XM-ONE® Křížová zkouška před transplantací – Návod k

XM-ONE® Křížová zkouška před transplantací – Návod k použití
CZ
Popis produktu: Křížová zkouška před transplantací XM-ONE® (4 testy). Sada obsahující zkumavky
Vacutainer® CPT pro přípravu mononukleárních buněk z periferní krve (PBMC), magnetické kuličky pro
izolaci prekurzorových buněk endotelu z těchto PBMC, které exprimují endotelové a monocytové markery,
a sekundární reagencie pro detekci protilátek v sérech, které se mohou vázat na izolované buňky. Sada
obsahuje také protilátky proti CD3 a CD19, které lze použít k provedení lymfocytové křížové zkoušky.
Součásti produktu: Sada složená z 16 zkumavek Vacutainer® CPT, 4 silikonizovaných skleněných
zkumavek, 4 zkumavek magnetických kuliček, 1 lahvičky s anti-CD3, 1 lahvičky s anti-CD19 a lahviček
s anti-IgG a anti-IgM.
Určení k použití: XM-ONE® je sada pro in vitro diagnostiku, která se používá k izolaci prekurzorových
buněk endotelu, jež exprimují endotelové a monocytové markery, a k přípravě vzorků pro analýzu IgM a IgG
protilátek specifických pro tyto buňky. Sada obsahuje také reagencie, které uživateli umožňují spolu s esejí
volitelně provádět lymfocytové křížové zkoušky.
Shrnutí, vysvětlení a principy: Analýza protilátek specifických pro buňky, které exprimují endotelové
a monocytové markery, umožňuje klinickým pracovníkům provést křížovou zkoušku před transplantací
pomocí detekce protilátek proti antigenům, jež jsou na těchto buňkách exprimovány. XM-ONE® poskytuje
optimalizované reagencie pro použití průtokové cytometrie k detekci protilátek, které se mohou vázat na
izolované buňky. Sekundární reagencie jsou konjugovány s FITC, který je možno detekovat pomocí kanálu
FL1. Postup zkoušky je podobný postupu při křížových zkouškách lymfocytů průtokovou cytometrií.
Prekurzorové buňky endotelu se izolují, inkubují se sérem a pak se barví sekundárními protilátkami proti
IgM a IgG. Buňky, které dávají pozitivní výsledky, mají ve srovnání s buňkami inkubovanými s negativním
kontrolním sérem posun ve FL1. Uživatel také může volitelně provádět křížové zkoušky T a B-buněk
pomocí protilátek CD3.PE a CD19.PerCP, které jsou dodávány v sadě.
Upozornění: K použití při diagnostice in vitro. Tento výrobek je určen pouze k použití pracovníky ve
zdravotnictví. Kromě toho je třeba, aby osoba odpovědná za analýzu výsledků měla zkušenosti s průtokovou
cytometrií. Všechny materiály po použití zlikvidujte jako nebezpečný biologický odpad. Se všemi
biologickými vzorky zacházejte jako s potenciálně infekčními.
Uchovávání: Magnetické kuličky a sekundární protilátky vždy uchovávejte při teplotách mezi +2 a +8 °C.
Zkumavky Vacutainer® CPT a silikonizované skleněné zkumavky lze uchovávat při teplotách 18–25 °C.
Zkumavky Vacutainer® CPT mají mít při použití teplotu 18–25 °C. Veškeré reagencie v sadě chraňte před
přímým slunečním světlem. Datum použitelnosti je uvedeno na obalu sady. Veškeré součásti sady používejte
pouze do tohoto data. Sekundární protilátky je nutno po otevření spotřebovat do dvou měsíců.
Obsah a reagencie sady: Sada obsahuje materiál na 4 testy, a to 4 lahvičky se suspenzí kuliček, 4
silikonizované skleněné zkumavky, 1 lahvičku s 400 μl Anti IgM, 1 lahvičku s 400 μl Anti IgG, 1 lahvičku
s 800 μl anti-CD3, 1 lahvičku s 800 μl anti-CD19, 16 heparinizovaných zkumavek BD Vacutainer® CPT a
1 návod k použití. Uchovávání: viz označení na vnitřním stojanu, zkumavkách CPT a níže v části Návod
k použití.
