Polymorfismus genu pro dopaminový receptor DRD4

Transkript

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE
Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů
Katedra genetiky a šlechtění
Polymorfismus genu pro dopaminový receptor D4 u plemene
border kolie
Diplomová práce
Vedoucí práce: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl
Autor práce: Lenka Holasová
2011
Prohlášení
Prohlašuji, ţe jsem svoji diplomovou práci na téma „Polymorfismus genu pro dopaminový
receptor D4 u plemene border kolie“ vypracovala samostatně, s pomocí vedoucího práce
doc. Dr. Ing. Pavel Vejla a konzultantky Ing. Daniely Čílové, a pouţila jen pramenů, které
cituji a uvádím v přiloţené bibliografii.
V Praze dne 31. března 2011
Podpis autora práce:
Poděkování
Především děkuji mým rodičům za nejdůleţítejší podporu během celého studia.
Ráda bych touto formou poděkovala vedoucímu diplomové práce doc. Dr. Ing. Pavlu
Vejlovi, konzultantce Ing. Daniele Čílové a Ing. Jakubovi Vaškovi za rady a odborné vedení.
Děkuji všem majitelům border kolií, kteří poskytli souhlas s vyuţítím DNA jejich psa pro
tuto práci, ochotně asistovali u odběru a vyplnili důleţitý dotazník. Zvláštní dík patří
Vladaně Šimkové a Šárce Kejvalové za oslovování dalších účastníků studie.
Ve stejné řadě děkuji svému příteli Hynkovi, který se mnou podnikal mnoho někdy
nechtěných výletů za odběrem vzorku a investoval do diplomové práce hodně času
a trpělivosti.
Řešení diplomové práce bylo podpořeno Výzkumným záměrem FAPPZ ČZU v Praze
MSM 6046070901 a grantovým projektem FRVŠ MŠMT 2730/2010.
SOUHRN
Polymorfní oblast genu pro dopaminový receptor D4 (DRD4) je spojována
s povahovými rysy osobnosti jako je především schopnost se soustředit a hledání nového.
Dopaminové dráhy jsou součástí odměňovacího systému mozku organismu; jsou tak zapojeny
do systémů motivace a dlouhodobé paměti a zúčastňují se procesu učení. Polymorfismus
v genu DRD4 byl zkoumán u lidí i u mnoha plemen psů. Dvě předchozí studie se věnovaly
porovnávání povahových rysů německých ovčáků a bearded kolií a jejich variantou genu
DRD4.
Tato práce se zaměřuje na ověření vztahu polymorfismu genu DRD4 a povahových
vlastností psů plemene border kolie. Border kolie jsou proslulé svou inteligencí, vrozeným
instinktem pro práci se zvířaty, ochotou těţce pracovat a fenomenální schopností spolupráce
s člověkem. Tito psi byli vţdy šlechtěni pouze na základě povahy a pracovních schopností.
Vzorky DNA byly získány od 100 border kolií stěrem buněk bukální sliznice.
Identifikace jednotlivých alel exonu 3 genu DRD4 byla provedena pomocí PCR a kapilární
gelové elektroforézy. U border kolií byly nalezeny tři různé alely 435, 447a, 498 z osmi
moţných. Nejvyšší četnosti dosahovala alela 447a, coţ lze povaţovat za typické pro plemena
psů pocházejících z evropského kontinentu.
Sekvenační analýza nalezených alel potvrdila jejich totoţnost s publikovanými
alelami. Ze stejného důvodu byla stanovena aminokyselinová sekvence části proteinu
kódovaném zjištěnými alelami exonu 3 genu DRD4 a opět byla potvrzena totoţnost alel jako
435, 447a a 498.
Na základě dotazníkového šetření byl charakterizován stupeň nepozornosti a aktivityimpulzivity u 89 border kolií. Dvouvýběrovým t-testem byl prokázán statisticky významný
rozdíl na hladině významnosti α=0,05 ve skóre pro nepozornost u fen genotypu 447a/447a a
fen genotypu s alespoň jednou alelou 498. Při ostatních šetření týkajících se skóre pro
nepozornost nebyla potvrzena statisticky významná závislost na alele či genotypu, nicméně
pravděpodobnost shody se pohybovala ve velmi nízkých hodnotách.
Alela 447a v homozygotní sestavě prokazatelně působí na sniţování nepozornosti u
border kolií, především u fen tohoto plemene. U dalších šetření týkající se aktivityimpulzivity nebyla potvrzena statisticky významná závislost.
Klíčová slova: D4 dopaminový receptor, border kolie, exon 3, gen DRD4, PCR
SUMMARY
The D4 dopamine receptor (DRD4) polymorphic area is associated with personality
traits such especially as the ability to concentrate and novelty-seeking. Dopamine pathways
are part of the brain reward system of the organism; so they are involved in the system
of motivation and long-term memory and participates in the learning process. Polymorphism
of the DRD4 gene has been studied in humans and many breeds of dogs. Two previous
studies concentrated on comparing the personality traits of German shepherds and Bearded
Collies and their DRD4 gene variant.
This study aims to verify the relationship between the DRD4 gene polymorphism and
personality traits of the breed border collie dogs. Border Collies are known for their
intelligence, an innate instinct for working with animals, willing to work hard
and a phenomenal ability to cooperate with humans. These dogs have always been bred only
on the nature and working ability.
DNA samples were obtained from 100 Border Collies swabbing cells from buccal
mucous membrane. Identification of alleles of exon 3 of DRD4 gene was performed by PCR
and capillary gel electrophoresis. Three different alleles 435, 447a, 498 of the possible eight
were found in Border collies. The highest frequency reached 447a allele, which may be
regarded as typical for the breed of dogs originating from the European continent.
Sequencing analysis of the found alleles confirmed the identity of the alleles already
published. For the same reason, the amino acid sequence of proteins encoded by the identified
alleles of exon 3 of DRD4 gene was determined and the identity of the alleles as 435, 447a
and 498 was once again confirmed.
Based on a questionnaire survey a degree of inattention, impulsivity and activity was
characterized in 89 Border Collies. Independent samples t-test confirmed a statistically
significant difference in scores for inattention in females with 447a/447a genotype and
females with genotype with at least one allele of the 498 on the significant level α=0.05.
Statistically significant dependence result of score for inattention on allele or genotype was
not confirmed for other inquiries, however, the probability of compliance varied in very low
levels.
The 447a allele in the homozygous group has proven to reduce the inattention
of border collies, especially in females of this breed. For other inquiries concerning the
activity-impulsivity was not confirmed statistically significant correlation.
Key words: D4 dopamine receptor, Border collie, polymorphism, exon 3, DRD4 gene
OBSAH
1
Úvod....................................................................................................................................9
2
Cíl práce ............................................................................................................................10
3
2.1
Vědecké hypotézy, ze kterých vychází řešení diplomové práce ................................10
2.2
Konkrétní cíle pro řešení diplomové práce ................................................................11
Přehled literatury...............................................................................................................12
3.1
3.1.1
Border kolie a způsob práce se zvířaty ...............................................................12
3.1.2
Historie a chov plemene v zemi původu - Velké Británii...................................13
3.1.3
Chov border kolií v České republice ..................................................................16
3.1.4
Sporty, ve kterých border kolie zcela vynikají ...................................................18
3.1.5
Vzhled border kolií a barvy ................................................................................21
3.2
Dopamin .....................................................................................................................25
3.2.1
Historie................................................................................................................25
3.2.2
Syntéza a skladování ...........................................................................................26
3.3
Dopaminové receptory ...............................................................................................26
3.3.1
Dopaminové neurony v mozku ...........................................................................27
3.3.2
Dráhy odměny v mozku ......................................................................................28
3.3.3
Dopaminový receptor D4....................................................................................30
3.3.4
Polymorfismus genu DRD4 u psů ......................................................................31
3.4
4
Charakteristika plemene border kolie ........................................................................12
Metody molekulární biologie .....................................................................................35
3.4.1
Polymerázová řetězová reakce (PCR) ................................................................35
3.4.2
Restrikční štěpení PCR produktů ........................................................................36
3.4.3
Kapilární elektroforéza fluorescenčně značených DNA fragmentů ...................37
Materiál a metodika ..........................................................................................................41
4.1
Hodnocené genotypy..................................................................................................41
4.2
Izolace genomické DNA z buněk bukálních sliznic ..................................................41
4.3
Amplifikace Exonu 3 genu DRD4 pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) ...45
4.3.1
Pouţité primery ...................................................................................................45
4.3.2
První amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky ......................................45
4.3.3
Identifikace alel v lokusu DRD4 pomocí ABI PRISM 310® (Applied
Biosystems) .......................................................................................................................45
4.3.4
Druhá amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky .....................................46
4.4
Sekvenační analýza markeru exonu 3 genu DRD4 ....................................................48
4.4.1
Sekvenované genotypy .......................................................................................48
4.4.2
Gelová purifikace fragmentů ..............................................................................49
4.4.3
Sloţení a příprava sekvenční reakce ...................................................................49
4.4.4
Teplotní a časové podmínky při amplifikaci sekvenční reakce ..........................50
4.4.5
Přečištění sekvenční reakce ................................................................................50
4.4.6
Vlastní sekvence PCR produktů s vyuţitím genetického analyzátoru ABI
PRISM 310® Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ....................................................50
4.5
Zpracování dotazníku pro odhad psychických vlastností psů ....................................50
4.6
Bioinformatické a statistické vyhodnocení výsledků .................................................51
4.6.1
Bioinformatické databáze a programy ................................................................51
4.6.2
Statistické vyhodnocení vztahů mezi bodovým hodnocením dotazníků
a genotypem exonu 3 genu DRD4 ....................................................................................51
4.7
5
Výsledky ...........................................................................................................................54
5.1
Izolace DNA...............................................................................................................54
5.2
Detekce alel exonu 3 genu DRD4 ..............................................................................54
5.3
Výsledky sekvenační analýzy nalezených alel ..........................................................56
5.3.1
Srovnání sekvence PCR produktů námi identifikovaných alel ..........................56
5.3.2
Vyhodnocení aminokyselinové sekvence produktů genu DRD4 .......................59
5.4
6
Analýza frekvence alel lokusu DRD4 ........................................................................53
Výsledky statistického zpracování hodnot získaných z dotazníků ............................61
5.4.1
Hodnocení ADHD dotazníku..............................................................................64
5.4.2
Výsledky parametrického t-testu ........................................................................64
Diskuze .............................................................................................................................69
6.1
Soubor hodnocených jedinců .....................................................................................69
6.2
Izolace DNA...............................................................................................................70
6.3
Detekce alel exonu 3 genu DRD4 ..............................................................................71
6.4
Sekvenační analýza alel 435, 447a, 498 exonu 3 genu DRD4...................................73
6.5
Aminokyselinová sekvence exonu 3 genu DRD4 ......................................................73
6.6
Statistické zpracování dotazníků ................................................................................74
7
Závěr .................................................................................................................................80
8
Seznam literatury ..............................................................................................................83
9
Seznam pouţitých zkratek a symbolů ...............................................................................89
SEZNAM PŘÍLOH
Příloha 1 – Plemenný standard
Příloha 2 - Odběr vzorku DNA ze sliznice dutiny ústní
Příloha 3 - ADHD dotazník validovaný pro majitele psů
Příloha 4 - Schéma syntézy katecholaminů
Příloha 5 - Výsledky jednotlivých testování uvedených v kapitole 4.6.2
Příloha 6 – fotografie laboratoře sekvenčních analýz Katedry genetiky a šlechtění FAPPZ
ČZU a přístroje ABI PRISM 100® (Applied Biosystems)
Příloha 7 - Autoři fotografií
1 ÚVOD
Border kolie je plemeno psa proslulé svou inteligencí, vrozeným instinktem pro práci
se zvířaty a ochotou těţce pracovat. Border kolie nikdy nebyly šlechtěny pro vzhled, vţdy jen
na základě povahy a pracovních schopností. Výstavní kruhy se plemeni otevřely aţ v roce
1976, po sto letech šlechtění pouze na základě pracovních schopností. V dnešní době jsou
border kolie k vidění především v oblasti psích sportů jako jsou agility, dodancing,
dogfrisbee, flyball a obedience, kde často o řády převyšují svými výkony ostatní plemena.
Svojí schopností spolupráce s člověkem a učením se nových úkolů získaly border kolie po
celém světe mnoho příznivců, kteří nechtějí pouze „psa“, ale přemýšlivého společníka.
V této diplomové práci se zabývám hodnocení některých povahových vlastností
jedinců plemene border kolie a srovnávám je variantou polymorfismu v genu pro dopaminový
receptor D4 daných jedinců.
Dopaminové receptory jsou bílkovinné struktury cytoplazmatické membrány buněk,
které mají schopnost vázat hlavní katecholaminový neurotransmiter v mozku savců dopamin. Dopaminové receptory D4 se nejvíce vyskytují v čelním v oblastech mozku, které
hrají důleţitou roli pro schopnost se soustředit, dále schopnost zvanou „novelty-seeking“,
tedy hledání nového a které jsou součástí odměňovacího systému pro mozek organismu.
Různé obměny genu pro tento receptor D4 jsou spojovány se syndromem hyperaktivity u dětí.
V současné době je studiu dopaminových drah v mozku věnována velká pozornost vzhledem
k návaznosti na vznik závislosti na drogách, kouření, hazardních hrách u lidí s určitými
variantami genu pro dopaminové receptory.
Předmětem této diplomové práce je ověřit hypotézu o vztahu mezi polymorfismem
markeru exonu 3 genu pro dopaminový receptor D4 a psychickými vlastnostmi border kolií.
Efekt tohoto genu se podařilo prokázat například u německých ovčáků, a to v oblasti aktivityimpulzivity, povahové sloţce, která bývá sledována při určování stupně hyperkinetického
syndromu s poruchou osobnosti u dětí. Konkrétním předmětem zájmu práce se tedy stalo
ověření hypotézy o vztahu polymorfismu genu pro dopaminový receptor D4 a stupněm
aktivity-impulzivity a nepozornosti u sledovaných border kolií.
9
2 CÍL PRÁCE
Vědecké hypotézy, ze kterých vychází řešení diplomové práce
2.1
Pro řešení diplomové práce byly vybrány vědecké hypotézy, které odpovídají aktuálním
metodám molekulární genetiky pouţívaným při studiu genomu psa. Tyto hypotézy vycházejí
ze studia problematiky molekulárních mechanismů souvisejících se schopností psa se
soustředit a se stupněm jeho aktivity-impulzivity. Mezi nejdůleţitější vědecké hypotézy, na
kterých je postaveno řešení diplomové práce, patří:

Řada psychických vlastností a schopností psů můţe být ovlivněna strukturou
dopaminového receptoru

Je známá úloha dopaminového receptoru DRD4 včetně molekulární charakteristiky
exonových a intronových částí genu, který tento receptor kóduje

V exonu 3 genu DRD4 byla popsána řada mutací vycházejících z opakování určitých
sekvenčních motivů a tyto mutace jsou řadou autorů dávány do souvislostí
psychickými vlastnostmi a schopnostmi nejen u psů, ale i u ostatních savců, včetně
člověka

Konkrétně u polymorfismu psího genu DRD4 byla v exonu 3 identifikována alela
447a, která má předpokládanou souvislost s vyšší schopností psů se soustředit a
současně vykazovat vyšší aktivitu

Metoda polymerázové řetězové reakce představuje účinný nástroj, kterým lze
amplifikovat vybrané části genomu

Fragmentační analýza realizovaná na základě kapilární elektroforézy je vhodnou
metodou pro identifikaci variability exonu 3, která vyplývá z opakování určitých
sekvenčních motivů

Sekvenačními technikami je moţné ověřit skutečnou velikost amplifikovaných
fragmentů
a současně
potvrdit
sekvenční
identitu
detekovaných
alelických
polymorfismů s výsledky publikovanými ve vědeckých pracích nebo v mezinárodních
nukleotidových databázích
10
Konkrétní cíle pro řešení diplomové práce
2.2
Cíle pro řešení diplomové práce je moţné shrnout do následujících bodů:

Vybrat vzorek populace plemene border kolie, který bude obsahovat vyrovnaný počet
psů a fen pocházejících z evropských chovatelských stanic

Izolovat vysokomolekulární genomickou DNA z buněk bukálních sliznic, která bude
mít vhodnou kvalitu i kvantitu pro následné molekulární analýzy

Optimalizovat metodický postup PCR amplifikace částí exonu 3 genu DRD4

Optimalizovat fragmentační analýzu pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM
310® (Applied Biosystems)

Vybrat fluorescenční značení primerů, které umoţní jednoznačnou identifikaci
velikosti PCR amplikonů pomocí programu GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems)

Stanovit jednotlivé alelické kombinace u všech hodnocených zvířat

Optimalizovat přímou sekvenaci polymorfních alel genu DRD4 s vyuţitím
genetického analyzátoru ABI PRISM 310® (Applied Biosystems)

Pomocí programu SeqScape 5.1 (Applied Biosystems) a CLC Main Workbench 6.0.1
(CLC) vyhodnotit sekvenční polymorfismy a porovnat je s jiţ publikovanými
výsledky

Zpracovat populační studii, která vyjádří frekvence jednotlivých alel ve studované
populaci pomocí programu Cervus 3.0.3

U všech psů provést hodnocení stupně aktivity-impulzivity a nepozornosti pomocí
standardizovaného mezinárodně pouţívaného dotazníku

