko – Objasnenie mechanizmov úspešného rastu a
reprodukcie ľanu v kontaminovanom prostredí Černobylu
13:00 – 13:10 Martin Černý – Ubikvitinace - jak ji lokalizovat?
13:10
Ukončení konference
4
Abstrakty
Čtvrtek, 26. 11. 2015
5
Strukturní biochemie a hmotnostní spektrometrie
Michal Rosůlek, Zdeněk Kukačka, Alan Kádek, Eliška Pospíšilová, Josef Chmelík,
Petr Pompach, Petr Man, Petr Novák
Mikrobiologický ústav AV ČR
Prostorová struktura bílkovin se v současné době řeší hlavně pomocí roentgen-strukturní
analýzy, která spolu s NMR spektroskopii a kryo-elektronovou mikroskopii patří mezi metody s
vysokým prostorovým rozlišením. Nicméně, pořád existují bílkoviny, jejichž prostorové struktury
zatím vyřešeny nebyly, i když pokusů bylo učiněno mnoho. Bu´d neochotně tvoří krystaly, nebo
jsou příliš velké pro NMR nebo naopak malé pro kryo-EM. V takových případech příchází na
řadu techniky nízkého prostorového rozlišení, mezi které lze zařadit i hmotnostní spektrometrii
ve spojení s proteinovou chemii. Zmíněná technologie dnes nabývá velkého uplatnění pro svoji
schopnost popsat studovaný systém jako celek včetně jeho proměnlivosti v čase a okolních
podmínkách, což konkurenční technologie neumožňují.
6
Vyhledávání a validace potenciálních biomarkerů metastazování u
nádorů prsu subtypu luminal A
Pavel Bouchal (1,2), Josef Maryáš (1,2), Monika Dvořáková (1,2), Theodoros Roumeliotis (3),
Jenny Ho (4), Jakub Faktor (1,2), Lenka Čápková (1), Hana Imrichová (5), Eva Budinská (1),
Spiros D. Garbis (6), Bořivoj Vojtěšek (1), Rudolf Nenutil (1)
(1) Masarykův onkologický ústav, Regionální centrum aplikované molekulární onkologie, Brno;
(2) Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Ústav biochemie, Brno; (3) Proteomics Mass
Spectrometry, The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge CB10 1SA, UK; (4)
ThermoFisher Scientific, Hemel Hempstead, UK;(5) Laboratory of Computational Biology,
Center for Human Genetics, University of Leuven, Belgium; (6) University of Southampton,
School of Medicine, Cancer Sciences Division, Institute for Life Sciences – Center for Proteomic
Research, Southampton, UK
Nádory prsu jsou nejčastějším typem nádoru u žen. Současné diagnostické přístupy však stále
vykazují nedokonalosti při stanovení rizika metastazování u subtypu luminal A, kdy se u malé
části pacientek vyvíjejí časné uzlinové metastáze v rozporu s teoretickou prognózou. V našem
výzkumu se snažíme identifikovat, validovat a charakterizovat specifické proteiny, mechanismy
a metastatické molekulární portréty, které by byly použitelné pro identifikaci pacientek s vyšším
rizikem metastazování.
Nejprve jsme se zaměřili na vyhledávání prometastatických cílů v souboru 96
charakterizovaných nádorů prsu zahrnujícího stratifikaci vzorků podle grade, exprese
hormonálních receptorů a stavu lymfatických uzlin. Primární proteomická studie byla založena
na metodice zahrnující štěpení komplexních lyzátů trypsinem, značení peptidů isobarickými
značkami (iTRAQ), separaci peptidů dvourozměrnou kapalinovou chromatografií a identifikaci a
kvantifikaci proteinů na bázi vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (iTRAQ-2DLC-MS/MS).
Soubor 95 vybraných genů pak byl profilován na transkriptové úrovni. Statistika zahrnující
Spearmanovu korelaci odhalila dva klastry související se stavem lymfatických uzlin u low garde
karcinomů. Hladiny proteinů, změny jejichž exprese byly potvrzeny na proteinové i transkriptové
úrovni, byly dále sledovány pomocí imunohistochemie.
Kombinovaný přístup na bázi proteomiky a transkriptomiky ukázal statisticky významné zvýšení
proteinových resp. transkriptových hladin panelu 9 genových produktů u metastazujících low7
grade nádorů prsu ve srovnání s nemetastazujícími. Statistika zahrnující Spearmanovu korelaci
odhalila dva klastry související se stavem lymfatických uzlin u low grade karcinomů. Exprese
genů byla úspěšně validována na nezávislém souboru nádorů luminal A (N=343) pro CPB1
(p=0.00155), PDLIM2 (p=0.02027) a RELA (p=0.00015), na dalším nezávislém souboru
(N=1678) byla získána statisticky významná data ve vztahu k přežití pacientů. Naše výsledky
ukazují, že molekulární mechanismy metastazování u low-grade karcinomů prsu zahrnují
aktivaci proteolýzy, NF-κB dráhy, změny v hladinách cytoskeletálních a adhezních proteinů a
liší se od metastatických mechanismů známých u high-grade karcinomů.
Práce byla podpořena Grantovou agenturou ČR (projekt č. 14-19250S), Evropským fondem pro
regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI - RECAMO
CZ.1.05/2.1.00/03.0101), státním rozpočtem České republiky (NPU I-LO1413) a MZ ČR - RVO
(MOÚ, 00209805).
8
Od teček a čárek k optimalizaci terapie? Studium rezistence
nádorových buněk na antinukleosidy
Jiří Petrák a kol.
Ústav patologické fyziologie 1. LF UK
Vývoj rezistence na protinádorové látky je hlavní komplikací terapií nádorových onemocnění.
Výjimkou není ani lymfom z buněk plášťové zóny (MCL - mantle cell lymphoma), B-buněčný
lymfom s velmi špatnou prognózou. Součástí vícesložkové terapie MCL jsou také antinukleosidy, například cytarabin nebo fludarabin. Pomocí proteomických přístupů jsme
identifikovali deoxycytidin kinázu jako klíčový protein v rezistenci na anti-puriny i anti-pyrimidiny
u MCL. Kromě kauzální molekuly jsme identifikovali také několik dalších změněných buněčných
procesů a demonstrovali, že detailní popis molekulárních změn, ke kterým dochází v
rezistentních buňkách, umožňuje částečně predikovat účinnost jiných protinádorových látek
(předpovídat křížovou rezistenci nebo naopak zvýšenou citlivost). Proteomická analýza
buněčných populací z individuálních pacientů by se tak mohla v blízké budoucnosti stát cenným
nástrojem k individualizaci terapie nádorových onemocnění.