Požadované přístroje/vybavení:
A) Průtokový cytometr
B) Magnet pro izolaci endoteliálních prekurzorových buněk.
Používejte magnet, v němž mohou být použity přiložené silikonizované skleněné zkumavky.
Nepoužívejte magnety, které vyžadují kolony nebo přídatné komponenty. Ve spojení se sadou
XM-ONE® byly použity standardní magnety pro separaci buněk od následujících výrobců:
Invitrogen (dřívější obchodní značka: Dynal), StemCell Technologies Inc. Je také možno použít
magnety od jiných výrobců, ale jejich výkonnost nebyla ve spojení se sadou zkoumána.
C) Kromě toho je též požadováno použití standardního laboratorního vybavení, jako jsou pipety, ledová
lázeň, chladničky, chlazená odstředivka s výkyvným rotorem a kolébač, na kterém lze nastavit 5–10
kyvů za minutu.
Požadované reagencie, které nejsou součástí sady:
A) Negativní kontrolní séra (sérum, které neobsahuje protilátky, jež se váží na izolované buňky).
B) Pozitivní kontrolní séra (sérum, které se váže na izolované buňky).
8
ABX100-5 Ver. 1
C)
Odběr
A)
Návod
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
ek
ch
a IgG
esejí
é
í
ytuje
na
análu
oti
vním
kovou
°C.
C.
řed
ívejte
čku
Ta
od
y.
ou
oužít
edová
5–10
Odběr a příprava vzorků
A) Zkoušené sérum může být čerstvé nebo rozmražené. Ze zkoušeného séra by však měly být před
testováním odstraněny odstředěním (8 000–10 000 g po 10 minut) nebo filtrací (0,2 μm) shluky.
Vyvarujte se opakovaného zmrazování a rozmrazování, protože to může snížit titry protilátek
v séru. Uvědomte si, že esej detekuje protilátky ve zkoušených sérech a že tyto protilátky mohou být
nepříznivě ovlivněny podmínkami při uskladnění, manipulaci atd. Zkoušené sérum by nemělo být
inaktivováno teplem.
Návod k použití
1) Od potenciálního dárce odeberte krev na přípravu buněk do 4 zkumavek Vacutainer® CPT.
Zkumavky Vacutainer® CPT mají mít při použití teplotu 18–25 °C. Alternativně: Pokud byla
krev odebrána na jiném místě do jiných zkumavek než CPT, přeneste krev do zkumavek CPT a
pokračujte podle návodu. Důležitá poznámka: nepoužívejte pro odběr krve zkumavky s EDTA,
protože EDTA zasahuje nepříznivě do izolace buněk.
2) Ihned po odběru naplněné zkumavky CPT jemně převraťte o 180° a zpět, celkem 8–10x.
Doporučujeme zpracovat odebranou krev co nejdříve.
3) Zkumavky odstřeďujte v horizontální odstředivce (s výkyvnou hlavou) s aktivovanou brzdou, při
1500–1800 g a teplotě +18–25 °C po 15 minut.
4) Nad stabilní gelovou bariérou by měla být viditelná bílá vrstva PBMC. Jemně zkumavku 3x
převraťte, aby se buňky rozpustily v plazmě. Gelová bariéra zůstane neporušena.
5) Otevřete zkumavky CPT a přeneste buněčnou suspenzi ze všech 4 zkumavek do prázdné 50ml
zkumavky. Zkumavku doplňte promývacím pufrem temperovaným na +18–25 °C.
6) Odstřeďte buňky při 450 g při +18–25 °C, aby vznikla buněčná peleta, a buňky rozpusťte
v 1 ml promývacího pufru temperovaného na +18–25 °C. Přeneste rozpuštěné buňky do jedné
silikonizované skleněné zkumavky dodané se sadou.
