Stáhnout bulletin - Společnost pro lékařskou mikrobiologii

Skladba Informačního Bulletinu KMIL 2002/2
SARS
Vedle válečných zpráv z Iráku trochu ve sdělovacích prostředcích zanikají články o těžkém akutním respiračním syndromu
(SARS). Zatímco výsledek války v Iráku je přese všechno mlžení pravděpodobně jasný, nebezpečná infekce z Asie může napáchat
mnohem více škody, než se zatím zdá z pozornosti, která jí věnují média. Pokud se však tato infekce rozšíří v Evropě, možná i u
nás, velmi rychle si uvědomíme, co děláme správně nebo jenom jako. Mezi to „jako“ mnohdy patří bezpečnost práce z minulosti
označovaná zkratkou OBP. Stejně jako populární hasičská školení, na jejichž závěr se píše ještě test, nic neříkají o tom, jak se
jednotlivec zachová při požáru, ani teoretické návody nás v systému, který spíše podporuje švejkování, neuchrání od takové metly,
jakou se nová morová rána zdá.
Vzpomeňme, jak jsme mobilizovali proti antraxu, a jak posléze všechny snahy o zlepšení podmínek OBP v laboratořích vyzněly
naplano (např. nákup laminárních boxů pro rozbalování materiálu na příjmu mikrobiologických oddělení). I když nakonec
problém odezněl sám od sebe, bylo to poučné. A to není řeč o těch, kdo přicházejí do styku pod jinými diagnózami s potenciálně
nemocnými pacienty, jako naši kolegové infekcionisté, ale ještě spíše na takový druh infekcí nepřipravení kolegové na odděleních
ARO.
Jak se obecně vyrovnáme s kategorií BSL3 v podmínkách, kdy ještě nevíme, s čím pracujeme, o tom bychom měli přemýšlet
dříve, než sem infekce dorazí. Možná i tentokrát vše odezní samo, nebo šikovní vědci v cizině něco vymyslí. Ale jak se říká, „do
třetice všeho nejlepšího (i nejhoršího)“ nebo také „tak dlouho se chodí se džbánem pro vodu, až se ucho utrhne“.
J. Scharfen
Zprávy odborných společností
Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP
Ze zasedání výboru SEM dne 4.3.2003 a 1.4.2003:
1. Předsedkyně předala doc.MUDr. D. Křížovi, CSc. diplom čestného členství odborné společnosti ČLS JEP za
zásluhy o rozvoj oboru, za dlouholetou odbornou, pedagogickou, koncepční a reprezentační činnost.
2. Výbor doporučil návrh pracovní skupiny pro lékařskou mikrobiologii při MZ ČR na přijetí samostatného
zástupce pro obor lékařské mikrobiologie ve VR MZ ČR.
3. Probíhají přípravy na konferenci 19. Pečenkovy epidemiologické dny 2003, 24.-26.9. v Poděbradech. Garant
akce MUDr. Vladimír Polanecký navrhl hlavní tematické okruhy odborného programu a stanovil organizační
podmínky pro účastníky konference. 1. Informace a příslušné pokyny a materiály jsou přiloženy k 2. cirkuláři
členstvu SEM. Kontakt e-mail [email protected]
4. Projednána otázka místa a pořadatele Celostátního sjezdu mikrobiologů a epidemiologů, plánovaného SEM
na říjen r. 2004. Výbor doporučuje oslovit organizátory v Olomouci.
5. Odborné semináře SEM+SIL v Lékařském domě. Úspěšně proběhly - v březnu Virologie, koord. prof.
Horáčkem, v dubnu Malárie, koord. dr. Nohýnkovou a prof. Beranem. Podrobné programy příštích seminářů
budou rozeslány v 2. cirkuláři: květen Virové hepatitidy, koord. dr. Plíškem a červen Antibiotika, koord. dr.
Urbáškovou. První seminář po prázdninovém období se bude konat 7. října.
6. 14. kongres ECCMID Praha květen 2004. Organizační přípravy probíhají intenzivně v úzké spolupráci
národního organizačního výboru s příslušnými složkami vedení ESCMID ve Švýcarsku. Prof. J. Beran poskytl
informaci jménem programového výboru kongresu adresovanou všem účastníkům: v závěru roku poslat
abstrakt s žádostí o možnost ústní nebo posterové prezentace. Formuláře budou k dispozici ve druhé polovině
t.r. na serveru www.ESCMID.org kam je také možno zaslat abstrakt v elektronické formě. Informaci o podání
abstraktu oznamte prosím na e-mail [email protected] Výbor SEM vyzývá mikrobiology a infekcionisty k
hojné aktivní účasti.
7. Informace ze zápisu zasedání výboru SIL. Účast na vnitřním připomínkovém řízení k vyhlášce MZ č. 108 o
hygienických požadavcích na provozy školských zařízení. Materiály poskytla doc. M. Staňková.
8. Nové členství: výbor projednal a doporučil přijetí 6ti nových členů.
V Praze dne 2.4.2003 za SEM ČLS JEP J. Jelínková
Z dění ve Společnosti infekčního lékařství
V únoru a březnu se výbor SIL ČLS zabýval a následně připomínkoval návrhy vyhlášek
MZ (Návrh vyhlášky č.108 , kterou se stanoví hygienické požadavky na prostory a provoz škol a předškolních zařízení. Zde jsme
museli konstatovat, že pokud bychom chtěli splnit všechna udávaná kritéria hygienických požadavků, bylo by nutné celou řadu
škol, internátů atd. v ČR zavřít. Překvapil nás doporučovaný vzduchový osoušeč rukou (§5), kde je známo, že pokud není pečlivě
čištěn a desinfikován, je nebezpečným chrličem různých mikrobů. V Návrhu vyhlášky č.350 , kterou se reguluje prodej
zdravotnických prostředků nás pouze zaujalo, že kondomy dle vyhlášky jsou zdravotnické potřeby, které mohou prodávat jen
oprávněné osoby.) K Návrhu nařízení vlády, kterým se stanoví vyměřovací základ u osoby, za kterou je plátcem pojistného stát
—1—
jsme měli pouze jedinou připomínku: Vyměřovací základ u osoby, za kterou je plátcem pojistného stát, je nepřiměřeně nízký
vzhledem k čerpání prostředků osobami, jichž se to týká ( Odůvodnění: platba státu je trvale podhodnocena oproti ostatním
kategoriím plátců pojistného) Doporučujeme zvýšení na úroveň minimální mzdy. A konečně Návrh novely vyhlášky o očkování
proti přenosným nemocím ( 439/2000).
K posledně jmenovanému návrhu, který je pro náš obor z výše uvedených nejvýznamnější, byl zaslán požadavek na rozšíření
vyhlášky ve smyslu aktivní imunizace proti přenosným nemocím u pacientů po transplantaci kostní dřeně, u pacientů po
splenektomii a u pacientů s hematoonkologickým onemocněním. Dále byly zaslány připomínky k návrhu systému vakcinace proti
dětské obrně, pertusi, TBC (koordinátor připomínek prof.MUDr.J.Beran,Csc.). Výbor SIL dále považuje za nutné, aby v novele
vyhlášky bylo jednoznačně určeno kdo očkování (pravidelné, zvláštní, mimořádné a další) provádí, kdo za její provádění
zodpovídá a případně kdo očkování hradí. Současně bylo opakovaně požadováno, aby očkování do zahraničí mohla provádět
všechna infekční pracoviště, a to při vědomí vazby na novelu zákona 258/2000.
Upozorňujeme všechny čtenáře, že v průběhu března byly webové stránky Společnosti infekčního lékařství převedeny na
novou adresu: www.infekce.cz. Stará adresa www.phfhk.cz/sil.htm je dosud funkční. Děkujeme prof.MUDr.J.Beranovi, CSc.
za zajištění nové jednodušší adresy. Naleznete zde informace o naší společnosti, kontakty na jednotlivá lůžková pracoviště,
aktualizovaný přehled akcí, programy akcí, cenné odkazy na další webové stránky s naší tématikou a řadu dalších informací.