9
De profundis: Proteomická analýza transmembránových proteinů na
základě transmembránových peptidů
Ondřej Vít (1), Petr Man (2), Alan Kádek (2), Karel Harant (3), Eliška Doktorová (1), Gary
Woffendin (4), Michaela Ščigelová (4), Jiří Petrák (1)
(1) 1. lékařská fakulta UK v Praze, Ústav patologické fyziologie, (2) Mikrobiologický ústav
Akademie věd ČR, (3) Přírodovědecká fakulta UK v Praze, (4) Thermo Fischer Scientific
Zásadní část biologických procesů včetně signalizace, intracelulárního transportu, buněčné
adheze a rozličných metabolických drah závisí na transmembránových proteinech (TMP). Ačkoli
jsou kódovány téměř třetinou eukaryotických genů, jejich amfipatie a často nízká hladina
exprese způsobují, že značná část TMP zůstává při standardních proteomických analýzách
opomíjena, nebo je běžnými nástroji proteomiky zcela neanalyzovatelná. Mnoho postupů
vyvinutých přímo pro potřeby proteomiky TMP má potíž se značným zastoupením
kontaminujících abundantních solubilních proteinů mezi identifikovanými. Naší strategií
(založené na metodě publikované Wu & Blackler) proto byla snaha o kompletní proteolytickou
degradaci nemembránových částí proteinů z nahrubo izolovaných intaktních buněčných
membrán v kombinaci s odmýváním solubilních proteinů a posléze peptidů pomocí bazického
karbonátového pufru. Membránové segmenty TMP chráněné lipidickou dvojvrstvou jsou
následně doštěpeny CNBr, vzorek delipidován a analyzován LC-MS/MS. Tuto metodu jsme
otestovali na buňkách mantle cell lymfomu a identifikovali přes 800 TMP (dvě třetiny z celkového
počtu identifikací) pocházejících jak z plazmatické membrány, tak dalších organelárních
membrán. Většina těchto TMP byla identifikována na základě peptidů, které se překrývaly s
predikovanými transmembránovými segmenty. V kombinaci s vhodným značením (SILAC,
iTRAQ, atd.) může tato metoda posloužit jako doplnění ke standardní proteomické analýze, díky
kterému lze proniknout ke kvantifikaci dříve nepřístupných změn v membránovém proteomu a
eventuelně doplnit chybějící data ohledně funkce málo prostudovaných TMP.
10
Huntingtonova choroba optikou hmotnostní spektrometrie
Eva Kotrcova (1), Rita Sucha (1), Jirina Tyleckova (1), Jiri Dresler (2), Hana Kovarova (1)
(1) Ústav živočišné fyziologie a genetiky, Akademie věd ČR, Liběchov, ČR; (2) Vojenský
zdravotní ústav, Praha, ČR
Huntingtonova choroba (z angl. Huntington´s disease, HD) je autozomálně dominantní dědičné
onemocnění způsobené zmnožením CAG repetic v genu pro huntingtin (HTT). Translací tohoto
genu vzniká protein huntingtin (HTT) obsahující polyglutaminovou oblast ve své N-terminální
části. Tato mutace významně ovlivňuje konformaci HTT, jeho posttranslační modifikace,
proteolýzu a v neposlední řadě i schopnost interakce s dalšími proteiny. Tyto molekulární změny
vedou následně k rozvoji neurodegenerativních změn a klinických symptomů onemocnění.
Zvířecí modely HD vzniklé genetickými manipulacemi jsou klíčovým prostředkem pro testování
nových terapeutických přístupů v preklinické fázi výzkumu. Na našem ústavu byl vytvořen model
miniprasete transgenního pro lidský mutovaný HTT, nesoucí inzert o délce 548 aminokyselin se
124 glutaminy. Tento inzert se úspěšně předává napříč několika generacemi. Genotyp
transgenních zvířat obsahuje dvě alely kódující prasečí, endogenní HTT a jednu alelu kódující
výše zmíněnou část lidského, mutovaného HTT.
Sekvence lidského (mutovaného, transgenního) a prasečího (wild-type, endogenního) HTT se
liší v několika aminokyselinách, což umožňuje rozlišení druhově specifických forem HTT a
nezávisle kvantifikovat transgenní a endogenní formu proteinu pomocí metody SRM (z angl.
Selected reaction monitoring).
První krok tohoto projektu byl zaměřen na mozkovou tkáň, tkáň s nejvyšší koncentrací HTT. Na
tomto typu vzorku jsme optimalizovaly SRM metodu pro sadu peptidů HTT. Abychom mohly
kvantifikovat jednotlivé formy proteinu simultánně, sestavily jsme jednotlivé SRM metody pro tři
skupiny peptidů. Prvními dvěma skupinami jsou peptidy specifické pro endogenní a transgenní
formu, dále pak skupina peptidů společných pro obě formy proteinu, která poskytuje informaci o
celkové hladině HTT. Detekovatelné peptidy byly spojeny v multiplexní metodu SRM. Vývoj této
metody probíhal pomocí izotopicky značené verze každého z peptidů. Odpovídající tranzice byly
vybrány po přidání takto značených syntetických peptidů ke vzorku a změření celé metody v
časově definovaném režimu.
Vzhledem k preklinickým studiím, které si kladou za terapeutický cíl snižování hladiny HTT, bude
tato kvantitativní metoda, nezávislá na dostupných protilátkách, klíčovým přístupem pro
sledování hladin transgenního a endogenního HTT. Dalším krokem bude aplikace SRM metody
na vzorky cerebrospinální tekutiny a séra, které bude možné opakovaně odebírat v průběhu
rozvoje HD a případných léčebných zásahů.
11
Imunodeplece mozkomíšního moku
Eliška Doktorová, Ondřej Vít, Jiří Petrák
1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Ústav patologické fyziologie
Mozkomíšní mok je cenným zdrojem informací o stavu centrální nervové soustavy a tedy i
zdrojem potenciálních biomarkerů neurologických onemocnění. Je to komplexní tekutina,
vznikající filtrací krevní plazmy a sekrecí buňkami choroidního plexu v mozku. Složením je
plazmě podobná, ale celková koncentrace proteinů je v mozkomíšním moku zhruba padesátkrát
nižší. Analýza mozkomíšního moku je podobně jako analýza plazmy nebo séra
komplikována vysokým dynamickým rozsahem koncentrací jednotlivých proteinů a přítomností
několika abundantních bílkovin. Tento problém je zpravidla před vlastní analýzou řešen deplecí
několika nejhojnějších proteinů.
Jelikož v současné době neexistuje specifický imunodepleční systém pro mozkomíšní mok,
testovali jsme účinnost komerční imunodepleční kolony odstraňující 14 nejhojnějších proteinů
lidského séra (Agilent Human 14 MARS). Hodnotili jsme vliv použití kolony na počet
identifikovaných proteinů v porovnání s nedepletovaným mozkomíšním mokem. Zabývali jsme
se také identifikací proteinů, které se zachytili na depleční koloně.
Směsné vzorky lidského mozkomíšního moku byly depletovány pomocí manuální kolony,
štěpeny trypsinem a analyzovány pomocí LC-MS/MS. V depletovaném mozkomíšním moku
jsme identifikovali 743 proteinů, analýzou frakce zachycené na imunodepleční MARS koloně
jsme identifikovali 189 bílkovin, z nichž více než 100 nebylo pozorováno v depletovaném moku.
