CanAg NSE EIA - Fujirebio Diagnostics, Inc.

CanAg NSE EIA - Fujirebio Diagnostics, Inc.

CS
CanAg NSE EIA
420-10
REF
IVD
Návod k použití. 2016-02
Use By/Годно до/Použitelné do/
EN
EXPLANATION OF SYMBOLS
Holdbar til/Verwendbar bis/
BG
ОБЯСНЕНИЕ НА СИМВОЛИТЕ
Ημερομηνία λήξης/Fecha
CS
VÝZNAM SYMBOLŮ
DA
SYMBOLFORKLARING
DE
ERKLÄRUNG DER SYMBOLE
EL ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΜΒΟΛΩΝ
ES
SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS
ET
SÜMBOLITE SELGITUS
FR
EXPLICATION DES SYMBOLES
HR
OBJAŠNJENJE SIMBOLA
HU
JELMAGYARÁZAT
IT
SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI
Batch code/Номер на партида/
LT
SIMBOLIŲ PAAIŠKINIMAI
Číslo šarže/Lotnummer/
LV
SIMBOLU SKAIDROJUMS
Chargenbezeichnung/Αριθμός
NL
VERKLARING DER SYMBOLEN
Παρτίδας/Código de lote/Partii
de caducidad/Kõlblik kuni/
Utiliser jusque/Rok valjanosti/
Felhasználható/Utilizzare entro/
Sunaudoti iki/Izlietot līdz/Houdbaar
tot/Brukes innen/ Użyć przed /
Prazo de validade/Expiră la/
Использовать до/Använd före/
Použite´né do/ Uporabno do/
Upotrebljivo do/Son Kullanma Tarihi
kood/Code du lot/Kod serije/
NOSYMBOLFORKLARING
PL
OBJAŚNIENIE SYMBOLI
PT
EXPLICAÇÃO DOS SÍMBOLOS
RO
SEMNIFICAŢIA SIMBOLURILOR
RU
ОБОНАЧЕНИЯ
Sarzsszám/Codice del lotto/
Partijos kodas /Partijas kods /Lot
nummer/Partikode/Kod partii/
Código do lote/Număr de lot/
Номер лота/Lotnummer/Číslo
SVSYMBOLFÖRKLARING
SK
VÝZNAM SYMBOLOV
SL
RAZLAGA SIMBOLOV
SR
OBJAŠNJENJE SIMBOLA
TR
SEMBOLLERİN AÇIKLAMALARI
šarže/Številka serije/Kod partije/
Parti Kodu
1
Date of manufacture/Дата на
8 oC
производство/Datum výroby/
Produktionsdato/Herstellungsdatum/
Ημερομηνία παραγωγής/Fecha de
2 oC
Temperature limitation/
Температурни граници/
Teplotní omezení/
Temperaturbegrænsning/
fabricación/Valmistamise kuupäev/
Temperaturbegrenzung/
Date de fabrication/Datum proizvodnje/
Περιορισμοί θερμοκρασίας/
Gyártási idő/Data di produzione/
Límites de temperatura/
Pagaminimo data/Ražošanas datums/
Temperatuuri piirang/
Productiedatum/Fremstillingsdato/
Limite de température/
Data produkcji/Data de fabrico/Data
Temperaturno ograničenje/
fabricaţiei/Дата производства/
Hőmérsékletre vonatkozó korlátozás/
Tillverkningsdatum/Dátum výroby/Datum
Limiti di temperatura/
izdelave/Datum proizvodnje/Üretim tarihi
Temperatūriniai apribojimai/
Temperatūras ierobežojums/
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device/
Temperatuurbeperking/
Медицински уред за диагностика
Temperaturbegrensninger/
ин витро/Diagnostický zdravotnický
Temperatury graniczne/
prostředek in vitro/Medicinsk udstyr til
Limite de temperatura/
in vitro-diagnostik/In-vitro-Diagnostikum/
Limite de temperatură/
Ιατροτεχνολογικό προϊόν για διάγνωση
Температурный режим/
In Vitro/Dispositivo médico para
Temperaturbegränsning/
diagnóstico in vitro/In vitro diagnostiline
Teplotné obmedzenie
meditsiiniseade/Dispositif médical de
Omejitev temperature/
diagnostic in vitro/Diagnostički medicinski
Temperaturno ograničenje/
uređaj In Vitro/In vitro orvosdiagnosztikai
Sıcaklık sınırlaması/
eszköz/Dispositivo medico per test
diagnostici in vitro/In Vitro Diagnostinė
Contains sufficient for <96> tests/Съдържа
Medicinos Priemonė/Medicīniska ierīce
достатъчно количество за тестове
in vitro diagnostikai/In vitro-diagnostisch
<96>/Lze použit pro <96> testů/Indeholder
medisch instrument/In vitro diagnostisk
tilsttrækkeligt/Inhalt ausreichend für <96>
medisinsk utstyr/Wyrób medyczny do
Prüfungen/Περιεχόμενο επαρκές για
diagnostyki in vitro/Dispositivo Médico
«96» εξετάσεις/Contenido suficiente para
de Diagnóstico In Vitro/Dispozitiv medical
<96> ensayos/Kogusest piisab <96> testi
pentru diagnostic in vitro/Только для
läbiviimiseks/Contenu suffisant pour “96”
диагностики In Vitro/Endast för in
tests/Sadrži dovoljno za <96> testova/A
vitro-diagnostik/ Zdravotnícka pomôcka na
doboz tartalma <96> vizsgálat elvégzéséhez
diagnostiku in vitro/In vitro diagnostični
elegendő/Contenuto sufficiente per “96”
pripomoček/Diagnostički medicinski
saggi/Turinys skirtas atlikti <96> tyrimus/
uređaj In Vitro/<96> testleri için yeterlilik
Saturs pietiekams <96> testiem/Inhoud
içerir
voldoende voor “96” testen/til ”96” test/
Tilstrekkelig innhold for <96> prøver/
REF
