Agrobacterium tumafaciens

GENETICKÁ TRANSFORMACE
OBILOVIN
Pokročilé biochemické a
biotechnologické metody
2.11.2015
K. Holubová
ÚVOD
Kukuřice – pšenice – rýže - ječmen
Obiloviny: potrava, krmivo, průmyslní výroba
Klimatické změny: poptávka po odolnějších odrůdách
Klasické šlechtění: časová náročnost
Genové inženýrství: rychlejší, efektivnější
Cíl: vnesení požadovaní genetické informace (DNA) do genomu
rostliny
• První genetické transformace: 80 léta 20. století
• Agrobacterium tumefaciens: dvouděložní rostliny, pro obiloviny
dlouhou dobu nevyužitelný
• Vývoj alternativních – přímých metod transformace (DGT)
•
•
•
•
•
•
ÚVOD
• Faktory ovlivňující úspěšnost transformaci:
• A) dostupnost vysoce účinné a reprodukovatelné metody přenosu
genu (přímé, nepřímé)
• B) volba cílového explantátu, který bude lehce regenerovat (listy,
embrya, protoplasty, atd.)
• C) dostupnost metody regenerace pro danu rostlinu a kultivar
• D) vhodná screeningová metoda pro selekci transgenních rostlin
ÚVOD
• Další důležité faktory při transformaci: promotor (řídi expresi genu),
terminátor (ukončuje transkripci), selekční gen
• Konstitutivní promotory: exprese konstantní ve všech pletivech a po
celou dobu života rostliny
 Vírové promotory: CaMV 35S (35S RNA vír květákové mozaiky, slabší
exprese u obiloví); CmYLCV (vír žluté kudrnatosti listů cestrum
aurantiacum) a RTBV (pararetrovirus rýže)
 Rostlinné promotory: Ubi (kukuřiční ubiquitinový promotor s prvním
intronem), Act1 (aktinový promotor s prvním intronem z rýže), Ubi4 a
Ubi9 (ubiquitinové promotory z cukrové třtin), atd.
ÚVOD
• Pletivově-specifické promotory: exprese specifická v určitém orgáne
anebo pletivu v závislosti na funkci daného genu
 Zrnově-specifické promotory: AsGlo (ovesný globulinový, v
endospermu a aleur. vrstvě, Hor1-Hor3 (hordeinové promotory z
ječmene), GLUB-1 (gluteninový, rýže), β-AMY (amylasa z ječmene)
 Kořenově-specifické promotory: NAS1 (nikotinaminsyntasa z
ječmene), IDS (dioxygenasa z ječmene), PHT (fosfátový transportér z
ječmene)
 Listově-specifické promotory: BTH7 (thionin, ječmen)
ÚVOD
• Inducibilné promotory: exprese genu se zapíná a vypíná v závislosti
na podnětu
 Chemicky-inducibilné promotory: glukokortikoidy, estradiol, etanol
 Abiotický/biotický stres-inducibilné promotory: chlad, tepelný šok,
vodný stres, atd.
• Terminátor: NOS (nopalinsyntasa z A.tumefaciens), CaMV 35S (35S
RNA vír květakové mozaiky), atd.
• Testování promotorů a exprese: reportérové gény
REPORTÉROVÉ GENY
• Produkty netoxické
• Snadná a levná detekce, ideálně in vivo
• Nízká, příp. žádná endogenní exprese v transformovaných rostlinách
•






ß-glukuronidáza (GUS)
Nejčastěji používaný reportérovy gen v rostlinných transformačních vektorech
Štěpí substrát na barevný anebo fluoreskující podukt
Snadná detekce v živých i neživých rostlinách, vysoká citlivost
Kvantitativní (míra exprese) a kvalitativní analýzy (lokalizace exprese)
Minimální exprese v rostlinách
Detekce histochemicky, spektrofotometricky nebo pomocí fluorogenního
substrátu
REPORTÉROVÉ GENY
• Fluorescenční proteiny
 Geneticky upravený zelený fluorescenční protein (GFP) z medúzy
 Odvozené žlté a modré fluorescenční proteiny
 Z korálu Discosoma – červený fluorescenční protein DsRed
 Není nutný substrát (kyslík a modré světlo)
 Detekce: zařízení pro detekci zeleného světla, fluorescenční anebo konfokální
mikroskop
 Možnost detekce genové exprese, lokalizace proteinů a studium proteinových
in vivo
 Kvantifikace fluorescence pomocí spektrofluorimetru na základě fluorescence
čistého fluorescenčního proteinu.