V nefrakcionovaném mozkomíšním moku jsme identifikovali jen 461 proteinů, z toho však 63
proteinů nebylo nalezeno v depletovaném vzorku ale ani ve frakci zachycené na MARS koloně.
Z výsledků vyplývá, že imunodeplece je z hlediska počtu identifikovaných proteinů i přes
vysokou cenu výhodná. Data rovněž ukazují, že analýza frakce bílkovin zachycených na
depleční koloně (která se zpravidla neprovádí) zvyšuje počet identifikovaných unikátních
proteinů zhruba o 12 procent. Počet proteinů identifikovaných analýzou obou frakcí po depleci
(celkem 850) může být dále zvýšen o 5-6 procent analýzou nefrakcionovaného mozkomíšním
moku.
Vzhledem k obtížné dostupnosti pacientských vzorků mozkomíšního moku (zvláště zdravých
kontrol) a jejich relativně nízkému objemu, je maximální využití vzorku nutností. Pro získání
maximální možné informace je tedy vhodné analyzovat kromě depletovaného mozkomíšního
moku také frakci zachycenou na depleční koloně a případně i nefrakcionovaný mozkomíšní
mok.
12
Radiosensibilizace nádorových buněk pomocí modulace autofagie:
fosfoproteomická analýza
Martin Ondrej (1), Lucie Čecháková (1), Petra Dvořáková (2), Lenka Hernychová (2),
Aleš Tichý (1)
(1) Katedra radiobiologie, Fakulta vojenského zdravotnictví v Hradci Králové, Univerzita obrany
v Brně, Česká republika; (2) Regionální centrum aplikované molekulární onkologie, Masarykův
onkologický ústav v Brně, Česká republika
Nádorová onemocnění jsou v dnešní době celosvětovým alarmujícím problémem. V České
republice vzrostl mezi roky 1998 a 2008 počet pacientů s nově diagnostikovaným nádorovým
bujením o 28 %. Nejvíce využívanými metodami v léčbě nádorových onemocnění jsou
radioterapie, chemoterapie a chirurgická léčba. Většina solidních nádorů je léčena pomocí
radioterapie. Četné nežádoucí účinky spojené s vyššími dávkami záření jsou však velkým
limitujícím faktorem radioterapie. Autofagie byla v tomto směru popsána jako mechanizmus
vedoucí k rozvoji radiorezistence. V poslední době se proto objevili studie, které využívají
modulaci autofagie ve prospěch radiosensibilizace nádorových buněk. Ukazuje se, že jak
inhibice, tak i aktivace autofagie má vliv na radiosensibilizaci nádorových buněk.
Tato práce se zabývá studiem nedávno syntetizovaných inhibitorů autofagie, spautin-1 a Lys05,
jako potenciálně radiosensibilizujících látek. Cílem je monitorovat vliv inhibitorů na
radiosensibilizaci nádorových buněk. Pro experimenty byla zvolena modelová buněčná linie
nemalobuněčného karcinomu plic H1299, jako reprezentativní nádorové onemocnění léčené
primárně radioterapií. V úvodní části studie byla zavedena metoda SILAC, která bude
aplikována pro zjištění signálních drah podílejících se na radiosensibilizaci, a to vzájemnou
komparací ozářených a neozářených buněk. Další experimenty budou zaměřeny na identifikaci
konkrétních proteinů/fosfoproteinů signálních drah, které mají hlavní regulační úlohu
v radiosensibilizaci nádorových buněk.
13
Cílená proteomická analýza vysoce rizikových toxinů
Alena Fučíková, Jiří Dresler, Zuzana Kročová
Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany, Hradec Králové
Proteinové toxiny (rostlinné, bakteriální) jsou díky snadnému způsobu izolace a vysoké toxicitě
snadno zneužitelným nástrojem v oblasti bioterorismu. Cílená proteomická analýza (SRM,
Selected Reaction Monitoring) je schopna díky své citlivosti, selektivitě a dobré
reprodukovatelnosti zabezpečit detekci, identifikaci a případnou kvantifikaci minimálních
množství těchto látek z komplexních matric. V rámci jedné metody je možné sledovat velké
množství vybraných toxinů najednou, a i proto je SRM vhodným nástrojem pro rychlou analýzu
neznámých vzorků.
Cílem naší práce bylo vyvinout SRM metodu pro tyto toxiny: ricin, stafylokokový enterotoxin B,
vybrané toxiny Clostridium perfringens a botulinové neurotoxiny, a ověřit aplikovatelnost této
metody na předem zvolených komplexních matricích (zemina, rašelina, písek, sušené mléko,
homogenát živočišné tkáně, homogenát rostlinné tkáně, oblečení).
Pro vývoj metody byly použity dostupné nebo připravené standardy toxinů a zároveň bylo
využito syntetických izotopicky značených ekvivalentů vybraných peptidů, díky nimž byla
prováděna kvantifikace toxinů na peptidové úrovni. Tyto peptidy byly vybrány s ohledem na
jejich unikátnost a další vlastnosti, zabezpečující jejich bezproblémové použití při SRM analýze.
Vlastní měření probíhá v uspořádání nanoHPLC on-line nanoESI/QTRAP 4000 (ABSciex),
vyhodnocovací a procesovací platforma Mascot/Skyline/GraphPAD.
Nejprve byly analyzovány čisté roztoky toxinů o známých koncentracích s přídavkem
syntetických izotopicky značených peptidů, nyní probíhá testování stejných roztoků, přidávaných
k jednotlivým matricím. Koncentrace jednotlivých toxinů jsou pro porovnání testovány též
pomocí rychlých detekčních kitů, kterými disponuje AČR (Environics, KDTB).
Práce je podporována formou veřejné zakázky Ministerstva vnitra České republiky
VF20122015024.
14
Studium mitochondriálních knockout modelů pomocí kvantitativní
proteomiky.
Marek Vrbacký (1), Vojtěch Tambor (2), Karel Harant (3), Jana Kovalčíková (1),
Tomáš Mráček (1), Josef Houštěk (1)
(1) Oddělení Bioenergetiky, Fyziologický ústav AV ČR, Praha; (2) Centrum biomedicínského
výzkumu, FN Hradec Králové; (3) BIOCEV a PřF UK, Praha
Mitochondrie jsou buněčné organely zodpovědné za produkci ca. 90% klíčové molekuly
energetického metabolismu - ATP. Syntézu ATP zajišťuje mitochondriální ATP syntáza, která
společně s respiračním řetězcem tvoří tzv. oxidačně fosforylační systém (OXPHOS). Savčí
mitochondriální proteom sestává z cca 1500 proteinů (13 je kódováno mitochondriální DNA),
jejichž defekty jsou příčinou celé řady závažných mitochondriálních chorob. K objasnění
mechanismu patologických mutací se s úspěchem používají knockout modely a právě tato
technologie ve spojení s kvantitativní shotgun proteomickou analýzou bude krátce představena.