Catalogue number/Каталожен номер/
Wystarczy na wykonanie <96> testów/
Katalogové číslo/Katalognummer/
Conteúdo suficiente para “96” ensaios/
Bestellnummer/Αριθμός καταλόγου/
Conţinut suficient pentru 96 de teste/
Número de catálogo/Kataloogi number/
Содержит достаточные количества для
Numéro de catalogue/Kataloški broj/
«96» определений/Innehåller tillräckligt
Katalógusszám/Numero di catalogo/
till “96” antal tester/Obsah postačuje na
Katalogo numeris/Numurs katalogā/
tento počet testov: <96>/Vsebina zadostuje
Catalogusnummer/Katalognummer/
za <96> testov/Sadržina dovoljna za <96>
Numer katalogowy/Número do catálogo/
testova/<96> testleri için yeterlilik içerir
Număr de catalog/Номер по каталогу/
Produktnummer/Katalógové číslo/
Kataloška številka/Kataloški broj/
Katalog numarası
2
Consult Instructions for Use/
ORIG
HUM
Human/С човешки произход/Lidské/
Прочетете инструкцията за
Humant/Human/δείγματα αναφοράς/
употреба/Konzultujte s návodem
Humano/Inimpäritolu/Humaine/Ljudskog
k použití/Se brugsanvisning/Siehe
porjekla/Humán/Origine Umana/
Gebrauchsanweisung/Συμβουλευτείτε
Žmogaus kilmės/Cilvēku izcelsmes/
τις Οδηγίες σχετικά με τη χρήση/
Human/Menneske/Ludzka/Humano/
Consulte las instrucciones de uso/
Origine umană/Человеческого
Vt kasutusjuhendit/Consulter le mode
происхождения/Human/Ľudské/
d’emploi/Pročitajte upute za uporabu/
Humanega izvora/Ljudskog porekla/İnsan
Olvassa el a használati utasítást/
Consultare le istruzioni per l’uso/Dėl
ORIG
MOU
From mouse/С миши произход/Myší/
naudojimo žiūrėkite instrukcijas/Izlasiet
Fra mus/Maus/απο ποντίκι/de ratón/
lietošanas instrukciju/Raadpleeg de
Hiirtelt/De souris/Mišijeg porjekla/
instructies voor gebruik/Les instruksene
Egérből/Murino/Pelės kilmės/No peles/
før bruk/Sprawdzić w instrukcji użycia/
Van muizen/Fra mus/Mysia/Do rato/De
Consulte as Instruções de Utilização/
la şoareci/Мышиного происхождения/
Consultaţi instrucţiunile de utilizare/
Från mus/Myšie/Mišjega izvora/Mišijeg
porekla/Fareden
Обратитесь к инструкции по
применению/Se bruksanvisning/
Prečítajte si návod na používanie/
ORIG
BOV
Bovine/С говежди произход/
Pročitajte uputstvo za upotrebu/
Hovězí/Bovin/Rind/από βοοειδή/
Kullanım Talimatlarına Bakınız
Bovino/Veistelt/Bovine/Rogate stoke/
Szarvasmarha/Bovino/Jaučio/No
CONT
Contents of kit/Съдържание на набора/
liellopa/Bovien/Bovin/Wołowy/Bovino/
Obsah soupravy/Kittets indhold/Inhalt
Origine bovină/крупного рогатого
des Kits/Περιεχόμενα του κιτ/Contenido
скота/Från ko/Hovädzie/Govejega
del kit/Komplekt sisaldab/Contenu du
izvora/Rogate krupne stoke/Bovin
kit/Sadržaj opreme/A készlet tartalma/
Contenuto del kit/Rinkinio turinys/
Komplekta saturs/Inhoud van de set/
Settets innhold/Zawartość zestawu/
Reconstitute with/Разтваряне с/
Rozřeďte pomocí/Rekonstitueres med/
Rekonstituieren mit/Ανασύσταση με/
Conteúdo do kit/Conţinutul setului/
Reconstituir con/Lahjendamine/
Компоненты набора/Kit innehåll/
Reconstituer avec/Rekonstituirajte s/
Obsah súpravy/Vsebina kompleta/Sadržaj
Feloldáshoz/Ricostituire con/Atkurti,
opreme/Kitin içindekiler
ištirpdant su/Atšķaidīt ar/Reconstitutie
met/Rekonstitueres med/Odtworzyć
Biological risks/Биологическа
za pomocą/Reconstituir com/A
опасност/Biologická rizika/Biologisk
se reconstitui cu/Растворить в/
fare/Biologische Gefahren/Βιολογικοί
Rekonstituera med/Rozrieďte pomocou/
κίνδυνοι/Riesgos biológicos/
Rekonstituirajte z/s/Ponovno formiranje
Bioloogilised ohud/Risques biologiques/
sa/Yeniden oluşturulur
Biološkli rizici/Biológiai kockázatok/Rischi
biologici/Biologinis pavojus/Bioloģiskais
Manufacturer/Производител/Výrobce/
risks/Biologische risico’s/Biologiske
Producent/Hersteller/Kατασκευαστής/
risikoer/Zagrożenie biologiczne/Riscos
Fabricante/Tootja/Fabricant/Proizvođač/
biológicos/ Biologisk risk/Pericole
Gyártó/Fabbricante/Gamintojas/
biologice/Биологическая опасность/
Ražotājs/Fabrikant/Produsent/
Biologicky rizikové/Biologické riziká/
Producent/Fabricante/Producător/
Biološkli rizici/Biyolojik riskler
Производитель/Tillverkare/ Výrobca/
Izdelovalec/Proizvođač/Üretici
3
CanAg NSE EIA
Návod k použití
CS
Enzymoimunometrická souprava
Pro 96 stanovení
POUŽITÍ
Souprava CanAg NSE EIA je určena pro kvantitativní stanovení NSE v lidském séru.
SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ TESTU
Glykolytický enzym enoláza (2-fosfo-D-glycerát hydroláza, EC 4.2.1.11) existuje jako
několik dimerních izoenzymů (αα, αβ, αγ, ββ a γγ), složených ze tří odlišných podjednotek
α, β a γ. Jednotka γ se nachází buď v homologickém γγ- nebo v heterogenním αγisoenzymu a je známa jako neuron-specifická enoláza (NSE). Monoklonální protilátky,
použité v soupravě CanAg NSE EIA, se váží na γ -podjednotku enzymu a tudíž detekují
jak formy γγ, tak formy αγ (1,2). Hladiny NSE jsou nízké u zdravých osob a u osob s
benigními chorobami. Zvýšené hladiny se obvykle nacházejí u pacientů s maligními tumory
s neuroendokrinní diferenciací, zvláště u rakoviny malých plicních buněk (SCLC) (3) a u
neuroblastomu (4). Kvantitativní stanovení NSE v séru může být cenným nástrojem při
léčbě pacientů s podezřením nebo diagnózou SCLC nebo neuroblastomu, při diferenciální
diagnóze a při sledování účinků léčení (5, 6).
PRINCIP STANOVENÍ
Souprava CanAg NSE EIA je nekompetitivní imunoanalýza na pevné fázi, založená na dvou
myších protilátkách, namířených proti dvěma různým antigenním determinantám na molekule NSE. Použité monoklonální protilátky (MAb) se váží na γ-podjednotku enzymu a tak
detekují jak formy γγ, tak formy αγ. Kalibrátory a pacientské vzorky se společně inkubují s
biotinylovanou monoklonální protilátkou proti NSE E21 a monoklonální protilátkou proti NSE,
značenou křenovou peoxidázou (HRP) E 17 v mikroproužcích, pokrytých streptavidinem.
Po promytí se do všech jamek přidá substrát s chromogenním činidlem v tlumivém roztoku
(peroxid vodíku a 3, 3’, 5, 5’ tetramethylbenzidin) a nechá se probíhat enzymatická reakce.
Pokud je přítomen antigen, objeví se v průběhu reakce modré zabarvení. Intenzita vzniklého
zabarvení je přímo úměrná množství NSE, přítomném ve vzorcích. Intenzita zabarvení se
stanoví ve spektrofotometru pro mikrotitrační destičky při 620 nm (nebo 405 nm) po přidání
Stop roztoku.
Kalibrační křivka se musí sestrojit pro každé stanovení vynesením hodnoty absorbance proti
koncentraci každého kalibrátoru. Koncentrace NSE v pacientských vzorcích se pak odečítají
z kalibrační křivky.
4
REAGENCIE
• Každá souprava CanAg NSE EIA obsahuje reagencie na 96 stanovení.
• Exspirační datum soupravy je uvedeno na vnějším štítku na krabici soupravy.
• Nepoužívejte soupravu po uplynutí exspirační doby .
• Nemíchejte reagencie z různých šarží soupravy.
• Soupravu skladujte při 2 – 8°C. Nezamrazujte.
• Stabilitu otevřených reagencií naleznete v tabulce, uvedené níže. Reagencie jsou stabilní po uvedenou dobu, pokud nejsou kontaminovány, jsou skladovány v
dobře uzavřených originálních lahvičkách a zachází se s nimi předepsaným
způsobem. Okamžitě po použití je opět uskladněte při 2 – 8°C.
Složka Množství
Skladování a stabilita
po prvním otevření
MICROPLA
Mikrodestička
1 destička 2—8 °C do data exspirace,
uvedeného na destičce
12 x 8 rozlomitelných jamek, pokrytých streptavidinem. Nepoužité proužky po otevření
okamžitě vraťte do hliníkového sáčku, obsahujícího vysoušedlo. Pečlivě uzavřete, aby byly
proužky uchovávány v suchu.