Informace SIL k SARS jsou uveřejněny v tomto čísle Bulletinu v sekci Doporučené postupy.
V Opavě l. dubna 2003
za výbor SIL ČLS JEP MUDr.Petr Kumpel
Společnost pro lékařskou mikrobiologii České lékařské společnosti
Zápis ze schůze výboru SLM z 1.4.2003
Přítomni: (abecedně) Dr. Bébrová, Dr.Čermák, Dr.Heinigeová, Dr.Horová, Doc.Obdržálek, Dr.Průšová, Dr. Scharfen,
Doc.Součková, Dr.Žampachová, omluveni: Dr.Bergerová, Doc.Kolář, Dr.Mareš, Dr.Nyč
1. Byla projednána žádost prim Jedličkové o potvrzení společnosti o oprávněnosti její garance ve specializaci virologie,
mykologie, parazitologie. Dr.Scharfen odpoví dle výsledků jednání.
2. Dr. Scharfen s použitím vyjádření Dr.Mencla a Dr. Mareše odpověděl na žádost Dr.Glasnáka ke kódu identifikace hyfomycet.
Dr.Scharfen rozešle kopie členům výboru.
3. Projednán dopis Doc.Jabora s nabídkou odborným společnostem laboratorního komplementu k publikaci v časopisu Klinická
biochemie a metabolismus. Návrh Doc. Jabora ke spolupráci na přípravě časopisu nebyl přijat s poukazem na existenci
komplexních mikrobiologicky orientovaných periodik. Bude nabídnuta interdisciplinární spolupráce v časopisu KMIL. Dr.
Scharfen odpoví dle výsledků jednání výboru SLM.
4. Z důvodu nepřítomnosti Dr. Förstla se překládá seminář o mikroskopii zpět na říjen. Seminář o molekulárně genetických
metodách v epidemiologii bude nahrazen aktuálním tématem SARS (návrh Doc.Součkové). Koordinátorem semináře bude
prim. Horová. Dr.Scharfen umístí změnu do Bulletinu KMIL. Pozvánky budou rozeslány mailem i poštou. Prim.Horová
oznámí prim Scharfenovi do konce dubna program semináře, nejpozději však do poloviny května.
5. Různé: Dr.Průšová požádala členy výboru, aby se poskytli témata pro sekci na připravovaném kongresu ECCMID v roce
2004 v Praze. Prim. Scharfen poděkoval prim.Čermákovi za dobře připravený seminář o kultivačních půdách.
Zapsal: J. Scharfen
Programy odborných akcí
Program odborných seminářů Společnosti pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS a
Společnosti infekčního lékařství ČLS v roce 2003
Lékařský dům v Praze, vždy v úterý od 13.30 hod.
Koordinátor
Téma
Virové hepatitidy
6.5.
MUDr. S. Plíšek, PhD
3.6.
RNDr. P. Urbášková, CSc."Rezistence k antibiotikům v laboratoři a v klinické praxi"
* (viz podrobný program dále)
7.10.
MUDr. V. Chmelík
Intenzivní medicína v infektologii
4.11.
doc. MUDr. B. Kříž, CSc.
Význam serologických přehledů pro prevenci
vybraných infekčních onemocnění
—2—
2.12.
doc. MUDr. M. Bednář, CSc.
MUDr. D. Průšová
Klinická mikrobiologie
Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP a Společnost infekčního lékařství ČLS JEP
pořádají seminář
dne 3. června 2003 ve 13.30 hod.
v Lékařském domě
na téma
Rezistence k antibiotikům v laboratoři a v klinické praxi
______________________________________________________________
Koordinátor: RNDr. Pavla Urbášková, CSc.- NRL pro antibiotika, CEM/SZÚ
1.
2.
3.
4.
5.
Susceptibility and resistance: clinical and epidemiological breakpoints. Kahlmeter G.
Antibiotická rezistence v klinické praxi. Jindrák V.
Panevropské multirezistentní klony Acinetobacter baumannii v ČR. Nemec A.
Vystřídání hlavního klonu MRSA v ČR. Melter O.
Trendy antibiotické rezistence u klinicky významných druhů bakterií. Urbášková P. a Pracovní skupina pro
monitorování rezistence.
Předpokládaný konec cca 16.00 hod.
Program odborných seminářů Společnosti pro lékařskou mikrobiologii ČLS v roce 2003
Lékařský dům v Praze, vždy od 9,30 hod, první úterý v měsíci.
Hlavní téma na rok 2003: Metody v klinické mikrobiologii, jejich biologická podstata a limity, klinická interpretace výsledků
vyšetření, aktuální změny a podrobný program bude členům společnosti zaslán poštou nebo na vyžádání e-mailem.
6. května: Mykologické metody.
Koordinátor MUDr. K.Mencl, CSc
3. června: ZMĚNA!!!
SARS: aktuální informace. Koordinátor: prim. MUDr. B.Horová
7.října: ZMĚNA!!! Přesun z červnového termínu.
Mikroskopie v klinicko mikrobiologické diagnostice. Koordinátor: MUDr. M.Förstl,
4. listopadu: Serologické metody,
Koordinátor prim. MUDr. E.Žampachová
2. prosince: Vyšetřování citlivosti a rezistence mikroorganismů.
Koordinátor: RNDr. P. Urbášková, CSc.
Tomáškovy dny
První informace k XII. ročníku Tomáškových dnů – konference mladých mikrobiologů:
uskuteční se 4. – 6. června 2003 v Brně. organizátoři se těší na setkání s vámi i s vašimi zajímavými příspěvky. Za organizační
výbor vás zve MUDr. Filip Růžička, tel. 543183099, e-mail: [email protected]
3. Česko – Slovenská mezioborová konference lékařské mykologie, Pardubice 6.-8.11.2003
Pořádá Mykologická sekce Československé společnosti mikrobiologické, Mykopatologická sekce České dermatovenerologické
společnosti ČLS JEP, Slovenská mykopatologická spoločnosť SLS, Krajská nemocnice Pardubice.
Téma: základní a klinické pohledy na problematiku lékařské mykologie z hlediska taxonomie, ekologie, epidemiologie,
patogenity, imunologie, diagnostických postupů, antimykotik, vakcinace, klinických projevů a terapie.
Přihlášky do 25.4.2003, sekretariát: Krajská nemocnice Pardubice, Laboratoř lékařské mykologie, Kyjevská 44, 523 03 Pardubice,
ČR, tel.:+420 466 013 211, fax: +420 466 013 202, e-mail: [email protected], internet: www.nem.pce.cz .
—3—
Katedra mikrobiologie IPVZ
Katedra mikrobiologie
IPVZ, Ruská 85, 100 05 Praha 10
Vedoucí: doc. RNDr. Jarmila Jelínková, CSc., tel. 271 019 294, 271 019 243, fax 271 019 269, e-mail: [email protected]
Katedra mikrobiologie
214003 Kurz vedoucích mikrobiologických pracovišť VII
Určeno pro vedoucí mikrobiologických pracovišť
a jejich zástupce.
Program: Metody etiologické diagnostiky, aspekty
terapeutické, epidemiologické. Vybrané infekce virové
a parazitární etiologie. Imunologie infekcí. Zprávy
z Národních referenčních laboratoří. Organizační
aktuality, standardní postupy, akreditační systém.
Postgraduální vzdělávání v mikrobiologických
disciplínách.
Vedoucí: doc. RNDr. J. Jelínková, CSc.
Místo konání: Praha 4, Budějovická 15
19.5.2003 - 22.5.2003
214004 Kurz - Mikroskopická diagnostika malárie
Určeno pro specialisty zabývající se laboratorní
diagnostikou importovaných parazitárních nákaz.
Program: Teorie a praxe laboratorní diagnostiky
malárie.
Vedoucí: RNDr. L. Kolářová, CSc., RNDr. I. Rubík
Místo konání: Praha 2, Viničná 7, PřF UK,
posluchárna parazitologie
5.6.2003
—4—
214013 Odborná stáž v lékařské parazitologii
Určeno pro lékaře a jiné VŠ pracovníky.