A to jak na modelu defektu proteinu TMEM70, který se účastní biogeneze ATP syntázy
(CRISPR-Cas9 knockout HEK293, SILAC analýza), tak na potkaním knockout modelu strukturní
podjednotky ATP syntázy (label-free, LFQ analýza).
15
Proteomická analýza moči laboratorních potkanů u experimentálního
modelu renální denervace
Michaela Balášová (1), Giovanna Castoldi (2), Andrea Stella (2), Martin Petřek (3),
Marek Šebela (1)
(1) Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého v Olomouci; (2) Universita' Milano-Bicocca,
Monza, Itálie; (3) Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci
Renální denervace představuje novou možnost léčby rezistentní-hypertenze. Dosud však nejsou
k dispozici biomarkery vhodné k posouzení úspěšnosti zákroku. Kvůli hledání markerových
proteinů jsme charakterizovali močový proteom laboratorních potkanů. V první fázi bylo nutné
optimalizovat metodiku zahrnující izolaci proteinů, jejich separaci, štěpení a následnou analýzu
peptidových frakcí pomocí hmotnostní spektrometrie ve spojení s kapalinovou chromatografií.
Na počátku byla užita moč potkanů před chirurgickou renální denervací (kontrola), po renální
denervaci a po falešné („sham“) denervaci. Jednotlivé vzorky byly připraveny spojením moči
odebrané u více pokusných zvířat („pools“). Metodika analýzy močového proteomu byla
optimalizována v pořadí acetonová precipitace proteinů z moči, rozpuštění precipitátu v
redukčním Laemmliho vzorkovém pufru, SDS-PAGE, štěpení trypsinem ve frakcích gelu,
odsolení peptidů z trypsinových digestů a konečná separace peptidů kapalinovou chromatografií
na obracené fázi v nanoprůtokovém uspořádání. K identifikaci proteinů se využívalo
hmotnostních spektrometrů: online spojení chromatografu s přístrojem ESI-Q-ToF a offline
spojení s přístrojem MALDI-ToF/ToF. Ve výsledku je k dispozici přibližně 200 identifikovaných
proteinů, z nichž porovnáním zastoupení identifikací mezi vzorky po denervaci a falešné
denervaci bylo možné odhalit některé proteiny, které již byly v literatuře popsány v souvislosti se
záněty a chorobami ledvin (např. alfa-1-antiproteinasa, kadherin-1, CD44 antigen, fibronektin,
meprin A, VEGFR-2 aj.). K posouzení použitelnosti těchto proteinů jako biomarkerů renální
denervace však budetřeba dalších experimentů.
Tato práce byla podpořena projekty Studentské grantové soutěže IGA_PrF_2015_026 a
IGA_LF_PU_2015_020.
16
Studium močového proteomu pacientů s IgA nefropatií
P. Přikryl, L. Vojtová, D. Maixnerová, M. Vokurka, T. Zima, V. Tesař
Ústav patologické fyziologie, 1. LF UK Praha; Ústav lékařské biochemie a laboratorní
diagnostiky, VFN a 1. LF UK Praha; Klinika nefrologie, VFN a 1. LF UK Praha
Proteinurie je často využívaným ukazatelem při sledování a predikci stavu pacientů s
chronickým onemocněním ledvin, není však příliš specifická. IgA nefropatie patří celosvětově k
nejčastějším primárním glomerulopatiím; terminálního stádia onemocnění ledvin je dosaženo asi
u 50 % pacientů během 30 let s nutností transplantace ledvin. Vývoj neinvazivních
diagnostických testů by mohl být užitečný pro detekci subklinických typů IgA nefropatie,
hodnocení aktivity onemocnění či sledování progrese a hodnocení účinnosti léčby onemocnění.
Hlavním cílem této práce bylo porovnat rozdíly v proteomech močí pacientů s IgA nefropatií a
zdravých kontrol a pokusit se identifikovat významně změněné proteiny jako potenciální
biomarkery onemocnění ledvin.
V pilotním projektu byly studovány vzorky močí 20 pacientů se stabilní funkcí ledvin
posuzovaných na základě koncentrace sérového kreatininu, hladin eGFR a denní proteinurie ve
srovnání se zdravými jedinci. K analýze byly použity různé proteomické přístupy. Jednotlivé
metody a data získaná těmito metodami byla vzájemně porovnána.
Tento výzkum byl podpořen projekty RVO-VFN64165 a AZV 15-31662A.
17
Porovnání vybraných kardiovaskulárních onemocnění pomocí iTRAQ
analýzy
Helena Řehulková (1), Pavel Řehulka (1), Alena Myslivcová Fučíková (1), Jiří Stulík (1),
Radek Pudil (2)
(1) Katedra molekulární patologie a biologie, Fakulta vojenského zdravotnictví Univerzity obrany,
Třebešská 1575, 50001 Hradec Králové; (2) 1. interní kardioangiologická klinika, Fakultní
nemocnice v Hradec Králové, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové
Včasná diagnostika některých kardiovaskulárních onemocnění je důležitým aspektem při léčbě
těchto typů onemocnění. Tato práce byla zaměřena na detekci proteinů se změněnou
koncentrací v lidské plazmě u těchto onemocnění: hypertrofická kardiomyopatie, dilatační
kardiomyopatie, ischemická choroba srdeční, aortální stenóza a arteriální hypertenze. Porovnání
proteinových profilů s kontrolní skupinou bylo provedeno pomocí iTRAQ techniky určené pro
relativní kvantifikaci proteinů. Zpracování dat ukázalo některé významné rozdíly a souvislosti
mezi jednotlivými kardiovaskulárními onemocněními.
Tato práce byla podpořena grantem ministerstva zdravotnictví České republiky č. NT13721.