Pomocí parametrického t-testu zpracovat statistickou analýzu s cílem charakterizovat
vztah mezi alelickými kombinacemi genu DRD4 a průměrnými hodnotami skóre pro
aktivitu a impulzivitu a pro nepozornost
11
3 PŘEHLED LITERATURY
3.1
Charakteristika plemene border kolie
Border kolie jsou nenápadné plemeno psa vyšlechtěné pro práci s ovcemi. Výstavní
kruhy se plemeni otevřely aţ v roce 1976, po sto letech šlechtění pouze na základě pracovních
schopností. Z toho plynou typické vlastnosti border kolií po generace spolupracujících
s člověkem.
Border kolie je plemeno psa proslulé svou inteligencí, vrozeným instinktem pro práci
se zvířaty a ochotou těţce pracovat. Tyto schopnosti byly upevňovány selekcí po mnoho
generací, přičemţ border kolie nikdy nebyly šlechtěny pro vzhled (The International Sheep
Dog Society, 2007). Border kolie se tradičně umisťují na prvním místě v pomyslném ţebříčku
plemen psů srovnaných podle pracovní inteligence, měřené podle nutného počtu opakování
nového cviku vedoucího k pochopení úkolu psem a dále podle procenta splněných známých
úkolů po vydání prvního povelu (Coren, 2007). Jsou to psi workholici, milují práci, vydrţí
přesně a neúnavně pracovat mnoho hodin. Ţádné jiné ovčácké plemeno si neuchovalo instinkt
shánět stádo zvířat dohromady a přivádět k ovčákovi tak silně (Loučka, 2008).
3.1.1 Border kolie a způsob práce se zvířaty
Práce se stádem zvířat je původním pracovním určením border kolií. Úkolem border
kolie vţdy bylo najít ovce roztroušené na pastvinách, sehnat je do stáda a poté je přihnat
k ovčákovi. Border kolie při této práci neštěká, ani zvířata nepohání kousáním, ovce ovládá
soustředěným pohledem a pohybem těla (Obrázek č. 1). Vše je zaloţeno na principu lovu,
který je u border kolií zablokován ve fázi „vystavování“, tedy v plíţivém pohybu a naprostém
soustředění na kořist těsně před útokem (Mikulica, 1991; Verhoeff-Verhallen, 2002; Vejrosta,
2009). Důleţitým faktorem je při tomto stádový pud naháněných zvířat. Ve chvílích, kdy se
cítí ohroţena predátorem, shluknou se do stáda aby byla méně zranitelná. Zvířata
v kompaktním stádu můţe border kolie přihnat k ovčákovi nebo podle jeho povelů hnát na
určená místa (Obrázek č. 2). Border kolie při přihánění zvířat neustále hlídají soudrţnost stáda
z ideální vzdálenosti a jsou vţdy připraveny neposlušné jedince tělem, upřeným pohybem
případně štípnutím do srsti zahnat zpět do stáda (Loučka, 2008).
12
Pasení zvířat border koliemi je záleţitost, které se věnovalo mnoho zahraničních
autorů a rozhodně téma nebylo vyčerpáno. Vycvičit border kolii k perfektní práci trvá mnoho
let a je zapotřebí důkladná obsáhlá teoretická příprava.
Obrázek 1: Border kolie ovce ovládá soustředěným pohledem a pohybem těla
Obrázek 2: Border kolie přihání stádo k ovčákovi nebo dle povelů na určená místa
3.1.2 Historie a chov plemene v zemi původu - Velké Británii
Pracovní
kolie
byla
vyšlechtěna
na
hranicích
mezi
Anglií
a
Skotskem
(The International Sheep Dog Society, 2007). Jiţ od 16. století zde ovčáci vybírali
z pasteveckých psů jedince, kteří vynikali ovladatelností a prací se stádem. Hlavní náplní
těchto psů nebylo hlídání stáda ovcí před divokými šelmami, tedy práce pasteveckých psů, ale
rychlé sehnání a přivedení stáda k ovčákovi na základě jeho povelů (Műller, 2001). Ovčáci si
13
nejlepší psy navzájem pronajímali, zřejmě proto jsou border kolie snadno ovladatelné i cizím
člověkem. Štěňata si nechávali pouze po psech s nejlepšími ovčáckými schopnostmi,
nehledíce na vzhled. Pro vzájemné porovnání psů začali pořádat závody v přihánění ovcí, tzv.
trialy. První zaznamenaný mezinárodní trial se konal v roce 1873 u obce Bala v Severním
Walesu. William Wallace předvedl o deset let později typickou práci ovčáka s border kolií,
kterou vedl na dálku pouhým sykotem a hvízdáním a gesty rukou. Do chovu byli pouštěni
pouze psi s nejlepším „okem“ pro práci. V roce 1890 Adam Telfer odchoval a vytrénoval psa,
který je povaţován za typického představitele plemene border kolie a zakladatele chovu. Pes
se jmenoval Old Hemp (Obrázek č. 3). V této době uţ začaly vznikat první spolky sdruţující
chovatele „kolií z oblasti hranic“. Označení „border kolie“ se začalo pouţívat po roce 1900.
(The International Sheep Dog Society, 2007)
Obrázek 3: Typický představitel plemene a zakladatel chovu pes Old Hemp
Zdroj: http://www.isds.org.uk/society/function_purpose/history.html
International Sheep Dog Society, která dodnes sdruţuje chovatele ryze pracovních
borderkolií, byla zaloţena v roce 1906, v Haddingtonu, ve Skotsku (The International Sheep
Dog Society, 2007). V srpnu téhoţ roku se konala první soutěţ v přihánění ovcí ve městečku
Gullan. Postupně se k International Sheep Dog Society připojovaly další národy Velké
Británie, v roce 1965 Irsko. V 80. letech 20. století se popularita trialů, soutěţí v pasení,
rozšířila i na pevninskou část Evropy a mnoho zemí se k International Sheep Dog Society
(ISDS) připojilo jako zámořští členové. Nicméně stále je ISDS nepovaţovalo za řádné členy.
Teprve od roku 2004 jsou řádnými členy kromě Velké Británie a Irska také Rakousko,
Brazílie, Česká republika, Itálie, Faerské ostrovy, Německo a Holandsko (The International
Sheep Dog Society, 2007). Počty narozených a registrovaných štěňat klubem ISDS zobrazuje
graf 1.
14
Graf 1: Počty narozených štěňat a registrovaných border kolií klubem ISDS v letech 1950 aţ 2010.
Zdroj: http://www.bcdb.info/nreg.htm
Britský Kennel Club uznal standard border kolie aţ v roce 1976, Mezinárodní
kynologická federace v roce 1986 (Műller, 2001; Vejrosta, 2009; La Fédération Cynologique
Internationale, 2011). Standard plemene border kolie je přílohou 1 této diplomové práce.
V současné době lze border kolie ve Velké Británii chovat pod dvěma různými kluby, a to
International Sheep Dog Society nebo pod Mezinárodní kynologickou federací, respektive
britským Kennel Clubem. Jako jediné plemeno můţe mít border kolie ve Velké Británii dvojí
registraci, jak pod Kennel Clubem, tak pod International Sheep Dog Society. Průkaz původu
ISDS je uznáván Kennel Clubem, ale naopak tato cesta moţná není. I tím je vyjádřena úcta
k původnímu zaměření border kolií (Loučka, 1999). Zájem o border kolie stále stoupá. Vývoj
počtu nově zaregistrovaných jedinců britským Kennel Clubem je znázorněn v grafu 2.
15
Graf 2: Počet nově zaregistrovaných border kolií britským Kennel Clubem v letech 2001 - 2010 (narozená
3000
2604
2500
2010
2113
2111
2230
2247
2219
2359
2375
2356
2000
1500
1000
500
20
10
20
09
20
08
20
07
20
06
20
05
20
04
20
03
20
02
0
20
01
Počet nově zaregistrovaných
jedinců
štěňata + importovaní jedinci)
Rok
Zdroj: http://www.thekennelclub.org.uk/download/5673/10-yearly-Breeds-Stats-pastoral.pdf
3.1.3 Chov border kolií v České republice
První border kolii dovezl na naše území z Německa v roce 1985 ovčák a mistr
republiky v pasení z roku 1984 E. Mlynarčík. Fena neměla oficiální průkaz původu, neboť
FCI uznalo border kolii jako samostatné plemeno aţ v roce 1986 a byla vyuţívána pouze
k pasení ovcí (Loučka, 1999). Border kolie byly zpočátku registrovány pod Klubem
málopočetných plemen psů spadající pod Českomoravskou kynologickou unii (ČMKU), kdy
bylo k uchovnění psa nutné předvést psa na klubové nebo speciální výstavě a pes musel získat
alespoň jednou ocenění „výborný“. První border kolií oficiálně registrovanou ČMKU byla
v roce 1993 fena Mobella Jackie, importovaná z Anglie, číslo dvě získal také importovaný pes
Caristan Jaguar. První registrovaný vrh štěňat se narodil v chovatelské stanici Czechmate
v roce 1994, bohuţel chybí údaje o štěňatech, prvním kompletně zaznamenaným vrhem je
„A“ vrh chovatelské stanice Bohemia Alké z 22.4.1994 (Hanačíková, 2000).
Pravidlo o předvedení border kolie na klubové výstavě a získání ocenění „výborný“
zcela odporovalo filozofii vzniku plemene border kolie a jeho určení a převáţně proto byl
v roce 1999 zaloţen samostatný Border Collie Club Czech Republic (BCCCZ), který funguje
dodnes a snaţí se propagovat původní pracovní určení border kolií a i další sportovní
uplatnění těchto psů. BCCCZ spadá pod Českomoravskou kynologickou unii a tedy psi
odchovaní pod tímto klubem získávají průkaz původu FCI. U zrodu klubu stáli především
Radko Loučka, Ivo Bartek, Alexandra Grygarová, Michal Krejčí, Nikol Hanačíková, Š.
16
Balcarová, M. Dostálová, L.Vojtěchová, S. Sochorová (Loučka, 1999). Border kolie stále
získávají na větší oblibě především díky jejich výborným predispozicím pro moderní psí
sporty jako jsou agility, dogdancing atd. (Loučka, 2008). Graf č. 3 znázorňuje vývoj v počtu
odchovaných štěňat a počtu vrhů s FCI registrací od roku 1994 do roku 2010 v České
republice.
Graf 3: Počet vrhů a narozených štěňat border kolií v České republice s FCI registrací odchovaných pod klubem
BCCCZ za roky 1994-2010
805
900
Počet nar. štěňat
600
Počet vrhů
126
62
11
54
4
55
5
19
0
33
3
0
21
200
100
9
12
19
35
324
263
200
300
281
400
46
378
500
44
493
507
700
649
800
56
65
91
84
113
138
20
10
20
09
20
08
20
07
20
06
20
05
20
04
20
03
20
02
20
01
20
00
19
99
19
98
19
97
19
96
19
95
19
94
0
Zdroj: Klubové zpravodaje Borderholic 1999-2008 a Monika Švarcová, poradce chovu BCCCZ
Border kolie lze v České republice chovat i pod International Sheep Dog Society,
britskou organizací, jejíţ členem je Česká republika od roku 2004 (The International Sheep
Dog Society, 2001). Chov v ČR zaštiťuje Klub Pracovních Ovčáckých psů o.s. a řídí se
pravidly ISDS. Chovatel například musí ţádat o originální předlohu průkazu původu ISDS,
kterou sám vyplňuje. Vše je zaloţeno na poctivosti chovatele a odhadnutí pracovních
schopností rodičovského páru. V rámci ISDS nejsou pořádány svody psů a bonitace ani
omezení chovnosti věkem fen. Jediný poţadavek je vyšetření očních chorob PRA a CEA. Pes,
který je registrován pod ISDS a je narozen mimo území Velké Británie, nemůţe nikdy získat
také zápis v plemenné knize FCI (Klub pracovních ovčáckých psů České republiky, 2004). Pes se
tak nemůţe zůčastnit mnoha vrcholových soutěţí pořádaných Mezinárodní kynologickou unií
(FCI), kde je vyţadován oficiální průkaz původu FCI, jako například mistrovství světa
v agility (Federation Cynologique Internationale, 2007).
17
Soutěţe v ovčáckém pracovním uplatnění border kolií v České republice
V České republice se konají závody a zkoušky v pasení ovcí nebo jalovic border
koliemi. Tyto akce zaštiťuje především Border Collie Club Czech Republic. První závodní
trial se konal v Česné republice v roce 2001 ve Lhůtě u Vysokého Mýta a zúčastnilo se ho
celkem 12 psů. Vítězem kategorie Trial 1 se stal pes Mouse Di Cambiano, vyšší kategorie
Trial 2 fena Etna Akumulátor (Loučka, 2001). První mistrovství BCCCZ v pasení proběhlo
v září 2001 a vítězem v tradičním anglickém stylu se stal pes Mouse Di Cambiano
(Loučka, 2002). Mistrovství BCCCZ v pasení v roce 2010 mělo jiţ 8 účastníků v nejvyšší
mistrovské kategorii.
3.1.4 Sporty, ve kterých border kolie zcela vynikají
Nejčastějším uplatněním border kolií v České republice není v dnešní době přihánění
hospodářských zvířat, ale především psí sporty, tedy agility, dogdancing, flyball, frisbee,
obedience atd. Psí sporty jsou moderní aktivitou slouţící pro pobavení člověka a psa, zvýšení
fyzické zdatnosti obou a posilnění vztahu mezi majitelem a jeho psem.
Border kolie mají pro psí sporty výborné předpoklady. Jsou středně velké, úţasně
rychlé, mrštné, vytrvalé, nemají srst náročnou na úpravu, ale především, jsou inteligentní.
Nové cviky se učí s nadšením a velice rychle si je osvojí, coţ je předpokladem pro další
trénink.
3.1.4.1 Agility
Agility je parkurová soutěţ fyzicky náročná jak pro psa, tak pro psovoda, která vznikla
v roce 1977. O rok později, v roce 1978, se představil na Cruftově výstavě v Londýně.
Na vzniku agility a jejich propagaci mají zásluhy především Peter Lewis a John Gillbert.
V roce 1996 se konalo ve Švýcarsku první Mistrovství světa FCI v agility (Divišová a kol.,
2003). Agility jsou určeny pro psy všech plemen a psovody všech věkových kategorií. Jedná
se o bezkontaktní sport se zvláštním důrazem na úzký a přátelský kontakt se psovodem
a radost z pohybu, ve kterém pes bez vodítka a obojku překonává na povel psovoda různé
překáţky. Na parkuru je od 15 do 20 standardizovaných překáţek. Pes je musí překonat
v pořadí, které určuje rozhodčí, v co nejrychlejším čase a bez chyb. Psovod má moţnost si
trať před závodem prohlédnout. Při závodě pak vede psa slovně nebo gesty na překáţky. Za
špatné překonání překáţky následují trestné body, za fyzický kontakt psovoda se psem nebo
překáţkou diskvalifikace (Federation Cynologique Internationale, 2007; Klub agility České
republiky, 2009). V agility nemají border kolie absolutně konkurenci, o čemţ vypovídá graf
18
plemenné příslušnosti psů umístěných na prvních dvaceti příčkách na mistrovství FCI
v agility v kategorii large, kam border kolie vzrůstem spadají (Graf č. 4) a graf plemenné
příslušnosti mistrů světa v agility (Graf č. 5) od roku 1996 do roku 2010. Při soutěţích jsou na
základě toho vypisovány navíc kategorie „ABC“ - any breed but collies, tedy pro všechna
plemena vyjma border kolií, jako například na prestiţním Crufts Show 2011.
Graf 4: Plemenná příslušnost psů umístěných na prvních dvaceti příčkách na mistrovství FCI v agility
v kategorii large v letech 1996 - 2010
Australský ov čák
Německý ohař
Australská kelpie
Španělský v odní pes
Australský honácký pes
Maďarská v izsla
20
Německý ov čák
Bearded collie
15
Laekenois
Pudl
Labradorský retrív r
10
Zlatý retrív r
Boxer
Peso de p.M.
5
Flat coated retrív r
Dobrman
Malinois
20 10
20 09
20 08
20 07
20 06
20 05
20 04
20 03
20 02
20 01
20 00
19 99
19 98
19 97
0
19 96
Počet jedinců daného plemene
Chorv atský ov čák
Briard
Groenendael
Beauceron
Terv ueren
Rok
Border collie
Graf 5: Plemenná příslušnost psů mistrů světa FCI v agility v kategorii large v letech 1996 - 2010
Tervueren
2
13%
Border Collie
Tervueren
Border Collie
13
87%
19
3.1.4.2 Dogdancing
Také soutěţe dogdancigu (tanec se psy, kdy se pes učí různé triky, například couvat,
zvedat jednotlivé nohy, válet sudy, pracovat s rekvizitami atd.) těţko hledají plemeno psa,
které by border kolie dostihlo svojí schopností učit se stále nové a nové cviky. Dogdancing se
stal populárním v oblasti showbyznysu, kdy border kolie po celém světě dosahují se svými
majiteli vynikajících umístění v ohromně populárních televizních talentových soutěţích.
Vítězky dogdancingu na světoznámé britské výstavě Crufts 2010, fena Dapper Dame Black
Chevers s majitelkou Alenou Smolíkovou, dostaly od diváků z České a Slovenské republiky
podle informací Televize Nova ve finálním kole soutěţe Talentmania 2010 celkem 1 064 150
hlasů, tedy 47 % z celkového počtu zaslaných dvěma finalistům. V této soutěţi skončily na
fenomenálním druhém místě .
3.1.4.3 Flyball
Flyball je nový sport určený velice rychlým psům. Principem je překonání čtyř
překáţek psem, doskok na mechanický box, chycení tenisového míčku vystřeleného boxem
a vrácení se zpátky k psovodovi přes překáţky. Jedná se o týmový závod, kdy se na trati musí
vystřídat čtyři psi za sebou. Trať je dlouhá celkem 102 stop (North American Flyball
Association, 2010), tedy 31,09 metrů (Flyball Club České republiky, 2010). Světový rekord
drţí Spring Loaded ze Spojených států amerických s časem 15,217 s (North American Flyball
Association, 2010). Průměrná rychlost psa včetně zdrţení na boxu a překáţkách je tedy
neuvěřitelných 29,5 km/h. Tento tým je sestaven ze dvou vipetů, border kolie a kříţence
border kolie. Flyball se v České republice běhá od roku 2003. Drţitelem českého rekordu je
tým Lavina Alfa se čtyřmi border koliemi s časem 17,51 s (Flyball Club České republiky,
2010).
3.1.4.4 Ostatní sporty
Border kolie vynikají v jakýchkoli sportech, kde je potřeba rychlost, přesnost
a schopnost pochopit nové povely. Za zmínku jistě stojí obedience, vysoká škola poslušnosti.
V obedienci jde právě o co nejrychlejší, nejpřesnější a nejradostnější splnění předepsaných
klasických cviků jakým je například chůze u nohy, aport předmětu z různých materiálů,
vysílání psa do vytyčených čtverců, plnění povelů psovoda na dálku a jiné (OBEDIENCE CZ,
2010). Mistři světa v obedience z let 2008-2010 jsou border kolie. (Slovenská kynologická
jednota, 2009, Dansk Kennel Klub. 2010).
20
Borderkolie se také často umisťují na prvních místech v soutěţi dogfrisbee, kdy pes
chytá létající disk. Soutěţí se především ve freestylu, kdy jde o dynamickou pohybovou
sestavu s házením disků psovi se zařazením obtíţných vysokých skoků a odrazů o psovoda
(Obrázek č. 8), ale také na přesnost hodu na terč, či o nejdále hozený a chycený disk. Mistrem
světa ve freestylu pro rok 2010 je Chuck Middleton s border kolií Bling Bling (US Disc Dog
Nationals, 2010).
3.1.5 Vzhled border kolií a barvy
Vzhled border kolií není dodnes jednotný. Důvodem je vyuţívání border kolií
k původní ovčácké práci v podstatné míře i v současné době. Velké procento border kolií je
stále chováno pouze na základě pracovních dovedností (ISDS) a nikoli podle standardu FCI.
Můţeme tak vidět výstavní linie border kolií odpovídající vzhledem standardu FCI,
který je uveden v příloze 1 této práce (Obrázek č. 9). Na druhé straně existují pracovní typy
psů, které se od výstavního liší tak, ţe by je šlo povaţovat za jiné plemeno psa (Obrázek
č. 10). ISDS rozlišuje v rámci pracovního typu další podtypy podle linie psa, ze které jedinec
pochází. Nejdůleţitějším kritériem při posuzování vzhledu border kolií je pohyb, který musí
být plynulý a neúnavný. Border kolie mohou mít jakoukoli barvu, nicméně nikdy nesmí na
těle převaţovat bílá. Jsou známé barvy černobílá, modrobílá, hnědobílá, lila, blue-merle, redmerle, lilac-merle, australská červená, sable a všechny tyto barvy v kombinaci s pálením či
tečkováním (mottle) (Mlnařík, 2006). Problematikou genetiky zbarvení srsti u psů se
z obecného hlediska zabývá Dostál (2007). Barva psa má vliv na schopnost ovládání stáda
ovcí. Velice tmavých psů se ovce příliš bojí, světlé respektují méně. Nejţádanějším
zbarvením border kolií určených pro práci s ovcemi je černá barva s pálením a s typickými
bílými znaky na ocasu a čenichu (Loučka, 2001).
21
Obrázek 4: Alena Smolíková a Dapper Dame Black Chevers vyhrály soutěţ v dogdancingu při prestiţní výstavě
Cruft´s 2010
Zdroj: http://multimedia.ctk.cz/cs/foto/document/4111597/alena-smolikova-pes-soutez-talentmania
Obrázek 5: Agility. Mistryně světa 2010 Lisa Frick a pes Hoss
22
Obrázek 6: Flyball – práce psa na boxu
Obrázek 7: Flyball - pes vracející se od boxu.
23
Obrázek 8: Dogfrisbee
Obrázek 9: Titul BOB (nejlepší z plemene) na Cruft’s 2011 získala fena Goytre Valentine Promise
Zdroj: http://crufts.fossedata.co.uk/crpix/2011_BOC_BOB.jpg
Obrázek 10: Vítěz World Sheep Dog Trial 2008, světový šampion v pasení - pes Aled Owen’s Roy