Kalibrátory NSE 5 lahviček, lyofolizované
CAL
NSE
A
CAL
NSE
B
CAL
NSE
C
CAL
NSE
D
CAL
NSE
E
4 týdny při 2-8 ºC
3 měsíce při -20 ºC
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
Lyofilizované kalibrátory obsahují lidskou NSE v proteinové matrici s 0.01 % konzervačním
prostředkem bez azidu. Před použitím je třeba je rozpustit v 0,75 ml destilované vody.
POZNÁMKA: Přesná koncentrace NSE je specifická pro každou šarži a je uvedena na
štítku na každé lahvičce.
5
Složka Množství
Skladování a stabilita
po prvním otevření
BIOTIN
Anti-NSE
Biotin Anti-NSE 1 x 15 ml
2—8 °C do data exspirace
uvedeného na štítku
Myší monoklonální protilátka biotin Anti-NSE, přibližně 2 μg/ml. Obsahuje fosfátový tlumivý
roztok (pH 7.1), hovězí sérový albumin, blokující činidla, inertní modré barvivo a 0.01 %
methyl-isothiazolone (MIT) jako konzervační prostředek. Před použitím musí být smíchána
s indikátorem HRP Anti-NSE.
CONJ
Anti-NSE
Indikátor (tracer), 1 x 0,75 ml
HRP Anti-NSE
2—8 °C do data exspirace
uvedeného na štítku
Základní roztok myší monoklonální protilátky HRP Anti-NSE, přibližně 40 μg/ml. Před
použitím se musí smíchat s protilátkou Biotin Anti-NSE. Obsahuje 0.02 % methylisothiazolonu (MIT), 0.02 % bromonitrodioxanu a 20 ppm Proclinu™ 300 jako konzervační
prostředky.
SUBS
TMB
Substrát TMB-HRP 1 x 12 ml
2—8°C do data exspirace
uvedeného na štítku
Připraven k použití. Obsahuje peroxid vodíku v tlumivém roztoku a 3, 3’, 5, 5’ tetramethylbenzidin (TMB).
STOP
Stop roztok 1 x 15 ml
2—8°C do data exspirace
uvedeného na štítku
Připraven k použití. Obsahuje 0.12 M kyselinu chlorovodíkovou.
6
Složka Množství
Skladování a stabilita
po prvním otevření
WASHBUF
25X
Koncentrát promývacího roztoku 1 x 50 ml
2—8°C do data exspirace
uvedeného na štítku
Před použitím je nutno naředit 25-krát destilovanou vodou. Tlumivý solný roztok Tris-HCl s
Tweenem 20. Obsahuje Germall II jako konzervační prostředek.
Známky nestability
Substrát TMB HRP by měl být bezbarvý nebo slabě namodralý. Modrá barva znamená, že
reagencie byla kontaminována a musí být zlikvidována.
UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ
Pouze pro diagnostické použití in vitro
• Pouze pro profesionální použití.
• Dodržujte příslušná bezpečnostní opatření pro práci v laboratoři a všechny další místní a národní bezpečnostní předpisy.
• Se všemi pacientskými vzorky zacházejte jako s potenciálně infekčními.
• Při likvidaci odpadu postupujte podle místních bezpečnostních předpisů.
Upozornění
Materiál, použitý při přípravě reagencií lidského původu, byl testován na přítomnost
protilátek proti HIV-1/2, HCV a povrchovému antigenu hepatitidy B (HBsAG), a byl shledán
jako negativní. Protože žádná metoda nemůže zcela vyloučit přítomnost infekčních látek
v krvi, při zacházení s reagenciemi lidského původu a při jejich likvidaci s nimi nakládejte
jako s potenciálně infekčními.
7
PŘÍPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ
Souprava CanAg NSE EIA je určena pro použití sérových vzorků. Krev odeberte ze žíly a
obvyklým postupem oddělte sérum. Sérum musí být odděleno od sraženiny nejpozději do
60 minut po odběru vzorku, aby se zabránilo úniku NSE z krevních buněk. Nepoužívejte
hemolyzované vzorky. Plazma se nedoporučuje, protože z destiček se může uvolňovat
značné množství NSE. Vzorky mohou být skladovány 24 hodin při 2 – 8°C. Pro delší
skladování uchovávejte vzorky při teplotě -70°C nebo nižší. Vzorky nesmí být skladovány
v samoodmrazovací mraznici a nesmí být před analýzou rozmrazeny a znovu zamrazeny.
Před analýzou vytemperujte zamrazené vzorky na laboratorní teplotu a DŮKLADNĚ
je promíchejte jemným převracením několikrát za sebou. Vzorky, které obsahují velké
částice, musí být centrifugovány při 10 000 x g po dobu 10 minut. Před analýzou musí být
odstraněny veškeré pevné částice, které se mohly vytvořit po rozmrazení. Rozmrazené
vzorky musí být analyzovány nejpozději jednu hodinu po rozmrazení.
POSTUP
Potřebné materiály nedodávané se soupravou
1.
Třepačka pro mikrodestičky
Třepání má být střední až intenzivní, přibližně 700 – 1 100 kmitů/min..
2.
Promývací zařízení pro mikrodestičky
Automatické vymývací zařízení destiček schopné provést 1 a 6 vymývacích cyklů s
minimálním plnicím objemem 350 μl/jamka/mycí cyklus.
Doporučená (ale nikoli vyžadovaná) je 8-kanálová pipeta s jednorázovými
plastovými špičkami pro dávkování objemu 350 μl, pokud se nepoužívá manuální
promývačka.