18
Abstrakty
Pátek, 27. 11. 2015
19
Proteomická analýza buněčných jader ječmene izolovaných
průtokovou cytometrií
Jana Uřinovská (1), Ivo Chamrád (1), Hana Jeřábková (2), Nicolas Blavet (3), René Lenobel (1),
Beáta Petrovská (2), Jaroslav Doležel (2), Marek Šebela (1)
(1) Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Univerzita Palackého v
Olomouci, Oddělení biochemie proteinů a proteomiky, Olomouc, Česká republika; (2) Centrum
regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Laboratoř strukturní a funkční
genomiky ÚEB AV ČR, v.v.i., Oddělení proteomiky buněčných struktur, Olomouc, Česká
republika; (3) Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Laboratoř
strukturní a funkční genomiky ÚEB AV ČR, v.v.i., Oddělení bioinformatiky, Olomouc, Česká
republika
U eukaryotních buněk je většina genetické informace uložena v buněčném jádře. Proto se také
téměř všechny procesy související s DNA, společně s jejich regulačními drahami, odehrávají v
této důležité organele. Efektory těchto biologických dějů jsou jaderné proteiny a tak je pro jejich
úplné pochopení charakterizace jaderného proteomu zcela nezbytná. Z hlediska složitosti
uvažovaného vzorku se jako ideální nástroj pro komplexní studie jaderných proteinů jeví metody
moderní proteomiky. O tom také svědčí dlouhá řada vědeckých prací z poslední dekády, ve
kterých byly rozličné proteomické techniky využity pro analýzu jader živočišných buněk. Na
tomto místě je však potřeba říci, že na poli rostlinné proteomiky jsou publikace věnované
jaderným proteinům spíše vzácností. Abychom tuto nerovnováhu alespoň mírně napravili a vrhli
trochu nového světla na “temnou proteinovou hmotu” rostlinného jádra, vyvinuli jsme nový
protokol, který kombinuje izolaci rostlinných jader pomocí průtokové cytometrie s hmotnostní
analýzou extrahovaných proteinů. Tato metodika umožnila úspěšnou identifikaci více než 800
různých jaderných proteinů ječmene v jediném proteomickém experimentu. Následná analýza
GO pojmů poté potvrdila, že absolutní majorita těchto proteinů s jadernými funkcemi opravdu
souvisela (Petrovská et al., 2014). V této přednášce budou prezentovány předběžné výsledky
aplikace této metody pro systematické studium proteinů izolovaných z jader kořínků ječmene v
různých fázích buněčného cyklu.
Odkazy: Petrovská B. et al., Cytogenet. Genome Res. 143, 78-85 (2014).
20
MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie intaktních spor a proteomická
analýza rostlinných patogenů rodu Puccinia
Jana Beinhauer (1), Martin Raus (1), Alena. Hanzalová (2), Pavel Horčička (3),
Marek Šebela (1)
(1) Oddělení biochemie proteinů a proteomiky, Centrum regionu Haná pro biotechnologický a
zemědělský výzkum, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, Šlechtitelů 27,
CZ-783 71 Olomouc, Česká Republika; (2) Oddělení genetiky a šlechtitelských metod,
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., Drnovská 507/73, CZ-161 06, Praha 6 – Ruzyně,
Česká Republika; (3) Selgen a.s., Šlechtitelská stanice Stupice, Stupice 24, 250 84 Sibřina,
Česká Republika
Rez je houbové onemocnění rostlin, způsobené obligátními biotrofními patogeny. Nejzávažnější
ztráty pšenice a dalších obilnin jsou způsobeny zástupci rodu Puccinia. Tyto druhy vytvářejí
takzvané specializované formy (formae speciales, f. sp.), které napadají pouze jeden druh
hostitelské rostliny nebo mají omezený počet hostitelů ve skupině. V rámci jednoho druhu, či
formae speciales můžeme popsat různé typy fyziologických ras (patotypů), které jsou
charakterizovány specifickou reakcí (virulencí/avirulencí) k danému genotypu hostitelské
rostliny. Přestože chemické ošetření snižuje ztráty způsobené napadením hostitelské rostliny
(pšenice), je finančně nákladné. Mnohem ekonomičtějším a ekologickým způsobem ochrany
před patogeny je šlechtění a pěstování odolných kultivarů. Navzdory doposud vyšlechtěným
rezistentním odrůdám pšenice, vznik a rychlé šíření nových virulentních ras (patotypů) rzí stále
překonává jejich rezistenci. V praxi je určování a rozlišování patotypů časově a manuálně velmi
náročné, nabízí se tedy možnost využití analýzy intaktních spor (IS) pomocí hmotnostní
spektrometrie (MS) využívající laserové desorpce/ionizace za účasti matrice (matrix-assisted
laser desorption/ionization, MALDI) ve spojení s analyzátory doby letu (time-of-flight, TOF) k
rychlejší analýze a určování rzí. Cílem této práce byla optimalizace IS MALDI-TOF MS metody
pro analýzu rzí. Všechny optimalizace byly provedeny se rzí pšeničnou (P. triticina).
Experimenty představovaly výběr vhodných promývacích roztoků, nalezení optimální
koncentrace spor v suspenzi, volbu MALDI matrice, stejně tak jako hodnocení různých technik
nanášení vzorku na MALDI destičku. Nejlepší výsledky byly získány při omývání spor roztokem
obsahujícím acetonitril a 0,1% (v/v) trifluoroctovou kyselinu v poměru 7:3 (v/v). Směs matric
kyseliny ferulové a sinapové (5:15 mg/ml) rozpuštěných v roztoku acetonitril/2.5% (v/v)
21
trifluoroctová kyselina (7:3, v/v) byly nalezeny jako optimální pro nanášení vzorku (50 mg
spor/ml) pomocí techniky dvou vrstev (two-layer volume, 2LV). Optimalizovaný protokol byl
následně aplikován na další zástupce rodu Puccinia (P. graminis, P. striiformis a P. coronata).
Při srovnání hmotnostních spekter představujících unikátní peptidové/proteinové profily
jednotlivých patogenů jsme byli schopni s pomocí programu BIOSPEAN rozlišit mezi sebou
nejen druhy, ale i různé patotypy těchto druhů. Navíc jsme identifikovali 40 a 30 proteinů
extrahovaných ze spor P. striiformis a P. graminis do roztoku představujícího rozpouštědlo
matrice. Vedle přítomnosti ribosomálních proteinů, histonů a proteinů vztahujících se k
patogenezi jsme identifikovali také extracelulární proteiny účastnící se patogeneze. Nakonec
jsme u každého z patogenů přiřadili tři proteiny, které by pravděpodobně mohly náležet třem
signálům viditelným v jejich typických hmotnostně-spektrometrických profilech a navrženy jako
diagnostické markery.
22
MALDI-TOF MS profilování bakterií a potravin
Ondrej Šedo
CEITEC, Masarykova univerzita
Během posledních pěti let se instrumentace pro MALDI-TOF MS stala nedílnou součástí
klinických laboratoří. Na základě přímé analýzy celých bakteriálních buněk či jejich extraktů jsou
touto technikou získávány charakteristické proteinové profily, které slouží k identifikaci
bakteriálních patogenů. Základními výhodami metodami jsou její rychlost a diskriminační
schopnosti.
Vedle klinické diagnostiky nalézá MALDI-TOF MS využití v mikrobiální analýze vzorků i z dalších
zdrojů, například v potravinářství. Na základě MALDI-TOF MS profilů je možné identifikovat
mikrobiální kontaminaci masných výroků či rozlišit kmeny laktobacilů. Vedle nesporných výhod
však v některých případech diskriminační schopnosti neumožňují rozlišení blízce příbuzných
bakteriálních kmenů. Pro tento účel byly vyvinuty dvě varianty standardního protokolu přípravy
vzorku, založené na přímé detekci vysokomolekulárních proteinových komponent, či mikrovlnné
proteolýze vzorku.
Aplikovatelnost přímé MALDI-TOF MS analýzy však není omezena pouze na mikrobiologii.