Zdroj: http://www.kinlochsheepdogs.com/2009%20Trials%20Gallery/4/med/Aled-Owen_s-Roy.htm
24
3.2
Dopamin
Dopamin je hlavní katecholaminový neurotransmiter v mozku savců, kde kontroluje
mnoţství procesů jako například motorickou aktivitu, kognitivní funkce, emoce, motivaci,
příjem potravy a endokrinní regulaci (Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong et al.,
2000). Dopamin je uvolňován v nucleus accumbens mozku při „odměňujících“ činnostech
jako je jídlo, pití, sex a další příjemné činnosti (Bressan a Crippa, 2005). Dopamin hraje také
různé role při regulací funkcí v okrajových částech těla. Moduluje kardiovaskulární funkce,
vylučování katecholaminů, sekreci hormonů, napětí cév, funkce ledvin a hybnost
gastrointestinálního traktu (Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong et al., 2000).
Dopaminergní cesty udrţují hodnoty krevního tlaku prostřednictvím sodíkových kanálů
v tubulech nefronů (Xiaoyan et al., 2008). Porucha nebo změna dopaminových systémů
způsobuje symptomy a znaky totoţné s těmi, které jsou k vidění u Parkinsonovy choroby,
schizofrenii, Alzheimerovy choroby či Huntingtonovy chorey. Dopaminové receptory jsou
cílem mnoha léčiv pouţívaných k léčbě psychóz, syndromu hyperaktivity a dalších. Jako
velký dopaminergní stimulant funguje velká část ilegálních drog jako např. kokain
a amfetamin (Jaber et al., 1996; Wong et al., 2000)
3.2.1 Historie
Dopamin, resp. 3-hydroxytyramine či intropin (IUPHAR Database, 2010) byl poprvé
uměle syntetizován v roce 1910 Mannichem & Jacobsohnem a Bargerem & Ewinsem
(Blaschko, 1942). Pojmenování dopamin získal podle své struktury monoaminu a prekurzoru,
kterým je 3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA), syntetizovaný poprvé v roce 1910 ze sazenic
bobu obecného (Vicia faba). Struktura L-DOPA byla zjištěna 1913 Markusem
Guggenheimem (Hornykiewicz, 2010). Dopamin se v té době povaţoval pouze za prekurzor
noradrenalinu a adrenalinu (Carlsson, 1958). Funkce dopaminu jako neurotransmiteru byla
poprvé prokázána v roce 1958 Arvidem Carlssonem (Carlsson, 1958; Benes, 2001). Za tento
objev získal Carlsson v roce 2000 Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii. Zájem o studium
dopaminu vzrostl po zjištění, ţe degenerace substantia nigra a dopaminergních drah
vedoucích přes jeho struktury jsou klíčovou poruchou pacientů s Parkinsonovou chorobou
a také teoretické moţnosti léčby Parkinsonovy choroby lékem levodopa (L-DOPA),
prekurzorem dopaminu (Bressan a Crippa, 2005; Hornykiewicz, 2010)
25
Obrázek 11: Strukturní vzorec dopaminu
3.2.2 Syntéza a skladování
Dopamin, chemickým názvem 4-(2-aminoetyl)benzen-1,2-diol (IUPHAR Database,
2010), je syntetizován dopaminergními neurony a skladován v presynaptické části axonu
v klasických vesiculech, v dendritech jak ve vesikulech, tak v hladkém endoplazmatickém
retikulu (Bressan a Crippa, 2005; Sűdhof a Starke, 2008). Patří do rodiny katecholaminů.
Prekurzorem dopaminu je L-DOPA, ze kterého je syntetizován pomocí enzymu L-DOPA
dekarboxylázy (Blaschko, 1942). L-DOPA je syntetizován z L-tyrosinu enzymem
tyrosinhydroxylázou. Dopamin je dále prekurzorem noradrenalinu, ze kterého se tvoří
adrenalin (Blaschko, 1942). Schéma cesty je přílohou č. 4 této diplomové práce.
3.3
Dopaminové receptory
V roce 1979 Kebabian a Calne zjistili, ţe efekt dopaminu se projeví navázáním na dva
typy receptorů, dnes známé jako D1 a D2 (Bressan a Crippa, 2005). Fyziologické působení
dopaminu je zprostředkováno vícero různými receptory spřaţenými s G-proteiny, které se dělí
do dvou skupin na D1-like receptory a D2-like receptory. Liší se podle toho, zda aktivují
adenylátcyklázu (D1-like), kam patří receptory označované D1 a D5 a nebo adenylátcyklázu
inhibují a zároveň aktivují draslíkové kanály (D2-like), kam patří receptory D2, D3, D4 (Jaber
et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong et al., 2000; Smeets a González, 2000). Analýzou
struktury genů bylo zjištěno, ţe geny pro D1 a D5 receptory neobsahují introny, zatímco gen
pro D2 receptor obsahuje intronů šest, D3 obsahuje pět a gen pro receptor D4 obsahuje tři
introny. Všechny dopaminové receptory patří do rodiny receptorů se sedmi membránovými
doménami a vykazují značnou konzervativnost v sekvenci aminokyselin těchto domén.
Skupiny receptorů se navzájem liší stavbou receptoru v cytoplazmě buňky, a to především
délkou COOH konce a fosforylací třetí intracytoplazmatické kličky. Dopaminové receptory se
vyskytují v mozku, míše, krevních cévách, nadledvinkách, ledvinách, sympatických gangliích
a v srdci (Missale et al., 1998).
26
Obrázek 12: Struktura dopaminového receptoru
Zdroj: http://www.eje-online.org/cgi/content/full/156/suppl_1/S13
3.3.1 Dopaminové neurony v mozku
Většina dopaminových neuronů se vyvinula z jediné skupiny embryonálních buněk
pocházejících z místa spojení mesencephalonu a diencephalonu (Bressan a Crippa, 2005).
Dopaminergní inervace předního mozku savců je tvořena malým počtem vysoce
kolateralizovaných neuronů (15 000 - 20 000 na kaţdé straně mozku potkana) s perikaryony
sídlícími ve ventrálním mesencephalonu ve skupinách A8 (dorzální a laterální substantia
nigra), A9 (pars compacta substantia nigra) a A10 (mediální část ventrální strany tegmenta)
(Schultz, 1999). Jsou tedy především součástí bazálních ganglií (Brown a Marsden, 1998).
Tyto dopaminové neurony mají velice dlouhé axony a jsou rozřazovány do několika systémů
podle umístění těla neuronu a zacílení axonu. Jsou známy tři hlavní dopaminergní dráhy, a to
nigrostriatální, mesolimbická, mesokortikální a dále dráha tuberoinfundibulární (Missale
et al., 1998; Bressan a Crippa, 2005).
o Nigrostriatální systém začíná v pars compacta substantia nigra a projekuje primárně
do nucleus caudatus a putamenu striata. Tento systém je spojen především
s motorickými funkcemi.
o Mesolimbický dopaminergní systém pochází z ventrální strany tegmenta a substantia
nigra compacta a projekuje do ventrální strany striata, konkrétně ncl. accumbens
27
a čichového hrbolku (tuberculum olfactorius), ale také inervuje septum, amygdalu
a hippocampus. Mesolimbický systém propojuje mozkové struktury, kde vznikají
motivační pochody a učení odměňováním (reward-learning).
o Mesokortikální dráhy začínají těly neuronů v mediální části ventrální strany tegmenta
a projekují do prefrontální mozkové kůry, cingula a perirhinální oblasti mozkové kůry.
Protoţe se dráhy mesolibmického a mesokortikálního systému překrývají, jsou často
označovány souhrnným pojmenováním mesolimbokortikální systém.
o Tuberoinfundibulární dráha se nachází v hypothalamu, kde vede z nucleus arcuatus
hypothalami intermedia hypothalamu do eminentia mediana hypothalami v intermediu
hypothalamu (Bressan a Crippa, 2005). Dopaminergní signály této dráhy tlumí sekreci
prolaktinu a α-melanocyty-stimulující hormonu (Missale, 1998).
Obrázek 13: Poloha středního mozku (mesencephalon), kde se nachází těla dopaminových neuronů a schéma
projekcí dopaminových neuronů mesencephala. Také je schematicky zobrazena poloha tuberoinfundibulární
dráhy.
Zdroj: Schultz (1999)
3.3.2 Dráhy odměny v mozku
Dopaminové neurony jsou kromě volního motorického pohybu zapojeny přes dráhy
mesolimbickou a mesokortikální do vyšších nervových funkcí jako je cílené chování
zahrnující motivaci, učení odměnou a předvídání situace (Schultz, 1997). Schopnost
předvídání situace dává organismu moţnost utéct před nebezpečím, snáze sehnat potravu a ve
spojení s učením vylepšit dosavadní chování. Dopaminové neurony jsou funkční detektory
28
„dobra“ události vztahující se k předpovědi pro danou událost. Vyšlou pozitivní signál pokud
vyhodnotí událost jako lepší neţ předpověď (nečekaná odměna), ţádný pokud je adekvátní
předpovědi (čekaná odměna) nebo negativní pokud je událost horší nebo slabší neţ očekávaná
(očekávaná a nezískaná odměna) (Schultz, 1997). Dopaminergní systém funguje především
jako „upozorňovač“ na odměnu za činnost, veškeré ostatní signály spojené například
s povahou odměny, vzniklou situací, učením, opravou způsobu zachování se, pohybem, musí
vyhodnocovat a vykonávat ostatní mozkové systémy (Schultz, 1998).
Dráhy odměny byly poprvé popsány pokusem prováděným na potkanech, kdy byla
potkanům implantována do mozku elektroda do oblasti septa, corpus callosum, nucleus
caudatus, tegmenta a dalších míst. Potkani si v upraveném boxu s dostatkem krmiva a vody
mohli sami zmáčknutím páčky dávkovat elektrický impuls způsobující pocity blaha. Bylo
zjištěno, ţe nejvíce a s nejmenšími přestávkami vyuţívali páku potkani s elektrodou
zavedenou do oblasti septa a nejvíce s největšími přestávkami s elektrodou v místě tegmenta.
Potkani raději stimulovali elektrodou tato místa v mozku neţ přijímali tekutiny a krmivo či
vykonávali jiné aktivity (Olds a Milner, 1954). Odpovídá to současným zjištěním o blízkém
propojení oblasti septa dopaminergními dráhami, výskytu dopaminových neuronů v tegmentu
a funkci a účincích dopaminu (Carlsson, 1958, Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong
et al., 2000; Bressan a Crippa, 2005; Hornykiewicz, 2010). Podněty spojené s následnou
(třeba pouze předpokládanou budoucí) odměnou jsou podmínkou pro zakódování události do
dlouhodobé paměti (Bialleck et al., 2011). Vyřazení nigrostriátového dopaminového systém
má za následek neschopnost vyuţívat dlouhodoubou paměť pohybové sekvence důleţité
k získání odměny (Satoh et al., 2003). Bylo dokázáno, ţe aplikace dopaminových léků
pacientům s Parkinsonovou chorobou, vykazující sníţené hodnoty uvolňování dopaminu díky
degeneraci nigrostriátových drah (Bressa a Crippa, 2005), zlepšuje pacientovy paměťové
schopnosti (Bialleck et al., 2011).
Dopaminergní receptory jsou spojovány s abnormálním vyhledáváním odměny jako je
hypersexualita, patologické hráčství, přejídání, riskantní chování a poţívání návykových drog.
Toto chování se vysvětluje jako potřeba kompenzace abnormálně vyvinutého dopaminového
systému odměn, který musí být více stimulován, aby poskytl obvyklý stupeň pocitu blaha
(Bressan a Crippa, 2005).
29
3.3.3 Dopaminový receptor D4
Dopaminové receptory D4 se nejvíce vyskytují v čelním laloku mozku, amygdale,
hippocampu, hypotalamu a ve středním mozku (Missale et al., 1998). Receptory D4 jsou
hlavně přítomny v oblastech mozku, které hrají důleţitou roli pro pozornost (Kebir a Joober,
2011). Oproti ostatním receptorům bylo D4 receptorů nalezeno v bazálních gangliích jen malé
mnoţství (Missale et al., 1998). Dopaminový receptor je kódován genem Dopamine receptor
D4 gene (DRD4). Nachází se na 11p chromozomu (Swanson et al., 1998). DRD4 gen
vykazuje vysoký polymorfismus, je to jeden z nejvariabilnějších známých lidských genů.
Většina této diverzity je výsledkem délkových a single-nukleotid polymorfismů (SNP)
v rámci 48-bp dlouhých tandemových repeticí (VNTR) v exonu 3 genu DRD4 (Ding et al.,
2002).. V lidském D4 receptoru existují značná variabilita ve stavbě třetí intracelulární kličky,
která obsahuje repetetivní sekvence 16 aminokyselin. Různý počet opakování znamená
různou stavbu receptoru. Nejčastější zastoupení v lidské populaci (60 %) má varianta se
čtyřmi opakováními (Missale et al., 1998; Ding et al., 2002). Variace DRD4 genu a tedy
variabilita receptoru D4 je studována ve vztahu k výskytu neuropsychických onemocnění,
jako například schizofrenie (Wong et al., 2000).
Jednou z nových oblastí výzkumu je hledání funkčního efektu polymorfismu třetí
cytoplazmatické kličky receptoru D4 na znak osobnosti zvaný novelty-seeking („hledání
nového“). Byla nalezena souvislost mezi variantou receptoru D4 se sedmi repeticemi sekvencí
16 amikonyselin (D4.7) (Missale et al., 1998) a výsledky novelty-seeking jakoţto části
mnoharozměrného dotazníku zaměřeného na testování osobnosti (Ebstein et al., 1996;
Benjamin et al., 1996; Noble et al., 1998). DRD4 varianta se sedmi repeticemi 7R by na
základě výpočtů zaloţených na poměrně vysoké frekvenci v populaci měla být stará více neţ
300 000 let. Nicméně výpočty zaloţené na pozorované intraalelické variabilitě určují věk
alely na 30 - 50 000 let. Tak velký rozdíl ve výsledku těchto dvou různých metod ukazuje na
to, ţe vysoká frekvence této alely není zapříčiněna pouhým genetickýcm driftem, ale také
pozitivní selekcí. Kdyby totiţ alela DRD4 7R byla původcem vlastnosti, která by části
populace dávala výhodu, mohla by se tak rozšířit do současné míry (Ding et al., 2002).
Pravděpodobnost vztahu mezi DRD4 a novelty-seeking je dále podpořeno studiemi
dokazujícími, ţe počet opakování VNTR v exonu III DRD4 můţe ovlivnit navázání ligandu
na receptor. Dále bylo dokázáno, ţe DRD4 je exprimován v limbickém systému zapojeném
do poznávání a emocí, ţe pacienti s poruchou dopaminergních systémů při Parkinsonově
chorobě mají nízkou schopnost pro hledání nového (Benjamin et al., 1996). Dalším důkazem
30
jsou studie provedené na myších s knock-outovaným genem DRD4 (DRD4 -/-). Takové zvíře
reaguje na nové podněty podstatně méně neţ myš s DRD4 +/+ (Dulawa et al., 1999).
Gen DRD4 je také asociován s častým problémem v oblasti dětské psychiatrie hyperkinetickým syndromem s poruchou osobnosti (attention deficit-hyperactivity disorder,
ADHD) (Swanson et al., 1998; Faraone et al., 2005) postihujícím 3-7% školních dětí
(Curatolo et al., 2010). Ačkoli je genetický podklad hyperkinetického syndromu kombinací
několika dalších variant genů, na VNTR polymorfismus v exonu III DRD4 genu byla vţdy
zaměřena největší pozornost vzhledem k tomu, ţe nejběţnější léčba ADHD stimulujícími
látkami (jako amfetamin) působí na dopaminové systém, především D4 receptory (Swanson
et al., 1998), které se vyskytují v hojné míře v cingulu mozkové kůry důleţitém pro udrţení
pozornosti (Kebir a Joober, 2011). Také byl statisticky prokázán statisticky vztah mezi
ADHD a chybějící alelou genu DRD4 se sedmi VNTR (Swanson et al., 1998; Noble et al.,
1998; Faraone et al., 2005; Kebir a Joober, 2011). Kandidátní geny pro vznik ADHD jsou
DRD4, DAT1 (gen pro proteinový dopaminový transportér, navrací dopamin zpět ze synapse
do
presynaptické
části),
COMT
(gen
pro
katechol-o-metyltransferázu
degradující
katecholaminy dopamin a noradrenalin), MAOA (gen pro monoaminooxidázu deaminující
katecholaminy na aldehydy), DBH (gen pro β-hydroxylázu katalyzující konverzi dopaminu na
adrenalin) (Kebir a Joober, 2011).
Jedinci s ADHD mají obtíţe v několika oblastech: řešení problémů, plánování,
orientaci, pohotovosti, flexibilním rozpoznávání, udrţení pozornosti, utlumeních reakcích
a v pracovní paměti. Také je ovlivněn motivační systém a mohou se vyskytovat motorické
obtíţe jako porucha rukopisu, nemotornost (Curatolo et al., 2010). U dětí s ADHD můţeme
pozorovat problémy se soustředěním na daný úkol, s nadměrnou aktivitou a impulzivitou
(Drtílková et al., 2007). Genetika hraje v rozvoji ADHD klíčovou roli, heritabilita ADHD se
pohybuje od 60 % do 90 % (Curatolo et al., 2010).
3.3.4 Polymorfismus genu DRD4 u psů
Obdobný repetitivní polymorfismus genu DRD4 jako u lidí byl identifikován
i u ostatních druhů savců, například u koní (Momozawa et al., 2005), primátů (Livak et al.,
1995) a psů (Niimi et al., 1999). U hlodavců polymorfismus prokázán nebyl
(O’Malley et al., 1992).
31
V prvotní studii porovnávali Niimi et al. (1999) sekvence exonu 3 genu DRD4 u dvou
plemen psů – zlatých retrívrů a u plemene shiba. Byly objeveny čtyři alely lišící se počtem
a pořadím 39 a 12 bp jednotek: 435, 549, 447a a 447b. Frekvence jednotlivých alel se mezi
oběma plemeny významně lišila. V navazující studii rozšířili Niimi et al. (2001) spektrum
plemen o šeltie a bígly. Podařilo se jim detekovat tři nové alely – 396, 486 a 498. Nejvyšší
heterozygotnost vykazovalo plemeno shiba inu (53,6 %), nejniţších hodnot dosahovaly šeltie
(25,0 %). Na rozdíl od evropských plemen nebyly u japonské shiby nalezeny krátké alely 396
a 435, zatímco dlouhá alela 549 se vyskytovala poměrně často.
Osmou alelu 567 objevili Ito et al. (2004) a zjistili, ţe exon 3 genu DRD4 vykazoval
polymorfismus u všech 23 zkoumaných plemen psů. U kaţdého plemene byl zjištěn výskyt
dvou aţ sedmi alel, u ţádného z nich však nebylo přítomno všech osm. Autoři rozdělili
plemena podle frekvence alel exonu 3 do dvou hlavních skupin. Do skupiny A zařadili
plemena okcidentálního původu s vysokou frekvencí alel 435 a 447a. Do skupiny B náleţela
orientální plemena s častým výskytem alel 447b, 498 a 549. Ito et al. (2004) poprvé zkoumali
vztah mezi genetickou variabilitou a povahovými vlastnostmi psů. Hodnotili chování psů
dotazníkem, který obsahoval 12 oblastí povahových rysů jako například zvykání na nového
majitele, do jaké míry je pes spokojený pokud je uspokojen jeho poţadavek, do jaké míry
chce být pes společně s vlastní rodinou, trénink poslušnosti, obrana teritoria, agrese ke psům,
strach atd. Dotazníky vyplňovali veterináři, trenéři psů a ošetřovatelé psů, nikoli majitelé.
Skupina B (vysoká frekvence alel 435 a 447a) dosahovala vyššího průměrného skóre pro
agresivitu a niţšího skóre pro reaktivitu oproti skupině A. Dále se podařilo nalézt nový
polymorfismus v exonu 1 zaloţený na inzerci/deleci 24 bp. Většina ze sledovaných plemen
měla obě alely S i L s výjimkou Shikoku inu a Hokkaido inu, kde se vyskytovala pouze
alela L.
32
Ito et al. (2004) publikovali u jednotlivých alel následující sekvence:
Alela 435 podle Ito et al. (2004)
1 TTCTTCCTAC CCTGCCCGCT CATGCTGCTG CTCTACTGGG CCACGTTCCG GGGCCTGCGG
61 CGCTGGGAGG CCGCGCGTCG GGCCAAGCTG CACGGCCGGA CACCGCGCAG ACCCAGCGGC
121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC GACGGCACCC CCGGCCCGCC GCCCCCCGAC
181 GGCAGCCCCG ACGGCACCTC GGACGGCACC CCCGGCCCAC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC
241 GACGGCACCC CCGGCCCGCC GCCCCCCGAC GGCAGCCCTG ATGACAACCC CCGCCCGCCG
301 CCCCCTGACA GCAGCCCTGG CCCGCCGCCC CCCGAGGTCA CCCCCGATGA CACCCCCGAC
361 GCCACACCCC GCCCCCTGCC CCCCGCCGCC GACGCCGCCG CGCCCCCCCC CGCCGACCCT
421 GCAGAGCCCC CGCGG
Alela 447a podle Ito et al. (2004)
121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCG GACGGCACCC CCAGCCCACC GCCCCCCGAC
181 GGCAGCCCCG ACGGCACCTC GGACGGCACC CCCGGCCCAC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC
241 GACGGCACCT CGGACGGCAC CCCCGGCCCG CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC TGATGACAAC
301 CCCCGCCCGC CGACCCCTGA CAGCAGCCCT GGCCCGCCGC CCCCCGAGGT CACCCCCGAT
361 GACACCCCCG ACGCCACACC CCGCCCCCTG CCCCCCGCCG CCGACGCCGC CGCGCCCCCC
421 CCCGCCGACC CTGCAGAGCC CCCGCGG
Alela 447b podle Ito et al. (2004)
121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC GACGGCACCC CGGACGGCAC CCCCAGCCCA
181 CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC CGACGGCACC TCGGACGGCA CCCCCGGCCC ACCGCCCCCC
241 GACGGCAGCC CCGACGGCAC CCCCGGCCCG CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC TGATGACAAC
301 CCCCGCCCGC CGCCCCCTGA CAGCAGCCCT GGCCCGCCGC CCCCCGAGGT CACCCCCGAT