3.
Spektrofotometr pro mikrodestičky
S vlnovou délkou 620 nm a/nebo 405 nm a rozsahem absorbance od 0 do 3,0.
4.
Přesné pipety
S plastovými špičkami na jedno použití, schopné dávkovat mikrolitrové objemy.
Užitečná, ale ne nezbytná je i 8-kanálová pipeta nebo opakovací pipeta s plastovými
špičkami na jedno použití pro dávkování 100 μl. Pipety pro dávkování mililitrových
objemů.
5.
Destilovaná nebo deionizovaná voda
Pro rozpouštění kalibrátorů NSE a pro přípravu naředěného promývacího roztoku.
8
Poznámky k postupu stanovení
1. Aby bylo zajištěno správné používání soupravy CanAg NSE EIA, je třeba důkladně
porozumět obsahu tohoto příbalového letáku. Reagencie dodávané se soupravou
jsou nedílnou součástí při jejím použití. Nemíchejte identické reagencie z této
soupravy, která mají různá čísla šarží. Nepoužívejte reagencie ze soupravy po
uplynutí data exspirace, vytištěného na vnější straně krabice soupravy.
2. Před použitím je třeba reagencie vytemperovat na laboratorní teplotu (20 – 25°C).
Abyste získali správné výsledky, pracujte pouze při teplotě mezi 20 - 25°C. Zmrzlá
séra musí být po rozmrazení jemně, ale důkladně promíchána.
3. Před započetím pipetování kalibrátorů a pacientských vzorků vám doporučujeme
označit si jednotlivé proužky, abyste byli schopni během stanovení i po jeho skončení
jednoznačně identifikovat všechny vzorky.
4. Jedním z nejdůležitějších kroků při EIA je účinné a důkladné promytí kvůli oddělení
navázaného a nenavázaného antigenu a reagencií od navázaných komplexů protilátkaantigen na pevné fázi. Abyste zajistili účinné promývání, ujistěte se, že všechny jamky
jsou během každého promývacího cyklu úplně naplněny promývacím roztokem až ke
svému okraji, že promývací roztok je dávkován ve správném tempu, že odsávání jamek
mezi a po promývacích cyklech je úplné a že všechny jamky jsou prázdné. Jestliže v
jamkách zbyla nějaká kapalina, obraťte destičku a pečlivě ji vyklepejte do vrstvy buničité
vaty.
-
Automatické promývání proužků: Postupujte podle pokynů výrobce pro čištění a údržbu a promývejte požadovaným počtem promývacích cyklů před a po každém
inkubačním kroku. Důrazně doporučujeme použít pracovní způsob strip a pro
promývání způsob overflow s dávkovacím objemem 800 μl. V odsávacím/
promývacím zařízení promývací roztok nesmí zůstávat po delší dobu, protože by se
mohly jehly ucpat a špatně dávkovat nebo odsávat kapalinu.
5. Substrát TMB HRP je velmi citlivý na kontaminaci. Abyste zachovali jeho optimální
stabilitu a zabránili kontaminaci reagencie, odlijte požadované množství z lahvičky
do pečlivě vymyté nádobky nebo nejlépe do plastové nádobky na jedno použití.
Používejte pouze čisté plastové špičky na jedno použití.
6. Při manipulaci se vzorky a reagenciemi používejte pouze čisté plastové špičky
na jedno použití a správnou techniku pipetování. Špičku pipety držte kousek nad
okrajem jamky a nedotýkejte se plastového proužku ani hladiny kapaliny v jamce,
abyste zabránili vzájemnému přenosu vzorku a reagencií. Správná technika
pipetování je zvlášť důležitá při manipulaci se substrátem TMB HRP.
9
10
REF
420-10
Připravte promývací roztok
Připravte roztok protilátky
3.
Připravte kalibrátory NSE
2.
1.
Krok
NSE
Anti-NSE
Anti-NSE
BIOTIN
25X
CONJ
WASHBUF
A, B, C, D, E
CAL
Lahvička/Destička
Indikátor
HRP-Anti NSE (µl)
Biotin
1
2
3
4
5
Anti-NSE (ml)
1
50
2100 3150
4200 5
250
proužků
Počet
Pro jeden proužek smíchejte 50 μl indikátoru, HRP AntiNSE, s 1 ml Biotin Anti-NSE:
Nařeďte 50 ml koncentrátu promývacího roztoku s
1200 ml destilované nebo deionizované vody.
Do každé lahvičky přidejte 0,75 ml destilované vody a
jemně promíchejte. Ponechte stát alespoň 15 minut.
Poznámka: Přesné koncentrace všech kalibrátorů jsou
uvedeny na lahvičkách. Tyto hodnoty kalibrátorů musí
být použity při výpočtech.
Postup
Bezprostředně před použitím složky promíchejte. Použijte způsob míchání, uvedený v návodu.
CanAg NSE EIA
Pracovní protokol
11
TMB
1 minutu třepat při laboratorní teplotě
Odečítejte v průběhu 15 minut při 405 nm
MICROPLA
MICROPLA
Alt. 13 Odečítejte absorbanci
100 μl do každé jamky
620 nm
30 minut třepat při laboratorní teplotě
100 μl do každé jamky
Všechny jamky šestkrát promyjte promývacím roztokem.