Program: Vybrané problémy lékařské parazitologie,
etiologie parazitárních nákaz, léčba parazitóz člověka,
laboratorní diagnostika, zpracování biologických
materiálů pro vyšetření, interpetace nálezů,
demonstrace preparátů.
Školitel: RNDr. L. Kolářová, CSc.
Místo konání: Praha 10, Ruská 85
22.4.2003 - 25.4.2003
Katedra hygieny a epidemiologie
IPVZ, Ruská 85, 100 05 Praha 10
Vedoucí: MUDr. Vladimír Polanecký, tel. 224 212 039, 271 019 291, fax 271 019 269, e-mail: [email protected]
Katedra hygieny a epidemiologie
207003 Kurz - Diskusní soustředění
Určeno pro krajské a okresní hygieniky, ředitele KHS,
OHS a MHS.
Program: Nejdůležitější okruhy činností hygienických
stanic v oblastech hygieny komunální, výživy, práce,
epidemiologie a správního řízení. (Doporučeno
hlavním hygienikem).
Vedoucí: MUDr. V. Polanecký
Místo konání: Praha 10, Ruská 85
5.5.2003 - 6.5.2003
26.5.2003 - 27.5.2003
207004 Kurz pro obsluhu sterilizační techniky (pro
začátečníky)
Určeno pro vedoucí SZP centrálních sterilizací a další
SZP obsluhující sterilizační techniky.
Program: Metody a postupy podle vyhl. č. 440/2000
Sb.
Vedoucí: MUDr. V. Polanecký, RNDr. J. Zelenková
Místo konání: Praha 10, Ruská 85
22.4.2003 - 25.4.2003
—5—
207005 Pokračovací kurz pro obsluhu sterilizační techniky
(pro pokročilé)
Určeno pro vedoucí SZP centrálních sterilizací a další
SZP obsluhující sterilizační techniky, kteří absolvovali
kurz pro začátečníky.
Program: Metody a postupy podle vyhl. č. 440/2000
Sb.
Vedoucí: MUDr. V. Polanecký, RNDr. J. Zelenková
Místo konání: Praha 10, Ruská 85
12.5.2003 - 15.5.2003
220203 Seminář (mezioborový) - Zdravotní péče
o učňovský dorost
Určeno pro dorostové lékaře, hygieniky práce
a nemocí z povolání, hygieniky dětí a dorostu,
praktické lékaře.
Program: Péče o učně v resortu MZ, MŠMT, MPSV.
Chemická rizika v přípravě na povolání. Rizikové
chování a kriminalita mládeže. Současná legislativa.
Vedoucí: doc. MUDr. J. Hamanová, CSc.
Místo konání: Praha 4, Budějovická 15
3.6.2003 - 4.6.2003
—6—
Přihlášky na všechny školící akce prosím zasílejte na příslušných formulářích na adresu :
PhDr.Morávková Eva – ved.studijního oddělení
Hotel ILF
Budějovická 15
145 00 Praha 4
nebo e-mail : [email protected]
Veškeré informace o akcích konaných IPVZ s možností přihlásit se naleznete na www.ipvz.cz
Doporučené postupy v infekčním lékařství – informace k SARS
• Aktuální informace k SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) jsou k disposici na
stránkách: MZ ČR
http://www.mzcr.cz/cl/630
CEM SZÚ http://www.szu.cz/cem/hpcem.htm
WHO
http://www.who.int/csr/don/cn
CDC
http://www.cdc.gov/ncidod/sars/
PHLS
http://www.phls.co.uk/topics_az/SARS/menu.htm
Z uvedených zdrojů vybíráme:
SARS je závažné akutně probíhající infekční onemocnění, postihující převážně respirační systém, probíhající zpravidla pod
obrazem těžké atypické pneumonie, komplikované resp.insuficiencí, případně ARDS. Onemocnění má vysokou nakažlivost
(pravděpodobně kapénková infekce) a vysokou smrtnost. K 2.4.2003 je ve světě evidováno 2223 případů , z toho v 78 případech
došlo k úmrtí. Onemocnění je k výše uvedenému datu hlášeno z 18 zemí různých kontinentů ( Čína – provincie Guandong,
Hongkong, Taiwan, Vietnam, Singapur, zavlečené případy v Kanadě, USA, Thajsku, Německu…. ). Původce onemocnění není k
31.3.2002 definitivně znám, uvažuje se o paramyxoviru či coronaviru. Současná definice onemocnění a doporučený postup
k zajištění mikrobiologického a virologického vyšetření jsou uvedeny v části Doporučené postupy v klinické mikrobiologii SARS
Z doporučení WHO k eliminaci přenosu této infekce uvádíme:
l. izolace pacienta dle následujících preferencí
a - místnost s negativním tlakem a zavřenými dveřmi
b – jednolůžkové pokoje s vlastní koupelnou
c – společné umístění v místnosti s nezávislým přívodem vzduchu a nezávislým větracím
systémem ( v případě, že nezávislý přívod vzduchu není reálný se doporučuje vypnout
klimatizaci a otevřít okna k zajištění dostatečného větrání)
2. pacienti by měli mimo izolační místnosti nosit chirurgické masky, event. ještě lépe
standardní masky NIOSH - N95 ( k nahlédnutí např. na adrese: http//www.lifeassist.com/n95mask.html., cena cca 1-2 USD)
3. při péči o pacienty používat jednorázové pomůcky a zařízení
4. veškeré návštěvy izolovaných pacientů včetně ošetřovacího personálu by měli užívat
masky N95 (filtrace částic od 0,3 um), chirurgické masky jsou méně účinnou alternativou
5. za nejdůležitější hygienické opatření v prevenci šíření infekce je opětovně považováno mytí rukou. Rukavice nejsou náhradou
za mytí, omytí rukou je nutné i po sundání rukavic. Přesto se užívání rukavic doporučuje všem zdravotníkům pečujícím o pacienty
se SARS. Rukavice by se měly u jednotlivých pacientů vyměňovat, stejně jako po jakémkoliv kontaktu s předměty, jež mohou být
kontaminovány respiračními sekrety (masky, kyslíkové brýle, hadice ventilátoru ..). Rovněž jsou doporučeny vodotěsné zástěry a
pokrývky hlavy. Při úkonech, kdy hrozí vystříknutí či rozprášení krve či jiného biologického materiálu se musí užívat ochranné
brýle nebo štíty chránící obličej.
6. biologický odpad je nutno dávat do odpovídajících nepropustných vaků nebo kontejnerů, náležitě označených a bezpečně
likvidovaných.
U kriticky nemocných může ke stabilizaci zdravotního stavu přispět nitrožilně podaný ribavirin a steroidy. Vakcína ani jiná
cílená profylaxe SARS není k datu sdělení známa. 2.4.2002 vydala WHO doporučení odložit cesty do Číny - Hongkongu a
provincie Guandong.
Poznámka doc.MUDr.J.Beneše,CSc.- izolační možnosti na infekčních odděleních v ČR - na Infekční klinice FN Bulovka byly v
průběhu března 2003 zřízeny pro přijetí pacientů se SARS čtyři pokoje po l-2 lůžkách ve standardní části kliniky a jeden pokoj s 1
lůžkem na resuscitační stanici JIP. Všechny tyto pokoje jsou napojeny na filtroventilační zařízení vytvářející podtlak a opatřené na
výstupu dvěma sériově zapojenými HEPA-filtry. Tato opatření odpovídají přibližně úrovni BL 2-3 a jsou postačující k izolaci a
léčbě pacientů se SARS. Nelze je však považovat za dostačující pro případ výskytu vysoce rizikových infekcí. Proto je urychleně
dokončován projekt na vybudování plně vybaveného centra, které by umožnilo péči o nemocné na úrovni BL 3-4. Jeden pokoj s
filtroventilačním zařízením pro l-2 pacienty má od jara loňského roku infekční odd. SSN v Opavě.