Přímou analýzou vzorků ječmene a piva lze například získat informace použitelné pro kontrolu
pivovarnického procesu.
Práce byla uskutečněna za podpory Středoevropského technologického institutu (CEITEC)
financovaného z Evropského fondu pro regionální rozvoj (projekt CZ.1.05/1.1.00/02.0068) a s
podporou projektu GAČR, projekt 13-26693S.
23
Potřebujeme stále nanosprej?
Juraj Lenčo, Marie Vajrychová, Kristýna Pimková, Vojtěch Tambor, Marian Kacerovský
Katedra molekulární patologie a biologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany
Hradec Králové; Centrum biomedicínského výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec Králové,
Hradec Králové; Porodnická a gynekologická klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové,
Hradec Králové
Vzhledem k mnohdy omezenému množství nebo dostupnosti počátečního biologického
materiálu jsou proteomické vzorky na hmotnostních spektrometrech rutinně analyzovány v nanokonfiguraci, tj. ve spojení s nano-kapalinovým chromatografem a nanosprejem. Některé studie
ukázaly, že s vývojem vysoce citlivých hmotnostních spektrometrů pro cílené proteomické
analýzy vybavených velice efektivním ionizačním rozhraním toto paradigma přestává platit. V
naší studii jsme se snažili zjistit, jestli je posun od nano-konfigurace ke LC-MS konfiguracím s
vysokým průtokem životaschopný také pro globální proteomické analýzy. Pro získání
srovnávacích dat jsme nejprve analyzovali vzorky připravené z HeLa buněk pomocí nanokapalinové chromatografie spojené přes nanosprej s Q Exactive Plus hmotnostním
spektrometrem. Počty identifikovaných proteinů, peptidů a spekter byly následně porovnávány s
daty, které jsme získali z totožného vzorku na totožném hmotnostním spektrometru, který byl
však spojen přes standardní ESI rozhraní s analytickým kapalinovým chromatografem. Po
několika kolech optimalizací jsme zjistili, že ve vysoko-průtokové konfiguraci lze dosáhnout
srovnatelného počtu identifikací jen s překvapivě mírně navýšeným množstvím analyzovaného
materiálu, které neodpovídá teorii. Takto optimalizovaná vysoko-průtoková LC-MS konfigurace
byla použita pro analýzu proteomu lidské plodové vody a dalších vzorků. Naše data vyvracejí
zažité dogma, že k provádění globálních proteomických analýz je bezpodmínečně nutné
pořízení nano-kapalinového chromatografu a nanospreje.
Práce byla podpořena projektem Ministerstva zdravotnictví ČR: IGA NT/13599.
24
„Label-free“ kvantifikace v proteomice za využití softwaru MaxQuant a
jeho LFQ algoritmu
Kristýna Pimková (1), Marie Vajrychová (2), Petra Domašinská (3), Marian Kacerovský (4,5);
Martin Vališ (6), Juraj Lenčo (2), Vojtěch Tambor (1)
(1) Centrum biomedicínského výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec Králové, Hradec Králové;
(2) Katedra molekulární patologie a biologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany
Hradec Králové; (3) Katedra biologických a biochemických věd, Fakulta chemickotechnologická, Univerzita Pardubice, Pardubice; (4) Porodnická a gynekologická klinika, Fakultní
nemocnice Hradec Králové, Hradec Králové; (5) Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzity
Karlova v Praze, Hradec Králové; (6) Neurologická klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové,
Hradec Králové
Hmotnostní spektrometrie (MS) je významným nástrojem proteomiky, který umožňuje kvalitativní
i kvantitativní analýzu tisíců různých proteinů. V posledních letech se díky dynamickému vývoji v
přípravě vzorku, separaci a hlavně zpracování dat začala MS hojně využívat též ke stanovení
hladin proteinů. Donedávna, byla globální kvantifikace proteinů v klinických vzorcích hmotnostní
spektrometrií prováděna především pomocí značících technik. V současné době zaznamenávají
velký nárůst obliby metody, které však značek nevyužívají tzv. „label-free“ metody. Výhodou
„label free“ kvantifikace je možnost kvantifikovat a porovnat neomezený počet vzorků. „Label
free“ kvantifikace též nespoléhá na volné N- konce peptidů k navázání značky, tudíž je možné
kvantifikovat také peptidy, které mohou být na N- konci posstranslačně modifikované. To je
velkou výhodou např. u stanovení hladin nativních peptidů, tj. takových, které nebyly štěpené
trypsinem nebo jinou proteasou in vitro. Avšak velkou výzvou při label-free kvantifikaci je zajistit
reprodukovatelnost a shodné podmínky napříč vzorky během jejich přípravy i během vlastní
analýzy. S tímto problémem se potýkají vyhodnocovací programy, kdy většina z nich zmíněné
podmínky pro správnou kvantifikaci vyžaduje. Nedávno vyvinutý MaxLFQ algoritmus, s nímž
pracuje volně dostupný program MaxQuant, využívá maxima možných informací získaných ze
signálu MS k výpočtu množství proteinu s ohledem na to, že množství kvantifikovatelných
peptidů se liší vzorek od vzorku. V naší práci jsme se zabývali label-free kvantifikací s využitím
MaxQuantu u modelového experimentu peptidů Escherichia Coli a buněk „Chinese hamster
ovary“ u nativních peptidů plodové vody u pacientů s předčasným odtokem plodové vody a u
trypsinem štěpených proteinů cerebrospinální tekutiny u pacientů s Alzheimerovou chorobou.
Práce byla podpořena projektem Ministerstva zdravotnictví ČR: IGA NT/13599.
25
MALDI-TOF mass spectrometry-based typing of phlebotomine sand
flies
Kristýna Hlavačková (1), Daniel Kavan (2), Vít Dvořák (1), Petr Volf (1), Petr Halada (2)
(1) Institute of Microbiology of the ASCR, v.v.i., Prague, Czech Republic; (2) Department of
Parasitology, Faculty of Science, Charles University in Prague, Czech Republic
Phlebotomine sand flies are exclusive biological vectors of leishmaniases, which are endemic in
98 countries worldwide. This group of important human and veterinary diseases put about 350
million people at risk and have a prevalence of 12 million cases per year. Rapid and accurate
tools for identification of vector arthropods are of a paramount importance in surveillance
programmes that are becoming more common due to the changing geographic occurrence of
many arthropod-borne diseases. Classical morphological identification of sand flies is rather
tricky and time-consuming and molecular approaches are labour-intensive and quite expensive.
To overcome the limitations of traditional techniques we established MALDI-TOF MS protein
profiling as a simple and reliable method for fast discrimination of sand flies [1].