1 hodinu třepat při laboratorní teplotě
100 μl do každé jamky
Alt. 12 Inkubujte
MICROPLA
MICROPLA
SUBS
MICROPLA
MICROPLA
ROZTOK PROTILÁTKY
25 μl do každé jamky
Všechny jamky jednou promyjte promývacím roztokem.
STOP
Odečítejte absorbanci
11.
NSE
A, B, C, D, E
CAL
MICROPLA
Alt. 11 Přidejte Stop roztok
Inkubujte
10.
Přidejte substrát TMB-HRP
Inkubujte
7.
9.
Přidejte roztok protilátky
6.
Promývejte
Přidejte kalibrátory a vzorky
5.
8.
Promývejte
4.
6
300
6
7
350
7
8
400
8
9
450
9
1050010
1155011
1260012
Příprava reagencií Stabilita připravené reagencie
Kalibrátory NSE
4 týdny při 2-8 ºC
3 měsíce při -20 ºC
Do každé lahvičky přidejte přesně 0,75 ml destilované vody a jemně promíchejte. Ponechte
stát nejméně 15 minut, dokud se vše nerozpustí. POZNÁMKA: Koncentrace kalibrátorů je
uvedena na štítcích a musí se používat při výpočtu výsledků.
Promývací roztok 2 týdny při 2—25 °C
v uzavřené lahvi
Do čisté lahve nalijte 50 ml koncentrátu promývacího roztoku a nařeďte 25-krát přidáním
1200 ml destilované nebo deionizované vody. Tak získáte pufrovaný promývací roztok.
Roztok protilátky 3 tři týdny při 2-8 ºC
Připravte požadované množství roztoku protilátky smícháním 50 μl indikátoru, HRP AntiNSE, s 1 ml biotinu Anti-NSE na jeden proužek (viz níže uvedená tabulka):
Počet proužků Indikátor, HRP Anti-NSE
Biotin Anti-NSE
(µl)
(ml)
1
50
1
2100 2
3
150
3
4
200
4
5
250
5
6
300
6
7
350
7
8
400
8
9
450
9
10500
10
11550
11
12600
12
Pro přípravu roztoku protilátky použijte zaručeně čistou plastovou nebo skleněnou
lahvičku.
Alternativa: Nalijte obsah lahvičky s indikátorem HRP Anti-NSE do lahvičky s Biotinem
Anti-NSE a jemně promíchejte. Zkontrolujte, že jste převedli všechen indikátor do lahvičky
s Biotinem Anti-NSE.
POZNÁMKA: Roztok protilátky je stabilní po dobu 3 týdnů při 2 - 8°C. Nepřipravujte větší
množství roztoku protilátky, než jaké bude použito během této doby, a zkontrolujte, že je
roztok správně skladován.
12
Postup stanovení
Stanovení kalibrátorů a pacientských vzorků provádějte v duplikátech. Pro každé stanovení
sestrojte novou kalibrační křivku. Všechny reagencie a vzorky musí být před použitím
vytemperovány na laboratorní teplotu (20 – 25°C).
1. Začněte připravovat kalibrátory NSE, promývací roztok a roztok protilátky. Postupujte
přesně podle návodu.
Es importante usar recipientes limpios. Siga las instrucciones cuidadosamente.
2. Do rámečku na proužky vložte požadovaný počet proužků s mikrojamkami.
(Zbývající proužky okamžitě vraťte do hliníkového sáčku s vysoušedlem a pečlivě ho
uzavřete.) Všechny proužky jedenkrát promyjte promývacím roztokem. Promyjte
pouze tolik proužků, které budou zpracovány během následujících 30 minut.
3.Do jamek napipetujte 25 μl kalibrátorů NSE (CAL A, B, C, D, E) a pacientských
vzorků (neznámé vzorky – nez) podle následujícího schématu:
12345
67 etc.
A Cal
Cal
4.
AEnez
B Cal
Cal
etc.
AE
C Cal
1.
Bnez
D
Cal
1.
B nez
E
Cal
2.
Cnez
F
Cal 2.
Cnez
G Cal 3.
Dnez
H
Cal 3.
Dnez
4. Pomocí přesné pipety (nebo přesné 8-kanálové pipety na 100 μl ) přidejte do všech
jamek 100 μl roztoku protilátky. Pipetu držte kousek nad horním okrajem jamky
a nedotýkejte se plastového proužku ani hladiny kapaliny, aby nedocházelo ke
vzájemné kontaminaci v jamkách.
5.Destičku inkubujte 1 hodinu (± 10 min) při laboratorní teplotě (20-25°C) za
nepřetržitého třepání na třepačce pro mikrodestičky.
6. Po inkubaci jamky odsajte a všechny 6-krát promyjte.
13
7. Do všech jamek přidejte 100 μl substrátu TMB-HRP stejným postupem jako v bodě
4. Substrát TMB-HRP pipetujte co nejrychleji, doba mezi napipetováním první a
poslední jamky nesmí přesáhnout 5 minut.
8. Inkubujte po dobu 30 minut (± 5 minut) při laboratorní teplotě za nepřetržitého třepání.
Zabraňte působení přímého slunečního světla.
9. Okamžitě změřte absorbanci při 620 nm spektrofotometrem pro mikrodestičky.
Další možnost
Pokud v laboratoři není spektrofotometr na mikrodestičky, schopný měřit při 620 nm,
můžete stanovit absorbanci jak je popsáno v bodě 10.