IBKMIL200302VER3.doc
V Opavě 2. dubna 2003
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
MUDr.Petr Kumpel
Doporučené postupy v klinické mikrobiologii - SARS
Uveřejněno se svolením redakce Zpráv CEM. Sdělení byla publikována ve Zprávách CEM 3/2003 (SARS) a 4/2003
(MRSA).
SARS – Severe Acute Respiratory Syndrome (těžký akutní respirační syndrom).
Pokyny pro terénní pracoviště klinické mikrobiologie.
Charakteristika:
SARS je závažné respirační onemocnění probíhající převážně jako těžká atypická pneumonie, komplikovaná respirační
insuficiencí, případně ARDS. Zaznamenané případy vykazují vysokou smrtnost. Původce onemocnění dosud nebyl jednoznačně
identifikován. Zatím jediným výsledkem je nález partikulí paramyxovirů elektronovou mikroskopií u dvou pacientů. Onemocnění
má podle dosavadních zkušeností relativně vysokou nakažlivost, k přenosu dochází pravděpodobně kapénkovou infekcí při
kontaktu s nemocnou osobou. Ve vysokém riziku infekce je zdravotnický personál, který přichází do kontaktu s nemocnými,
pokud striktně nedodržuje opatření protiepidemického režimu.
Epidemiologie:
K 18.3.2003 bylo zaznamenáno bezmála 200 nemocných, 9 zemřelo. První případy byly zjištěny v Číně (provincie
Guangdong). Nevýznamnější současná ohniska byla identifikována ve Vietnamu (Hanoi), v Hongkongu a v Singapuru.
V posledním období došlo k rychlému šíření onemocnění do dalších zemí světa. Dosud byla zaznamenána v Kanadě, Spolkové
republice Německo, ve Švýcarsku, Slovinsku a dalších zemích. Vždy se jednalo o osoby, které přicestovaly z rizikové oblasti,
nebo osoby v blízkém kontaktu s nimi (např. rodinní příslušníci). V České republice nebyl podle informací Ministerstva
zdravotnictví dosud hlášen žádný případ. Inkubační doba onemocnění se zatím odhaduje na 2 až 7 dnů. Problému věnuje
maximální pozornost WHO a CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta USA). Na internetových stránkách těchto
institucí je možné průběžně sledovat vývoj epidemiologické situace a nalézt informace o preventivních opatřeních.
Definice případu:
•
osoba s přítomností jednoho nebo více příznaků respiračního onemocnění, zahrnujících kašel, zkrácený nebo ztížený dech,
hypoxii nebo rentgenový obraz pneumonie či ARDS
a současně
•
horečka nad 38oC
a současně jedna nebo více následujících okolností:
•
•
*
**
úzký kontakt* s osobou s přítomným SARS nebo pro tento syndrom vyšetřovanou, a to v průběhu předchozích 10 dnů od
vzniku příznaků
cestování do oblastí** s dokumentovaným výskytem přenosného SARS, a to v průběhu předchozích 10 dnů od vzniku
příznaků
úzkým kontaktem se rozumí péče o nemocného, nebo soužití s nemocným se suspektním nebo přítomným SARS,
případně přímý kontakt s jeho sekrety z dýchacích cest a/nebo s jinými tělesnými tekutinami
oblasti s výskytem přenosného SARS jsou k 18.3.2003 následující: Hongkong, Čína – provincie Guangdong, Vietnam –
Hanoi, Singapur, Kanada – Toronto. Je třeba průběžně sledovat aktualizovaný seznam rizikovým oblastí na internetových
stránkách WHO, CDC, případně Ministerstva zdravotnictví ČR.
Mikrobiologická diagnostika:
Každý pacient s klinickým obrazem komunitní pneumonie, zejména její těžké formy, musí být pečlivě mikrobiologicky
vyšetřen. Odpovídá-li případ výše popsané klinické i epidemiologické definici, musí být vybrané vzorky biologického materiálu
uchovány k odeslání do speciálních diagnostických laboratoří (viz dále). U každého pacienta je třeba zajistit následující vzorky
22.6.200606
Strana 8 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
biologického materiálu (jsou-li dostupné, případně není-li kontraindikován invazivní odběr) a provést vyšetření nezbytná pro
diferenciální diagnostiku SARS:
Mikrobiologická vyšetření pro etiologickou diferenciální diagnostiku komunitní pneumonie.
•
•
•
•
vzorky z dolních cest dýchacích (sputum, tracheální aspirát, bronchoalveolární laváž) se odebírají obvyklým způsobem, a to
zásadně před zahájením úvodní antibiotické léčby. Invazivní odběry (laváže, bronchoskopické odběry) se provádějí pouze
v případě, že nejsou kontraindikovány v souvislosti s celkovým klinickým stavem nemocného. V lokálních laboratořích se
doporučuje provést následující vyšetření:
základní bakteriologické vyšetření (mikroskopické a kultivační) se provádí v lokální rutinní laboratoři podle místních
standardních postupů. Doporučuje se prodloužená kultivace (3 až 5 dnů) a opatrná interpretace nálezů neobvyklých
izolátů. U obtížně identifikovatelných a neobvyklých izolátů je třeba vyšetřit citlivost k antibiotikům a odeslat je
k identifikaci do příslušné referenční laboratoře
kultivační průkaz legionel je doporučeno provádět standardním postupem u všech klinicky relevantních vzorků
z dolních cest dýchacích. Není-li vyšetření k dispozici v lokální laboratoři, provede se ve smluvní či spádové laboratoři
podle místních zvyklostí.
průkaz chlamydií a mykoplasmat v sekretech z dolních cest dýchacích je doporučeno provést, je-li příslušné vyšetření
k dispozici v lokální, smluvní či spádové laboratoři podle místních podmínek. Detailní podmínky a způsob odběru je
vhodné konzultovat s příslušnou laboratoří, která obvykle poskytuje také adekvátní odběrový materiál.
virologické vyšetření je doporučeno provádět u všech případů odpovídajících definici SARS. Provádí se v místních
diagnostických laboratořích podle lokálních podmínek. Není-li na daném pracovišti k dispozici virologická laboratoř,
odesílají se vzorky na vyšetření místně obvyklým způsobem do lokálních smluvních či spádových laboratoří. Detailní
podmínky a způsob odběru je vhodné konzultovat s příslušnou virologickou laboratoří, která obvykle poskytuje také
adekvátní odběrový materiál.
hemokultura - odebírají se 2 až 3 vzorky krve venepunkcí periferní žíly, u dospělého nemocného na každý vzorek 10 ml krve
rozdělených po 5 ml do aerobní a anaerobní hemokultivační lahvičky. Odběr musí být proveden zásadně před zahájením
úvodní antibiotické léčby. Provádí se standardní hemokultivační vyšetření v automatickém systému podle lokálního
protokolu. Je vhodné prodloužit délku inkubace na 10 až 12 dnů, pokud jsou vzorky negativní.
moč - vyšetření antigenu Legionella pneumophila v moči by mělo být provedeno u všech závažně probíhajících případů
komunitní pneumonie. Provádí se v lokální laboratoři. Není-li k dispozici, odesílá se do místní smluvní či spádové laboratoře
podle místních zvyklostí.
krev na sérologické vyšetření (dvě zkumavky srážlivé krve po 10 ml) se odebírá při přijetí k hospitalizaci, případně v ordinaci
praktického lékaře nebo ambulantního specialisty při ambulantním ošetření. S odstupem 2 až 3 týdnů je třeba opakovat odběr
a zajistit rekonvalescentní sérum k opakovanému vyšetření a průkazu případného signifikantního vzestupu titru protilátek. Na
lokální úrovni se provádějí následující sérologická vyšetření:
sérologie respiračních virů
sérologie Mycoplasma pneumoniae
sérologie Chlamydia pneumoniae
sérologie legionelózy
Zajištění vzorků k následnému průkazu neznámého původce ve specializovaných laboratořích.