7) Přidejte 0,5 ml promývacího pufru temperovaného na +18–25 °C do jedné zkumavky s kuličkami
(zelené víčko) a rozpusťte magnetické částice. Přeneste magnetické částice do silikonizované
zkumavky obsahující PBMC.
8) Inkubujte PBMC a směs magnetických kuliček na ledu 30 minut při jemném kývání (5–10 kyvů/
minuta).
9) Přidejte 4 ml chladného promývacího pufru o teplotě +0–4 °C a izolujte buňky přiložením
zkumavky k magnetu na 10 minut. Síla magnetického pole může ovlivnit dobu potřebnou pro
magnetickou separaci. Poté odpipetujte neizolované buňky do nové zkumavky a uložte je na ledu.
Žádné buňky nelikvidujte, než se ujistíte o úspěšné izolaci žádaných buněk. Neizolované buňky lze
použít pro křížové zkoušky T a B-buněk, pokud se tyto eseje neprovádí v rámci eseje XM-ONE.
10) Vyjměte zkumavku z magnetu a rozpusťte izolované buňky v promývacím pufru o teplotě +0–4 °C.
Rozdělte izolované buňky rovným dílem mezi zvolený počet zkumavek pro průtokovou cytometrii.
Počty buněk by měly být mezi 0,2–1 milionu buněk na 1 zkumavku. Mají-li se volitelné křížové
zkoušky T a B-buněk provádět ve stejné zkumavce a mají-li být B-buňky získány ve statisticky
významných počtech, měl by být počet buněk 0,5–1 milion buněk na jednu zkumavku.
Plánujte rozdělení buněk na inkubaci s:
- pozitivními kontrolními séry
- negativními kontrolními séry
- séry příjemce
ABX100-5 Ver. 1
9
CZ
pro
kery,
C) Promývací pufr: Fyziologický roztok fosfátového pufru (PBS) pH 7,4 bez Ca2+ a Mg2+,
temperovaný jak při +18–25 °C, tak při +0–4 °C. Volitelně: 0,01 % BSA bez IgG jako přísada
k promývacímu pufru. Pokud se přidá BSA, dbejte na to, aby šarže BSA nezpůsobila nespecifické
barvení izolovaných buněk v průtokové cytometrii. Pokud se křížové zkoušky T a B-buněk provádějí
jako součást eseje XM-ONE, doporučujeme přidáním BSA zvýšit životnost zejména B-buněk.
Pro detekci IgG i IgM to znamená celkový počet minimálně 6 zkumavek.
Popis s
Přidejte vymývací pufr o teplotě +0–4 °C k celkovému objemu 4 ml na jednu zkumavku FACS. Odstřeďte
buňky při 450 g (nejlépe při teplotě +4–10 °C), opatrně odlijte a dále nepoužívejte supernatant, a odlitím
zkumavky proti papírové utěrce odstraňte poslední kapky promývacího pufru. Přidejte 50 μl každého
jednotlivého séra k buněčné peletě (kontrolní séra nejsou součástí sady). Promíchejte a inkubujte po dobu 15
+ 15 minut při pokojové teplotě, při jemném promíchání po uplynutí prvních 15 minut.
CZ
Volitelně:
- Vzhledem k riziku tzv. fenoménů prozóny, které mohou způsobit falešně negativní výsledky v sérech
obsahujících vysoké titry protilátek, doporučujeme použít neznámá séra naředěná 1:50 souběžně
s neředěnými séry.
Poznámka: ředění se provede v negativních kontrolních sérech.
- XM-ONE je také možno použít k provedení autologního testování na autoprotilátky.
11) Promyjte buňky třikrát 4 ml promývacího pufru o teplotě +18–25 °C.
Po tomto kroku můžete zvolit, zda se ve stejné zkumavce mají provést křížové zkoušky T a B-buněk.
Pokud se budou provádět lymfocytové křížové zkoušky, proveďte esej včetně volitelného kroku 13.
