IV. Transgenoze rostlin

15/03/2010
TRANSGENOZE ROSTLIN
vnášení cizorodých genů či jiné genetické
informace do rostlin a manipulace s nimi
(GMO)
TRANSGENOZE trvalá
- změna genetické
i k iinformace
f
jje přenášená na potomstvo
(infekce Agrobakteriem)
TRANSGENOZE dočasná
- genetická informace je změněna pouze u vegetativní části
rostliny a nepřenáší se na potomstvo
(elektroporace, biolistické metody)
1
15/03/2010
PG1
Agrobacterium tumefaciens
•
•
•
patogenní
bakterie
přirozeně
se
vyskytující v kořenovém systému
bobovitých rostlin
přítomnost baktérie se projevuje tumory
tzv. crown gall tissue
Agrobacterium je schopné napadat
jakékoliv pletivo většiny dvouděložných
rostlin a za určitých podmínek i rostlin
jednoděložných
Ti plazmid
(tumor inducing)
Agrobacteria tumefaciens (200 kb)
ipt,aux,nop
syntéza
cytokininů
auxinů
opinů
další geny pro biosyntézu
cytokininů, permeasy,
přenašeče přes membránu,
enzymy metabolizující opiny a
ostatní enzymy umožňující
infekci
2
Snímek 3
PG1
čeleď Rhizobiaceae, stejně jako symbiotické bakterie fixující dusík např druh Rhizobium
galuszka; 18/03/2006
15/03/2010
PG2
rostlina při zranění produkuje fenolické látky
(acetosyringon), ty se váží na specifické
receptory na membráně Agrobacteria VirA a
způsobují transkripci genu s vir regionu Ti
plazmidu Agrobacteria
nopalin
• aktivace vir regulonu
• VirD2 protein se váže na 5‘ T-DNA
(transferred)
• denaturace ss T-DNA z Ti plazmidu
• VirE2 proteiny stabilizují ss T-DNA
• VirD2
Vi D2 a VirE2
Vi E2 proteiny
i
obsahují
b h jí
sekvenci potřebnou pro cílení do jádra
rostlinné buňky
• VirE2 se váže na proteiny VIP1 a VIP2
které
zacílí
T-DNA
řetězec
do
chromatinu rostlinného chromozomu
3
Snímek 5
PG2
opines: nopaline a octopine, together with cytokinins nand auxins are synthetised in infected cells,
serve as a source of nitrogen and energy for agrobacterium
galuszka; 18/03/2006
15/03/2010
binární vektory odvozené od
Ti plazmidu pro genetickou
modifikaci rostlin
Ti plazmid je rozdělen na dva:
pomocný plazmid (velký): nese větší
část Ti plazmidu, všechny geny
potřebné pro symbiózu s hostitelem
a přenos T-DNA
klonovací plazmid (malý): nese
pouze T-DNA, do jejíž části se
naklonuje požadovaná
gen.informace, replikační počátky
pro E.coli a Agrobacterium a
potřebné selekční markery
klonovací plazmid pBinpBin-Hyg
Hyg-TX
polylinker
resistence k hygromicinu B
(selekce transgenních
rostlin))
T-DNA
tetracyklinový
supresor
replikační
počátky ori
resistence ke
kanamycinu
• požadovaný gen se překlonuje
do polylinkeru a konstrukt se
namnoží v E.coli . Pro přenos
je nutná jen 25bp repetice z
konce původní T-DNA.
(kanamycinová selekce)
• transformace do Agrobacteria
nesoucí pomocný vektor
(selekce Kan, Rimf, Gent)
• transformace rostliny a selekce
transgenního potomstva
(selekce hygromycinová)
pomocný plazmid ma resistenci
k rimfapicinu a gentamycinu
4
15/03/2010
začlenění TT-DNA do chromozomu
Arabidopsis thaliana
• začlenění T-DNA
T DNA do hostitelské
hostitelského chromozomu je víceméně
náhodné
• nejčastěji se začlení jedna TDNA do jedné buňky, muže však
nastat i několikanásobné
začlenění
• kolem centromer je začlenění
méně pravděpodobné
• čím blíže telomerám tím větší
pravděpodobnost
transgenoze Agrobacteriem
•
standardní postupy pro řadu dvouděložných užitkových rostlin (rajče,
hořčice, fazole).
•
nevýhoda: zdlouhavá regenerace přes tkáňové kultury
•
ne u všech se dá p
použít „g
„germ-line“ transformace jjako u Arabidopsis
p
•
transformace T-DNA se dá využít i jako inzertní mutageneze. T-DNA
přeruší důležitý gen (mutace) a tuto mutaci lze pak pomocí markerů na
T-DNA snadno lokalizovat. Existují databanky mutantních (transgeních)
rostlin Arabidopsisu, kdy máte mutaci (inzerci) přímo v genu který
studujete.
•
od poloviny 90 let možná transformace i jednoděložných - lilie, palmy,
obilniny. Použití supervirulentních kmenů Agrobacteria, hlavní problém je
v regeneraci.
g
5
15/03/2010
transgenoze namáčením květů
(floral dipping, germgerm-line)
A) rostliny Arabidopsis se vypěstují do
fertilního stádia (3-5 v květináči)
B) lodyhy
l d h sk
květy se vymáchají
h j vk
kultuře
l
Agrobacteria nesoucí binární systém
vektorů s naklonovaným transgenem
(5-10 min., přidává se smáčedlo).
C) rostliny se nechají pořádně okapat a
vrátí do skleníku, kde dozrají (vytvoří
semena)
D) transgenní semena se selektují
vyklíčením na živném médiu obsahující
selekční marker (hygromycin)
např. Arabidopsis thaliana
transgenoze namáčením květů
(floral dipping)
Agrobacterium se dostává do
y j j
se květů a T-DNA jje
vyvíjejících
včleněna do samičího gametofytu
a přenesená přes vajíčko do další
generace (nikdy ne do samičích
pohl. buněk, transgenní semena
jsou proto vždy heterozygotní na
vložený transgen).
zlepšení :
vakuová infiltrace
přidávání smáčedla silikon Silwet L-77
účinnost: až 20% transgenního potomstva
tato metoda funguje i u vojtěšky a petúnie
6
15/03/2010
REPORTÉROVÉ TRANSGENY
jsou geny jejichž expresi lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat, slouží
hlavně ke stanovování účinnosti různých rostlinných promoterů
MODRÉ ROSTLINY
REPORTÉROVÝ GEN pro β-glucuronidasu z E.coli
po transformaci se rostlina namočí do barviva X-Gluc
p
vzniká nerozpustné indigo zabarvení, které jde detekovat
v intaktní rostlině. Stabilní enzym bez kofaktoru.
• GUS (uidA gen)
β-glucuronidasa
X-Gluc
modrý precipitát
5-bromo-4-chloro-3-inolyl
-β-D-glucuronic acid
SVĚTELKUJÍCÍ ROSTLINY
využívá se cDNA pro gen luciferasu ze světlušky Photinus pyralis nebo
baktérie Vibrio harvei
substrát luciferin se přidává do substrátu (hlíny), pletivo rostliny pak
emituje viditelné záření, které se měří luminimetrem nebo scintilační
kamerou = velice citlivá metoda, žádna nespecifická aktivita, velmi nákladná
PG3
REPORTÉROVÉ TRANSGENY
FLUORESKUJÍCÍ ROSTLINY
malý gen pro GFP (green fluorescent protein) z medúzy Aequorea victoria
po ozáření modrým světlem (440-480nm) zeleně fluoreskuje bez jakéhokoliv
substrátu a je velice stabilní
fluorescenci si zachovává i po fúzi s jiným proteinem (chimerické geny)
A. thaliana C24 wild type (vlevo)
35S-mgfp4-ER transformed (vpravo)
Aequorea victoria
7
Snímek 14
PG3
v medúze není třeba osvětlovat, jelikož GFP se váže na aquaporin, který po vazbě Ca2+ vyzařuje
modré záření, které aktivuje GFP
galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
PŘÍKLAD VYUŽITÍ TRANSGENOZE V ZÁKLADNÍM VÝZKUMU:
subcelulární lokalizace AtCKXAtCKX-GFP
chimerického proteinu (Werner et al., 2003)
GFP
kontrola
cytosol+
cytosol
jádro
mitochondrieJ
AtCKX1-GFP
AtCKX3-GFP
detekováno ve
vakuolách
AtCKX2-GFP
lokalizace na endoplasmatickém
retikulu s následnou sekreci ven z
buňky
transgenoze pomocí listových disků
např. tabák
metoda používaná u většiny dvouděložných rostlin
8
15/03/2010
regenerace transgenních tabákových
rostlin z kalusu vzniklých na listových
discích
Arabidopsis
tabák
9
15/03/2010
TRANSFORMACE TOPOLU
TOP 10 ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN
1. rýže setá
2. sója luštinatá
3. pšenice setá
4. lilek brambor
5. kukuřice setá
6. čajovník
7 banánovník
7.