Six laboratory-reared colonies (genus Phlebotomus) belonging to five different species were
studied to evaluate the discriminatory power of MALDI-TOF MS for sand fly species
identification. Thoraxes with legs and wings were manually homogenized in a microtube with 10
µl of 25% formic acid, mixed with matrix and spotted on MALDI target plate. Protein patterns
were measured on an Ultraflex III MALDI-TOF mass spectrometer within a mass range 3-25
kDa, processed under control of MALDI Biotyper software and evaluated using PCA or cluster
analysis. The analyzed Phlebotomus species generated intense and reproducible protein
spectra with a high number of species-specific peaks allowing reliable taxonomical classification
of sand flies as was proved by hierarchical cluster analysis. The unique peptide/protein masses
were present independently of age, gender, and different periods of storage in ethanol. To
investigate the effect of storage time, protein spectra of specimens kept in 70% ethanol for 3, 39
and 75 days were compared. The protein patterns for all storage length conditions were
reproducible and enabled unambiguous species differentiation even after longer period of
storage in ethanol. Additionally, the approach differentiated all but two specimens of
Phlebotomus sergenti from laboratory colonies originating from two geographically distant
regions. Our results suggest that protein profiling by MALDI-TOF MS can serve as a promising
method for rapid and accurate identification of phlebotomine sand flies.
[1] Dvorak V., Halada P., Hlavackova K., Dokianakis E., Antoniou M., Volf P.: Parasites &
Vectors 7:21, (2014).
This work has been supported by the Grant Agency of the Czech Republic (GA15-04329S) and
by the Institutional Research Project of the Institute of Microbiology (RVO61388971).
26
Proteom nervových kmenových buněk a jeho studium v průběhu
cílené diferenciace
Martina Žižková (1), Rita Suchá (1), Dáša Doležalová (2), Hana Kovářová (1)
(1) Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, v.v.i., Liběchov, Česká republika; (2) Ústav
histologie a embryologie, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika
Nervové kmenové buňky jsou multipotentní buňky, které díky své schopnosti diferencovat v
neurony a gliové buňky mohou být použity při léčbě neurodegenerativních onemocnění či
míšního poškození. Pro využití v klinické praxi musí být buňky velmi podrobně charakterizovány,
proto je naší snahou studium proteomu lidských nervových kmenových buněk v průběhu
neuronální diferenciace indukované diferenciačními faktory BDNF (Brain Derived Neurotrophic
Factor) a GDNF (Glial cell line Derived Neurotrophic Factor). K získání kvantitativní informace o
známých proteinových markerech vývojových stádií neuronů využíváme metodu cílené
hmotnostní spektrometrie, konkrétně SRM (Selected Reaction Monitoring), namísto hojně
používané imunocytochemie.
Provedli jsme analýzu vybraných proteinových markerů u několika typů buněk odvozených od
pluripotentních embryonálních kmenových buněk, od multipotentních nervových kmenových
buněk, přes diferencované neurony až po gliové buňky (oligodendrocyty i astrocyty). Posuzovali
jsme možnost detekce těchto proteinů a jejich vhodnost pro kvantifikaci v konkrétních
buněčných typech. Podařilo se nám připravit metodu pro monitorování neuronálních markerů
(doublecortin, βIII- tubulin a Map2), jejichž hladina podle očekávání s diferenciací roste, zatímco
hladina markerů nervových kmenových buněk (nestin a Sox2) klesá. Pro odhalení přítomnosti
podpůrných gliových buněk jsme sledovali i hladiny proteinů, jako jsou GFAP, S100B, GalC či
Olig1. Abychom vyloučili přítomnost pluripotentních buněk v kultuře, monitorovali jsme hladinu
proteinu Oct4. Na základě SRM analýzy vybraných proteinových markerů jsme potvrdili, že
přítomnost faktorů BDNF a GDNF spouští cílenou diferenciaci nervových kmenových buněk do
neuronů.
27
Velké nesnáze s malými peptidy
Marie Vajrychová (1), Kristýna Pimková (2), Vojtěch Tambor (2), Marian Kacerovský (2,4), Petra
Domašinská (2,4), Juraj Lenčo (1)
(1) Katedra molekulární patologie a biologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita
obrany, Hradec Králové; (2) Centrum biomedicínského výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec
Králové; (3) Porodnická a gynekologická klinika, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v
Hradci Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové; (4) Katedra biologických a biochemických
věd, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice
Endogenní peptidy vznikají nespecifickým štěpením in vivo, tedy jejich analýza může přinést
nové poznatky o proteolytické aktivitě v přímé souvislosti s probíhajícím patologickým procesem.
I přes velký potenciál je ale peptidomika stále velkou výzvou z hlediska přípravy vzorku,
samotné analýzy a vyhodnocení experimentálních dat. V této práci bychom rádi upozornili na
možná úskalí analýzy endogenních peptidů přítomných v plodové vodě a také prezentovali
konkrétní řešení v podobě optimalizované přípravy vzorku a uspořádání chromatografické
separace.
Práce byla podpořena projektem Ministerstva zdravotnictví ČR: IGA NT/13599.
28
Porovnání různých metod přípravy vzorku po imunoprecipitaci
Karel Harant
Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy, Praha
V přípravě na rozsáhlejší studii jsme porovnávali různé postupy přípravy IP vzorku s ohledem na
následnou hmotnostně spektrometrickou analýzu. Srovnán byl vliv použitých detergentů na
efektivitu eluce a výtěžek z imunoprecipitačního experimentu. Do porovnání bylo zařazeno i
štěpení proteinu přímo na kuličkách nosiče, bez elučního kroku. Naměřená data byla porovnána
pomocí MaxQuant LFQ.
29
Studium vlivu ligninolytické houby Pleurotus ostreatus na bakterii
Rhodococcus erythropolis
Denisa Petráčková, Barbora Kozická, Silvia Bezoušková, Petr Halada a Kateřina Svobodová
Mikrobiologický ústav, AV ČR, v.v.i., Praha, Česká republika
Směsná houbová i bakteriální společenstva se běžně v přírodních ekosystémech vyskytují.
Nicméně mnohá vědecká pojednání řešící otázky související např. s biodegradacemi xenobiotik
tyto studie provádějí s čistými houbovými kulturami. Přesto tyto vzájemné mezidruhové interakce
půdních partnerů mohou mít zásadní vliv na fyziologický, resp. metabolický aparát jednoho z
účastníků. Naše studie ukazuje, jaký vliv má kultivační tekutina z dřevokazné houby bílé hniloby
Pleurotus ostreatus na celkovou fyziologii gram-pozitivní bakterie Rhodococcus erythopolis,
která patří k půdním organismům schopným odbourávat celou řádu polutantů (např. fosilní
paliva).
Kultivační tekutina byla získána po 14 denní kultivaci Pleurotus ostreatus v MEG médiu a v této
tekutině byly následně bakterie aerobně po dobu 24 hod kultivovány a sledovány fyziologické
parametry růstu. Získané bakteriální lyzáty byly separovány pomocí 1-D a 2-D SDS-PAGE
elektroforézy. Výsledkem proteomových analýz bylo určeno 8 signifikantně se měnících bílkovin
z celkového počtu 800-1000 detekovatelných bílkovin (barveno fluorescenčně Sypro®Ruby).