Pro další speciální analýzy v centrálních laboratořích se uchovávají, případně odebírají níže popsané vzorky pouze od
pacientů, kteří odpovídají klinické i epidemiologické definici případu SARS (viz výše).Pro provedení virologických vyšetření je
nezbytné uchování všech vzorků při teplotě -70OC, nebo transportovat biologický materiál bezprostředně po odběru při teplotě
+4OC do cílové laboratoře tak, aby byl zpracován nejdéle za 6 hodin. Teplota –20 OC může významně negativně ovlivnit výtěžnost
virologických vyšetřovacích metod.
•
•
sputum se uchovává ve sterilním kontejneru při teplotě –70 OC nebo nejnižší teplotě, která je na pracovišti k dispozici
(nejméně –20OC). Transport vzorku posléze probíhá na suchém ledu. Vzorek je možno odeslat bezprostředně po odběru při
teplotě +4OC, za předpokladu, že bude v cílové laboratoři zpracován nejdéle do dvou hodin od odběru, v případě
virologického vyšetření do šesti hodin od odběru. Sputum by mělo být uchováno, přestože nejde o optimální vzorek pro
virologické vyšetření.
tracheální aspirát, bronchoalveolární laváž (případně jiné invazivně odebrané vzorky z dolních cest dýchacích) se
uchovávají ve sterilním kontejneru při teplotě –70OC nebo nejnižší teplotě, která je na pracovišti k dispozici (nejméně –20OC).
Transport vzorku posléze probíhá na suchém ledu. Vzorek je možno odeslat bezprostředně po odběru při teplotě +4 OC, za
předpokladu, že bude v cílové laboratoři zpracován nejdéle do dvou hodin od odběru, v případě virologického vyšetření do
šesti hodin od odběru. Vzorky jsou vhodné pro komplexní mikrobiologickou diagnostiku včetně virologické.
22.6.200606
Strana 9 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
• hemokultura – u negativních vzorků se po ukončení standardního vyšetření uchovává pro eventuální další analýzu 3 x 1 ml
z každého vzorku krve ve sterilních kontejnerech nejméně při teplotě –20OC, případně nižší.
• moč – 20 ml moči (střední proud, cévkovaná moč) se uchovává po provedení rutinních vyšetření ve sterilním kontejneru při
teplotě –70OC nebo nejnižší teplotě, která je na pracovišti k dispozici (nejméně –20OC). Transport vzorku posléze probíhá na
suchém ledu. Vzorek je možno odeslat bezprostředně po odběru při teplotě +4 OC, za předpokladu, že bude v cílové laboratoři
zpracován nejdéle do dvou hodin od odběru, v případě virologického vyšetření do šesti hodin od odběru.
• nazofaryngeální výplach, případně aspirát – nazofaryngeální výplach je vhodný pro ELM vyšetření, aspirát pro veškerá
virologická vyšetření včetně ELM.
• faryngeální výtěr a výtěr z nosu – provádí se sterilním vatovým tamponem na špejli (nikoliv detoxikovaným s carbosorbem)
nazální a orální cestou následujícím způsobem: pacient se vyzve, aby si odkašlal a provede se energický stěr ze zadní
faryngeální stěny, druhým tamponem se vytřou oba nosní průduchy a oba tampony se zalomí do téže zkumavky
s transportním virologickým mediem.
• sérum – uchovává se celý zbytek separovaného séra po provedení rutinních vyšetření, a to při teplotě nejméně –20OC nebo
nižší. Uchovány musí být vzorky akutního i rekonvalescentního séra.
• ostatní klinicky relevantní vzorky (např. mozkomíšní mok, primárně sterilní tělesné tekutiny jako např. pleurální nebo
perikardiální výpotek) se po provedení rutinních vyšetření uchovávají při teplotě –70 OC nebo nejnižší teplotě, která je na
pracovišti k dispozici (nejméně –20OC). Transportují se na suchém ledu.
• sekční materiál – odebírá se stěr z tracheální sliznice na virologické vyšetření do speciálního média (MEM bez séra
s antibiotiky nebo PBS s antibiotiky, nepoužívat BSA). Vzorky tkáně (ze suspektních pneumonických ložisek apod.) se
odebírají do sterilních kontejnerů a pokud možno ihned se transportují do cílové laboratoře při teplotě +4 OC a nebo se
uchovávají při –70OC.
Uchovávání kmenů a sér.
Všechny suspektní izoláty mikroorganismů získané výše popsanými vyšetřeními a všechna suspektní séra se uchovávají
standardním způsobem pro potřeby dalších analýz, a to po dobu, dokud není daný případ epidemiologicky došetřen.
Transport vzorků.
Materiál je nutné transportovat v trojím obalu (klasický postup pro transport vysoce rizikového biologického materiálu),
teplotní režim viz výše. Pro převoz materiálu může SZÚ po předchozí domluvě eventuálně poskytnout auto.
Kontakt na centrální pracoviště.
sekretariát vedoucího Centra epidemiologie a mikrobiologie SZÚ: +420-267 082 250, v závislosti na vývoji
epidemiologické situace budou na internetové adrese http://www.szu.cz/ k dispozici kontakty na službu konající osoby.
Bezpečnost práce s biologickým materiálem v laboratořích klinické mikrobiologie v případě podezření na SARS.
Každý vzorek biologického materiálu odesílaný na mikrobiologické, případně jiné laboratorní vyšetření, musí být
označen jako vysoce rizikový. Podobně musí být označen průvodní list, jako diagnóza musí být zřetelně uvedeno podezření na
SARS. Se vzorky krve a séra musí být zacházeno jako se vzorky vyšetřovanými při podezření na infekci HIV a virové hepatitidy.
Biologický materiál má být zpracováván podle kritérií biologické bezpečnosti BSL 3. Zejména to platí pro sekrety z dýchacích
cest a další tekutý materiál. Personál laboratoře musí být při zpracování vzorků bezpodmínečně vybaven rouškou a rukavicemi,
případně ochranným štítem.
Informační zdroje na internetu:
WHO: http://www.who.int/csr/don/en/
CDC: http://www.cdc.gov/ncidod/sars/
PHLS: http://www.phls.co.uk/topics_az/SARS/menu.htm
Ministerstvo zdravotnictví České republiky:http://www.mzcr.cz/cl/630
Centrum epidemiologie a mikrobiologie SZÚ:
http://www.szu.cz/cem/hpcem.htm
20.3.2003
Autoři (podle abecedy, bez titulů): Vlastimil Jindrák, Bohumír Kříž, Jan Kynčl, Marie Otavová, Pavla Urbášková, Eva
Žampachová
22.6.200606
Strana 10 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
Mikrobiologický průkaz MRSA, GISA a GRSA
Úvod
MRSA, methicillin - resistant S. aureus, je tradiční název pro kmeny Staphylococcus aureus rezistentní k oxacilinu. Rezistence
MRSA k oxacilinu a k dalším β-laktamovým antibiotikům je způsobena produkcí alterované transpeptidázy nazvané penicillin - binding protein
2a (PBP2a), jejíž syntéza je kódována genem mecA. Podle počtu buněk s genem mecA se populace MRSA rozlišuje jako homorezistentní (>=1
buňka s vysokým stupněm rezistence/100 buněk populace), populace s nižším počtem rezistentních buněk se označují jako heterorezistentní.
Mechanismus heterorezistence není zcela objasněn, předpokládá se, že zahrnuje interakce mezi PBP2a a různými genovými produkty
kódovanými geny fem (factor essential for methicillin resistance), které se účastní syntézy peptidoglykanu při stavbě buněčné stěny (1).
MRSA jsou typicky rezistentní ke všem beta-laktamovým antibiotikům, včetně jejich kombinací s inhibitory β-laktamáz a karbapenemů (2).