12) K detekci IgM navázaných na izolované buňky: Přidejte 10 μl sekundárních protilátek specifických
pro IgM (konjugované s FITC, žluté víčko) na jednu zkumavku. K detekci IgG navázaných na
izolované buňky: Přidejte 10 μl sekundárních protilátek specifických pro IgG (konjugované
s FITC, červené víčko) na jednu zkumavku. Nezapomeňte přidat sekundární protilátky k vzorkům
na negativní a pozitivní kontroly.
13) Volitelně: Pokud se mají ve stejné zkumavce jako XM-ONE provést křížové zkoušky T a B-buněk,
přidejte do každé zkumavky 10 μl anti-CD3 (konjugované PE, modré víčko) a/nebo 10 μl antiCD19 (konjugované PerCP, fialové víčko).
14) Inkubujte v temnu na ledu či při +4 °C po 20 minut.
15) Promyjte buňky dvakrát promývacím pufrem o teplotě +0–4 °C odstředivkou při 450 g (nejlépe při
teplotě +4–10 °C). Rozpusťte buňky v 0,2 ml PBS. V případě potřeby je možno tento objem zvýšit
nebo snížit podle protokolu laboratoře průtokové cytometrie. Uchovejte vzorky v temnu a v ledu či
při +4 °C. Doporučujeme provést analýzu vzorků co nejdříve po postupu barvení, a také proto, aby
se předešlo prodlouženému uskladnění, které snižuje životnost izolovaných buněk.
16) Analyzujte pomocí průtokové cytometrie. Speciální nastavení, brány a hraniční hodnoty, které
by měly být použity pro průtokovou cytometrii, závisí na použitém přístroji a rozhoduje o nich
každý uživatel individuálně. Pokud se používají volitelné protilátky CD3 a CD19, je třeba provést
taková nastavení, aby mohly být všechny buňky analyzovány současně, a je třeba provést náležitou
kompenzaci pro FITC, PE a PerCP.
Další informace najdete na stránce http://www.absorber.se/products.asp
Literatura
1) Sumitran-Holgersson, S. and Holgersson, J. Curr. Opin. Organ Transplant. 2006, 11: 425-432.
2) Vermehren, D. and Sumitran-Holgersson, S. Transplantation 2002: 72, 1479-1486 Sumitran-Karuppan,
S., Tydén, G., Reinholt, F., Berg, U. and Möller, E. Transplant Immunol. 1997, 5:321-327.
3) Lucchiari, N., Panajotopoulos, N., Xu, C., Rodrigues, H., Estevam, L., Kalil, J. And Glotz,
G.;Human Immunology 2000: 61, 518-527
4) Rodrıguez PC, Arroyave IH, Mejía G, García LF. Clin Transplantation 2000: 14, 472-478.
5) Breimer, M.E., Rydberg, L., Jackson, A.M., Lucas, D. P., Zachary, A. A., Melancon, J. K., von
Visger, J., Pelletier, R., Saidman, S. L., Williams, Jr. W. W., Holgersson, J., Tyden, G., Klintmalm,
G. K., Coultrup, S., Sumitran-Holgersson, S., and Grufman, P. Transplantation 2009: 87: 549-556.
10
ABX100-5 Ver. 1
Žádost
AbSor
www.a
Popis symbolů
obu 15
h
n
Katalogové číslo
Kód dávky
Použít do rrrr-mm
Lze použít pro <n> testů
Prostudujte si návod
k použití
Teplotní omezení
Výrobce
Lékařské zařízení pro
in vitro diagnostiku
Chraňte před slunečním
světlem
CZ
ďte
m
Žádosti o informace a připomínky zasílejte na adresu:
AbSorber AB, Drottninggatan 33, SE-103 95 Stockholm, Švédsko
www.absorber.se
ěk.
.
ckých
a
kům
uněk,
-
pe při
výšit
edu či
o, aby
é
h
vést
ežitou
uppan,
n
alm,
556.
ABX100-5 Ver. 1
11