8. réva vinná
9. tabák virdžinský
10. mák polní
10
15/03/2010
transgenoze jednoděložných
např. ječmen (Tingay et al.,1997)
•
•
•
•
•
•
izolace nevyvinutých embryí z obilniny
mechanické narušení – odstranění embryonální osy
kokultivace s Agrobacteriem
kultivace na kalusotvorném médiu
detekce reportérového genu v T0 i T1 generaci
efektivita do 4% (např. z 1282 embryí vyselektováno 54 transformovaných linií
• poprvé chřest (1988)
• problém: jednoděložné obsahují daleko méně fenolických látek
zlepšení:
ošetření acetosyringonem (aktivace vir
regionu)
supervirulentní kmeny Agrobacteria: mají
zmnožený gen pro virG, který je navíc pod
konstitutivním promotorem
SELEKCE HOMOZYGOTNÍ LINIE
T0 generace
T1 generace
T-DNA inzerce na jednom lokusu
¼ 00 homozygotů †
½ M0+0M heterozygotůU
¼ MM homozygotů U
3:1 75% U
T-DNA inzerce na dvou lokusech
všichni transformanti jsou
heterozygotní
9:3:3:1 93% U
T-DNA inzerce na třech lokusech
1/64 oo 00 00 homozygotů †
27/64 homo-heterozygotůU
36/64 MM hetero-homozygotů U
27:9:9:3:9:3:3:1 98% U
selekce semen na
nutričním
mediu
obsahující selekční
antibiotikum
100% U 75% U
HOMOZYGOTNÍ
LINE
selekce semen na nutričním
mediu obsahující selekční
antibiotikum
1/14 oo 00 homozygotů †
3/14 oo Mx homo-heterozygotů U
3/14 mx 00 homo-heterozygotů U
9/14 mx MX hetero-homozygotů U
T2 generace
11
15/03/2010
přímá transgenoze
TRANSGENOZE PROTOPLASTů
odstranění buněčné stěny a inkubace protoplastů s roztokem DNA, DNA vniká do protoplastu
endocytózou
• polyetylenglycol ↑
• elektoporace ↑
• makroinjekce ↑
protoplasty se dají udělat ze všech rostlin
lze z nich však jen velmi obtížně regenerovat celé rostliny
BIOLISTICKÉ METODY
TRANSGENOZE
p
používají
j se zlaté nebo wolframové kuličky
y
(2μm)
smíchají se s roztokem plazmidové DNA
s transgeny, odpaří se
vstřelují se do pletiva pod vakuem
transgen společně s reportérovým genem (GUS)
snadná detekce transformace
1O%
pronikne do
pletiva
50%
zůstane v
epidermis
(netvoří kalus)
95% cytoplazma
nedochází k transkripci)
5% jádro
99% umírá
1% přežívá a
dochází k integraci
do genomu
12
15/03/2010
genetické dělo
pokud se nepodaří z buněk zregenerovat kalus, transgenoze je pouze dočasná
PG4
PG5
SELEKČNÍ MARKERY pro ROSTLINN0U
TRANSGENOZI
1.ANTIBIOTIKA
1.
ANTIBIOTIKA
KANAMYCIN – gen nptII pro neomycinfosfotransferasu. Rostliny se buď stříkají,
nebo se dává p
přímo do média.
HYGROMYCIN B gen aphIV pro hygromycinfosfotransferasu –silně toxický i pro
člověka – inhibitor proteosyntesy
1
2. HERBICIDY
nejpoužívanější GLYFOZÁT inhibitor syntézy aromatických AK (je esenciální u
autotrofních organismů) sp. 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntasa (EPSP)
tři strategie: 1) overexprese EPSP
2) exprese mutantní ne tak citlivé formy EPSP
3) exprese glyfozátoxidoreduktasy (degradace glyfozátu)
transgenní potomstvo se sprejuje glyfozátem, přežívají pouze rostliny nesoucí
současně s transgenem jeden ze tří způsobů rezistence
13
Snímek 26
PG4
Hyg i Kan jsou aminotriglycosidy které se váží na ribozom a způsobují nesmyslný přepis mRNA
PG5
glyfozát - fosfometylglycin
galuszka; 19/03/2006
3-fosfošikimát + fosfoenolpyruvát = enolpyruvátšikimát 3 fosfát
galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
SELEKČNÍ MARKERY pro ROSTLINN0U
TRANSGENOZI
3. ZDROJ SACHARIDů
v ranných stádiích vývoje rostlin v in vitro podmínkách je plná závislost
na zdroji uhlíku v médiu (sacharóza). Selekční marker: v médiu je místo
sacharózy xylóza a manóza. Hexokinasou vzniká manóza-6-fosfát, který
není schopen podléhat následné glykolýze a je pro rostlinu toxický,
kumuluje fosfor. Selekční transgen: fosfomanózaizomerasa přeměňuje
manóza-6-fosfát na fruktóza-6-fosfát (použito u tabáku, cukrovky a
kukuřice)
4. SELEKCE ROSTLINNÝMI
Ý
HORMONY
transgen isopentenyltransferasa produkuje nadbytek cytokininů (nemusí
se přidávat do selekčního média) které podporují tvorbu prytů z
transformovaného pletiva, u tabáku a salátu bylo zjištěno že tento
nadbytek nemá vliv na celkovou morfologii transgenní rostliny.
PG6
ODSTRANĚNÍ SELEKČNÍCH TRANSGENů Z ROSTLIN
někdy je třeba tento transgen odstranit aby nenarušoval vývoj rostliny
(ipt,nptII)
využití bakteriofágového systému Crelox, přirozený exscisní systém, gen cre
kóduje rekombinasu (transpozasu) a lox
symbolizují krátké cílové sekvence
excise.
14
Snímek 28
PG6
bakterifág p1 využívá systém k zaclenení casti DNA do bakterie loxB místa
galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
ODSTRANĚNÍ SELEKČNÍCH TRANSGENů Z ROSTLIN
SYSTÉM MAT (multi(multi-autotransformation )
rekombinační
systém
z
kvasinky
Zygosaccharomyces rouxii R/RS ,R- gen pro
rekombinasu, RS – specifická rozpoznávací
sekvence. Gen R je pod inducibilním promotorem
(
(např.
ř tetracyklin),
t t
kli ) mezii RS místa
í t vložen
l ž
i t
ipt
selekční gen.
Po transformaci (exprimuje se ipt gen vyrůstají
tzv. teratomy (rychle rostoucí výhony ale zakrslé,
(a), ESP fenotyp (enormous shooty phenotype) po
indukci tetracyklinem, dojde k vyštěpení ipt a z
teratomového pletiva začnou vyrůstat normální
výhony (b) .
tabák
PG25
topol
SLOŽKY TRANSGENů
konstitutivní
35 S - nejpoužívanější, virového původu, nebezpečí KOSUPRESE
ubikvitin – rostlinného původu, exprese kolísá během ontogeneze
actin – rostlinného původu, vysoká ale kolísavá exprese
PROMOTOR
tkáňově specifické
2A11
- z rajčete, plodově specifický
Lhcb3 - listově specifický, světlem regulovaný z Arabidopsis
promoter APasy - indukovaný v kořeni, fosfátem
inducibilní
In2In2
-2 – je indukovaný benzensulfonamidovým herbicidem Safener
tet - indukce tetracyklinem, nejpoužívanější
pOp - indukovaný glucocortikoidem DEXAMETHASONE, živočišný systém přenesený do
rostliny
CaMV35S:GUS PsMTA:GUS
15
Snímek 30
PG25
pOp/LhG4. The pOp/LhG4 transcription factor system is
based on regulatory elements of the E. coli lac operon . It was first described in tobacco , but has
subsequently been deployed in numerous
developmental studies in tobacco, Arabidopsis, or maize.