Samostatná rezistence k této skupině antibiotik se u MRSA vyskytuje výjimečně, mnohem častěji je sdružena s rezistencí k několika nebo většině
antibiotik z dalších skupin, jako jsou makrolidy, aminoglykosidy, tetracyklin, chloramfenikol, rifampicin, fluorochinolony, chloramfenikol, méně
často s rezistencí ke ko-trimoxazolu, mupirocinu, kyselině fusidové a doposud velmi vzácně ke glykopeptidům, linezolidu nebo kombinaci
quinupristinu s dalfopristinem. Všechny izoláty MRSA, které byly necitlivé k vankomycinu, jevily až do zcela nedávné doby pouze
intermediární stupeň rezistence k vankomycinu, respektive k dalšímu glykopeptidu, teikoplaninu. Označovaly se jako VISA (vancomycin –
intermediate resistant S. aureus), nebo přesněji jako GISA (glycopeptide-intermediate-resistant S. aureus). U řady těchto izolátů není rezistence
ke glykopeptidům homogenní a proto se označují se jako hGISA (heteroresistentní GISA). GISA vznikají z MRSA a doposud nepříliš dobře
poznaným způsobem vytvářejí abnormálně silnou vrstvu peptidoglykanu, pravděpodobně jako reakci na přítomnost glykopeptidů v prostředí (3).
V průběhu druhé poloviny roku 2002 byly popsány případy infekcí způsobených kmeny MRSA, které byly současně vysoce rezistentní
k vankomycinu. U těchto kmenů, nazývaných VRSA (vancomycin-resistant S. aureus) nebo přesněji GRSA (glykopeptide-resistant S. aureus), je
rezistence ke glykopeptidům způsobena přítomností genu van A, získaného pravděpodobně konjugací od enterokoků (4).
Nebezpečí selhání léku volby oxacilinu při léčbě infekcí způsobených MRSA, častá multirezistence těchto kmenů a možnost
výskytu kmenů MRSA se sníženou citlivostí či zcela rezistentních ke glykopeptidům zvýrazňuje význam rychlého získání spolehlivého výsledku
vyšetření citlivosti. Laboratorní průkaz MRSA a GISA má určitá úskalí, neboť zejména heterorezistentní kmeny mohou uniknout pozornosti.
Postup metod je proto nutno pečlivě dodržovat a kvalitu jejich provedení pravidelně kontrolovat.
Laboratorní průkaz rezistence u S. aureus
Zlatým standardem pro průkaz genu mecA je metoda PCR. S výsledky této metody poměrně dobře korespondují výsledky vyšetření
přítomnosti produktu tohoto genu (enzymu PBP2a) metodou latexové aglutinace (5). Výhodou obou zmíněných metod je rychlost získání
výsledků v průběhu několika hodin.
K detekci rezistence k oxacilinu u homorezistentních a většiny heterorezistentních kmenů lze použít běžné fenotypové metody
(disková difusní metoda, vyšetření MIC), které je však nutno upravit tak, aby vyhovovaly růstovým podmínkám MRSA. Při pečlivém
dodržování předepsaných podmínek korespondují výsledky těchto metod s výsledky získanými metodou PCR. Heterorezistentní kmeny MRSA
s extrémně nízkým počtem buněk rezistentních k oxacilinu (<=1 rezistentní buňka /100 000 000 buněk populace) jsou obvykle inhibovány
nižšími koncentracemi než 4 mg/l oxacilinu, kolem disku s 1 ug oxacilinu vytvářejí velké inhibiční zóny v nichž není patrný žádný růst, nerostou
na dříve doporučované vyhledávací půdě s 6 mg/l oxacilinu a tudíž se fenotypově jeví jako citlivé k oxacilinu. Vzhledem k tomu, že žádný
fenotypový systém není zcela spolehlivý pro potvrzení MRSA, doporučuje se v rutinní laboratoři používat kombinaci více metod a výsledky
ověřovat a podezřelé kmeny zasílat do speciální laboratoře ke konfirmaci genu mecA, případně i k epidemiologické analýze klonů MRSA
vyskytujících se na daném území.
Metody pro průkaz intermediární rezistence nebo úplné rezistence ke glykopeptidům se týkají pouze kmenů MRSA. Heterorezistentní
kmeny (hGISA) se obvykle vyznačují značným stupněm nestability glykopeptidové rezistence, a proto se při selhání léčby glykopeptidy u
pacientů infekcí MRSA doporučuje očkovat vzorky krve pacienta na běžné laboratorní půdy a případně také na půdu obsahující nízké
koncentrace vankomycinu. Zatímco pro vysokou rezistenci lze pro průkaz GRSA použít běžné vyšetření MIC nebo vyhledávací metodu s 6 mg/l
vankomycinu, průkaz GISA vyžaduje vysokou koncentraci inokula a jiné uspořádání vyhledávací metody (6).
Rutinní vyšetření citlivosti poskytuje primárně informaci o antibioticích, která jsou pro rezistenci původce infekce nevhodná
k léčbě. Kvantitativní údaje vyšetření citlivosti k antibiotikům (minimální inhibiční koncentrace nebo průměr zón inhibice) lze využít
k fenotypové typizaci MRSA, neboť různé epidemické kmeny mají odlišné antibiogramy. Příslušnost kmene k určitému klonu lze
posoudit podle podobnosti kvantitativního antibiogramu epidemiologicky definovaného souboru kmenů, podrobených multivariabilní
analýze. Výsledky antibiotické typizace korelují s výsledky typizace klonů MRSA získanými elektroforézou fragmentů DNA
v pulsním poli (PFGE - pulsed field gel electrophoresis) a mohou sloužit také k zjištění dynamiky šíření klonů (5).
a) Průkaz MRSA v klinickém materiálu
Rychlá identifikace MRSA ve vzorcích pacientů infikovaných nebo kolonizovaných MRSA může efektivně přispět k zahájení postupů
omezujících šíření těchto bakterií v nemocnicích. Detekci urychlí naočkování vzorku pacienta na vyhledávací selektivně-diagnostickou půdu
s oxacilinem a s vyšší koncentrací NaCl, která podporuje růst MRSA a inhibuje většinu druhů gramnegativních tyček. Tyto půdy mohou
obsahovat také manitol a indikátor k předběžnému odlišení S. aureus od jiných stafylokoků, případně další antibiotikum k potlačení růstu jiných
druhů bakterií (7). Vzorky je zapotřebí očkovat současně také na neselektivní krevní agar a na krevní agar se 4% NaCl, neboť zvýšená
koncentrace soli podporuje růst MRSA. Postup a podmínky používání jedné z komerčních půd je v tabulce 1.
b) Detekce MRSA v čistých kulturách S. aureus
Při rutinním vyšetřování antibiotické citlivosti izolátu S.aureus se používá vyhledávací metoda pro MRSA v kombinaci s alespoň
jednou běžně používanou metodou vyšetřování citlivosti (diskovou, diluční). NCCLS (2) doporučuje Mueller Hinton agar se 4% NaCl a se 6
mg/l oxacilinu (tabulka 2), na které lze spolehlivě vyhledat většinu MRSA s výjimkou heterorezistentních kmenů s extrémně nízkým počtem
buněk rezistentních k oxacilinu. Naopak na slaném agaru se sníženým obsahem oxacilinu (2 mg/l) (tabulka 3) mohou vyrůstat kmeny které jsou
22.6.200606
Strana 11 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
pouhými hyperproducenty β-laktamázy. Nejefektivnější se jeví použití obou vyhledávacích metod současně. Rutinní metody vyšetřování
citlivosti musí být upraveny tak, aby vyhovovaly růstovým podmínkám MRSA.