361 GACACCCCCG ACGCCACACC CCGCCCCCTG CCCCCCGCCG CCGACGCCGC CGCGCCCCCC
421 CCCGCCGACC CTGCAGAGCC CCCGCGG
33
Alela 498 podle Ito et al. (2004)
121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC GACGGCACCC CGGACGGCAC CCCCAGCCCA
181 CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC CGACGGCACC TCGGACGGCA CCCCCGGCCC ACCGCCCCCC
241 GACGGCAGCC CCGACGGCAC CTCGGACGGC ACCCCCGGCC CACCGCCCCC CGACGGCAGC
301 CCCGACGGCA CCCCCGGCCC GCCGCCCCCC GACGGCAGCC CTGATGACAA CCCCCGCCCG
361 CCGCCCCCTG ACAGCAGCCC TGGCCCGCCG CCCCCCGAGG TCACCCCCGA TGACACCCCC
421 GACGCCACAC CCCGCCCCCT GCCCCCCGCC GCCGACGCCG CCGCGCCCCC CCCCGCCGAC
481 CCTGCAGAGC CCCCGCGG
Zelenou barvou v rámečku jsou označeny primery.
Khaki barvou VNTR 4 a další v pořadí touto barvou
Samotný Exon 3 genu DRD4 je vyznačen ostatními
VNTR 8
barvami.
Šedou barvou je zvýrazněn VNTR 12
Ţlutou barvou
je zvýrazněn VNTR 1 a další v pořadí
Tmavě šedou je zvýrazněn VNTR 13
VNTR 5
Světle modrou je zvýrazněn VNTR 14
Červenou barvou je zvýrazněn VNTR 2
(Číslování VNTR je převzato taktéţ z práce Ito et al.,
Růţovou barvou je zvýrazněn VNTR 3
2004)
Polymorfismus byl také nalezen v oblasti intronu 2 genu DRD4. Alely P a Q se liší
inzercí/delecí 17 bp. Obě alely byly detekovány téměř u všech sledovaných 28 plemen psů a
u obou poddruhů vlka – vlka mongolského (Canis lupus chanco) i vlka evropského (Canis
lupus lupus). Výjimku tvořilo korejské plemeno jindo, u kterého se podařilo zaznamenat
výskyt pouze alely Q. Alela P převládala převáţně u plemen okcidentálního původu a obou
poddruhů vlka, kdeţto alela Q byla častěji pozorována u plemen orientálních. Alela Q vlka
evropského se liší od alely Q psa jednonukleotidovou substitucí, zatímco alely P i Q vlka
mongolského a psa jsou totoţné (Nara et al., 2005). To odpovídá předchozím teoriím
zaloţených na studiu mitochondriální DNA, podle nichţ domestikovaný pes pochází
z východní Asie (Savolainen et al., 2002).
Hejjas et al. (2007b) se zaměřili na studium vztahu mezi polymorfismem exonu 3
genu DRD4 a aktivitou-impulzivitou německých ovčáků. V genotypu sledovaných psů tohoto
plemene byly zjištěny alely 435 (resp. 2) a 447a (resp. 3a). Jedinci byli rozděleni na základě
vlivu různorodých podmínek prostředí odchovu do dvou skupin na psy „policejní“ a psy
„mazlíčky“. Pro posouzení aktivity-impulzivity a pozornosti v obou skupinách byl pouţit
dotazník pro rodiče dětí s ADHD (ADHD Rating Scale) upravený a validovaný pro majitele
34
psů (Vas et al., 2007). Skóre pro aktivitu-impulzivitu u policejních německých ovčáků, kteří
měli alespoň jednu alelu 447a, dosahovalo významně vyšších hodnot neţ u jedinců bez této
alely. Tento rozdíl nebyl u psů zařazených do skupiny „mazlíčků“ pozorován. To můţe být
způsobeno jednotnými podmínkami odchovu policejních psů (stejný druh výcviku, ustájení a
obdobná úroveň stresu). U psů vychovávaných v rodinách je pravděpodobně genetický efekt
polymorfismu DRD4 maskován různorodými vnějšími podmínkami prostředí, jako je
například přístup majitele, kvalita výcviku a podobně. Pohlaví ani věk psů neovlivňovalo
výsledné skóre získané vyhodnocením dotazníku (Hejjas et al., 2007b).
3.4
Metody molekulární biologie
3.4.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) lze provádět amplifikaci genů a dalších
sekvencí DNA in vitro (Snustad a Simmons, 2009). Tuto převratnou a jednoduchou metodu
navrhl v roce 1983 biochemik Kary Mullis (Mullis et al., 1986), který ji nechal následující rok
patentovat a obdrţel za ni v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii. Technika PCR výrazně
urychlila pokrok ve studiu struktury genomů různých organismů. Umoţňuje specificky
amplifikovat jakoukoliv oblast genomu během několika hodin, pokud známe nukleotidové
sekvence leţící v blízkosti této cílové oblasti (Saiki et al., 1988). Amplifikaci obvykle provádí
enzym DNA polymeráza. Významnou inovaci představovalo pouţití termostabilní Taq
polymerázy izolované z termofilní gramnegativní bakterie Thermus aquaticus (Innis et al.,
1988).
3.4.1.1 Princip polymerázové řetězové reakce – PCR
Princip PCR popisuje řada autorů (např. Mullis et al. 1986; Saiki et al., 1988;
Sambrook et al., 1989). Metoda zahrnuje tři základní kroky, které se mnohokrát opakují:
denaturace templátové DNA, nasedání primerů, tzv. „annealing“, a prodluţování nově
vznikajícího řetězce DNA.
V prvním kroku je DNA denaturována zahřátím na 92-95°C po dobu asi 30 sekund
(Snustad a Simmons, 2009). Při této teplotě se poruší vodíkové můstky a výsledkem je vznik
jednořetězcových molekul DNA (Brown, 2007). Jednořetězcové molekuly DNA jsou nutným
substrátem pro enzymy DNA polymerázy (Sambrook et al., 1989).
Ve druhém kroku se roztok denaturované templátové DNA ochladí na teplotu
přibliţně 50-60°C, coţ umoţní hybridizaci s nadbytkem syntetických oligonukleotidových
35
primerů (Snustad a Simmons, 2009). Primer je krátký fragment jednořetězcové DNA
komplementární ke specifickým oblastem templátové DNA (Saiki et al., 1988). Optimální
délka primerů je přibliţně 18-24 bází (Griffin a Griffin, 1994). Primer poskytuje volnou
3´ hydroxylovou skupinu potřebnou pro kovalentní navázání dalšího nukleotidu a následné
prodluţování řetězce. Ideální teplota pro připojení primerů („annelační“ teplota) závisí na
tom, z kolika a z jakých bázích jsou sloţeny (Snustad a Simmons, 2009). Mezi základní
parametry při výběru primerů patří: unikátnost sekvence primeru v rámci zkoumané molekuly
DNA, délka primeru, teplota tání a obsah C a G, stabilita na konci 3‘ primeru, tendence ke
vzniku sekundárních struktur a komplementarita mezi dvěma primery (Griffin a Griffin,
1994).
Ve třetím kroku zahřejeme templátovou DNA s navázanými primery na optimální
teplotu pro zahájení polymerace (obvykle 72°C), coţ umoţní zabudování volných
nukleotidtrifosfátů do nově vznikajícího řetězce DNA na základě komplementarity
(Sambrook et al., 1989). Nyní máme čtyři vlákna molekuly DNA místo dvou původních
vláken (Brown, 2007).
V následujícím cyklu se denaturují produkty vzniklé v prvním cyklu replikace a proces
se mnohokrát opakuje, dokud není dosaţeno poţadovaného stupně amplifikace. Amplifikace
je exponenciální, jedna dvoušroubovice DNA dá po 30 cyklech vzniknout více neţ miliardě
kopií sekvence DNA (Sambrook et al., 1989).
Nejprve se jako replikační enzym pouţívala při PCR DNA polymeráza I z E. coli,
která se během denaturačního kroku inaktivovala, a bylo nutné ji opětovně do reakce přidávat.
Vylepšení přišlo s objevem termostabilních DNA polymeráz, které zůstávají během teplotně
denaturačního kroku aktivní. Na rozdíl od většiny polymeráz, nemá Taq-polymeráza 3‘→ 5‘
korekční aktivitu, a tak produkuje při replikaci chyby s vyšší četností, neţ je obvyklé. Pokud
je poţadována vysoká přesnost, provádí se PCR s pouţitím termostabilních polymeráz
vykazujících 3‘→ 5‘ korekční aktivitu, např. Pfu (z Pyrococcus furiosus) nebo Tli
(z Thermococcus litoralis). Pomocí PCR nelze účinně amplifikovat fragmenty delší neţ 35 kb
(Snustad a Simmons, 2009).
3.4.2 Restrikční štěpení PCR produktů
Nukleové kyseliny lze štěpit pomocí speciální skupiny enzymů nazývaných restrikční
endonukleázy, jejichţ objev Smithem a Wilcoxem v roce 1970 znamenal revoluci
v molekulární biologii. Mnohé endonukleázy štěpí DNA zcela náhodně, ale restrikční
36
endonukleázy typu II štěpí DNA pouze ve specifických sekvencích, tzv. restrikčních místech.
Cílové místo je tvořené obvykle 4 aţ 8 nukleotidy. Tato sekvence je velmi často
palindromická. Palindromem rozumíme sekvenci párů nukleotidů, které se čtou stejně
dopředu i pozpátku od centrální osy symetrie.
Restrikční
endonukleázy
jsou
produktem
různých
mikroorganismů,
jejichţ
biologickou funkcí je chránit genetický materiál před cizorodou DNA z jiných druhů,
například před virovou DNA, kterou odbourávají. Všechna štěpná místa ve vlastní DNA jsou
chráněna metylací jednoho nebo více nukleotidů v kaţdé nukleotidové sekvenci, která je
rozeznávána restrikční endonukleázou daného organismu. Dodnes bylo charakterizováno
a purifikováno jiţ okolo 400 restrikčních enzymů majících v molekulární biologii široké
vyuţití (Brown, 2007; Snustad a Simmons, 2009).
Některé typy molekulární diagnostiky jsou zaloţeny na testování přítomnosti nebo
nepřítomnosti specifických míst pro štěpení restrikčními enzymy v testované molekule DNA.
Alelu s mutací v restrikčním místě lze od standardní alely odlišit tak, ţe se daný úsek genu
amplifikuje pomocí PCR, amplifikovaná DNA se štěpí příslušným enzymem a výsledné
produkty restrikčního štěpení se vyhodnotí pomocí elektroforézy na agarózovém gelu, aby se
prokázalo, zda amplifikovaný fragment byl nebo nebyl štěpen (Snustad a Simmons, 2009).
3.4.3 Kapilární elektroforéza fluorescenčně značených DNA fragmentů
Pojmem kapilární elektroforéza, respektive vysokoúčinná kapilární elektroforéza
(High-Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) je dnes označována celá rodina
elektromigračních separačních metod realizovaných v kapilárním instrumentálním formátu:
zónová elektroforéza (CZE), izotachoforéza (CITP), izoelektrická fokusace (CIEF),
elektroforéza v síťovacích prostředích klasických agarosových i polyakrylamidových gelů
(CGE) i v kapalných síťovacích mediích (SDS-elektroforéza bílkovin), a dále kombinované
elektromigrační a chromatografické techniky, elektrokinetická chromatografie (MEKC)
a kapilární elektrochromatografie (CEC) (Lemos et al., 2001; Ugaz a Christensen, 2007).
Kapilární elektromigrační metody jsou zaloţeny na elektroforetické pohyblivosti
částic, která je definovaná jako rychlost pohybu nabitých částic v kapalném prostředí ve
stejnosměrném elektrickém poli o jednotkové intenzitě. Pohyblivost iontu je přímo úměrná
jeho náboji a nepřímo úměrná jeho poloměru a viskozitě roztoku (Kašička, 1997).
Pohyb anorganických částic v elektrickém poli v koloidním roztoku byl pozorován jiţ
v roce 1892. Brzy poté se ukázalo, ţe podobně putují i proteiny ve vodných roztocích.
37
V třicátých letech dvacátého století zkonstruoval švédský elektrochemik Arne Tiselius
zařízení umoţňující rozdělit proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí
pohybu v elektrickém poli, za coţ získal v roce 1948 Nobelovu cenu. Roku 1981 Jorgenson
a Lukacsová popsali separaci různých iontů (aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou
elektroforézou ve velmi tenké skleněné kapiláře s vnitřním průměrem 75 μm. Účinnost
separace v porovnání s velmi rozšířenou kapalinovou chromatografií byla řádově mnohem
vyšší (Gaš, 2001).
Zónová elektroforéza je nejjednodušší elektromigrační technikou, při které se
jednotlivé ionty lišící se svými elektroforetickými pohyblivostmi oddělují v homogenním
prostředí základního nosného elektrolytu (backgroud electrolyte - BGE), kterým je vodní
roztok. Schéma zobrazující princip zařízení pro kapilární elektroforézu zobrazuje obrázek 14.
Oba konce křemenné kapiláry jsou ponořeny do elektrodových nádobek naplněných
základním elektrolytem, kterým je naplněna také kapilára. Vnitřní průměr křemenné kapiláry
je obvykle 50 nebo 75 μm a její délka většinou 30 aţ 80 cm. Kapilární formát separačního
prostoru dovoluje účinný odvod tepla, coţ umoţňuje pouţití vysokých intenzit elektrického
pole a tím i dosaţení vysokých účinností a rychlostí separace. Miniaturizace separačního
prostoru je také základem vysoké citlivosti metody.
Na začátku je velmi krátký úsek kapiláry naplněn roztokem vzorku. Vstupní konec
kapiláry je umístěn do nádobky se vzorkem a po určitou dobu je vytvořen rozdíl hladin mezi
roztokem vzorku a roztokem nosného elektrolytu. Jakmile je vzorek zaveden do kapiláry, je
konec kapiláry obsahující vzorek ponořen zpět do elektrodové nádobky a k systému je
připojeno stejnosměrné elektrické pole. Sloţky vzorku lišící se svými elektroforetickými
pohyblivostmi se v kapiláře pohybují různými rychlostmi směrem k detektoru a na tomto
principu se od sebe oddělují. Pohyb zón vzorku v kapiláře je nejčastěji sledován pomocí „on
column“ UV-VIS-absorpčního detektoru. V určitém místě kapiláry je při zvolené vlnové
délce měřena absorpce záření pohybujícího se nosného elektrolytu a zón vzorků určených
k analýze (Kašička, 1997). Nejčastěji bývají pouţívány laserem indukované fluorescenční
systémy, kdy jsou fluorescenčně značené analyzované vzorky nasvíceny laserem. Ten
excituje fluorofory značených vzorků a výsledný signál je zaznamenávám fotodetektory
případně digitálními kamerami (Ugaz a Christensen, 2007). Ze získaného záznamu časového
průběhu absorpce, takzvaného elektroforeogramu (Obrázek č. 15), je získána kvalitativní
a kvantitativní informace o sloţení analyzovaného vzorku. Kvalita vzorku je dána migračním
časem jeho „peaku“ a kvantita tohoto vzorku je přímo úměrná výšce, respektive ploše
38
„peaku“. Oboje je matematicky porovnáváno softwarem vzhledem k hodnotám hmotnostního
standardu (Kašička, 1997).
Obrázek 14: Schéma zařízení pro kapilární elektroforézu
Zdroj: Kašička, 1997
3.4.3.1 Kapilární gelová elektroforéza
Při kapilární gelové elektroforéze se jako náplň kapiláry pouţívají roztoky polymerů,
které slouţí jako molekulární síto zvyšující rozdíly mezi elektroforetickými pohyblivostmi
analyzovaných částic, které jsou nuceny migrovat mezi molekulami gelu; tak je moţné lépe
oddělit stejně nabité částice podle jejich velikosti. Tato metoda je pouţívána jako adekvátní
metoda ke klasické gelové elektroforéze a umoţňuje oddělit vysokomolekulární biologické
látky jako fragmenty DNA
na základě jejich velikosti (Lemos et al., 2001; Ugaz
a Christensen, 2007).
Kapilární elektroforéza má obrovské spektrum moţností vyuţití v analytické chemii,
biotechnologiích, farmaceutických a biomedicínských analýzách. Slouţí k separaci menších
molekul, stanovení sacharidů, aminokyselin, proteinů, barviv, vitamínů. Kapilární
elektroforézou se diagnostikuje plazma, sérum nebo moč na přítomnost určitých metabolitů
nebo léků (Altria, 1999). Velkým přínosem je kapilární elektroforéza při forezních analýzách
jedů a jejich metabolitů v těle. Je často vyuţívána při analýzách sloţení zadrţených drog. Je
schopna zachytit ve vzorku stopy látek pouţívaných k výrobě výbušnin nebo rezidua látek po
pouţití střelné zbraně (Lemos et al., 2001). Komerčně je kapilární elektroforéza vyuţívána
39
především pro detekci alel dědičných onemocnění. Pro sekvenování DNA a celých genomů
de novo je kapilární elektroforéza stále nejrozšířenější metodou, ačkoli ji technicky předčily
metody nové.
Obrázek 15: Ilustrativní elektroforeogram kapilární gelové elektroforézy
40
4 MATERIÁL A METODIKA
4.1
Hodnocené genotypy
Do sledované populace zvířat bylo zařazeno celkem 89 zástupců plemene border kolie
obou pohlaví (52 fen a 37 psů). Jedinci pocházeli z České republiky a Nizozemí. Všichni psi
zařazení do studie jsou drţeni v domácnosti jako „domácí mazlíčci“. Všichni aktivně
provozují některý ze psích sportů a je s nimi tedy pracováno. Abecední seznam psů, kteří se
zúčastnili studie je uveden v tabulce č. 1. V tabulce jsou uvedeni i psi, kteří do sledované
populace nebyli zařazeni buď z důvodu špatné kvality odebraného vzorku a nebo z důvodu
nevyplnění dotazníku majitelem.
4.2
Izolace genomické DNA z buněk bukálních sliznic
Vzorky DNA byly získány od 100 psů neinvazivní metodou stěrů buněk bukální
sliznice psů sterilním cytologickým kartáčkem firmy Lotus Global Co., Ltd., London. Protoţe
bylo nutné zamezit kontaminaci vzorku, zvíře nesmělo před odběrem přijímat alespoň půl
hodiny potravu. Kartáček byl vsunut do záhybu vnitřní strany tváře a krouţivými pohyby byla
setřena epiteliální vrstva vnitřní strany tváře. Během celé doby odběru bylo s kartáčkem
manipulováno asepticky a po oschnutí byl vloţen do sterilní polypropylénové zkumavky.
Vzorky byly tímto způsobem uchovávány v mrazicím boxu při teplotě –20°C. Pro vlastní
izolaci genomické DNA byl pouţit kit NucleoSpin® Tissue XS (Macherey-Nagel, SRN)
s postupem,
který
výrobce
doporučuje
pro
41
izolaci
z
buněk
bukálních
sliznic.
Tabulka 1: Abecední seznam psů, kteří se zúčastnili studie. Kříţkem (x) je označena nedostatečná kvalita biologického materiálu k provedení fragmentační analýzy nebo
nezískání dotazníku. Psi označení kříţkem nebyli zařazeni do sledované populace.
Jméno Psa
A´Lyric Mystique Near Future
A-Berta Queen of Garden
Acid Apple Koryfej
Aimee Luck Speedy Dream
Airin Lex Wonderfull Dream
Airy Vixen Graceful Avalanche
Aisha z Teneriffe Gold
Aiwa Plush Berry
Akihiro Hamyfa
Alexa Nildanya
Algida Ice Rainy Love
Allegra z Nefritu
Amica Mirus lumen
Ammy z Teneriffe Gold
Andy z Újezdského ranče
Ange White Face Gasko Prim
Annakim Czech Black
Annie Dot Hardy Horde
Anything 4U od Zlatonosné říčky
Apache Ponca Graceful Avalanche
Arctic Moon z Ohromujícího světa
Arnika Fitmin
Aron Nildanya
Arrow of the Sky Bohemia Patrix
Artan Heart Hola-Hopa
Artusch In Love Slobberchops
Arty Bačenka
Ascha Stříbrný Permoník
Atomic Energy Unique Forever
Aymee Plush Berry
Bak z Dublovické Samoty
Bart Bartova Lípa
Bart od Dupíků
Be Free Unique Forever
fena
fena
pes
fena
fena
fena
fena
fena
pes
fena
fena
fena
fena
fena
pes
fena
fena
fena
fena
pes
pes
fena
pes
pes
pes
pes
pes
fena
fena
fena
pes
pes
pes
pes
Barva
černobílá
černobílá
černobílá
hnědobílá s pálením
tricolor
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
tricolor
tricolor
černobílá
černobílá
blue merle s pálením
černobílá
sable merle
blue merle s pálením
černobílá
tricolor
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
modrobílá
černobílá
Otec psa
Artur Border Town
AAron Bashmar
Filip ze Skalistých hor
Vigour Bohemia Alké
Cid Akumulator
Jack LOI 01/191302
Alf Border Town
Never Never Land Agent Double O Seven
Ritson Bohemia Alké
Airin Lex Wonderfull Dream
Ace del Mulino Prudenza
Coudy od Ančičky
Jack LOI 01/191302
Crazy Brown Gasko Prim
Accord Black Chevers
Chimney Sweep Aibara
Idrus Bohemia Alké
Bearbine Mysterious Djo
Freestyler Red Sensation vom Sumelocenna
Dreamer Highland
Earl-Grey z Černobílých
Alderaan Sgian Dubh
Eyes Of The World Galaxy
Maeglin Energy
Wendevick Zephyr
Ted from Scottish Roy vom Beutenhof
Alf Border Town
Duncan Bohemia Alké
Dak z Nečtinského Podhradí
Cassidy z Bengasu
Rising Sun Spot at Narrow Lane
42
Matka Psa
Tosari Flies High
Bonita Chiquita od Zlatonosné říčky
Airin z Paleolitu
Finnty Fey Aibara
Dream of Kintyre Diamond Rose
Jessamine Sprite Black Chevers
Dwarf Tiny z Černobílých
A´Lyric Mystique Near Future
Eyes Like Appaloosa Hardy Horde
Broady from the Cottage of Harmony
Be Happy Od zlatonosné říčky
Cranberry Hardy Horde
Cilka Slezský Hrádek
Funky Akumulator
Chase Rubínové srdce
Blackie Foxy Fox
Jessamine Sprite Black Chevers
Aries Ika Unique Forever
Judy Akumulator
Tambhe Bohemia Alké
Cat Ballow Hardy Horde
Annie Lennox Tender Flash
Adja Haliba
Bessy Coly Queen
Anet z Česalky
Dwarf Tiny z Černobílých
Bonny Ayky
Abina Bartova Lípa
Ally Dajavera
Amaze By Fate Unique Forever
Izolace DNA