The pOp/LhG4 system comprises an artificial promoter
‘pOp’ and a chimaeric transcription factor ‘LhG4’ ). The pOp promoter consists of two ideal lac
operators positioned upstream of a minimal CaMV 35S
promoter ()50 to þ8 relative to the transcription initiation
point) and is physiologically silent in the absence of the
artificial transcription factor LhG4 .
LhG4
binds to the lac operators in the pOp promoter via its DNAbinding
domain, which is derived from a high-affinity DNAbinding
mutant of the E. coli lac repressor . Once bound, LhG4 promotes transcription from the
minimal CaMV 35S promoter of pOp by virtue of a
transcription-activation domain derived from the Saccharomyces
cerevisiae transcription factor Gal4p (Moore et al.,
1998). The sequences that are critical for transcriptional
activation in Arabidopsis lie within the carboxy-terminal 17
amino acids of the Gal4 activation domain and conform to
the consensus for eukaryotic acidic activation domains
(Rutherford et al., 2005). pOp can be activated in specific
cells following a cross with ‘activator lines’ that express
LhG4 from appropriate promoters
galuszka; 31/03/2008
15/03/2010
SLOŽKY TRANSGENů
POLYADENYLAČNÍ SIGNÁL a TERMINÁTOR
v klonovací kazetě je kromě promotorové sekvence i terminátor
transkripce s polyadenylačním signálem
nejčastěji používaný terminátor z agrobacteriálního genu pro nopalin
syntasu používá se jak u jedno tak dvouděložných rostlin
další používané terminátory: 3´nekódující sekvence rostlinného genu pro
pšeničný histon H3
může se použít i vlastní 3´nekódující sekvence transgenu, ale ta nemusí vždy
fungovat, je jednodušší mít univerzální již v plasmidu
SLOŽKY TRANSGENů
INTRONY
ínkorporace intronu do transgenu může zvyšovat sílu exprese
transgenu v rostlině např. intron I z genu pro rýžový aktin nebo
i t
intron
I z genu pro kukuřičný
k k řič ý ubikvitin
bik iti
5´ NEKODUJÍCÍ REGION
Kozákova sekvence a podobné sekvence zvyšují postranskripční
stabilitu mRNA a tím zvyšují míru exprese
NUKLEOTIDOVÉ SLOŽENÍ
pokud vkládáme do rostliny gen z baktérie, hrozí nebezpečí použití
odlišného genetického kódu, vyštěpení neexistujícího intronu atd.
geny ze vzdálených taxonů se proto musí často syntetický
upravovat (mutacemi) aby bylo dosaženo dostatečné exprese v
rostlinném hostiteli (např. u Bt toxinu z baktérie)
16
15/03/2010
odchylky v genetickém kódu?
snižují výtěžek heterologní exprese
výjimky:
jiná preference:
kodón pro arginin (6 různých):
CGU
CGA
CGG
CGC
E. coli
AGA 2.2%
AGG 1.6%
AGA
AGG
Arabidopsis th.
H. sapiens
AGA 18.9%
AGG 11.0%
AGA 11.9%
AGG 12.1%
ORGANELOVÉ CÍLENÍ TRANSGENU
transgen je začleněn do genomu v jádře, transkripce probíhá v jádře, zralá
mRNA je pak transportovaná do cytosolu kde probíhá proteosyntéza na
ribozómech, buď volně nebo vázaně na ER
POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY PROTEINU ZAHRNUJÍ i OGANELOVÉ CÍLENÍ
specifické signály – SIGNÁLNÍ PEPTID, úprava transgenu:
cílení do plastidu: genetická informace pro 23AK signální peptid malé
podjednotky Rubisca se naklonuje před vlastní N-terminus transgenu
cílení do mikrotělísek: ke konci transgenu se připojí posledních 34 AK z
isocitrátlyasy
zůstává na ER: motiv H/KDEL se zabuduje na C-terminus proteinu
transgenu
atd.
17
15/03/2010
PŘÍMÁ TRANSFORMACE CHLOROPLASTů
začlenění tragenu do chloroplastové DNA
VÝHODY:
dědí se pouze matrilineárně, tzn. transgen se
nepřenáší pylem.
k začleňování transgenu dochází pouze na
specifických
ifi ký h místech
í t h DNA h
homologní
l
í
rekombinací
vysoká exprese, až několik procent
celkových proteinů
lepší pro expresi bakteriálních genů v
rostlinách (stejný gen.kód)
NEVÝHODY:
provedení: používá se biolistické metody
velice silné genetické dělo hnané héliem
héliem,
musí prorazit dvojitou chloroplastovou
membránu, velice malá účinnost
specifické vektory: obsahují část genetické
informace chloroplastu aby mohla
proběhnout homologní rekombinace
selekční marker antibiotikum spektinomycin
PŘÍKLAD VYUŽITÍ TRANSGENOZE V ZÁKLADNÍM VÝZKUMU:
CytokininCytokinin
-deficient
deficientní
ní rostliny
Nadexprese cytokinin oxidasy pod
silným
ý konstitutivním promotorem
p
vyvolává cytokinin-deficientní
fenotyp
Potvrzení hlavní funkce cytokininů
na diferenciaci rostliny
Možné aplikace v zemědělství
Galuszka et al., Eur.J.Biochem., 2004
18
15/03/2010
Trvalá transgenoze ječmene s ektopickou expresí CKX
pomocí Agrobacterium tumefaciens
Umlčení CKX pod specifickými promotory
reprodukčních orgánů např. HvLTP2 (lipid
transporter protein)
CKX aktivita v aleuronové vrstvě
Nadexprese CKX pod kořenově specifickým
promotorem RAF (root abundant factor)
VYUŽITÍ TRANSGENOZE ROSTLIN
A) ZMĚNA VLASTNOSTÍ ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN
1. rezistence k herbicidům
2. resistence k hmyzím škůdcům
3 rezistence
3.