REPORTÉROVÉ GENY
• Luciferáza (LUC)
 Enzymy podílející se na bioluminiscenci
 Pro transformaci rostlin: geneticky upravená luciferáza
světlušky (LUC, produkuje jasnější světlo než přirozená forma
enzymu), luciferázy korálu Renilla (rLUC), bakteriální
luciferázy (LUXA a LUXB z Vibrio harvei)
 Detekce v buněčných extraktech (luminometr, scintilační
detektor) anebo in planta (speciální a nákladné zařízení s CCD
systémem zobrazování)
 Menší využití vzhledem k nákladnosti
 Sledování dynamických změn genové exprese, studium
proteinových interakcí a tranzientní exprese jako součást
duálního reportérového systému spolu s GUS
 Výhoda: oproti fluorescenčním proteinům nízké pozadí
(nespecifická bioluminiscence) v rostlinách.
REPORTÉROVÉ GENY
• Akumulace antokyaninu
 Ve vodě rozpustné flavonoidní pigmenty, které se mohou ve velkém množství
akumulovat ve vakuole buňky
 Vizuální detekce (bez nutnosti substrátu) - sledování tranzientní exprese
 Nutná přítomnost dvou skupin transkripčních faktorů - MYB a bHLH
 Detekce antokyaninů - v rostlinách, u kterých byla narušena přirozená dráha
syntézy těchto pigmentů (nejsou pro rostlinu esenciální)
 Výhoda metody: přímé počítání individuálních pozitivních buněk
SELEKCE TRANSGENNÍCH ROSTLIN
OBILOVINA
Pšenice
Ječmen
Oves
SELEKČNÍ MARKER
SELEKČNÍ LÁTKA
bar (phosphinothricinacetyltransferasa)
hptII (hygromycinphosphotransferasa)
cah (cayanamidhydratasa)
nptII (neomycin phosphotransferasa)
manA (phosphomannosaisomerasa)
CP4 epsps (5-enolpyruvylshikimát-3-fosfatsynthasa)
codA (cytosindeaminasa)
pat (phosphinothricinacetyltransferasa)
bar
hpt
manA
nptII
nptII
bar
L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy)
Hygromycin B (ATB)
Cyanamid
Geneticin (aminoglykosidové ATB)
Manosa (alternativní zdroj uhlíku)
Glyfosát (herbicid)
5-fluorocytosin
L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy)
hpt
Přímé metody transformace (DGT)
• Cílový explantát: protoplasty odvozené z různých pletiv, mikrospory
• Transformace pomocí polyethylenglykolu
 Destabilizace plazmatické membrány protoplastů v přítomnosti Ca2+ umožní
proniknutí požadované DNA do buňky
 Nutná izolace protoplastů, problematická regenerace rostlin
 Tranzietní exprese: lokalizace proteinů, testování promotorů
Elektroporace
Transformace rostlinných buněk a protoplastů
Elektrický impuls o vysokém napětí – póry v cytoplazmatické membráně
Množství DNA, které se dostane touto metodou do buněk je malé – nízký počet
integrací požadované DNA
 Účinnost elektroporace je srovnatelná s biolistickou transformací
•



Přímé metody transformace (DGT)
• Silikon karbidová vlákna
 K suspenzi obsahující rostlinný materiál a DNA se přidají silikon-karbidová
vlákna, která pronikají buněčnou stěnou a umožní vstup DNA do buňky
 Nevýhoda: nízká efektivita transformace a poškození buněk, které negativně
ovlivní jejich regenerační schopnost
• Mikroinjekce
 zavedení DNA do jádra nebo cytoplazmy prostřednictvím skleněné
mikrokapilární injekční pipety za užití mikromanipulátoru
 Využití zejména pro živočišné buňky, jelikož rostlinné buňky obsahují buněční
stěnu, která tvoří bariéru pro mikroinjekci
 Mikroinjekce protoplastů po odstranění vakuol snižuje schopnost regenerace.