x












x
x










Dotazník


































Beatrice Cinderella´s Ranch
Berenika Slezský Hrádek
Bizzy Bee Unique Forever
Black Bree Budgerigar
Bond Speed Bondy Hardy Horde
Bonita Chiquita od Zlatonosné říčky
Bonny Boy Hardy Horde
Brendy Ganden Monge
C. D. od Zlatonosné říčky
Calypso Carl Hardy Horde
Carby Ayky
Carry Ball Hardy Horde
Cat Ballow Hardy Horde
Cessy Irish Hafkins
Clever Lady od Zlatonosné říčky
Coffe Princess z Jasmínových Hor
Come Back Bohemia Alké
Connie Tara Tennant
Corry Black z Bengasu
Cranberry Hardy Horde
Cress Glow Ambra Professional
Crim Darley Arabian
Dag Valiant Mintaka
Dazzle Trixi z Černobílých
Doreen Katemy
Easy Ayky
Ebony Ayky
Electric Brown Gasko Prim
Elegance Eysha z Bengasu
Elis Ayky
Elsa Foxy Fox
Elton Darley Arabian
Escort Ayky
fena
fena
fena
fena
pes
fena
pes
fena
pes
pes
pes
pes
fena
fena
fena
fena
pes
fena
fena
fena
pes
fena
pes
pes
fena
fena
fena
fena
pes
fena
fena
fena
pes
pes
fena
blue merle
černobílá
černobílá
tricolor
černobílá
černobílá
tricolor
černobílá
černobílá
tricolor
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
blue merle
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
hnědobílá
černobílá
hnědobílá
černobílá
tricolor
hnědobílá
černobílá
černobílá
hnědobílá
černobílá
černobílá
hnědobílá
černobílá
dark sable
I´m Just Yours Gasko Prim
Cid Akumulator
Rising Sun Spot at Narrow Lane
Jessomine Aussie Merlot
Ike Of Magic Border's
Earl-Grey z Černobílých
Dark Devil from the Narrow Lane
Ghost of Pinewood Country
Ted from Scottish Roy vom Beutenhof
Ethan von Waltenweiler
Dark Devil from the Narrow Lane
Detania Victory
Nice of You to Come Bye Secret Switch
Wendevick Zephyr
Clan-Abby Nz's Black Magic
Florey Bohemia Alké
Dreamer Highland
Broady from the Cottage of Harmony
Cassidy Fantasy z Černobílých
Atos Budgerigar
Jump Jet Black Chevers
Idrus Bohemia Alké
Geri Foxy Fox
Wendevick Usecasper
Brown Dancer Gasko Prim
43
Qatma Bohemia Alké
Briggi Foxy Fox
Amaze By Fate Unique Forever
Budgie Choco Silver Breeze
Blackie Foxy Fox
Accra Moonvillage
Blondie Ayky
Alba Okřešická Perla
Angie z Jabloňového Dvora
Ofra Bohemia Alké
Deuce Czechmate
Babsi Foxy Fox
Tosari Flies High
Gee Akumulator
Ferine Bohemia Alké
Cory Faith Black Chevers
Henriet Czechmate
Alka Dívčí Dvůr
Cindy Ayky
Cindy Ayky
Tosari Flies High
Babsi Foxy Fox
Cindy Ayky
Daryl Bohemia Alké
Ferine Bohemia Alké
Cindy Ayky
Arushka Plume Hardy Horde





















x












x













x
















x

x


Ezar Blue z Bengasu
Ezechiel Lusika
Far Far Away Hardy Horde
Farra Slezský Hrádek
Filip ze Skalistých Hor
Flash Foxy Fox
Foolish Bree Hardy Horde
Forcy Run Hardy Horde
Forever Free Black Chevers
Gália Estrella ze Skalistých Hor
Genesis ze Skalistých Hor
Gentleman of Tennant
Gigi Foxy Fox
Great Spirit Hardy Horde
Griotka Svěţí Vítr
Grumble RM Sting z Černobílých
Gucci Brown z Černobílých
Hawkeye In Black Hardy Horde
Heavenly Dot Hardy Horde
Chase Rubínové srdce
Immortal Beauty Z Černobílých
Janek Fitmin
Liza's Border Vega Blue
Nice of You to Come Bye Eager Eagle
Nice of You to Come Bye Simply Sarah
Noemi Foxy Fox
Ozzie Rubínové Srdce
Petr Pan Akumulator
Timothy Foxy Fox
pes
pes
fena
fena
pes
pes
fena
pes
fena
fena
fena
pes
fena
pes
fena
pes
pes
pes
fena
fena
fena
pes
fena
fena
fena
fena
fena
pes
pes
pes
modrobílá
černobílá
černobílá
blue merle
černobílá
černobílá
tricolor
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
černobílá
tricolor
černobílá
red merle s pálením
černobílá
černobílá
tricolor
blue merle
černobílá
blue merle
blue merle
australská červená
černobílá
černobílá
černobílá
blue merle
černobílá
Geri Foxy Fox
Elton Darley Arabian
Hector Czechmate
Brown Dancer Gasko Prim
Braveheart of Pinewood Country
Laetare Be Just
Berry Blue Foxy Fox
Berry Blue Foxy Fox
Wendevick Zephyr
Arrow From The Lovely Annie
Akersborg Sid ISDS 284130
Gift in Trics Gasko Prim
Laetare Be Just
Laetare Be Just
Csóványospataki Elixir
Csóványospataki Elixir
Eyes of the World Galaxy
Just the One Gasko Prim
Liza's Border Q Red
Nice of you to Come Bye Stormchaser
Locheil Time Moves On, Bond
Oodnadatta True Deal
Gondor Rubínové Srdce
Alf Border Town
Imai Bohemia Alké
Kerrybrent Nz Midnite Solo
44
Babsi Foxy Fox
Bonnie Lusika
Barunka Slezský Hrádek
Anelim ze Skalistých hor
Glare Bohemia Alké
Blaze Black Chevers
Francis Foxy Fox
Gay Bohemia Alké
Connie Blue Svěţí Vítr
Henriet Czechmate
Henriet Czechmate
Hane Rubínové srdce
Henriet Czechmate
Judy Akumulator
Silque Asweetie
Arnpriors Come and be Nice
Rhonabwy Awsome Lady, Wish
Elsa Foxy Fox
Gina Miveko
Dyna Miveko
Roxana vom Skuddenhof
Simaro Angela Lansbury