i t
k virům
i ů
4. změna obsahu olejů
5. oddálení dozrávaní plodů
6. kontrola opylování
7. zvyšování nutriční hodnoty (zlatá rýže)
B) TOLERANCE VůČI STRESU (WeatherGuardGenes)
C) MOLEKULÁRNÍ FARMÁŘSTVÍ
1. plantibodies a jedlé vakcíny
2. produkce léků rostlinami
3. produkce biopolymerů rostlinami
19
15/03/2010
rezistence k herbicidům
REZISTENCE KE GLYFOZÁTU (RoundUp ®)
A)
nadprodukce enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntasy - málo účinné
B)
mutovaný
t
ý EPSP z E.coli
E li v pouze 1 AK máá 8000x
8000 nižší
ižší sensitivitu
iti it ke
k
glyfozátu, transgen má navíc ještě signální peptid pro cílení do
chloroplastu (transgenní rostlina odolná i vůči 0.5 kg glyfozátu na ha,
běžná letální dávka pro nerezistentní druhy) – využito u řady
kulturních rostlin firmou MONSANTO
C)
katabolismus
glyfozátu
glyfozátoxidoreduktasou (gox)
z
Achromobacteru
se
signálním peptidem genu pro
Rubisco pod konstitutivním
promotorem – uplatňuje se u
řepky olejné
PG11
rezistence k herbicidům
REZISTENCE KE FOSFINOTRICINU (glufozinát, BASTA®)
- ireverzibilní inhibitor glutaminsyntasy (fixace amoniaku do glutamátu)
geny bar a pat z bakterií Streptomyces inaktivují glufozinát acetylací, byly
vneseny do odrůd kukuřice a řepky povolené v USA a Kanadě
REZISTENCE K DERIVÁTůM SULFONYL MOČOVINY (chlorsulfuron,
GLEAN ® )
- inhibitory acetolaktátsyntasy (první krok v biosyntéze Val,Leu a Ile)
rezistence založená na mutaci původního genu ve vazebném místě pro herbicid
účinné u čekanky, topolu, rýže, jabloně, lnu, řepky a tabáku
transgenní odrůdy nejsou moc využívaný často byla pozorována samovolná
mutace a získaní rezistence
REZISTENCE K BROMOXYNILU – inhibitor fotosystému II
půdní baktérie jsou schopny ho metabolizovat transgen klonován z rodu Klebsiella
REZISTENCE K 2,4
2,4-D (2,4(2,4-dichlorfenofyoctová kyselina)
nalezeny půdní baktérie schopny ho metabolizovat
20
Snímek 40
PG11
gluphosinate 2-amino-4-hydroxymetylfosfinil butanová kyselina
galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
PG7
rizika ekologická
(pouze teoreticky, nebyla zatím prokázána)
1/ tolerance k herbicidu by mohla přeměnit kulturní rostlinu v plevel
- u žádného transgenu nebyl zatím potvrzen pozitivní selekční tlak
2/ gen pro toleranci k herbicidu by mohl mít neočekávány pleiotropní
efekt, který by mohl negativně změnit kulturní plodinu
- testuje se
3/ šíření transgenu do okolních populací stejné cizosprašné plodiny pylem
- největší
j
riziko
i ik u řepky
k olejné,
l j
zabrání
b
se zavedením
d
transgenu d
do
chloroplastu
- dodržování základních principu agrotechniky, pokud by se stalo, je
třeba na určitou dobu změnit herbicid
rizika zdravotní
vnesením transgenu do rostlin se dostávají do potravy tři nové typy
molekul:
1/ DNA transgenu – nemá smysl o riziku uvažovat, tento typ
h i
horizontálního
tál íh přenosu
ř
nebyl
b l nikdy
ikd prokázán
ká á ((např.
ř přenos
ř
d
do
střevních bakterií).
2/ produkt transgenu – většinou jde o enzymy specifických
metabolických drah rostlin či baktérií, které metabolismus člověka
neovlivňují, alergické reakce nebyly u žádného prokázány, enzymy
jsou v trávicím traktu člověka okamžitě rozkládány
3/ vlastní herbicid – všechny herbicidy mají pro živočichy vysoké letální
dá k např.
dávky
ř glyfozát
l f á LD50=
LD50 5g
5 na kg,
k potenciál
iál podráždění
d áždě í kůž
kůže
srovnatelný s detergentem na nádobí
nebyly prokázány ani genotoxické, teratogenní či karcinogenní účinky
spekulace glyfozát se může v půdě bohaté na nitráty a nitrity měnit na
spekulace:
slabě mutagenní N-nitroglyfozát (tato konverze však v rostlinách
nikdy nebyla prokázána)
21
Snímek 41
PG7
pleiotropní efekt vnášeného genu vyvolaný buď nečekanou interakcí produktu vnášeného genu s
některou komponentou rostliny, nečekanou interakcí metabolické cesty podmíněné vnášeným genem
s jinou metabolickou cestou, jež je rostlině vlastní, nebo nečekanou aktivací metabolické cesty, jež
není v rostlině obvykle aktivní. Vyloučit nelze ani tzv. inzerční mutaci, která vznikne „nabouráním“
vnášeného genu do genu, jenž je rostlině vlastní a jenž je tímto zásahem narušen, takže nemůže
zajišťovat obvyklé funkce.
galuszka; 19/03/2006
15/03/2010
GMO rezistentní k herbicidům
Roundup Ready® bavlna, kukuřice, sója
a jarní řepka (kanola)
běžná kanola
Roundup Ready®kanola
PG12
rezistence ke hmyzím škůdcům
Bt - rostliny
1902 – byla v Japonsku objevena baktérie Bacillus thuringiensis, která způsobovala
úhyn bource morušového
1987 – byl z této baktérie izolován krystalický protein δ-endotoxin
endotoxin, který po projití
trávicím traktem hmyzu, způsobuje jeho rozklad
1980 - se začala tato baktérie využívat jako insekticid, postřiky byly drahé a
dlouho neúčinkovali
1985 – připraven transgenní tabák overexprimující Bt-toxin (nízká exprese
0.0001% všech listovým proteinu)
důvod: nestabilita bakteriální mRNA v rostlině
synteticky upravené geny pro δ-endotoxin
- byl snížen obsah AT bází
- pozměněn genetický kód tak aby vyhovoval rostlinám
- vloženy introny
exprese se zvýšila až 1000x, většinou se využívá konstitutivní 35S promotor
existuje řada genů pro Bt-toxin (CryIA- CryIIIB) s různou specifitou vůči různým
hmyzím druhům
22
Snímek 44
PG12
zavíječ kukuřičný motýlek vytvářející chodby ve stéblech a palicích, housenky okusují listy a přezimují
v pokosených stvolech na strništi
největší škody na jižní Moravě
galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
BtBt
-rostliny
40% pěstované kukuřice v USA jsou BtBt-transgenní odrůdy
Bt-kulturní plodiny
1989 rajče
jč
1992 kukuřice
1993 bavlník
1995 zelí, brokolice
1997 brambor, baklažán
2000 čínské zelí
běžná rostlina bramboru napadená mandelinkou
země kde jsou povolené odrůdy
další: tabák, topol, borůvka,
rýže, sója,
rýže
sója ořešák
BtBt-brambora
Bt bavlníku
Argentina
Austrálie
Čína
Indie
Indonésie
Mexiko
Jižní Afrika
USA
a
Bt kukuřice
Argentina Kanada
EU (některé)
Jižní Afrika
USA
PG13
vývoj a zavádění GMO
VÝVOJ TRANSGENNÍ ODRUDY RAJČETE
primární transgenní rostlina – 6 měsíců
(selektování homozygotní populace – 2 roky)
vývoj stab
stabilní variety
va ety – 3 roky
o y
zkoušky variety – 2 roky
uvádění na trh – 1-2 roky
6-7 roku od transgenní rostliny po komerční uvedení
ZAVÁDĚNÍ BtBt-BAVLNÍKU V INDII
1994 podání žádosti o dovoz transgenních semen
1995 povolení k dovozu z USA
1996 dovoz, pokusné pěstování ve skleníku
1996 první pokusné pole
1997-98 povoleno pět pokusných lokalit
1998 testy na stepních kozách a alergologické
testy na lidech
1998-99 25 lokalit na pěstování
2000-01 první velkoplošné pěstování (100 ha)
2001 první vlastní sklizeň transgenních semen
2002 povolení pro komerční prodej a pěstování
23
Snímek 46
PG13
obsah významných hmyzích druhů v bavlníkových polích jednak konvenčních, jednak Bt bavlníku. Bt
bavlník se používá k potlačení černopásky bavlníkové Helicoverpa armigera . V polích transgenního
bavlníku zjistili vyšší zastoupení predátorů než na polích konvenčně ošetřených insekticidy, až na
parazitické vosičky, jejichž počet byl snížen v odpovědi na sníženou hustotu a nízkou kvalitu larev
černopásky. Jelikož je dosti predátorů, je snížen výskyt mšic, ale zvyšuje se počet svilušek, protože
se nestříká insekticidem. Pestrost druhů členovců je vyšší v Bt bavlníku, což naznačuje, že Bt bavlník
je výhodnou plodinou pro integrovanou ochranu.