Biolistická transformace
• Vnesení požadované DNA do buněk, ze kterých je možné nejsnáze regenerovat
celou rostlinu (kalusové kultury nebo embryonální tkáň skutela)
• Uplatnění pro transformaci obilovin
• Studium tranzietní exprese různých genových konstruktů
• Testování promotorů
• Nižší nároky na vektor, explantát a genotyp rostliny
• Nevýhody: nižší efektivita transformaci ve
srovnání s A. tumefaciens, nestabilita
exprese genů, vyšší počet integrací může
vést k umlčení exprese, ztráta transgenů
v potomstvu
Biolistická transformace
• První transgenní rostlina kukuřice v roku 1989 - významný krok na poli gen.
modifikace obilovin
• Poprvé připraven transgenní ječmen a pšenice (Obr.1)
Obr. 1 Chronologické řazení transformací hlavních obilovin pomocí biolistických metod a A. tumefaciens
Biolistická transformace
•
•
•
•
Biolistické metody jsou založeny na urychlení kovových částic (nejčastěji zlatých) o
průměru kolem 1 µm obalených požadovanou DNA pro přímé vnesení do
rostlinných buněk
Genové dělo PDS 1000/He od firmy BioRad, genová pistole
Evakuace přístroje a puštění helia (1 100 psi) → praskne “rupture” disk → náraz
plynu do makronosiče s kovovými čás cemi s navázanou DNA → vystřelení čás c,
které vniknou do pletiva embrya.
Transformační účinnost do 10 %
Biolistická transformace
• Ideální explantát pro transformaci - nezralá embrya nebo skutelum (největší
schopnost regenerace) – pěstování donorové rostliny až do fáze vývoje
nezralých semen
• Regenerace rostliny na čtyřech odlišných médiích:
 kalus-indukční médium (dediferenciace buněk působením auxinu dicamby)
 kalus-indukční médium s manitolem (osmotické působení manitolu)
 tranzitní médium (indukce diferenciace vlivem auxinu 2,4-D a cytokininu BAP)
 regenerační médium bez hormonů.
A
B
Obr. 2 Nezralé zrno pšenice (A), vyizolovaná skutela (B)
Biolistická transformace
• 8 hod před a 16 hod po bombardování kultivace na médiu s manitolem při 25°C
ve tmě
• 6 týdnů kultivace na kalus-indukujícím médiu se selekčním tlakem (25°C, tma)
• 2 týdny kultivace na tranzitním médiu v polotme – začína růst listů (Obr. 3A)
• 2-4 týdní regenerace při plném svetle na médiu bez hormonů (Obr. 3B)
• Přesazení rostlin do hlíny
A
B
B
Obr. 3 Diferenciace buněk na povrchu kalusu (A), zregenerovaná rostlina (B)
Transformace pomocí A. tumefaciens
• Agrobacterium tumefaciens: tumor u rostlin
• Schopnost vnést cizorodou DNA do genomu hostitele
• Hostitelská tkáň: exprese genů, kódujících auxiny, cytokininy, a enzymy řídící
syntézu derivátu aminokyselina cukrů – vznik tumoru
• Ti plazmid, T-DNA – využití v gen. inženýrství po odstranění genů, způsobujících
tumor
• První pokusy – přímá transformace Ti plazmidu do rostlinných buněk
• První transgenní rostliny (dvouděložné) připravené v r. 1984
• První jednoděložní rostlina – chřest
• 1993 – transg. rýže, 1998 – transg. kukuřice
B
• V posledních 10 letech úspěšné vyvinuté protokoly pro transformaci obilovín
(rýže Japonica, Indica a Javanica, jarní a zimní odrůdy pšenice a ječmene,
hybridní kukuřice, čiroku, žita a několika pícnin a travin)
Agrobacterium
tumefaciens
Rostlinná buňka
Regenerace
rostlin
Pomocný
plazmid
Binární
plazmid
T- DNA
Vnášený
gen
1.
Vnesení
T-DNA s
požadovaným
genem do
genomu
rostlinných
buněk
2.
T-DNA
integrovaná
vT-DNA
rostlinném
chromozomu
Rostlina
se změněnou
genetickou
informací
Transformace pomocí A. tumefaciens
• Kmene: AGL1 nebo AGL0, případně LBA 4404
• Cílový explantát: nezralé embryo, mikrospory
• Značné množství binárních plazmidových konstruktů pro transformaci obilovin,
např. vektory série pBract
• Výhody: vysoká transformační účinnost (až 30 %), nízký počet integraci
transgenu, stabilnější dědičnost, nízká míra umlčení transgenu
• Produkce velkého množství nezávislých transgenních linií schopných reprodukce
• Studium funkce genů v obilovinách
B
Transformace pomocí A. tumefaciens
• PROVEDENÍ:
• 1. Klonování genu
 Vnesení požadovaného genu do jednoduché plazmidové DNA podporujicí
nejlépe tzv. Gateway technologii klonování
 Rekombinace požadovaného genu do cílového - binárního vektoru (dvojí
selekce)
 Často používané cílové binární vektory odvozené od vektoru pGreen (malé,
snadná manipulace v E. coli)
 Transformace binárního vektoru s požadovaným
genem do A.tumefaciens
B
(AGL1) spolu s vektorem pSoup pomocí elektroporace.