x
























x































4.3
Amplifikace Exonu 3 genu DRD4 pomocí polymerázové řetězové
reakce (PCR)
4.3.1 Pouţité primery
Pro analýzu genu DRD4 byly pouţity následující primery uvedené v tabulce 2. Jeden
z pouţitých primerů z kaţdého páru byl značen fluorescenční barvou 6-FAMTM(Applied
Biosystems) (Applied Biosystems).
Tabulka 2: Pouţité primery
Název primeru
Marker
Sekvence primeru
Zdroj
exon 3 DRD4
1.první amplifikace
D4FFAM
D4DogR5A
5‘-TTCTTCCTACCCTGCCCGCTCATG-3‘
5‘-CCGCGGGGGCTCTGCAGGGTCG-3‘
Ito et al.
(2004)
exon 3 DRD4
2.první amplifikace
D4FFAM
D4DogBR5A
5‘-TTCTTCCTACCCTGCCCGCTCATG-3‘
5‘-TGGGCTGGGGGTGCCGTCC-3‘
Ito et al.
(2004)
4.3.2 První amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky
Optimalizovaná reakční směs o objemu 12,5 μl obsahovala 50 ng templátové DNA,
1,25 U Pfu polymerázy (Fermentas) a 0,1 mg BSA. Koncentrace ostatních komponent PCR
reakce byla následující: 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1%
Triton X-100, 2mM MgSO4, 250 μM dATP, 250 μM dCTP, 250 μM dTTP, 125 μM dGTP, 7deaza-dGTP 125 μM, 0,5 μM primer D4FFAM, 0,5 μM primer D4DogR5A a 2 mM
tetramethylamonium oxalát (Top Bio).
Amplifikace probíhala v termocykleru C1000TM Thermal Cycler (BioRad) při
následujících podmínkách: 1x (98° C - 2 minuty), 35x (98° C - 30 sekund, 65° C – 1 minuta,
74° C – 1 minuta), 1x (74° C - 10 minut).
4.3.3 Identifikace alel v lokusu DRD4 pomocí ABI PRISM 310® (Applied
Biosystems)
Pro stanovení velikosti PCR amplikonů-jednotlivý alel markerů třetího exonu
dopaminového receptoru byl pouţit genetický analyzátor ABI PRISM 310® (Applied
Biosystems). Produkty amplifikace popsané v kapitole 4.3.2 byly 49x naředěny ddH2O pro
kapilární elektroforézu. Z naředěného PCR produktu byl odebrán 1 µl roztoku, který byl
45
přenesen do nové zkumavky. K tomuto objemu bylo přidáno 14 µl DI formamidu pro
kapilární elektroforézu (Applied Biosystems) a 0,2 µl velikostního standardu GeneScanTM 600 Liz® Size Standard (Applied Biosystems). Tento hmotnostní standard slouţí pro odečtení
velikosti amplifikovaných alel. Takto připravené zkumavky s analyzovanými vzorky byly
denaturovány při teplotě 95° C po dobu 5 min v termocykleru C1000 (BioRad). Po ukončení
denaturace byly denaturované vzorky v termocykleru prudce ochlazeny na teplotu 4° C. Při
této teplotě byly vzorky ponechány po celou dobu před vlastní fragmentační analýzou. Pro
fragmentační analýzu byl pouţit modul přístroje ABI PRISM 310® (Applied Biosystems)
umoţňující postupně analyzovat 96 vzorků. Tento modul je výrobcem označen jako GS STR
POP4 (1ml) G5, který udává, ţe se jedná o fragmentační analýzu tandemových repeticí
s polymerem POP4 a virtuálním filtrem G5. Pro nástřik vzorků byla pouţita hodnota napětí
5 kV a doba nástřiku 5 sekund. Během separace byla nastavena hodnota napětí 15 kV, teplota
separace 15 °C a doba separace 33 minut. Výstupy fragmentační analýzy byly automaticky
zaznamenány programem GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems). Tento program byl pouţit
i pro následné odečtení velikosti amplifikovaných alel.
4.3.4 Druhá amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky
Alela označená jako 447 představuje dvě moţné sekvence, které lze odlišit další PCR
amplifikací a pouţitím jiného R primeru. Při této následné amplifikaci vznikají dva rozdílně
velké produkty 168 bp (alela 447a) a 180 bp (alela 447b). Toto označení alel je rovněţ
převzato z práce Ito et al. (2004).
Optimalizovaná reakční směs o objemu 12,5 µl obsahovala 50 ng templátové DNA,
1,25 U Pfu polymerázy (Fermentas) a 0,1 mg BSA. Koncentrace ostatních komponent PCR
reakce byla následující: 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1%
Triton X-100, 2mM MgSO4, 250 µM dATP, 250 µM dCTP, 250 µM dTTP, 125 µM dGTP,
7-deaza-dGTP 125 µM, 0,5 µM primer D4FFAM, 0,5 µM primer D4DogBR5A a 2 mM
tetramethylamonium oxalát (Top Bio).
Amplifikace probíhala v termocykleru C1000 (BioRad) při následujících podmínkách:
1x (98°C - 2 minuty), 35x (98°C - 30 sekund, 70°C – 1 minuta, 74°C – 1 minuta),
1x (74°C - 10 minut) a nakonec zchlazení na 4°C. Vzorky byly analyzovány stejným
postupem jako v kapitole 4.3.3.
46
Obrázek č. 16 a 17: Pouţitý termo cykler a náhled programu pro 2. amplifikaci v ovládacím panelu přístroje
47
4.4
Sekvenační analýza markeru exonu 3 genu DRD4
K sekvenační analýze námi nalezených alel jsme přistoupili z důvodu maximální
moţné identifikace nalezených alel, které odpovídaly svými velikostmi na základě
fragmentační analýzy alelám 435, 447a, 498 (Ito et al., 2004). Sekvenační analýza přístrojem
ABI PRISM 310® Genetic Analyzer (Applied Biosystems) a programem DNA Sequencing
Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems) umoţňuje dokonale porovnat variantu námi
nalezených alel s dosavadními pracemi na toto téma (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004)
4.4.1 Sekvenované genotypy
Pro sekvenční analýzu byly pouţity PCR produkty první amplifikace, která je popsána
v kapitole 4.3.2. Všechny fragmenty byly sekvenovány od F i od R primeru. Cílem této
analýzy bylo ověřit, zda skutečná velikost amplikonů odpovídá údajům, které popsali Ito et al.
(2004). Dalším cílem této analýzy bylo zjistit, zda - li se amplikony o shodné velikosti neliší
z hlediska sekvence nukleotidů v exonu 3 genu DRD4. Pro analýzy bylo vybráno 30 psů
s různými genotypy, coţ přehledně zobrazuje tabulka č. 3.
Tabulka 3: Přehled osekvenovaných vzorků a jejich genotypů
Vzorek obsahuje alelu
435
Vzorek číslo
68
24
28
42
65
70
82
84
94
100
1
56
75
Genotyp
435/435
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/498
435/498
435/498
48
447a
498
435/447a
435/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/498
447a/498
24
28
2
5
6
36
71
3
4
1
56
3
4
9
11
25
98
435/498
435/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
498/498
498/498
4.4.2 Gelová purifikace fragmentů
Amplifikované fragmenty byly separovány pomocí agarózové elektroforézy (1,5%
koncentrace gelu) v prostředí TBE pufru. Pro separaci byl pouţit postup, který popisuje
Sambrook et al. (1989). Amplikony o poţadované velikosti byly u kaţdého genotypu po
dvouhodinové separaci vyříznuty z gelu sterilním skalpelem. Délka separace dvě hodiny byla
nezbytná pro to, aby u heterozygotů došlo k dokonalému oddělení obou amplikonů.
Z vyříznutého fragmentu byla extrahována DNA pomocí MiniElute PCR Purification Kit
(Qiagene). Pro extrakci DNA z gelu byl pouţit zcela shodný postup, který doporučuje
výrobce tohoto kitu. Výsledkem této extrakce bylo získání 20 µl amplifikovaných fragmentů
rozpuštěných v ddH2O určené pro kapilární elektroforézu. U kaţdého vzorku byla pomocí UV
spektrofotometru (Eppendorf) stanovena koncentrace DNA. Všechny vzorky byly následně
naředěny ddH2O na jednotnou koncentraci 5 ng.10-1.
4.4.3 Sloţení a příprava sekvenční reakce
Pro sekvenční analýzu byl pouţit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems). Připravená reakční směs o celkovém objemu 20 µl obsahovala
20 ng purifikované DNA, 3,2 pmol F nebo R primeru, 2 µl Terminator Ready Reaction Mix
a 4 µl 5 x Sequencing Buffer (Applied Biosystems).
49
4.4.4 Teplotní a časové podmínky při amplifikaci sekvenční reakce
Pro amplifikaci byl pouţit rovněţ termocykler C1000 (BioRad). Byly pouţity
následující podmínky: 1x (96 °C – 60 s), 25x (96 °C – 10 s, 50 °C – 5 s, 60 °C – 240 s).
Vzorky byly následně ochlazeny na 4 °C. Pro vlastní amplifikační profil byla nastavena
rychlost změny teploty 1 °C.s-1.
4.4.5 Přečištění sekvenční reakce
K získané sekvenční reakci popsané v kap. 4.4.4 (objem 20 µl) byly přidány
2 µl roztoku glykogenu (koncentrace 20 ng.ml-1, Fermentas), 2 µl 3M octanu sodného
a 50 µl 96% čistého etanolu. Vzorky byly promíchány a následně ponechány 15 minut při
laboratorní teplotě. Následně proběhlo odstředění při 13 200 ot.min-1 po dobu 30 minut.
Supernatant byl následně opatrně odsát sterilní pipetou a sediment přichycený na dně
zkumavky byl opláchnut 250 µl 70% čistého etanolu. Vzorky byly odstředěny při
13 200 ot.min-1 po dobu 15 minut. Supernatant byl rovněţ opatrně odsán a opláchování
a odstředění 70% etanolu bylo ještě jednou zopakováno. Získaný supernatant po odsátí
etanolu byl vysušen ve vyhřívaném bloku při teplotě 50 °C po dobu 45 minut. Dokonale
vysušený sediment byl rozpuštěn v 15 µl Di formamidu pro kapilární elektroforézu (Applied
Biosystems).
4.4.6 Vlastní sekvence PCR produktů s vyuţitím genetického analyzátoru ABI
PRISM 310® Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
Pro sekvenování byl nastaven sekvenční modul KB_310_POP6_BDTv3_50std.mob.
Pro separaci byl pouţit polymer POP6 (Applied Biosystems) a kapilára se čtecí délkou 50 cm.
Pro nástřik vzorku bylo pouţito napětí 2,5 kV a doba 30 s. Vlastní separace probíhala při
napětí 12,2 kV, teplotě 50 °C po dobu 120 minut. Získaná data byla automaticky
zaznamenána počítačem a připravena pro vyhodnocení programem DNA Sequencing
Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems).
4.5
Zpracování dotazníku pro odhad psychických vlastností psů
Pro posouzení aktivity-impulzivity a nepozornosti sledovaných jedinců byl pouţit
ADHD dotazník validovaný pro majitele psů (Vas et al., 2007), který obsahoval celkem
13 poloţek. Sedm z nich se týkalo posouzení aktivity a impulzivity (např. „Můj pes je divoký,
50
hůře ovladatelný, kdyţ vyrazí vpřed, je těţké ho udrţet“) a zbylých šest souviselo
s nepozorností (např. „Je snadné upoutat pozornost mého psa, ale brzy ztratí zájem“). Majitel
psa ohodnotil pozorovanou frekvenci projevů daného chování na stupnici 0 – 3. Skóre pro
aktivitu-impulzivitu bylo vypočítáno jako součet majitelem uvedených hodnot u poloţek č. 4,
5, 6, 8, 9 11 a 13 a skóre pro nepozornost bylo dáno součtem hodnot u zbývajících poloţek
č. 1, 2, 3, 7, 10 a 12. Dotazník byl majitelům odesílán v elektronické podobě emailem nebo
v papírové formě poštou. Přesné znění dotazníku je přílohou 3 této práce.
4.6
Bioinformatické a statistické vyhodnocení výsledků
4.6.1 Bioinformatické databáze a programy
Informace o sekvencích studovaných genů byly získány z mezinárodní databáze NCBI
(National Center for Biotechnology Information) volně dostupné na internetové adrese
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Pro stanovení velikosti amplikonů byl pouţit GeneMapper 4.1
(Applied Biosystems). Pro získání vstupních sekvenčních dat byl pouţit program DNA
Sequencing Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems). Pro porovnání sekvencí
hodnocených markerů byl pouţit program BioEdit verze 7.0.9.0 (CIT). Program CLC Main
Workbench 6.0.1 jsme pouţili pro grafické srovnání nalezených sekvencí alel s dříve
publikovanými pracemi Ito et al. (2004). Pomocí programu Cervus 3.0.3 (Kalinowski et al.,
2007) byla provedena deskriptivní statistika hodnotící variabilitu exonu 3 genu DRD4. Byl
stanoven stupeň očekávané (HE) a pozorované (HO) heterozygotnosti. Hodnota HE je
teoretická hodnota frekvence heterozygotů, která by v populaci nastala při dosaţení
rovnováţného stavu podle Hardy-Weinbergova zákona.
4.6.2 Statistické vyhodnocení vztahů mezi bodovým hodnocením dotazníků
a genotypem exonu 3 genu DRD4
Pro zjištění statistické významnosti rozdílů získaných průměrných skóre pro aktivituimpulzivitu a nepozornost byl pouţit parametrický t-test. Vyhodnocení bylo provedeno
pomocí programu STATISTICA 9.1. Parametrickým t-testem jsme porovnávali výsledná
skóre zvlášť pro aktivitu-impulzivitu a pro nepozornost následujících dvojic skupin (Tabulka
č. 4). Skupiny byly vybrány na základě zjištěných genotypů a na základě pohlaví psů.
51
Tabulka 4: Testované skupiny parametrickým t-testem. Pod pojmem „psi“ jsou myšleni jedinci samčího
pohlaví. „Fenami“ jsou myšleny samice. „Všichni“ znamená zástupci obou pohlaví, tedy všichni sledovaní
jedinci.
Číslo testování
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
9
SKUPINA A
n
všichni s genotypem 447a/447a
všichni s alespoň jednou alelou 447a
všichni s alespoň jednou alelou 435
všichni s genotypem 435/447a
psi s genotypem 447a/447a
feny s genotypem 447a/447a
psi s alespoň jednou alelou 447a
feny s alespoň jednou alelou 447a
feny s genotypem 435/447a
feny s genotypem 435/498
feny s alespoň jednou alelou 498
psi s alespoň jednou alelou 498
všichni homozygoti, nezáleţí na typu
alely
feny homozygoti, nezáleţí na typu
alely
psi homozygoti, nezáleţí na typu alely
psi
49
83
49
49
13
30
9
30
24
25
35
48
24
25
25
8
25
3
3
19
11
SKUPINA B
všichni ostatní
všichni ostatní
všichni s genotypem 447a/498
všichni s genotypem 435/447a
všichni ostatní
všichni ostatní
všichni s genotypem 447a/498
ostatní psi
ostatní feny
ostatní psi
ostatní feny
psi s genotypem 447a/498
feny s genotypem 447a/498
feny s genotypem 435/447a
ostatní feny
ostatní feny
feny s genotypem 447a/498
n
40
6
25
9
76
59
25
49
13
27
2
4
10
15
8
44
3
49
15
25
24
52 všichni heterozygoti, nezáleţí na typu alely
37
26 feny heterozygoti, nezáleţí na typu alely
26
26 psi heterozygoti, nezáleţí na typu alely
25 psi s genotypem 447a/447a
37 feny
11
24
52
Poznámka: Statistická analýza byla provedena mezi všemi uvedenými testovanými skupinami
zvířat bez ohledu na počet jedinců ve skupině. Tyto výsledky budou rovněţ prezentovány
v další části diplomové práce. Vzhledem k tomu, ţe u testování číslo 2, 4, 7, 12, 13, 16, 17,
18, 19, 20 se vyskytovaly výrazně rozdílné počty hodnocených zvířat, nebudou tato
hodnocení povaţována ze reprezentativní a diskuse diplomové práce bude zaměřena na
testování s vyrovnaným, reprezentativním počtem zvířat.
52
4.7
Analýza frekvence alel lokusu DRD4
Pomocí programu Cervus 3.0.3 (Kalinowski et al., 2007) byla provedena deskriptivní
statistika hodnotící variabilitu exonu 3 genu DRD4. Byl stanoven stupeň očekávané (HE)
a pozorované (HO) heterozygotnosti. Hodnota HE je teoretická hodnota frekvence
heterozygotů, která by v populaci nastala při dosaţení rovnováţného stavu podle HardyWeinbergova zákona.
53
5 VÝSLEDKY
5.1
Izolace DNA
Z původně odebraných 100 vzorků se podařilo extrahovat DNA v dostatečné kvalitě
vhodné ke kapilární gelové elektroforéze z 92 vzorků. Parametry kvality i kvantity DNA
získané izolací z buněk bukální sliznice byly následující. Při namátkovém fotometrickém
měření za pouţití UV spektrofotometru GeneQuant RNA/DNA Calculator (Pharmacia
Biotech, Velká Británie) byla průměrná výtěţnost DNA z jednoho stěru u plemene border
kolie 2310 ng DNA (Vk = 5,1 %). Průměrný poměr absorbancí A260/A280 byl 1,87
(Vk = 4,9 %). Parametry charakterizující kvantitu a kvalitu DNA nebyly blíţe statisticky
ověřeny, protoţe tuto část řešení práce lze povaţovat za zcela standardní předpoklad nezbytný
pro následující analýzy.
5.2
Detekce alel exonu 3 genu DRD4
Po první amplifikaci byla pomocí kapilární gelové elektroforézy přístrojem ABI
PRISM 310® (Applied Biosystems) zjištěna přítomnost alel o velikosti 435 bp, 447 bp
a 498 bp. Alely kaţdého genotypu byly odečítány jednotlivě v programu GeneMapper 4.1
(Applied Biosystems), Pomocí tohoto programu je moţno určit velikost jednostlivých alel
porovnáním s hmotnostním standardem. Celkem bylo nalezeno 6 kombinací alel, a to
435/435, 435/447, 435/498, 447/447, 447/498, 498/498. Na následujících obrázcích jsou
zobrazeny ektroforeogramy vzorků obsahující zjištěné kombinace alel.
Obrázek 18: Výstupy programu Gene Mapper 4.1 zobrazující detekci alel 435, 447 a 498 genu DRD4
54
Pro odlišení alely 447a a 447b byla provedena další PCR amplifikace při pouţití
jiného R-primeru. Při této amplifikaci mohou vzniknout dva různé produkty 168 bp (odpovídá
alele 447a) nebo 180 bp (alela 447b). V námi sledované populaci se vyskytovala pouze
varianta o velikosti 168 bp; výsledek zobrazují následující elektroforeogramy. Tabulka č. 6
v kapitole 5.4 nastiňuje výčet všech nalezených genotypů u námi sledované populace border
kolií.
Obrázek 19: Výstupy programu Gene Mapper 4.1 při odlišení alel 447a a 447b, zobrazující fragment velikosti
168 bp, jedná se tedy o vzorky obsahující pouze alelu 447a.
55
5.3
Výsledky sekvenační analýzy nalezených alel
Abychom mohli ověřit skutečnou totoţnost nalezených alel a porovnat s dosavadními
pracemi na toto téma (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004), přistoupili jsme k sekvenování alel