Kontrolně se testoval vliv pylu Bt bavlníku na bource produkující hedvábí (Antheraea pernyi a Bombyx
mori) a zjistilo se, že vliv je zanedbatelný.
galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
PG14
rizika
• Bt-rostliny i samotný endotoxin byly testovány na
lidech, psech, morčatech, čolcích, krysách, rybách a
ptácích bez žádných příznaků
• byly prováděny alergologické testy
• nebyl pozorován ani žádny vliv na hmyzích
predátorech (1996 včela, slunéčko)
1999 – NEJVĚTŠÍ SKANDÁL GMO
případ motýlka Danaus plexipus
tento motýl patří v USA mezi ohrožené druhy
publikovaná práce kdy byla prokázána zvýšená mortalita larev po
poprášení rostlin klejichy (potrava) pylem z Bt kukuřice
v roce 1999 byl však zaznamenán nárůst populace tohoto
motýlka
nedochází k časové koincidenci kvetení kukuřice a vývoje larev
GREENPEACE vydává seznam evropských motýlů ohrožených
endotoxinem v Bt-rostlinách
snaha o zavádění Bt-rostlin s matrilineární dědičnosti
PG1
bourec morušový
první transgenní motýl?
•
odsekvencovaný genom
•
díky člověku ztratil schopnost létat
•
hledání genetických příčin (porovnání s drosofilou a anopheles)
•
1874 genů odpovědných za produkci vlákem ze kterých se vyrábí hedvábí
24
Snímek 47
PG14
Monarch butterfly
galuszka; 25/03/2006
Snímek 48
PG1
Samička klade 300-500 vajíček, ta jsou nejprve žlutá a později tmavnou. Housenky, které se z nich
líhnou, se živí výhradně listím moruše bílé nebo černé ( Morus alba, M. nigra ), jedná se tedy o tzv.
monofágní hmyz. Vývoj housenek trvá asi 35 dnů a má pět instarů (vývojových stadií, z nichž každé
je zakončeno svlékáním). Za tuto dobu housenka vyroste na 25 - 30násobek své délky a hmotnost
zvýší sedm- až devěttisíckrát. Plně vyvinutá, dorostlá housenka se začne kuklit. Z párových slinných
žláz vylučuje tekutinu, která na vzduchu tuhne, čímž vzniká tenké hedvábné vlákno. Jím se opřádá
tak dlouho, až vytvoří pevný pružný zámotek - kokon. Ten je svrchu ještě opředen jemnými vlákénky,
tzv. bourovinou.
Petr Galuszka; 20/03/2007
15/03/2010
PG8
PG2
rezistence ke hmyzím škůdcům
transgeny rostlinného původu
inhibitory trávicích enzymů (amylas a proteas) hmyzu, lektiny (proteiny
vážící sacharidy), chitinasy, syntéza alkaloidů
INHIBITORY PROTEAS
sójový inhibitor serinových proteas
inhibitor trypsin proteas z vigny
inhibitor proteas z rajčete
INHIBITORY AMYLAS
amylasový inhibitor z fazole
LEKTINY (účinné proti mšicím)
lektin sněženky GNA
(Galantus nivalis aglutinin)
lektin hrachu
chitinasa z fazole
rezistence k háďátkům
ročně způsobují ztráty až 77 miliard dolarů
napadají především brambory
brambory, řepu,
řepu rajčata
existují přirozené proteiny způsobující rezistenci v těchto
plodinách
již dlouhodobě se šlechtí brambory s vysokou rezistenci
genetickým mapováním byly nalezeny geny způsobující rezistenci
použity jako transgeny v GMO
stírají se rozdíly mezi přirozenou
a umělou rezistenci (GMO pouze
urychlilo klasické šlechtění)
25
Snímek 49
PG8
GNA - nebyla na krysách prokázána toxicita, až na podivnou studii Arpada Pusczaye ze Skotska,
mediální vlna, navíc brambory se vaří a lektin se varem ničí
galuszka; 19/03/2006
PG2
lektin - bilkovina vážicí se na glykosylované povrchy buněk
Petr Galuszka; 20/03/2007
15/03/2010
virové a bakteriální nemoci kukuřice
Varieta
WI MD NB
Seneca White Knight
Silver Dollar
Silver Queen Hybrid
Silverado
Snowbelle
Snow White
Spring Snow
Stardust
Summer Flavor #81W
Summer Sweet 7101W
Summer Sweet 8101W
Sweet Ice
Sweet Magic
R
SB SM SW BW C
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
rezistence různých variet kukuřice
x
MD = maize dwarf mosaic virus
NB = corn leaf blight
R = rust
SB = so. corn leaf blight
SM = smut
SW = Stewart’s wilt
BW = bacterial wilt
C = cold
rezistence k virům
hlavním způsobem rezistence je exprese genu pro
plášťový protein daného viru
1986 – prvníí transgenní
t
í rostliny
tli ttabáku
bák rezistentní
i t t í vůči
ůči TMV ((existuje
i t j ffaktor,
kt
který rozbalí virus a aktivuje ho, tento faktor se při infekci vychytá plášťovým
proteinem produkovaným rostlinou.
Korelace: čím větší exprese tím vyšší rezistence
byly nalezeny i jiné původní geny způsobující rezistenci, ty byly mapovány a
použity jako transgeny
proti RNA virům se využívá protismyslná RNA strategie
26
15/03/2010
PG9
papája na Havaji
papaya ringspot virus (PRV)
ovlivňoval úrodu na Havaji
od roku 92 do roku 96 klesla produkce díky viru o 40%
1996 první transgenní papája overexprimující plášťový
protein pod 35S promotorem připravená biolistickou
metodou
od roku 1998 nárůst produkce
PG15
rizika
TRANSKAPSIDACE
transgenní rostlina napadená jiným virem, sestavování pseudovirionů,
hmyzem přeneseny do rostliny, která nebyla vůči původnímu viru
senzitivní
k tomuto jevu dochází přirozeně, virové populace již přirozeně vyčerpaly
všechny možnosti pozitivních mutací
REKOMBINACE
virový genom se může rekombinovat s transgenní mRNA virového
původu
ů d a dát vznik
ik viru
i novému
é
bylo již prokázáno, ale nikdy zatím nevznikl infekční virus (schopnost
přenosu z buňky do buňky)
27
Snímek 53
PG9
u nás se začíná zavádět odrůda transgenní slivoně Stanley s expresí obalového proteinu viru šarky
galuszka; 19/03/2006
Snímek 54
PG15
To assess the risks associated with recombination involving viral sequences in transgenic plants, we
have constructed two hybrids between tobacco mosaic tobamovirus (TMV) and cucumber mosaic
cucumovirus (CMV).These hybrid viruses have been used to assess risks associated with
recombination and transcapsidation. In Nicotiana tabacum, both viruses could infect the inoculated
leaf and move cell-to-cell, but neither virus could move systemically. In N. benthamiana, T/CMV-0 did
not show systemic symptoms and moved systemically very poorly. In the same host, T/CMV-1 gave a
systemic infection, in which the leaves showed mosaic symptoms, although the kinetics of infection
suggested that the route of systemic invasion was not via the vasculature. Since only encapsidated
RNAs can be transmitted by the aphid vectors of CMV, these data demonstrate that RNAs of
heterologous viruses will only be encapsidated efficiently if the RNAs are similar in size to the CMV
RNAs. Thus, these data indicate that transgenic plants expressing CMV CP, at levels orders of
magnitude lower than observed here for T/CMV-1, do not pose a risk of transcapsidation and
transmission of heterologous viral genomes. These data also demonstrate that recombinant viruses
formed between TMV and the CMV CP gene are debilitated for long-distance movement via the
vascular system. Thus, recombinant viruses formed between the CMV CP gene and most other viral
genomes are unlikely to survive in nature.
The issue of whether transgenic plants expressing the coat protein (CP) gene(s) of a virus are likely
to be sources of genetic material for recombination with unrelated viruses, generating unique, and by
inference, more virulent viruses has been of concern to a number of critics and some researchers in
the field .
While transcapsidation occurs with some closely related plant viruses, it occurs rarely, Recombination
has been observed to occur among plant viruses and also between a plant virus and similar viral
sequences expressed from a transgene, under strong or moderate selection pressure
However, this is not the main cause of concern, which is whether an unrelated virus could obtain
viral sequences from a transgene and alter its pathogenicity, host range, or method of transmission;
i.e., virus-vector interactions
Thus, transgenic plants are being examined for recombination between viral transgenes and various
viruses to see if such recombinant viruses will form and whether the recombinant viruses display any
selective advantage and/or altered phenotype.