Vybrané bílkovinné spoty byly identifikovány pomocí MS. Navíc používaná kultivační tekutina z
houby byla podrobena GC-MS analýze ve snaze identifikovat v ní obsažené nízkomolekulární
látky.
Tento výzkum byl podporován z výzkumného záměru MBÚ AV ČR, RVO: 61388971 a bylo
použito technické vybavení (FX Molecular Imager) podporované ze strukturálních fondů
(C4Sys).
30
Výroba rekombinantního toxinu beta2 Clostridium perfringens
Miloslava Ďuráčová (1), Valeria Sheshko (1), Alena Myslivcová Fučíková (1),
Jana Klimentová (1), Jiří Dresler (2)
(1) Katedra molekulární patologie a biologie, Fakulta vojenského zdravotnictví Univerzity obrany,
Třebešská 1575, 50001 Hradec Králové; (2) Vojenský zdravotní ústav,Tychonova 1, 160 01
Praha 6
Clostridium perfringens, gram pozitivní anaerobní tyčinkovitá sporulující bakterie z rodu
Clostridium, je mimo jiné jeden z nejvýznamnějších střevních patogenů u lidí a zvířat. Vysoká
virulence C. perfringens je spojena s produkcí různých enterotoxinů a exotoxinů v závislosti na
konkrétním toxigenním typu (A-E). Gen cpb2, lokalizovaný na plazmidu, kóduje 28 kDa velký
beta2 exotoxin produkovaný C. perfringens (typ A). Cílem práce byla příprava vzorků
rekombinantních proteinů beta2 Clostridium perfringens pro pozdější detekci na hmotnostním
spektrometru. Základním krokem přípravy rekombinantního proteinu byla izolace genu
kódujícího požadovaný protein a následné namnožení cílového genu pomocí PCR. Dále vložení
genové sekvence do vektoru – plazmid pET28b(+) za pomocí DNA ligázy. Konstrukt byl
transformován do expresního systému T7 Express Competent E. coli. Finálním krokem byla
purifikace pomocí Stre-tag purifikačního systému. Peptidy byly separovány pomocí kapalinové
chromatografie na přístroji Ultimate 3000 RSLCnano (Dionex) a dále analyzovány na přístroji QExactive (Thermo Scientific) připojeném on-line přes Nanospray Flex iontový zdroj.
Práce byla podporování v rámci projektu: Databáze typizačních znaků biologických agens VF
20152016039.
31
Objasnenie mechanizmov úspešného rastu a reprodukcie ľanu v
kontaminovanom prostredí Černobylu
Maksym Danchenko (1), Dáša Gabrišová (2), Ľudovít Škultéty (1), Namik Rashydov (3),
Martin Hajdúch (2)
(1) Virologický ústav, Slovenská akadémia vied; (2) Ústav genetiky a biotechnológie rastlín,
Slovenská akadémia vied; (3) Ústav bunkovej biológie a génového inžinierstva, Národná
akadémia vied Ukrajiny
Divoká flóra prosperuje v okolí miesta havárie Černobyľskej jadrovej elektrárne, a to napriek
značnej zostávajúcej rádioaktívnej kontaminácie. Schopnosť rastlín prežiť a úspešne sa množiť
v takom drsnom prostredí je neočakávaná a stále neobjasnená. Cieľom našej štúdie bolo
zhodnotiť reakcie ľanu (Linum usitatissimum L.) počas dozrievania semien na molekulárnej
úrovni pomocou porovnávacej proteomiky.
Tretia generácia ľanu bola pestovaná v čistej a rádionuklidmi znečistenej pôde v blízkosti
Černobylu. Semená boli zbierané s časovými odstupmi dvoch, štyroch a šiestich týždňov po
odkvitnutí, a taktiež po dozretí. Následne sa z nich proteíny extrahovali, ktoré boli ďalej
analyzované pomocou dvojrozmernej gélovej elektroforézy (2-RE) a farbené koloidným
Coomassie. Na identifikáciu proteínov sme použili separáciu tryptických peptidov pomocou
kvapalinovej chromatografie s nasledujúcou tandemovou hmotnostnou spektrometriou a
vyhľadávanie v druhovo špecifickej databáze.
Určili sme párované profily prítomnosti pre 130 spotov z 2-RE, čo znamená profily rovnakých
spotov počas vývinu semien z čistej ako aj kontaminovanej pôdy. Na základe štatistickej
analýzy sme vyhodnotili 39 rozdielnych profilov medzi dvomi experimentálnymi podmienkami.
Identifikovali sme 30 proteínových izoforiem, z toho 19 unikátnych. Najväčšia funkčná skupina
obsahovala 17 zásobných proteínov. Tridsaťšesť percent 2-RE spotov mali odlišnú prítomnosť,
pretože obsahovali fragmenty zo skupiny cupin-podobných proteínov. Väčšina týchto
fragmentov bola odvodená z N-koncovej časti natívnych cupinov. Tieto výsledky sú v súľade s
našimi predchádzajúcimi publikovanými údajmi o vývine semien ľanu druhej generácie na území
Černobylu. Navyše sme zistili, že predpokladaný regulátor transkripcie DJ-1 a cinnamyl-alkohol
dehydrogenáza boli prítomné vo zvýšenom množstve počas vývinu semien v kontaminovanej
oblasti.
Predpokladáme, že fragmentácia cupinov je dôležitý proces prispievajúci k úspešnému rastu a
rozmnožovaniu ľanu v rádioaktívne kontaminovanom prostredí. Naše experimenty potvrdzujú
úlohu fragmentácie cupinov v reakcii rastlín na stres navrhnutú inými autormi, ale špecifické
funkcie jednotlivých členov z tejto rozmanitej rodiny proteínov zostávajú neznáme.
32
Ubikvitinace - jak ji lokalizovat?
Hana Černá, Alžběta Breineková, Martin Černý
CEITEC & Mendelova univerzita v Brně
Ubikvitinace patří mezi významné prvky signálních drah. Její hlavní známá role je označení
proteinů určených k degradaci, proces, který je například zapojen do signalizace všech známých
fytohormonů. I když jsou dostupné afinitní nosiče pro zachycení ubikvitinovaných proteinů,
vlastní lokalizace této modifikace v rámci sekvence proteinu není jednoduchá. Zde ukazujeme,
že pomocí spektrální knihovny získané rekombinantní expresí a cílené analýzy predikovaných
ubikvitinací lze tato místa naleznout i u velmi málo abundantních proteinů.
33
Pokud chcete být informování o aktivitách Proteomické sekce České
společnosti pro biochemii a molekulární biologii a podílet se na její
činnosti, zaregistrujte se jako členové nebo jako neplatící sympatizanti na
našem webu:
www.czproteo.cz
[email protected]
Výbor Proteomické sekce:
Hana Kovářová
Jiří Petrák
Pavel Řehulka
Marek Šebela
34