odpovídajících svými velikostmi na základě výsledků fragmentační analýzy alelám 435, 447a
a 498 (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004). Důleţitým bodem bylo především potvrzení
identifikace alely 447a od alely 447b. Námi provedená sekvenační analýza alel 435,
447a a 498 potvrdila jiţ publikované výsledky v práci Ito et al. (2004) uvedeným v kapitole
3.4.1.
5.3.1 Srovnání sekvence PCR produktů námi identifikovaných alel
V rámci námi sledované populaci border kolií bylo osekvenováno 13 vzorků
obsahujících alelu 435 ve třech různých genotypech, devět vzorků obsahujících alelu 447a,
také ve třech různých genotypech a osm vzorků obsahujících alelu 498 rovněţ ve třech
různých genotypech. Přehled osekvenovaných vzorků a jejich genotypů zobrazuje tabulka č. 3
v kapitole 4.4.1. Srovnání sekvencí s dříve publikovanými bylo provedeno programem NCBI
Blast. Porovnání námi zjištěné sekvence alely 447a a publikované sekvence alely 447b (Ito et
al., 2004) bylo provedeno v programu CLC Main Workbench 6.0.1. Alela 447a nalezená
v našem souboru border kolií skutečně odpovídá sekvencí alele 447a publikovené Ito et al.
(2004). Grafické znázornění tohoto srovnání a námi zjištěné sekvence alel 435, 447a a 498
ukazuje následující obrázek.
56
Obrázek 20: Námi zjištěné sekvence alel 435, 447a, 498 a srovnání námi zjištěné sekvence alely 447a proti publikované (Ito et al., 2004) sekvenci alely 447b – 1. část
57
Obrázek 20: Námi zjištěné sekvence alel 435, 447a, 498 a srovnání námi zjištěné sekvence alely 447a proti publikované (Ito et al., 2004) sekvenci alely 447b – 2. část
58
5.3.2 Vyhodnocení aminokyselinové sekvence produktů genu DRD4
Programem CLC Main Workbench 6.0.1 byla stanovena sekvence aminokyselin části proteinu kódovaném zjištěnými alelami genu
DRD4. Sekvence proteinů jednotlivých alel byly porovnány s publikovanými výsledky. Zároveň bylo graficky znázorněno porovnání produktu
alely 447a a 447b (Obrázek č. 21). Aminokyselinová sekvence zjištěných alel 435, 447a, 498 se shoduje s dříve publikovanými výsledky (Ito et
al., 2004).
Obrázek 21: Aminokyselinová sekvence námi zjištěných alel 435, 447a, 498 a dále porovnání alely 447a s publikovanou sekvencí alely 447b (Ito et al., 2004)
Aminokyseliny jsou popsány písmenkovým zápisem:
Glycin Gly (G), Alanin Ala (A), Valin Val (V), Leucin Leu (L), Isoleucin Ile (I), Kyselina asparagová Asp (D), Asparagin Asn (N), Kyselina glutamová Glu (E), Glutamin
Gln (Q), Arginin Arg (R), Lysin Lys (K), Histidin His (H), Fenylalanin Phe (F), Serin Ser (S), Threonin Thr (T), Tyrozin Tyr (Y), Tryptofan Trp (W), Methionin Met (M),
Cystein Cys (C), Prolin Pro (P)
59
Pomocí programu CLC Main Workbench 6.0.1 byla rovněţ provedena biochemická
analýza aminokyselinové sekvence části proteinu kódovaném exonem 3 genu DRD4. U alely
435 je velikost této sekvence 7 369,551 Da, její izoelektrický bod je 3,41 a alifatický index
3,718. U alely 447a je velikost této sekvence 7 763,886 Da, její izoelektrický bod je 3,38
a alifatický index 3,537. U alely 447b (Ito et al., 2004) je velikost této sekvence 7 769,935
Da, její izoelektrický bod je 3,38 a alifatický index 3,537. U alely 498 je velikost této
sekvence 9 302,456 Da, její izoelektrický bod je 3,3 a alifatický index 2,929.
Dále byla spočítána distribuce aminokyselin v části proteinu kódovaném dotyčnými
alelami a porovnána s frekvencí těchto aminokyselin v proteinech savců. Výsledky ukazuje
následující tabulka.
Tabulka 5: Distribuce aminokyselin v části proteinu kódovaném alelami 435, 447a, 447b a 498 a frekvence
těchto aminokyselin v genomu savců
alela
aminokyselina
Alanine (A)
Cysteine (C)
Aspartic Acid (D)
Glutamic Acid (E)
Phenylalanine (F)
Glycine (G)
Histidine (H)
Isoleucine (I)
Lysine (K)
Leucine (L)
Methionine (M)
Asparagine (N)
Proline (P)
Glutamine (Q)
Arginine (R)
Serine (S)
Threonine (T)
Valine (V)
Tryptophan (W)
Tyrosine (Y)
435
Frekvence
447a
Frekvence
447b
Frekvence
498
Frekvence
Frekv. u
savců
0,000
0,000
0,167
0,013
0,000
0,167
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,013
0,449
0,000
0,013
0,090
0,077
0,013
0,000
0,000
0,000
0,000
0,171
0,012
0,000
0,159
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,012
0,415
0,000
0,012
0,110
0,098
0,012
0,000
0,000
0,000
0,000
0,171
0,012
0,000
0,159
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,012
0,439
0,000
0,012
0,098
0,085
0,012
0,000
0,000
0,000
0,000
0,172
0,010
0,000
0,172
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,010
0,424
0,000
0,010
0,101
0,091
0,010
0,000
0,000
0,070
0,023
0,048
0,067
0,039
0,067
0,025
0,047
0,056
0,100
0,023
0,037
0,060
0,045
0,054
0,079
0,054
0,062
0,013
0,029
60
5.4
Výsledky statistického zpracování hodnot získaných z dotazníků
Pro vyhodnocení vlivu jednotlivých alel markeru exonu 3 genu DRD4 na chování
dotyčných psů bylo nutné zpracovat dotazník zmíněný v kapitole Materiál a metody, který je
přílohou č. 3 této práce. Z celkového počtu 100 odebraných vzorků bylo získáno 97
vyplněných dotazníků. Kvalitní DNA se podařilo extrahovat z 92 vzorků, ke kterým se
podařilo získat 89 vyplněných dotazníků. Přehled výsledných skóre ADHD dotazníků
a zjištěných genotypů zobrazuje tabulka 6, kde jsou údaje seřazeny podle nalezeného
genotypu. Seznam psů, kteří se zúčastnili této studie je uveden abecedně v kapitole 4. Část
majitelů si přála uvést výsledné skóre pouze anonymně, z těchto důvodů budou v následující
tabulce uvedeni jednotliví psi pod anonymními kódy.
Tabulka 6: Přehled analyzovaných genotypů a výsledných skóre ADHD dotazníků
Kód psa
BOC01
BOC02
BOC03
BOC04
BOC05
BOC06
BOC07
BOC08
BOC09
BOC10
BOC11
BOC12
BOC13
BOC14
BOC15
BOC16
BOC17
BOC18
BOC19
BOC20
BOC21
BOC22
BOC23
BOC24
BOC25
BOC26
BOC27
GENOTYP
exon 3 genu DRD4
Skóre pro
AKTIVITUIMPULZIVITU
435/435
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/447a
435/498
435/498
435/498
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
Skóre pro
NEPOZORNOST
8
4
6
7
7
11
11
11
13
14
4
9
12
2
2
3
4
5
5
5
5
5
5
6
6
6
6
61
8
0
2
3
5
2
3
9
9
7
3
6
7
1
3
4
2
0
0
1
1
2
4
1
1
1
2
BOC28
BOC29
BOC30
BOC31
BOC32
BOC33
BOC34
BOC35
BOC36
BOC37
BOC38
BOC39
BOC40
BOC41
BOC42
BOC43
BOC44
BOC45
BOC46
BOC47
BOC48
BOC49
BOC50
BOC51
BOC52
BOC53
BOC54
BOC55
BOC56
BOC57
BOC58
BOC59
BOC60
BOC61
BOC62
BOC63
BOC64
BOC65
BOC66
BOC67
BOC68
BOC69
BOC70
BOC71
BOC72
BOC73
BOC74
BOC75
BOC76
BOC77
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/447a
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
447a/498
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
10
11
11
12
12
12
13
13
13
15
19
X
0
2
2
3
4
5
6
7
7
7
7
7
8
8
62
3
3
6
6
7
9
0
1
3
3
3
4
5
0
1
1
3
6
6
7
10
4
6
6
2
7
8
2
6
7
4
4
6
8
7
X
0
2
5
1
2
9
7
3
4
4
4
7
1
1
BOC78
BOC79
BOC80
BOC81
BOC82
BOC83
BOC84
BOC85
BOC86
BOC87
BOC88
BOC89
BOC90
BOC91
BOC92
447a/498
8
447a/498
8
447a/498
9
447a/498
9
447a/498
9
447a/498
11
447a/498
12
447a/498
12
447a/498
13
447a/498
17
447a/498
20
447a/498
X
447a/498
X
498/498
6
498/498
8
X = u daného jedince se nepodařilo získat vyplněný dotazník
2
3
3
6
11
4
3
13
3
11
18
X
X
7
6
V rámci všech hodnocených vzorků border kolií byly detekovány celkem 3 alely, a to
435, 447a a 498. Alely byly nalezeny jak v homozygotních sestavách 435/435 (n=1),
447a/447a (n=50), 498/498 (n=2), tak v heterozygotních sestavách 435/447a (n=9), 435/498
(n=3) a 447a/498 (n=27). Celkem bylo tedy zjištěno šest různých genotypů:
 435/435
 435/447a
 435/498
 447a/447a
 447a/498
 498/498.
Terminologie označování alel podle jejich velikosti je převzata z práce Ito et al. (2004)
a na základě výsledků sekvenační analýzy doplněna o alelu 435. Získaná data byla
zpracována programem Cervus 3.0.3 (Kalinowski, 2007). Výsledky hodnocení jsou
prezentovány v tabulce 7. Pozorovaná heterozygotnost odpovídá očekávané heterozygotnosti,
která by nastala při platnosti Hardy-Weinbergova zákona.
Tabulka 7: Relativní frekvence alel a heterozygotnost markeru exonu 3 genu DRD4 u sledovaných jedinců
plemene border kolie
n
89
435
Frekvence alel
447a
498
HE
0.0787
0.7416
0.1798
0.4139
n = počet genotypovaných jedinců
HO
0.4157
HE = očekáváná heterozygotnost, HO = pozorovaná heterozygotnost
63
5.4.1 Hodnocení ADHD dotazníku
Ke statistickému zpracování se podařilo získat 89 vyplněných dotazníků (96,7 %)
z celkového počtu 92 moţných, coţ je počet psů, u kterých jsme zjistili genotyp. Skóre pro
aktivitu-impulzivitu a nepozornost bylo vypočítáno u 52 fen a 37 psů. Všichni sledovaní psi
ţijí v domácnosti svých majitelů. Tabulka číslo 8 charakterizuje výsledná skóre obou
pozorovaných vlastností.
Tabulka 8: Parametry výsledných skóre pro aktivitu-impulzivitu a nepozornost získané pomocí ADHD
dotazníku
Parametr Skóre pro aktivitu-impulzivitu Skóre pro nepozornost
xmin
0
0
xmax
20
18
X
8,0225
4,3933
s
3,6431
3,2705
Vk [%]
45,4113
74,4425
xmin = nejniţší získané skóre, xmax = nejvyšší získané skóre, X = aritmetický průměr,
s = směrodatná odchylka, Vk = variační koeficient
5.4.2 Výsledky parametrického t-testu
Během řešení diplomové práce byla provedena analýza výsledných skóre pro aktivituimpulzivitu a pro nepozornost pomocí dvouvýběrového t-testu, který pouţili také Hejjas et al.
(2007b). Analyzované byly všechny skupiny psů uvedené v tabulce 4 v kapitole 4.6.2 bez
ohledu na počet jedinců v testované skupině. Výsledky analýzy zobrazuje tabulkový přehel
uvedený v příloze 5 této práce.
V diskusi budou diskutována pouze šetření s reprezentativním počtem jedinců ve
skupinách, a to skupiny s více neţ deseti jedinci. Výsledky testování byly taktéţ zobrazeny
graficky. Zde uvádíme krabicové grafy prvních osmi statistických testování, které vykazovaly
největší rozdíly v průměrném skóre pro aktivitu-impulzivitu a nepozornost.
64
Graf 6: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro aktivitu-impulzivitu – 1.část
65
Graf 7: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro aktivitu-impulzivitu – 2.část
66
Graf 8: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro nepozornost – 1.část
67
Graf 9: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro nepozornost – 2.část
68
6 DISKUZE
6.1
Soubor hodnocených jedinců
Dostatečný počet jedinců ve sledovaném souboru je zásadní pro správné statistické
hodnocení vlivu polymorfismu genu na sledované povahové rysy. V případě psů plemene
border kolie jsem se většinou setkávala s ochotou majitele poskytnout vzorek svého psa pro
tuto práci, s velkým zájmem o téma moţného vlivu genů na povahu jedince a o výsledky
svého psa. Nicméně i tak bylo potřeba majitelům vše několikrát vysvětlovat z důvodu jejich
obav o zneuţití vzorku. Další obavou bylo veřejné prezentování výsledků a strach z poškození
dobrého jména chovatelské stanice. Tomu jsme předešli prezentací výsledků anonymní
formou.
V prvotních studiích zaměřených na téma polymorfismu exonu 3 genu DRD4 u psů
bylo genotypováno 34 psů (19 zlatých retrívrů, 15 shiba inu) (Niimi et al., 1999).
V následujícíh pracech se čísla souborů zvyšovala. Niimi et al. (2001) genotypovali 102 psů,
z toho 38 bíglů, 40 šeltií, 11 zlatých retrívrů a 13 shiba inu. Ito et al. (2004) analyzovali
vzorky 1535 jedinců 23 různých plemen, z čehoţ největší četnost zastoupení mělo plemeno
shiba inu (192 jedinců), zlatý retrívr (174 jedinců), bígl (142 jedinců), labradorský retrívr (134
jedinců a maltézský psík (126 jedinců). Hejjas et al. (2007a) sledovali variabilitu genu DRD4
u 497 jedinců čtyř plemen psů (belgický ovčák tervueren, malinois, groenandael a německý
ovčák) a 22 zástupců vlka evropského (Canis lupus). První studie zaměřená na hledání vztahu
mezi polymorfismem genu dopaminového receptoru DRD4 a povahovými vlastnostmi psů
pracovala s 241 jedinci plemene německý ovčák, ke kterým bylo získáno 189 vyplněných
dotazníků podle Vas et al. (2007). Čtyřicetšest procent těchto oklasifikovaných německých
ovčáků patřilo policejním psovodům.
Variabilita sledovaného markeru nebyla dosud u plemene border kolie hodnocena. Při
řešení této práce se podařilo získat vzorky celkem 100 jedinců plemene border kolie,
narozených v České republice nebo v Nizozemí, a to především při příleţitosti soutěţí agility,
flyballu nebo klubové výstavy. Kvalitní DNA se podařilo extrahovat z 92 vzorků.
Pro hodnocení vztahu mezi polymorfismem exonu 3 genu DRD4 a psychickými
vlastnostmi psů bylo potřeba získat majitelem vyplněný ADHD dotazník validovaný pro psy
(Vas et al., 2007), coţ se podařilo u 97 jedinců ze sta. Do naší studie bylo zapojeno 92 psů, ke
69
kterým bylo získáno 89 dotazníků (96,7 %). Hejjas et al. (2007b) měli k dispozici tato data o
189 německých ovčácích z celkového počtu 241 (78 %).
6.2
Izolace DNA
Vzorky byly odebrány metodou stěru buněk z bukální sliznice psů pomocí sterilního
cytologického kartáčku. Tato metoda byla vybrána z několika důvodů. Odběr nevyţaduje
asistenci veterinárního lékaře, je zcela neinvazivní, je časově nenáročný, odběr lze provádět
kdekoli v terénu a k odběru je nutné jen minimální vybavení. Nicméně tento způsob odběru
vyţaduje výbornou socializaci zvířete, dobrou ovladatelnost a krotkost. Psi plemene border
kolie toto vše splňují; standard plemene border kolie vyţaduje výbornou ovladatelnost,
poslušnost a striktně zakazuje agresi. Naprostá většina zvířat snášela stěr bez problémů, často
nebyla nutná další asistence. Stěry vzorků byly prováděny na závodech agility, na klubové
výstavě, na závodech ve flyballu, po dohodě s majiteli u nich doma nebo na smluveném
místě. Podmínkou bylo zamezit zvířeti alespoň půl hodiny před odběrem přijímat potravu, aby
nedošlo ke kontaminaci vzorku.
Jinou vhodnou metodou, která by připadala v úvahu, je izolace DNA z chlupových
cibulek. Odběr chlupů by měl být teoreticky jednodušší zejména u méně krotkých zířat. Tuto
metodu jsme nezvolili vzhledem k malé výtěţnosti získané DNA oproti stěru buněk bukální
sliznice.
Největší výtěţnosti se dosahuje při izolaci DNA ze vzorků krve. Odběr však smí
provádět pouze veterinární lékař a jde o invazivní metodu, která čato psa stresuje a je malá
pravděpodobnost, ţe by majitel s odběrem krve pro nekomerční účel souhlasil. V úvahu by
přicházelo vyuţít část krve původně odebrané k léčebně-diagnostickým účelům. Další
moţností získání vzorku krve u border kolií je vyuţít hromadných odběrů vzorků krve při
bonitacích nebo jiných příleţitostech, které jsou zasílány komerčním společnostem
k diagnostice markerů genu pro onemocnění CEA, CL.
Hejjas et al. (2007b) izolovali DNA pouze z buněk bukální sliznice získaných stěrem
pomocí cytologického kartáčku. Ito et al. (2004) a Niimi et al. (2004) vyuţili vzorky jak
buněk bukální sliznice, tak i vzorky krve, Niimi et al. (1999) pouţívali metodu krevního
odběru. Oberbauer et al. (2003) ověřovali moţnost vyuţití odstřiţených kusů drápů a zjistili,
ţe poskytují mnoţství DNA dostatečné pro tisíce PCR reakcí a navíc se původní tkáň snadno
skladuje.
70
Pro vlastní izolaci genomické DNA byl pouţit kit NucleoSpin® Tissue XS
(Macherey-Nagel, SRN) s postupem doporučeným výrobcem. Tato metoda je poměrně rychlá
a DNA získaná tímto způsobem byla pouţitelná pro následující PCR analýzy a vykazovala
výborné parametry kvality i kvantity. Navíc zaručuje na rozdíl od tradiční fenolchloroformové purifikační metody sterilitu a stabilní sloţení pouţitých roztoků.
Ito et al. (2004) a Niimi et al. (1999, 2004) pouţili kit QIAamp (Quiagen, USA).
Hejjas et al. (2007b) izolovali DNA pomocí kitu Gentra DNA Purification kit.
Z počtu 100 vzorků se podařilo extrahovat DNA v dostatečném mnoţství a kvalitě
z 92 vzorků. Důvodem byla špatná kvalita některých vzorků způsobená pravděpodobně
přepravou vzorků od majitele dopravní společností, nevhodně naplánovaná na konci
pracovního týdne, takţe vzorky byly před laboratorním zpracováním skladovány dva dny při
pokojové teplotě. Tento problém se týkal sedmi dotyčných vzorků. U osmého vzorku
pravděpodobně došlo k získání malého počtu buněk při stěru bukální sliznice. Psi nezařazení
do studie z tohoto důvodu jsou přehledně uvedeni v kapitole 4.2.
6.3
Detekce alel exonu 3 genu DRD4
K detekci alel byla pouţita kapilární gelová elektroforéza přístrojem ABI PRISM 310®
(Applied Biosystems). Niimi et al. (1999, 2001) pouţili k detekci alel separaci na agarózovém