Although many plants are infected by several plant viruses at one time, there is no evidence for new
viruses having been formed recently by recombination between two viruses that are taxonomically
different
galuszka; 25/03/2006
15/03/2010
PG16
další využívané transgeny
ZMĚNA OBSAHU ROSTL.OLEJů – řepka olejka, sója, len a slunečnice
biosyntéza
y
olejů
j v rostlinách dvě části 1)) v chloroplastech
p
2)) na ER (p
(prekurzor
k.palmitová)
roční produkce 60 miliónů tun ročně
cíle transgenoze: změna poměru jednotlivých mastných kyselin ve prospěch
nasycených
využití: potravinářství (zvýšení nutriční hodnoty)
kosmetický průmysl
mazadla bionafta (metylestery mastných kyselin)
mazadla,
hlavní transgeny: lauroyl-ACP-tiolesterasa (z krysy) –vznik kratších uhlíkatých
řetězců
1-acylglycerol-3-fosfátacetyltransferasa - opak
high laurate canola
1996 – Brassica
B
i napus transformována
t
f
á
acyl-ACP-tiolesterasou pod specifickým
promotorem s cílením do semen
zvýšený obsah k.laurové na úkor olejové a
linoleové
myristová
palmitová
olejová
linolová
linoleová
laurová
další
4%
3%
31%
11%
7%
38%
6%
0.02% původně
využití: výroba mýdel a šampónů
výroba čokolády
výroba rostlinných sýrů
light smetana
28
Snímek 55
PG16
přirozeně v řepce 90% mastných kyselin s 16 a více uhlíky, laurová 12 nasycených
galuszka; 26/03/2006
15/03/2010
PG17
další využívané transgeny
ZMĚNA OBSAHU ZÁSOBNÍCH PROTEINů – obiloviny a luštěniny
A)) zvýšení
ý
syntézy
y
y nedostatkových
ý AK
bakteriální mutovaný gen pro DIHYDROPIKOLINÁT SYNTASU
a ASPARTÁT KINASU, které nemají zpětnou inhibici nadbytkem produktu (Lys)
transgenní rostliny 100x vyšší obsah lyzinu a methioninu ten se ale nezabudovává
v tak velké míře do zásobních proteinů.
B) transgenoze genu pro zásobní protein
zein
i -28%
28% methioninu
thi i
2S2S
-albumin z paraořechů – 18% methioninu
aspartát kinasa
dihydropikolinát syntasa
29
Snímek 57
PG17
hlavně jako krmné směsi pro živočichy, větší výživná hodnota
vysoké procento esenciálních AK, které jsou důležité pro správný a rychlý vývoj živočichů
galuszka; 26/03/2006
15/03/2010
GENOVÉ UMLČOVÁNÍ
(gene silencing)
genové umlčování
TGS (transcriptional gene silencing)
nedochází k transkripci transgenu
může jí předcházet transkripce promotorové sekvence a následná inhibice
promoteru komplementárním duplexem RNA-DNA
nebo častěji metylace promotorové sekvence
PTGS (post-transcriptional gene silencing)
založena na specifické degradaci mRNA
30
15/03/2010
TGS a PTGS
read-through
t
transcription
i ti
DNA-DNA pairing
methylation
chromatin remodelling
RNA-DNA
pairing
RNA-RNA
pairing
RNA degradation
methyltransferases
chromatin remodelling factors
dsRNA
SYNTÉZA PROTEINU
3’
přirozený
promoter
A
T
G
C
5’
Gen (dsDNA)
5’
T
A
C
G
3’
transkripce
jednořetězcová
mRNA
Ribosome
translace
exprese
genu
protein
31
15/03/2010
obecný princip PTGS
TEORIE PROTISMYSLNÉ RNA
A
3’
přirozený
promoter
5’
T
T
A
G
C
C
5’
gen (dsDNA)
3’
G
transkripce
jednořetězcová
mRNA
Ribosom
žádná translace
mRNA řetězec
h b idi j a stává
hybridizuje
á á
se duplexem dsRNA
gen (dsDNA)
A
T
žádná
exprese
genu
G
C
mnoho kopií
5’
5’ transkripce
silný
promoter
T
A
C
G
3’
transgen
= žádný
protein
GEN JE
UMLČEN
32
15/03/2010
poprvé pozorováno 1990 u transgenní
petúnie
vědci se pokoušeli ztmavit květy petúnie
overexpresí genu pro chalkonát syntasu
(enzym produkující černý antokyanin) pod
silným virálním promotorem. Transgen
interferoval s vlastním genem pro tento
enzym a docházelo k jeho vzájemnému
umlčování.
prpl
prpl
RNA interference (RNAi)
Science, prosinec 2002
33
15/03/2010
PRINCIP RNAi
hairpin RNA
Virus dsRNA
Transgene RNA
dsRNA
Cleavage of dsRNA
by dicer-like enzyme
siRNA
p
(short interfering
RNAs, 21-24 nt long)
systém funguje v
cytoplasmě a zřejmě
existuje jako
rezistence vyvinutá
proti RNA virům
OH
p
p
p
HO
OH
p
p
HO
siRNA/protein
complex
OH
p
HO
p
OH
p
HO
siRNA is unwound,
single-stranded RNA formed
p
RISC complex
(RNA-induced
silencing complex)
sequence-specific
target recognition
mRNA target
OH
p
HO
(DICER contains dsRNA cleavage
activity, helicase and dsRNA
binding activity) RNase III like protein
p
p
OH
RISC se automaticky generuje v
rostlině v přítomnosti siRNA
imunitní odpověď na úrovni NK
OH
continued on next slide
mRNA degradation
34
15/03/2010
Single-stranded siRNAs can also be used
as primers to make more dsRNA
by host RNA polymerase
RNA dependentní RNA polymerasa
New dsRNA formed
from target mRNA
p
OH
Dicer (as in previous slide)
p
OH
p
OH
p
HO
p
HO
p
p
HO
OH
p
HO
Etc….
OH
p
Model was modified from Roth et al.,
(2004) Virus Research 102: 97-108
význam
ý
RNAi
STUDIUM FUNKCE GENů
• knockknock-out nebo inhibice funkce genu
• přežije organismus
organismus??
• jaké pozorujeme fenotypové změny?
změny?
TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ
• léčba rakoviny (viz. genová
terapie)
PG20
dvě strategie:
a) KLASICKÁ – PCR s dvěma typy
primerů a postupné klonování
(vektor pHANNIBAL
pHANNIBAL)
b) REKOMBINANTNÍ – jedno PCR a
klonování s následnou rekombinací
(BP klonasa, vektor pHELLSGATE
pHELLSGATE)
35
Snímek 69
PG20
2004 první testy na lidech, degenerativní poškození sítnice, zmožení cév, praskání, způsobeno
nadměrnou expresí určitého růstového faktoru
2005 degerativní onemocnění mozku SGA1, exprese toxinu v buňkách, který je zodpovědný za rozpad
neuronů
galuszka; 26/03/2006
15/03/2010
další využívané transgeny
ODDÁLENÍ DOZRÁVÁNÍ PLODů
– rajčata
zrání plodů rajčat (i ostatních) je způsobováno
hlavně degradaci pektinu (polysacharid, polymer
kys D-galakturonové)
kys.