Podrobnosti provedení a podmínky zvyšující spolehlivost průkazu MRSA jsou uvedeny pro diskovou metodu v tabulce 4, pro diluční
mikrometodu v tabulce 5 a pro Etest v tabulce 6. Podezření na přítomnost MRSA lze ověřit metodou průkazu produktu PBP2a genu mecA
(tabulka 7) nebo amplifikací genu mecA metodou PCR (tabulka 8). Podrobnosti přípravy a provádění fenotypových metod a vyšetření citlivosti
S. aureus k jiným antibiotikům jsou uvedeny v podrobné příručce (8), zde jsou uvedeny metody pro průkaz MRSA doplněné o nové poznatky,
které se v určitých podrobnostech od této příručky liší. Pro získání spolehlivého výsledku platí podmínka přesného dodržení postupu.
c) Detekce GISA, GRSA v čistých kulturách MRSA
Diskovou metodu nelze použít k vyšetření citlivosti S. aureus včetně MRSA ke glykopeptidům, a ani vyšetření MIC v běžném
uspořádání dilučních metod není spolehlivé. Průkaz GISA vyžaduje vysokou koncentraci inokula a kvalitní živnou půdu. Kmeny GRSA lze
zřejmě prokázat snadněji, doposud však chybí vlastní zkušenosti. K doporučovaným metodám patří vyhledávací metoda s 5 mg/l teikoplaninu
(tabulka 9), vyhledávací metoda s 6 mg/l vankomycinu (tabulka 10) a Etest s vankomycinem a teikoplaninem. Spolehlivost průkazu zvyšuje
použití více metod současně.
Literatura
1.
Chambers HF. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications.
Clin Microbiol Rev
1997;10:781 – 791.
2.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.; twelfth
informational supplement. NCCLS document M100-S12, Pa, USA 2002.
3. Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced
vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 1997;40:135-136.
4.
Centers for Disease Control and Prevention. Staphylococcus aureus resistant to vancomycin-United States, 2002. Morbid Mortal
Weekly Rep 2002;51:565-567.
5.
Tenover FC, Arbeit R, Archer G, et al. Comparison of traditional and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. J
Clin Microbiol 1994;32:407 - 415.
Walsh TR, Bolmström A, Qwárnström A, Ho P, Wotton M, Howe RA, MacGowan AP, Diekema D. Evaluation of current methods for
detection of staphylococci with reduced susceptibility to glycopeptides. J Clin Microbiol 2001;39:2439-2444.
Simor AE, Goodfellow J, Louie L, Louie M. Evaluation of a new medium, Oxacillin Resistance Screen Agar Base, for the detection of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus from clinical specimens. J Clin Microbiol 2001;39:3422.
6.
7.
8. Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. Trios 1998.
22.6.200606
Strana 12 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
Tabulka 1. Vyhledávání MRSA ze vzorků – skríningová metoda s 2 mg/l oxacilinu (ORSAB Oxoid)
Půda
Očkování
Inkubace
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Odečítání
Hodnocení
Další vyšetření
Živný agar s 5,5% NaCl a 2 mg/l oxacilinu.
Vzorek se masivně rozetře na vymezenou výseč vyhledávací půdy.
Současně se očkuje na krevní agar se 4% NaCl a na obyčejný krevní agar.
24 hodin/35oC.
S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).
S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).
Hodnotí se růst.
Růst dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA.
Obsahuje-li půda manitol a indikátor, půda kolem kolonií S. aureus (MRSA) se zbarví.
Izolace kolonií z vyhledávací půdy na krevní agar a inkubace 24 hodin/35oC.
Čistá kultura se rutinně identifikuje (vyšetření produkce koagulázy , příp. desoxiribonukleázy).
Další postup, viz vyšetření citlivosti izolátů.
Tabulka 2. Vyhledávací metoda s 6 mg/l oxacilinu (2)
Půda
Inokulum
Koncentrace inokula
Očkování
Inkubace
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Odečítání
Hodnocení
Další vyšetření
Ověření MRSA
MHA agar se 4% NaCl a 6 mg/l oxacilinu.
Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.
Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.
Upraví se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.
10 ul inokula se rozetře kličkou na povrch agaru (průměr plochy 15 mm) a nechá se zaschnout.
24 hodin/35oC.
S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).
S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).
Hodnotí se růst.
Růst dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA.
Vyhledávací metoda s 2 mg/l oxacilinu a další rutinní metoda vyšetření citlivosti.
Latexová aglutinace nebo PCR.
Tabulka 3. Vyhledávací metoda s 2 mg/l oxacilinu*
Půda
Inokulum
MHA agar s 4-5,5% NaCl a 2 mg/l oxacilinu.
Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.
Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.
Koncentrace inokula
Upraví se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.
Očkování
10 ul inokula se rozetře kličkou na povrch agaru (průměr plochy 15 mm) a nechá se zaschnout.
Inkubace
24 hodin/35oC.
Negativní kontrola
S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).
Pozitivní kontrola
S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).
Odečítání
Hodnotí se růst.
Hodnocení
Růst dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA.
Další vyšetření
Vyhledávací metoda s 6 mg/l oxacilinu a další rutinní metoda vyšetření citlivosti.
Ověření MRSA
Latexová aglutinace nebo PCR.
* Lze použít komerční půdu, je však třeba striktně dodržet postup uvedený v tabulce 3.
Tabulka 4. Disková metoda pro vyšetření citlivosti k oxacilinu (8)
Půda
Inokulum
Koncentrace inokula
Očkování
Disk
Inkubace
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Odečítání
22.6.200606
Mueller-Hinton agar.
Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.
Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.
Upraví se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.
Roztěr na celou plochu agaru kličkou nebo přelitím a odsátím přebytku.
Disk s 1 ug oxacilinu se umístí na povrch agaru.
Celá plocha disku musí být v kontaktu s agarem.
24 hodin/35oC.
S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).
S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).
Inhibiční zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o.
Pátrá se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou.
Průměr zřetelné inhibiční zóny se změří obvyklým způsobem.
Strana 13 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Hodnocení
Příčiny chyb
Další vyšetření
Ověření MRSA
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
Homorezistentní populace MRSA obvykle nevytváří zóny inhibice.
Heterorezistentní populace vytváří zřetelné zóny inhibice s patrným růstem rezistentní
subpopulace MRSA v povlaku nebo jednotlivých koloniích.
Heterorezistentní populace s extrémně nízkým počtem rezistentních buněk vytváří zóny inhibice
jako citlivá populace (>=13 mm).
Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.
Příliš koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky.
Vyhledávací metoda a diluční mikrometoda nebo Etest.
Latexová aglutinace nebo PCR.
Tabulka 5. Diluční mikrometoda pro vyšetření citlivosti k oxacilinu (8)
Půda
Koncentrace oxacilinu
Inokulum
Koncentrace inokula
Očkování
Inkubace
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Odečítání
Hodnocení
Příčiny chyb
Další vyšetření
Ověření MRSA
Mueller-Hinton bujon (20-25 mg/l Ca2+ a 10-12,5 mg/l Mg2+) + 2 % NaCl pro oxacilin.
Osm ředění dvojnásobně geometrickou řadou (od 0,125 mg/l do 16 mg/l).
Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.
Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.
Upraví se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.
1-5 ul podle typu jehlového inokulátoru.
24 hodin/35oC.
S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).
S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).
MIC je koncentrace v první jamce která inhibuje růst.
Homorezistentní populace vykazuje zřetelný růst i ve vysokých konc. oxacilinu (>16 mg/l).
Heterorezistentní populace se může jevit jako citlivá k oxacilinu.
Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.
Příliš koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky.
Vyhledávací metoda.
Latexová aglutinace nebo PCR.
Tabulka 6. Etest pro vyšetření citlivosti k oxacilinu (ABBiodisk Solna)
Půda
Inokulum
Koncentrace inokula
Očkování
Etest
Inkubace
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Odečítání
Hodnocení
Příčiny chyb
Další vyšetření
Ověření MRSA
Mueller-Hinton agar s 2% NaCl.
Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.
Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.
Upraví se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.
Roztěr 0,2 ml inokula na celou plochu agaru kličkou.
Proužek s oxacilinem se umístí na agar tak, aby jeho celá plocha byla v kontaktu s agarem.
24 hodin/35oC.
S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).
S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).
Inhibiční zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o .
Pátrá se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou.
Mikrokolonie a izolované kolonie se zahrnují k rostoucí kultuře.
MIC se odečítá v místě úplné inhibice růstu kolonií, kde okraj inhibiční zóny protíná proužek.
Homorezistentní populace vykazuje zřetelný růst i ve vysokých konc. oxacilinu (>16 mg/l).
Heterorezistentní populace se může jevit jako citlivá k oxacilinu.
Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.
Vyhledávací metoda.
Latexová aglutinace nebo PCR.
Tabulka 7. Průkaz PBP2a latexovou aglutinací (MRSA-SCREEN Denka Seiken)
Vyšetřovaný kmen
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Inokulum
Koncentrace inokula
22.6.200606
24 hodinová kultura na živném agaru.
S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).
S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).
2 plné kličky o obsahu 1 ul (2 ul).
1,5 x 109 buněk.
Strana 14 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Extrakce PBP2a
Latexová aglutinace
Odečítání
Hodnocení
Interpretace
Příčiny chyb
Ověření MRSA
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
K inokulu v mikrozkumavce se přidají 4 kapky činidla 1.
Suspenze se povaří po dobu 3 minut.
Po vyjmutí z lázně se mikrozkumavka nechá vychladnout pokojové teplotě.
Přidá se kapka činidla 2 a suspenze se promíchá.
Suspenze se centrifuguje při nízkých otáčkách (1500g) po dobu 15 min.
Supernatant se po centrifugaci odsaje.
Na podložku se přenese 50 ul supernatantu a promíchá se s 25 ul specifických Ig proti PBP2a
značených latexem.
Na podložku se přenese 50 ul supernatantu a promíchá se 25 ul nespecifických Ig proti PBP2a
značenými latexem (negativní kontrola)
Suspenze na podložce se promíchává obvyklým kolébavým způsobem.
Odečítá se nejdříve po 3 minutách a pak za 15 minut.
Pozitivní: zřetelná a typická aglutinace (vytvoření shluků v čiré tekutině).
Negativní: nezřetelná, nejasná aglutinace ve zkalené tekutině.
MRSA – aglutinace jen se specifickými Ig pro PBP2a.
MRSA negativní – žádná nebo netypická aglutinace.
Nemožno interpretovat – aglutinace s negativní kontrolou.
Ingredience nebyly před použitím řádně protřepány.
Mikroorganizmus není S. aureus.
Suspenze nebyla ve vodní lázni 3 minuty (prodloužení této doby snižuje senzitivitu, zkrácení
doby je příčinou nespecifické aglutinace).
Supernatant obsahoval sediment-buněčnou drť (nespecifická aglutinace).
PCR.
Tabulka 8. Amplifikace mecA genu pomocí PCR
Vyšetřovaný kmen
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Inokulum
Koncentrace inokula
Kontrola amplifikace
Lýza buněk
Denaturace
Naředění vzorku
Odstranění drtě
Templát
Primery
Parametry PCR
Detekce
Odečítání
Příčiny chyb
24 hodinová kultura na živném agaru.
S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).
S. aureus ATCC 27626 (kontrola detekce mecA genu)
Do mikrozkumavky s 0,5 ul lysostafinu (10 mg/ml) a 20 ul roztoku TE (10mM Tris, 1mM
EDTA, pH8) se přidá inokulum 1 ul kličkou.
1,5 x 109 buněk.
Primery pro 16S rRNA (kontrola správně připravené templátové DNA)
Inkubace 37oC/15 min.
95oC/15 min.
Přidá se 180 ul deionizované vody, obsah se řádně protře na vortexu.
Centrifugace 13000 g/5 min.
2 ul supernatantu (do 50 ul PCR reakce)
RSM 2647: 5´-AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C-3´
RSM 2648: 5´-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTGC-3´
40 cyklů: 94oC/30 s, 55oC/30 s, 72oC/1 min.
Závěrečná inkubace - 72oC/5 min.
10 ul vzorku po amplifikaci, elfo; 2% agaróza, 1 hod.
Pozitivní – amplikon (fragment DNA) velikosti 533 bp.
Negativní – žádný amplikon specifické velikosti.
Kontaminace negativních vzorků prostřednictvím DNA pozitivních vzorků nebo pozitivní
kontroly (zdroj kontaminace-pipety, roztoky, neadekvátní prostorové podmínky pro PCR).
Nízká senzitivita reakce - málo nebo příliš koncentrované inokulum (interference jiných součástí
buněk nebo ingrediencí použitých při přípravě templátu).
Jiný než popsaný způsob manipulace s ingrediencemi (falešná negativita).
Malé množství vzorku pro detekci (falešná negativita).
Tabulka 9. Vyhledávací metoda pro GISA a GRSA s 5 mg/l teikoplaninu (8)
Půda
Inokulum
Koncentrace inokula
Inokulace
Inkubace
Negativní kontrola
22.6.200606
Mueller Hinton agar s 5 mg/l teikoplaninu.
Klička 24 hodinové kultury MRSA z krevního agaru se očkuje do zkumavky s 5 ml BHI*.
BHI se inkubuje při 35oC přes noc.
10 ul kultury ve stacionární fázi růstu (neředěná kultura z BHI).
Inokulum se rozetře po povrchu půdy s teikoplaninem do plochy o průměru 15 mm.
48 hodin/35oC.
S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).
Strana 15 (celkem 16)
22.6.200606
IBKMIL200302VER3.doc
Pozitivní kontrola
Odečítání
Hodnocení
Příčiny chyb
Další vyšetření
Ověření GISA, GRSA
* Brain Heart Infusion
Vytvořeno dne 30.05.2006 18:17:00
Vytvořil MUDr. Scharfen CSc.
E. faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530).
Odečítá se růst.
Růst >=1 kolonie vede k podezření na GISA nebo GRSA.
Málo koncentrované inokulum
Etest s teikoplaninem a vankomycinem a vysokou koncentrací inokula (tab.11)
Zaslat do NRL/ATB.
Tabulka 10. Vyhledávací metoda pro GISA a GRSA s 6 mg/l vankomycinu (2)
Půda
Inokulum
Koncentrace inokula
Inokulace
Inkubace
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Odečítání
Hodnocení
Příčiny chyb
Další vyšetření
Ověření GISA, GRSA
* Brain Heart Infusion
Brain Heart Infusion agar s 6 mg/l vankomycinu.
Klička 24 hodinové kultury MRSA z krevního agaru se očkuje do zkumavky s 5 ml BHI*.
BHI se inkubuje při 35oC přes noc.
10 ul kultury ve stacionární fázi růstu (neředěná kultura z BHI).
Inokulum se rozetře po povrchu půdy s vankomycinem do plochy o průměru 15 mm.
48 hodin/35oC.
S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).
E. faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530).
Odečítá se růst.
Růst >=1 kolonie vede k podezření na GISA nebo GRSA.
Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.
Etest s teikoplaninem a vankomycinem a vysokou koncentrací inokula (tab.11).
Zaslat do NRL/ATB.
Tabulka 11. Etest s vankomycinem a teikoplaninem (AB Biodisk, Solna)
Půda
Inokulum
Koncentrace inokula
Očkování
Etest
Inkubace
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Odečítání
Brain Heart Infusion Agar.
Do fyz. roztoku se rozetře několik kolonií z 24 hod. kultury MRSA vyrostlé na krevním agaru.
Upraví se fyz. roztokem dle stupně 2 McFarlandova zákalového standardu.
Roztěr 0,2 ml inokula na celou plochu agaru kličkou.
Proužek s antibiotikem se umístí na agar tak, aby jeho celá plocha byla v kontaktu s agarem.
48 hodin/ 35oC.
S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).
E. faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530)
Inhibiční zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o .
Pátrá se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou.
Mikrokolonie a izolované kolonie se zahrnou do růstu.
MIC se odečítá v místě úplné inhibice růstu.
Hodnocení
Negativní: MIC vankomycinu <8 mg/l, MIC teikoplaninu <12 mg/l.
Pozitivní: MIC vankomycinu a teikoplaninu >=8 mg/l, nebo MIC teikoplaninu >=12 mg/l*.
Příčiny chyb
Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.
Ověření GISA, GRSA
Zaslat do NRL/ATB.
• bez ohledu na MIC vankomycinu.
Předběžná verze pracovního postupu.
22.6.200606
Strana 16 (celkem 16)
22.6.200606