Transformace pomocí A. tumefaciens
pSa-ORI
npt1
LB
colEI ori
RB
35S-Hyg-nos
Stu I (7154)
SacI (6752)
pBrac t2 14
nosterm 3' Reverse primer
SacI (2315)
9165 bp
nos terminator
attR2
XhoI (2653)
ccdb
HindIII (2674)
Sma I (6004)
XmaI (6002)
XhoI (3383)
Cm(R)
Ubi promoter
attR1
ApaI (3742)
pAH Ubi promD primer forward
Vstupní vektor
Rekombinace
Cílový vektor
Transformace pomocí A. tumefaciens
•
•







PROVEDENÍ:
2. Transformace ječmene
Sterilizace zrn ječmene hypochloridem.
Izolace nezralých embryí (velikost embrya 1.5-2 mm) a oddělení osy embrya
pod stereoskopem ve sterilních podmínkách laminárního boxu.
Umístění embryí na kalus-indukční médium (CIM) -dediferenciace buněk a růst
kalusů (Dicamba)
Kultivační média: tří základní složky a stužovací látka (phytagel) na báze agaru:
esenciální prvky nebo minerální ionty (makroelementy,
mikroelementy a zdroj
B
železa )
organické látky (vitamíny a aminokyseliny)
zdroj vázaného uhlíku - pletivo kalusu nefotosyntetizuje - zdroj uhlíku 3%
maltosa.
Transformace pomocí A. tumefaciens
epicotyl
radicle
Zrno ječmene
Transformace pomocí A. tumefaciens
•
•



PROVEDENÍ:
3. Inokulace
Do 24 hod po izolaci
Nutná přítomnost fenolických látek (acetosyringone) – spouštění virulace
Ko-kultivace v přítomností A.tumefaciens – 3 dni
B
Transformace pomocí A. tumefaciens
• PROVEDENÍ:
• 3. Selekce transgenních buněk
 Kalus-indukující medium obsahující selekční prvek (fosfinotricin,hygromycín 100
% selekce) a antibiotikum timentin (zabíjí agrobakterium)
 6 týdnů ve tmě, pasáž po dvou týdnech
 Tvorba kalusů – beztvárná masa volně uspořádaných parenchymatických buněk
B
Transformace pomocí A. tumefaciens
• PROVEDENÍ:
• 4. Regenerace rostlin
 2 týdny na tranzitním médiu – diferenciace buněk (BAP, 2,4-dichlorofenoxyoctová kyselina), slabé světlo, růst prýtu
 2-4 týdny: regenerační médium bez hormonu, plné osvětlení, vývoj kořenů a
listů
 Transgenní rostliny přenesené zpět na kalus-indukující medium bez hormonu –
růst a vývoj rostliny, kořenů
 Přenos rostlin do rašelinových disků (2 Btýdny) a přesazení do hlíny
Transformace pomocí A. tumefaciens
Izolace a ko-kultivace
Osvětlení:
Selekce
-
-
Izolované skutelum
nezralých embryí
na kalus-indukujícím Ko-kultivace s A. tumefaciens,
přesun na kalus-indukujícím
médiu
médiu s antibiotikem
Tranzitní médium
50 μmol/m 2 /s
6-ti týdenní selekce
transformovaných
embryí/ kalusů
na antibiotiku
Regenerace
500 μmol/m 2 /s
Regenerace rostlin
na médiu bez
hormonů
2-týdenní
kultivace na
tranzitním médiu
s rostlinnými hormony
Transformace pomocí A. tumefaciens
Přesun rostlin
s 2-3 cm listy
Zregenerované rostliny
s listy a kořeny
Přesazení
do disků
se zeminou
Kultivace jednotlivých
rostlin na základním
médiu bez hormonů
Přesazení
do květináčů
se zeminou
Pěstování rostlin
v hlíně ve skleníku
Příklady využití transgenních obilovin
• Molekulární farmaření, produkce farmaceuticky účinných látek
(antimikrobiální peptidy)
• Obohacení esenciálních aminokyselin v zrnech rostlin (kukuřice s vyšším
obsahem lyzinu)
• Transgenní rostliny s vyšší kvalitou škrobu v zrnech
• Zlepšení sladovnické kvality ječmene
• Zlepšení rezistenci rostlin vůči škůdcům: Bt kukuřice
• Zlepšení tolerance vůči abiotickým stresům: kukuřice odolná vůči suchu
(nadprodukce „cold shock“ proteinu B)
• Zvýšení tolerance obilovin vůči herbicidům