D galakturonové) v buněčné stěně plodů
při zrání se aktivuje polygalakturonasa která
rozkládá pektin
1994 transgenní odrůda lilku rajčete FlavrSavr s
knock-outovanou polygalakturonázou (na 10%)
transgen produkuje protismyslnou RNA
zvýšena trvanlivost rajčat po sklizni o 2 týdny
větši rezistence vůči houbovým a bakteriálním
chorobám
transgenic
+ ethylene
control
transgenic
další využívané transgeny
ODDÁLENÍ SENESCENSE - karafiát, brokolice, rajče
ETHYLÉN - rostlinný hormon aktivující senescenci
klíčový enzym v biosyntéze ethylenuethylenu 1-aminocyklopropan
aminocyklopropan-1-karboxyloxidasa
transgeny produkující protismyslnou RNA
prodloužení životnosti řezaných květin
plody začnou zrát až v prostředí etylénu
PROBLÉM: při transportu takovýchto transgenních rostlin nebo plodů docházelo
ke styku s výfukovými plyny, které iniciovaly senescenci
v současnosti se vytvářejí odrůdy, které budou mít zablokovány přímo etylenový
receptor (gen Etr1-1)
Etr1 1) model petúnie - životnost květů prodloužena o 8 dní
36
15/03/2010
biosyntéza ethylénu
další využívané transgeny
MODRÁ RůŽE
2004 vědci z firmy FLORIGENE (Calgene Pacific)
pracovali na vývoji transgenní modré růže po několik
let. Nakonec použili jako transgen gen pro flavonoid
3', 5'- hydroxylasu z petúnie pod specifickým
promotorem s cílením do květů a transformovali
čínskou čajovou růži (Rosa x hybrida). Transgen
způsobil syntézu modrého flavonoidu delfinidinu.
U
37
15/03/2010
transgen
PG21
další využívané transgeny
pylová sterilita
HETEROZE – jev kdy se zemědělci snaží zvyšovat úrodu pěstováním rostlin v
heterozygotním stavu, vyšlechtěná odrůda (homozygotní, hybridní linie) se zkříží
s původní.
heterozní osivo musí být tudíž získáno z pylově sterilních rostlin (jednodomých).
Pylově sterilní rostliny usnadní produkci heterozního osiva.
aby se tyto rostliny mohli ale klasicky rozmnožovat, musí mít partner křížení gen
který obnovuje fertilitu.
PG22
řepka olejka – systém genu pro barnasu (extracelulární RNasa z Bacillus
amyloliquefaciens) a jejího inhibitoru barstar
d rostlin
do
r tli (I) byl
b l gen pro
r b
barnasu
r
vložen
l ž pod
d specifickým
ifi ký promotorem
r
t r
s cílením
íl í
do tapeta (součást pylového váčku) + transgen pro rezistenci k herbicidu
(pylově sterilní linie)
do rostlin (II) byl pod stejným promotorem vložen gen pro barstar (i samosprášení)
křížením těchto rostlin vzniká heterozní osivo, které se vždy v další generaci
selektuje herbicidem pro něž mají rezistenci pouze rostliny nesoucí gen pro
pylovou sterilitu (potlačení homozygotů z linie II)
38
Snímek 76
PG21
hybridní odrudy jsou u některých zemědělských plodin a většiny zeleniny nejpoužívanější. Zvýšení
produkční schopnosti F1 generace a vitality proti rodičům
pro přípravu heterozního osiva se většinou používá chemických látek způsobující pylovou sterilitu u
samosprašných rostlin
cytoplasmatická pylová sterilita, sporofytická inkompatibilita atd....
galuszka; 27/03/2006
PG22
obě linie jsou vysazeny současně na pole
sklizeň heterozního osiva samozřejmě příměs homozygotů původních u fertilní linie
při výsevu heterozního osiva aplikace herbicidu, přeživají pouze heterozygoti
galuszka; 27/03/2006
15/03/2010
další využívané transgeny
zlatá rýže
největší evropský projekt GMO
– ovlivněná celá metabolická dráha
geranylgeranyl
pyrofosfát
fytoen
fytoensyntasa
fytoendesaturasa
fytoendesaturasa
normální zrna rýže
ζ-karoten
ζ-karoten desaturasa
lyk
ly
kopen
lykopenlykopen
- β-cyklasa
b-karoten
zrná rýže s β-karotenem
endogenní
endogenní
lidské geny
Vitamin A
projekt
- zlatá rýže
•
•
•
rýže je schopná syntetizovat β-karoten jen v zelených částech
v obilkách je posledním meziproduktem geranylgeranylpyrofosfát
do genomu rýže vneseny pod specifickým glutinovým promotorem s
cílením do endospermu tři geny:
fytoendesaturasa z baktérie Erwinia
fytoensyntasa z narcisu
lykopenlykopen
- β-cyklasa
•
•
•
β-karoten (provitamín A) nejsou obratlovci schopni syntetizovat, ale potřebují
ho pro syntézu retinalu (součást pigmentu rhodopsinu) a k.retinové (reguluje
morfogenezi)
avitaminóza způsobuje dětskou slepotu, snižování imunity a je příčinou asi půl
milionové dětské úmrtnosti především v rozvojových zemích jihovýchodní Asie
silné námitky antibiotechnologických aktivistů – není třeba, jsou tabletky
- může dojít k předávkování atd.
39
15/03/2010
PG24
další využívané transgeny
bezkofeinová káva
7-metylxantin NN-metyltransferasa a
theobromin NN-metyltransferasa
JAPONSKO 2003
exprese genů inhibována metodou
RNAi
druh Cofea canephora
transformován Agrobaktériem
transformované rostliny stejné
jako wild type
Cofea canephora se pěstuje na
Madagaskaru a má 2x větší obsah
kofeinu než nejrozšířenější Cofea
arabica
v mladých listech:
↓ theobromin 30
30-80%
↓ kofein 50
50-70%
transgenní rostliny tolerantní vůči stresu
VODNÍ STRES –
při nedostatku vody (i zasolení) se zvyšuje
osmotický tlak buněk, dochází k poklesu fotosyntézy a fotoredukci kyslíku za
vzniku aktivních kyslíkových radikálů → poškození
a) nadprodukce osmoprotektivních látek
glycinbetain – transgen cholindehydrogenasa z E.coli (tabák, brambor)
prolin – transgen semialdehyddehydrogenasa k. glutamové z vigny
manitol – transgen manitol
manitol-1-fosfátdehydrogenasa
fruktany – chimerický transgen fruktozyltransferasa z Bacillus subtilis a
vakuolární signální sekvence z karboxypeptidasy ze Saccharomyces
b) ovlivnění signální dráhy pro dehydratační stres
u Arabidopsis thaliana byla objevena signální dráha společná pro stres
dehydratací a chladem současně bylo zjištěno, že geny reagující na tyto stresy
mají ve svých promoterech konzervovanou sekvenci TACCGACAT tzv. DRE
(dehydratation responsive element). Byl nalezen transkripční faktor aktivující tuto
sekvenci DREB1A, a jeho gen použit jako transgen.
+ transgenní rostliny daleko odolnější k suchu, mrazu zasolení
- zpomalení růstu (může se použít specifický promotor indukovatelný stresem)
40
Snímek 79
PG24
příprava bezkofeinové kávy - , buď extrakce chloroformem - karcinogen, vymražování tekutym CO2 značně náročná finančně
galuszka; 27/03/2006
15/03/2010
transgenní rostliny tolerantní vůči stresu
STRES CHLADEM –
významná je korelace mezi citlivosti k
chladu a množstvím nenasycených mastných kyselin v membránách.
vnesení transgenu které indukují tvorbu cis-dvojných vazeb v nasycených
mastných kyselinách se zvýší rezistence k chladu (gen pro ω-6-desaturasu z
Arabidopsis do tabáku, 1996).
BIOTICKÝ STRES –
jako transgeny byly použity geny pro
chitinasy a beta
beta-1,31,3-glukanasy
glukanasy, které zvyšovaly resistenci vůči širokému
spektru houbových patogenů, tím že rozkládaly jejich buněčnou stěnu
byly zkoušeny i PR
PR-proteiny,
proteiny fungují ale ne samostatně, pouze v různých
kombinacích
kyselina salicylová
signál hypersenzitivní reakce na napadení patogenem
jako transgeny geny pro enzymy přeměňující chorismát na k.salicylovou
až 1000x vyšší obsah k.salycilové, nezměnil fenotyp rostlin (tabák) a vyvolal
silnou rezistentní reakci proti širokému spektru patogenů (viry,baktérie i
houby)
transgenní rostliny tolerantní vůči stresu
FYTOREMEDIACE –
odstraňování těžkých kovů z půdy
pomocí transgenních rostlin schopných lépe akumulovat těžké kovy.
savčí nebo kvasničný transgen pro metalotionein
přenesení genů redukující rtuťnaté soli z baktérií do rostlin,
odčerpávání těchto solí z půdy, přeměna na rtuť a její
následné odpařování do atmosféry.
savčí gen pro cytochrom P450
2E1, jaterní enzym, schopný
odbourávat
db
á t TCE (trichloretylen,
(t i hl
t l
hlavní polutant podzemní vody),
byl exprimován v rostlinách
Arabidopsisu, které byly následně
schopny ho odbourávat.