10. Přidejte 100 μl Stop roztoku, promíchejte a změřte absorbanci při 405 nm
spektrometrem pro mikrodestičky během 15 minut po přidání Stop roztoku.
Měřící rozsah
Souprava CanAg NSE EIA měří koncentrace mezi 1 a přibližně 150 μg/l. Jestliže jsou
očekávány koncentrace NSE, přesahující měřící rozsah soupravy, doporučujeme před
analýzou naředit vzorky normálním lidským sérem.
POZNÁMKA: Sérum, použité pro ředění, musí být rovněž analyzováno, aby byla
stanovena endogenní koncentrace NSE (viz „Výpočet výsledků“).
Kontrola kvality
Pro validaci série stanovení doporučujeme kontrolní séra CanChek Tumor Marker Level 1
a 2 (dodávaná samostatně, REF 107-20). Pokud jsou získány hodnoty mimo specifikovaný
rozsah, je třeba provést důkladnou kontrolu reagencií a účinnosti spektrofotometru a analýzu
opakovat.
Referenční materiály
Protože pro antigen NSE není k dispozici žádný referenční materiál, hodnoty kalibrátorů
soupravy CanAg NSE EIA byly stanoveny ve srovnání se sadou referenčních standardů
výrobce.
VÝPOČET VÝSLEDKŮ
Používá-li se spektrofotometr na mikrodestičky s vestavěným výpočetním programem,
řiďte se návodem ke spektrofotometru a vytvořte program, ve kterém použijete
koncentrace, uvedené na štítcích kalibrátorů NSE.
Pro automatický výpočet výsledků NSE doporučujeme použít některou z následujících
metod:
• Aproximaci křivky “kubický spline”. Do křivky je nutno zahrnout kalibrátor 0 s hodnotou 0 μg/l.
• Aproximaci křivky „vyhlazený spline“. Kalibrátor 0 se použije jako blank destičky.
14
•
Interpolaci proložením od bodu k bodu. Do křivky je nutno zahrnout kalibrátor 0 s hodnotou 0 μg/l.
• Metodu kvadratické aproximace křivky. Do křivky je nutno zahrnout kalibrátor A s hodnotou 0 μg/l.
POZNÁMKA: Nepoužívejte 4-parametrovou nebo lineární regresi.
Při manuálním vyhodnocení se kalibrační křivka získá vynesením hodnot absorbance (A),
získaných pro každý kalibrátor NSE, proti odpovídající koncentraci NSE (v μg/l), viz obrázek
níže. Neznámé koncentrace NSE se potom odečtou z kalibrační křivky na základě průměrné
hodnoty absorbance každého pacientského vzorku. Jestliže při prvním stanovení vzorky
vykazují hodnoty NSE vyšší než je koncentrace kalibrátoru E, musí být naředěny normálním
lidským sérem v poměru 1/10, aby získané výsledky byly správné. Výsledek se pak počítá
podle následujícího vzorce:
Ředění: 1/10: 10 x ([NSE] naředěný vzorek -(0,9 x [NSE] normální lidské sérum ))
Příklad výsledků
vzorek CAL
NSE
A
CAL
NSE
B
CAL
NSE
C
CAL
NSE
D
CAL
NSE
E
hodnoty kalibrátorů průměrná hodnota absorbance (A) 0 µg/l
0,037
7.5 µg/l
0,238
22.9 µg/l
0,663
68.4 µg/l
1,688
138.0 µg/l
2,720
vzorek 10.51817.5
vzorek 21.47457.8
15
NSE
µg/l
2.8
2.4
A 620 nm
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
0
20
40
60
80
100
120
140
NSE µg/L
Příklad, tuto křivku nepoužívejte ke stanovení výsledků analýzy.
Přesné hodnoty koncentrace NSE jsou uvedeny na štítcích lahviček kalibrátorů.
OMEZENÍ SOUPRAVY
Hladina NSE nemůže být používána jako absolutní důkaz existence nebo neexistence
maligního onemocnění a stanovení NSE nesmí být použito pro screening rakoviny.
Výsledky stanovení mohou být interpretovány pouze v souvislosti s ostatními poznatky a
postupy při diagnóze onemocnění a stanovení NSE nemůže nahradit jakákoliv používaná
klinická vyšetření.
Zvýšené hodnoty NSE, které nejsou způsobeny nádorem, se mohou projevit u
dialyzovaných pacientů a u pacientů s leukemickými chorobami.
Sérum nesmí být viditelně hemolytické (absorbance nezakaleného vzorku při 500
nm nesmí přesáhnout 0.3), protože erytrocyty obsahují značné množství NSE (7).
Prodloužené skladování plné krve může způsobit uvolňování NSE z krevních buněk.
Protilátky proti reagenciím (lidská protilátka proti myši (HAMA) nebo heterofilní
protilátky) v pacientském vzorku mohou příležitostně interferovat se stanovením, i když
tlumivý roztok obsahuje specifická blokující činidla.
OČEKÁVANÉ HODNOTY
CanAg NSE EIA se použil k měření hladin protilátek NSE ve vzorcích od 495 zjevně
zdravých dárců krve. V této studii mělo 97,5 % subjektů koncentraci NSE 10,5 μg/l nebo
méně a 95 % subjektů mělo koncentraci NSE 9,9 μg/l nebo méně. Střední hodnota v séru
byla 6,5 μg/l.