41
15/03/2010
molekulární farmářství
rostlinné – jedlé vakcíny
ƒ jako transgeny se používají oslabené toxiny původců mnohých chorob
ƒ stimulace mukózního imunitního systému v epitelu trávícího traktu (účinná
imunizace)
ƒ velice levné a efektivní
ƒ značné uplatnění v rozvojových zemích, pojídáním čerstvých plodů se získá
imunita vůči nemocem, které v těchto zemích způsobují milióny úmrtí.
ƒ vše ve formě testů v rostlinách tabáku a bramboru – zatím úspěšné
zubní kaz – protein spaA ze Streptococcus mutans
hepatitida B – povrchový antigen HBsAg viru
cholera – termolabilní enterotoxin B z Vibrio cholerae
1 g brambor vyrobí 30µg tohoto toxinu brambory se uvaří a toxin
denaturuje testy na myši prokázaly vysokou účinnost a
neškodnost
1997 poprvé
testováno na
člověku
hlavní snaha vědců je produkce těchto vakcín v plodinách
rozšířených ve třetím světě jako je banánovník
molekulární farmářství
plantibodies
v rostlinách připravené živočišné protilátky nebo části protilátek
ƒ v rostlinách lze produkovat i monoklonální protilátky
ƒ protilátky jsou vylučovány do mezibuněčného prostoru
ƒ mohou sloužit přímo v rostlině (jako
(jako ochrana proti patogenům)
patogenům)
ƒ nebo mohou být extrahovány a použity v diagnostice či medicíně
ƒ výrazně se sníží náklady a čas na
tvorbu protilátek (hybridomové buňky)
42
15/03/2010
plantibodies
• hlavní problém – rozdíly v NN-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a
rostlin
• plantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete
vyvolávají nechtěnou imunitní odpověď
• řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,41,4galaktosyltransferasu – rostlina pak produkovala „polidštěné protilátky“
• jako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z
lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidem
scFv – single chain variable fragment
ƒ non
non--hodgkinský lymfom – rakovina lymfatických uzlin (B
(B--lymfocytů)
ƒ nádorové buňky produkují specifické protilátky (zachycené na svém
povrchu, liší se od zdravých)
ƒ tabák infikován TMV s vloženou části genu pro scFV myši
ƒ tabák produkuje scFv nádorových buněk
43
15/03/2010
ƒ tabák produkuje funkční antigen, který po aplikaci myši produkuje
protilátky proti nádorovým buňkám
ƒ imunitní odpověď nevznikla na mezidruhovou odlišnost, produkt rostliny
– odlišná glykosylace, špatně ustřižený signální peptid
ƒ 80% myší přežilo
ƒ antigen vytvořen během 6 týdnů
ƒ velice jednoduchá izolace – RYCHLE A LEVNĚ
ƒ léčba (vakcína) dělaná pacientovi přímo na míru
v současné době klinicky
testované plantibodies
antigen
rostlina
typ rekomb. Protilátky
aplikace
povrchový antigen
Streptokoka
tabák
sekreční IgA
CaroRx™
terapeutická
povrchová aplikace
Herpes simplex
virus
sója, rýže
IgG
terapeutická
povrchová aplikace
sperma
kukuřice
IgG
antikoncepce ve
formě gelu
non-Hodginský
nonlymfom
tabák
scFv
personalizovaná
vakcína
virus vztekliny
tabák
IgG
terapeutická
intravenosně
CEA - cancer
embryonic antigen
tabák, rýže,
pšenice, rajče
scFv, diabodies,
chimerické protilátky
terapeutická
diagnostická
Stoger et al., Recent progress in plantibody technology, Curr. Pharm Design 11, 2005
44
15/03/2010
molekulární farmářství
biodegradovatelné plasty
ƒ některé bakterie jsou schopny uchovávat uhlík a energii ve formě
osmoticky inertních polymerů (polyester k. hydroxymaselné PHB)
ƒ tyto jsou pak v přírodě rychle degradovatelné
ƒ tři geny z baktérií byly vloženy do rostlin Arabidopsis
3-ketotiolasa
NADH--dep
NADH
dep.. acetoacetylacetoacetyl-CoA
CoA--reduktasa
PHB--polymerasa
PHB
ƒ syntéza PHB navazuje na syntézu mastných kyselin, jejíž část
probíhá
bíhá v chloroplastech
hl
l t h
ƒ pokud byly tyto geny vloženy do jaderného genomu pod 35S
35S
promotorem docházelo k nadměrné produkci polyhydroxybutyrátu v
listech (PHB tvořil 0.14%
14% sušiny)
ƒ pokud byly produkty transgenů cíleny pomocí signálních peptidů do
chloroplastů zvýšila se produkce až 100
100x
x
45
15/03/2010
molekulární farmářství
biodegradovatelné plasty
A bid
Arabidopsis
i slouží
l ží jako
j k modelová
d l á rostlina
tli
předpokládá se že, tento model bude
přenesen do nějaké rostliny, která produkuje
velké
hlízy
nebo
semena
a
není
konzumována ani člověkem ani zvířaty
(skočec Ricinus communis
communis))
transgenní
g
řepka
p
vyprodukuje
yp
j až 10 g PHB
na rostlinu
fa
MONSANTO
zatím
tento
projekt
pozastavila, jelikož to stále ještě není
ekonomicky výhodné (výroba plastů z
fosilních zdrojů je daleko levnější)
PG10
GMO schválené pro komerční využívaní a polní
pokusy na území ČR
• GM virus vakcína proti Aujeszkého chorobě (fa Vermie Veterinär Chemie)
• GM virus vakcína proti vzteklině (fa Rhone-Merieux)
• Streptococcus termophilus (fa Valio, testování residuí antibiotik v mléce)
• tabák tolerantní k herbicidu bromoxynilu (fa SEITA)
• řepka olejka tolerantní k herbicidu glufosinátu pro krmiva (fa Plant Genetic Systems)
• řepka olejka tolerantní k herbicidu glufosinátu pro pěstování (AgrEvo)
• sója tolerantní k herbicidu glyfozátu (Monsanto)
• čekanka částečně tolerantní k herbicidu glufosinátu s pylovou sterilitou (fa Bejo-Zaden)
•
•
•
•
kukuřice s rezistenci vůči hmyzu (Bt-endotoxin) a toleranci k glufosinátu (Ciba-Geigy a Novartis)
kukuřice rezistentní vůči hmyzu (Bt-endotoxin) (Monsanto)
k k ři ttolerantní
kukuřice
l
t í vůči
ůči h
herbicidu
bi id glufosinátu
l f i át (A
(AgrEvo)
E )
kukuřice tolerantní k herbicidu glyfozátu (Monsanto)
• karafiáty se změněnou barvou květu (Florigene)
• karafiáty s prodlouženou trvanlivostí (Florigene)
• slivoň s obalovým proteinem viru šarky PPV
• brambor s pozměněným metabolismem sacharidů (redukce amylosy ve prospěch amylopektinu ve
škrobu, BASF)
• len setý s genem pro hygromycin (testování křižitelnosti s wt druhy lna vyskytujícího se na území ČR)
Evropa a GMO: 2005 - Rumunsko, Španělsko, Francie, Německo, Portugalsko a ČR
46
Snímek 92
PG10
GM viry se používají např. do návnad pro lišky v lese
galuszka; 19/03/2006