Každé laboratoři doporučujeme stanovit si vlastní referenční hodnotu pro sledovanou
populaci a postup odběru vzorku používaný v laboratoři.
16
ANALYTICKÉ PARAMETRY STANOVENÍ
Přesnost
Celková přesnost byla stanovena na základě směrnice NCCLS EP5-A (8). Byla použita
čtyři směsná séra zmrazeného lidského séra s různými hladinami, obsahující přídavek
NSE. Každý vzorek byl náhodně pipetován v duplikátech a analyzován dvakrát každý den
v průběhu 20 dnů. Analýzy byly provedeny v rozmezí 40 měsíců > třemi různými laboranty
a bylo použito 20 různých šarží soupravy CanAg NSE EIA.
vzorek replikáty
průměr
µg/l
Opakovatelnost
SD (µg/l)
VK (%)
Reprodukovatelnost
SD (µg/l) VK %
NSE 1
NSE 2
NSE 3
NSE 4
10.3
23.7
48.2
92.7
0.24
0.82
1.02
1.60
0.57
0.97
1.93
3.44
80
80
80
80
2.3
3.5
2.1
1.7
5.5
4.1
4.0
3.7
Mez detekce
Mez detekce soupravy CanAg NSE EIA je < 1 μg/l a je definována jako koncentrace
odpovídající průměru hodnot absorbance kalibrátoru NSE A plus dvojnásobek směrodatné
odchylky podle vzorce:
2 x SD CAL A
OD CAL B–OD CAL A
x [CAL B] µg/l
Hook efekt
Nebyl pozorován žádný hook efekt pro koncentrace NSE až do 200.000 μg/l.
Linearita
Pacientské vzorky byly naředěny normálním sérem a analyzovány. Získané hodnoty byly v
rozmezí 93—101 % očekávaných hodnot.
17
Specifita
Použité monoklonální protilátky jsou specifické pro γ-podjednotku enolázy. Žádné
měřitelné zkřížené reakce s jinou enolázou nebyly pozorovány.
Možné zdroje interference byly stanoveny na základě směrnice NCCLS EP7-P (9).
Byly testovány následující sloučeniny a koncentrace a žádná z nich neinterferovala se
stanovením.
Koncentrace s žádnou významnou
(± 10%) interferencí
Lipemie (Intralipid®)
Bilirubin, nekonjugovaný
10 mg/ml
0.6 mg/ml
ZÁRUKA
Uvedené analytické parametry soupravy byly získány popsaným postupem stanovení.
Jakékoliv změny nebo modifikace postupu, které nebyly doporučeny výrobcem Fujirebio
Diagnostics, mohou ovlivnit výsledky. V tomto případě Fujirebio Diagnostics odmítá
zodpovědnost za všechny poskytované záruky, ať už předpokládané nebo zákonné,
včetně předpokládané záruky prodejnosti a způsobilosti k použití.
18
LITERATURA
1. Paus E. and Nustad K., (1989) Immunoradiometric Assay for αγ- and
γγ-Enolase (Neuron-Specific Enolase), with Use of Monoclonal Antibodies
and Magnetizable Polymer Particles. Clin. Chem. 35: 2034-2038.
2. Dahlén U., Karlsson B., Nilsson O. and Uhl W., (1995) Development of an
Enzyme Immunoassay, NSE-Enzymun Test For Determination of NeuronSpecific Enolase. XXIII International Society for Oncodevelopmental Biology
and Medicine, Montréal, Ouébec .
3. Cooper E.H., (1994) Neuron-specific enolase. The International Journal of Biological Markers 9(4):205-10.
4. Cooper E.H., Pritchard J., Bailey C.C. and Ninane J., (1987) Serum neuronspecific enolase in children’s cancer. Br. J. Cancer 56: 65—67.
5. Schneider, P. M. et al., (2002) Lung Cancer. In “Tumor markers, Physiology,
Pathobiology, Technology and Clinical Applications” Eds. Diamandis E. P. et
al., AACC Press, Washington pp 287-303.
6. Bonner J. A., Sloan JA., Rowland KM., Klee GG., Kugler JW., Mailliard JA.,
Wiesenfeld M., Krook JE.,Maksymiuk AW., Shaw EG., Marks RS and Perez
EA., (2000) Significance of Neuron-specific Enolase Levels before and
during Therapy for Small Cell Lung Cancer. Clinical Cancer Research 6:
597-601.
7. Påhlman S., Esscher T., Bergvall P. and Odelstad L., (1984) Purification
and characterization of human neuron-specific enolase: Radioimmunoassay
development. Tumor Biol. 5: 127—139.
8. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A
(1999).
9. National Committee for Clinical Laboratory Standards, National Evaluation
Protocols for Interference Testing, Evaluation protocol Number 7, Vol. 6, No
13, August (1986).
19
Fujirebio Diagnostics AB
Elof Lindälvs gata 13
SE-414 58 Göteborg
Sweden
Telefon + 46 31 85 70 30
Fax + 46 31 85 70 40
[email protected]
www.fdab.com
20
CanAg NSE EIA Prod no. 420-10 CS, 2016-02. F6038, r3
CanAg ® je registrovaná obchodní značka Fujirebio Diagnostics AB