gelu a následně sekvenaci PCR produktů přístrojem 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer,
Applied Biosystems Division, USA). Ito et al. (2004) vzorky také sekvenovali, a to přístrojem
ABI3100 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division , USA). Hejjas et al.
(2007a; 2007b) pouţili k detekci alel separaci elektroforézou na agarózovém gelu a
vizualizaci ethidium bromidem. Z pohledu přesnosti detekce alel se zdá být rozhodně nejlepší
kombinace separace fragmentů na gelu a jejich sekvenace, kterou vyuţili Ito et al. (2004)
a Niimi et al. (1999, 2001). Detekce alel zaloţená pouze na separaci na agarózovém gelu
můţe být nedostačující při odlišení alel 447a a 447b.
Z osmi známých alel exonu 3 genu DRD4 se u border kolií podařilo fragmentační
analýzou detekovat celkem tři alely, a to alely 435, 447a a 498. Ito et al.(2004) pozorovali u
kaţdého z 23 hodnocených plemen výskyt dvou aţ sedmi alel, u ţádného ale nebylo přítomno
všech osm. Nejvíce různých alel bylo přítomno u plemene shiba, maltézský psík a velškorgi, a
to sedm (Ito et al., 2004). Japonské plemeno shiba je známé svojí vysokou genetickou
diverzitou (Niimi et al., 2001). Nejméně různých alel bylo nalezeno u papillonů, a to dvě (Ito
71
et al., 2004). Z pohledu počtu alel se zdá být variabilita tohoto lokusu u border kolií
průměrná.
Pozorovaná heterozygotnost (0,4157) byla téměř totoţná s očekávanou hodnotou
(0,4139), která by nastala při platnosti Hardy-Weinbergova zákona. V práci Ito et al. (2004),
která se zabývá rozdíly v distribuci alel exonu 3 genu DRD4 u 23 plemen psů, se hodnoty
očekávané heterozygotnosti pohybovaly od 0,149 do 0,745. Výsledek téměř ideální
heterozygotnosti je nejpravděpodobněji výsledkem šlechtění border kolií na základě
pracovních schopností v pasení ovcí, kdy jsou dodnes do chovu zařazováni i jedinci bez
průkazu původu, kteří prokáţou výjimečné pracovní schopnosti (The International Sheep Dog
Society, 2007). Ve srovnání s hodnotami zjištěnými u border kolií uvádíme hodnoty zjištěné
v práci Jeţková (2010), kdy pozorovaná heterozygotnost (0,4495) alel exonu 3 genu DRD4
byla niţší neţ očekávaná hodnota (0,4675). Jedním z příčin tohoto výsledku můţe být
tzv. bottleneck efekt (efekt hrdla láhve), při kterém dochází k silnému poklesu genetické
proměnlivosti v důsledku dramatického sníţení velikosti populace k němuţ u plemene
bearded kolie došlo po druhé světové válce.
V rámci všech hodnocených vzorků DNA border kolií byly detekovány celkem tři
alely, 435, 447a, 498. Nejvyšší frekvenci výskytu vykazovala alela 447a (0,7416),
následována alelou 498 (0,1798) a v minoritním zastoupení byla alela 435 (0.0787). Ito et
al. (2004) přisuzují plemenům s vysokou frekvencí alel 435 a 447a okcidentální původ.
Orientální plemena mají podle něj vyšší zastoupení alel 447b, 498 a 549. Všeobecně se
předpokládá, ţe významným střediskem domestikace ovcí byla Střední Asie, je tedy moţné,
ţe psi doprovázející starověké pastevecké kmeny během migrace na západ se tak mohli dostat
aţ do Velké Británie a dát původ i border koliím určeným pro práci s ovcemi.
Vzhledem k tomu, ţe neexistují záznamy o tom, ţe by border kolie pocházely určitým
kříţením orientálních plemen psů, můţeme vyšší výskyt alely 498 přisuzovat i způsobu chovu
border kolií. Po staletí byly do chovu připouštěni psi na základě pracovních schopností
a nikoli na základě původu nebo vzhledu, proto je moţné původ alel hledat i v jiném plemeni
psů jako jsou kolie, bearded kolie a další ovčácká plemena. Nejpodobnější výskyt a frekvenci
alel jako jsme nalezli u border kolií zjistil Ito et al. (2004) u plemene šeltie, které vzniklo také
ve Velké Británii. Bearded kolie, které mnoho staletí sháněly dobytek na stejném území jako
border kolie, měly podle práce Jeţková (2010) nejčastěji zastoupeny alely 447a (0,7110)
a 435 (0.1376). Alela 498 byla zastoupena frekvencí 0,0688.
Důvodem výskytu právě takového zastoupení alel genu pro dopaminový receptor D4
u border kolií by mohl být jejich částečný vliv na povahové vlastnosti psů, schopnost učit se
72
nové věci a tím těmto psům dávat jistou selektivní výhodu. V praxi se tato výhoda mohla
projevit tak, ţe byli do chovu pouţívání psi, kteří byly bystřejší, vnímavější, ovladatelnější
a kteří pracovali s větší chutí po mnoho hodin. V této práci jsme získali vzorky převáţně od
psů, kteří se nevěnují práci na farmě, ale jsou chováni jako mazlíčci a jejich vrozená touha po
činnosti je směrována na psí sporty. V této oblasti chovu border kolií nejsou psi selektováni
na základě pracovních vlastností. I v dnešní době ale fungují ve velké míře chovy border kolií
pro pracovní uplatnění na farmách s ovcemi. Zde jsou psi, kteří nepracují, špatně se učí, kteří
nemilují pracovní kontakt s člověkem, okamţitě prodáni jako mazlíčci. Bylo by velice
zajímavé provést podobnou studii v dostatečně velkých populacích border kolií, a to jak
úspěšně pracujících, které se osvědčily a byly tedy zařazeny do chovu, tak těch, kteří byli pro
povahové vlastnosti vyřazeny.
Ito et al. (2004) dále uvádějí, ţe skupina s vyšší četností alel 447b, 498 a 549
dosahovala vyššího průměrného skóre pro agresivitu a niţšího skóre pro reaktivitu neţ
skupina s vysokou frekvencí alel 435 a 447a. V tomto případě lze s autorem souhlasit, protoţe
podle plemenného standardu mají být border kolie výborně ovladatelné, ţivé, pozorné,
poslušné a inteligentní. Nesmí být ani nervózní ani agresivní. Ţádný z hodnocených psů navíc
neprojevil při odběru vzorků bukální sliznice sebemenší náznak agresivity.
6.4
Sekvenační analýza alel 435, 447a, 498 exonu 3 genu DRD4
K sekvenaci PCR produktů jsme přistoupili z důvodu přesného ověření totoţnosti
nalezených alel vzhledem k publikovaným sekvencím (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004).
Zvláště nás zajímalo stoprocentní odlišení alel 447a a 447b a sekvence alely 435. Grafickým
srovnáním byla zjištěna shoda s dříve publikovanými výsledky, proto lze s jistotou
konstatovat, ţe se u námi sledované populace border kolií vyskytly tři alely, a to 435, 447a,
498. Označení alel na základě jejich velikosti je převzato z práce Ito et al. (2004).
6.5
Aminokyselinová sekvence exonu 3 genu DRD4
Pro dodatečné ověření výsledků fragmentační analýzy jsme programem CLC Main
Workbench 6.0.1 stanovili sekvenci aminokyselin části proteinu kódovaném zjištěnými
alelami exonu 3 genu DRD4. Sekvence je zobrazena v kapitole 5.3.2 a odpovídá výsledkům
práce Ito et al. (2004). Frekvence výskytu jednotlivých aminokyselin v alelách byla
srovnávána s frekvencí aminokyselin v proteinech savců. Frekvence se lišily z důvodu malé
73
velikosti srovnávaného kódovacího úseku genu (78 aţ 99 bp exonu 3 genu DRD4) oproti
průměrným velikostem kódujících úseků pro všechny doposud známé proteiny savců.
6.6
Statistické zpracování dotazníků
Pro posouzení povahových vlastností border kolií byl pouţit ADHD dotazník
upravený a validovaný pro majitele psů (Vas et al., 2007), který byl pro stejný účel pouţit
i v pracích Hejjas et al. (2007a) a Hejjas et al. (2007b). Průměrné skóre pro aktivituimpulzivitu dosahovalo hodnoty 8,022 a průměr skóre pro nepozornost byl 4,393. Hejjas et al.
(2007b) uvádí průměrné skóre pro aktivitu-impulzivitu u německých ovčáků 7,9±0,4, přičemţ
skóre policejních psů bylo o něco vyšší neţ u psů mazlíčků. Průměrné skóre pro nepozornost
uvádějí 4,7±0,3. V tomto ohledu můţeme konstatovat, ţe se hodnoty u border kolií výrazně
nelišily, spíše odpovídaly skóre policejních německých ovčáků uvedených v práci Hejjas et
al. (2007b). V práci zaměřené na stejné téma u plemene bearded kolie byly výsledky
průměrného skóre pro aktivitu-impulzivitu 6,908 a průměrné skóre pro nepozornost 4,678
(Jeţková, 2010). Ve srovnání s bearded koliemi vykazují border kolie vyšší stupeň aktivityimpulzivity a menší stupeň nepozornosti. Nicméně je nutné dodat, ţe v práci Jeţková (2010)
bylo získáno 65 dotazníků oproti 89 dotazníkům v této práci.
Odpovědi dotazníku jsou také ovlivněny vztahem majitele a jeho psa a jejich čas
strávený při posuzovaných činnostech. Jinak bude svého psa znát majitel výstavního plemene
a jinak majitel, který se psem kaţdý den aktivně pracuje nebo cvičí. V tomto ohledu jsou
majitelé border kolií výjimeční a vhodní pro naše studie, neboť border kolie vyţadují neustálé
zaměstnání a s tímto faktem si plemeno border kolie vybírají lidé aktivní, zvídaví, otevření
všem novým činnostem. Hejjas et al. (2007b) rozdělili hodnocené německé ovčáky na dvě
skupiny na základě vlivu podmínek prostředí chovu na psy policejní a psy mazlíčky. V tomto
ohledu nebylo nutné border kolie dělit na dvě skupiny, neboť všechny ţijí v domácnostech
svých majitelů a byly odchovávané za podobných podmínek.
Hejjas et al. (2007b) zaznamenali významně vyšší skóre pro aktivitu-impulzivity
u policejních německých ovčáků, kteří měli alespoň jednu alelu 447a. Tento rozdíl nebyl u
psů zařazených do skupiny „mazlíčků“ pozorován, coţ si vysvětlují působením různorodých
vnějších podmínek prostředí, jako je například přístup majitele, kvalita výcviku a podobně.
U policejních psů jsou často podmínky odchovu i výcviku jednotné. V následující studii
provedené na belgických ovčácích se však vliv genotypu na výsledné skóre pro aktivituimpulzivitu ani nepozornost neprokázali (Hejjas et al., 2007a).
74
Porovnání výsledných skóre aktivity-impulzivity u border kolií
Z kapitoly Výsledky 5.4.2 a tabulkového přehledu v příloze 5 je patrné, ţe nebyly na
hladině významnosti α=0,05 pozorovány významné rozdíly mezi testovanými skupinami psů.
Tento výsledek bylo moţné předpokládat, protoţe povahové vlastnosti psů je poměrně
obtíţné jednoznačně charakterizovat bodovým skóre stanoveným na základě dotazníku
a současně je nutné si uvědomit, ţe výsledné chování kaţdého jedince nebude ovlivněno
pouze mutací jediného genu. Hejjas et al. (2007b) sice prokázali statisticky průkazný vliv
detekovaného genotypu na výsledné hodnoty dotazníkového šetření. Jejich práce je však
jediná tohoto druhu, která statistickou průkaznost potvrdila. V diskuzi diplomové práce se
nyní zaměřím na hodnocení rozdílů u takových skupin psů, kde minimální počet jedinců
v porovnávané skupině byl deset. Důvody toho, ţe se v diskuzi nebudu zmiňovat
o málopočetných skupinách jsou uvedeny jiţ v kapitole Výsledky.
Největší rozdíl v bodovém skóre pro aktivitu-impulzivitu byl získán u testování 5, ve
kterém byly porovnáváni všichni jedinci s alespoň jednou alelou 435 vůči všem ostatním
genotypům bez ohledu na jejich pohlaví. Skupina zvířat s alespoň jednou alelou 435 vykázala
průměrnou hodnotu aktivity-impulzivity 9,000, naopak zbývající genotypy měly průměrnou
hodnotu 7,886 (příloha 5). Pravděpodobnost shody těchto dvou průměrů dosáhla hodnoty
p=0,298. Hejjas et al. (2007b) pro hodnocení efektu alel vytvořili částečně odlišné skupiny.
Do skupiny jedinců s alelou 435 zařadil pouze homozygoty 435/435, které porovnával
s genotypy 435/447a a 447a/447a. V diplomové práci jsem takovéto roztřídění nemohla
provést, protoţe alelickou kombinaci 435/435 u hodnocených border kolií měl pouze jeden
jedinec. Při porovnání mnou získaných výsledků se nepotvrdilo, ţe jedinci s alelou 435
vykazují niţší průměrnou hodnotu skóre pro aktivitu-impulzivitu oproti ostatním genotypům.
V hodnocené populaci border kolií byla rovněţ detekována alela 498 (tabulka 6).
Hejjas et al. (2007b) tuto alelu u souboru německých ovčáků nezjistili. Ze statistického
testování číslo 22, ve kterém byli porovnáváni všichni psi (samci) s alespoň jednou alelou 498
oproti všem psům s genotypem 447a/447a, byly zjištěny relativně vyšší rozdíly na úrovni
aktivity-impulzivity.
Pravděpodobnost
shody
průměrných
hodnot
skóre
u
těchto
porovnávaných skupin dosahovala hodnot p=0,372 (příloha 5). Skupina psů s homozygotní
sestavou 447a/447a vykazovala vyšší průměrnou hodnotu aktivity-impulzivity oproti psům
s alespoň jednou alelou 498. Hejjas et al. (2007b) ve své práci zdůrazňují, ţe jedinci s alespoň
jednou alelou 447a, kteří plní funkci u policie, vykazují vyšší hodnoty aktivity-impulzivity.
Naopak Ito et al. (2004) předpokládají, ţe alela 498, která je charakteristická zejména pro
75
některá primitivní asijská plemena psů, můţe mít souvislost s vyšší agresivitou. V diplomové
práci jsem prokázala, ţe alela 498 není typická pouze pro asijská plemena. Problematiku
výskytu alely 498, která u psů způsobila mírné sníţení skóre pro aktivitu-impulzivitu, jsem jiţ
diskutovala v předcházející části kapitoly. Pokud bylo provedeno porovnání bodových skóre
aktivity-impulzivity všech jedinců bez ohledu na pohlaví s alespoň jednou alelou 498 oproti
zbývajícím genotypům, byly naopak zjištěny minimální diference získaných skóre.
Pravděpodobnost shody dosahovala hodnot p=0,967. Tento výsledek svědčí tomu, ţe alela
498, kterou Ito et al. (2004) povaţují za zodpovědnou pro agresivní chování psů, nebude hrát
významnou roli při stupni aktivity-impulzivity.
Další vyšší rozdíly v hodnotách průměrné aktivity-impulzivity byly zjištěny při
porovnávání heterozygotních a homozygotních sestav genu DRD4. Tento způsob statistického
vyhodnocení nepouţili ani Hejjas et al. (2007a, 2007b). Ze statistického testování 24 bylo
zjištěno, ţe při porovnávání jakýchkoli homozygotních fen vůči všem heterozygotním fenám
je pravděpodobnost shody p=0,339. Průměrná hodnota skóre aktivity-impulzivity
u homozygotních fen byla niţší ve srovnání s heterozygotními fenami. Přestoţe na základě
hodnocení homozygotnosti jednoho genu nelze usuzovat na inbreední původ těchto zvířat, je
však moţné tvrdit, ţe homozygotní jedinci se vyštěpí na základě kříţení geneticky příbuzných
jedinců z hlediska alel pro dopaminový receptor DRD4. Tento závěr potvrzuje i statistické
testování 25, kde byli porovnáváni homozygotní psi (samci) s heterozygotními psy (samci).
U opačného pohlaví byl zjištěn zcela opačný výsledek. Homozygotní jedinci vykazovali
nepatrně vyšší průměrnou hodnotu skóre pro aktivitu-impulzivitu.
Tento výsledek u samců je zřejmě ovlivněn i efektem pohlaví při porovnávání
bodových skóre aktivity-impulzivity (testování číslo 9, příloha 5). Pravděpodobnost shody
mezi průměrnými hodnotami skóre pro aktivity-impulzivitu všech psů (samců) a fen bez
ohledu na jejich genotyp sice nebyla statisticky průkazná, ale dosáhla hodnoty p=0,384. Tato
pravděpodobnost shody je pátá nejniţší v rámci všech reprezentativních statistických
testování (příloha 5). Psi (samci) získali průměrnou hodnotu bodového skóre pro aktivituimpulzivitu 8,308 a feny 7,622. Přestoţe tyto výsledky nejsou statisticky průkazné na hladině
významnosti α=0,05, je moţné vyvodit hypotézu, ţe mírné zvýšení aktivity-impulzivity
u samců můţe být ovlivněno pohlavím, které způsobuje vyšší dráţdivost samců. Pokud se na
tuto hypotézu díváme z pohledu rozdílů mezi samci a samicemi s homozygotními sestavami
447a/447a, tak tento výsledek není moţné potvrdit. Důkazem je statistické testování číslo 26,
ve kterém průměrné hodnoty skóre pro aktivitu-impulzivitu se shodovaly mezi fenami a psy
s pravděpodobností p=0,939 (příloha 5). Z tohoto výsledku je moţné usuzovat na to, ţe
76
rozdíly v aktivitě-impulzivitě mezi psy a fenami zřejmě nebudou způsobeny přítomností alely
447a. Tomuto výsledku nasvědčuje i práce Hejjas et al. (2007b), kteří rovněţ u genotypů
447a/447a nezjistili statisticky průkazné rozdíly mezi psy a fenami.
Porovnání výsledných skóre nepozornosti u border kolií
Výrazně vyšší rozdíly oproti aktivitě-impulzivitě byly zjištěny při hodnocení
bodových skóre pro nepozornost. V rámci těchto statistických testování byla zjištěna pomocí
t-testu výrazně niţší pravděpodobnost shody porovnávaných genotypů. Tento výsledek je
moţné odůvodnit tím, ţe pro chovatele je mnohem snadnější posoudit stupeň nepozornosti
psa oproti stupni jeho aktivity-impulzivity.
Z přílohy 5 vyplývá, ţe u statistického testování číslo 21, kde byly porovnávány
všechny feny s alespoň jednou alelou 498 oproti homozygotním fenám 447a/447a, byly
zjištěny statisticky významné rozdíly na hladině významnosti α=0,05. Porovnávané průměry
se shodovaly pouze s pravděpodobností p=0,043. Přičemţ feny s alespoň jednou alelou 498
vykazovaly průměrné skóre pro nepozornost 5,316 a feny s genotypem 447a/447a pouze
3,16. Vzhledem k tomu, ţe Hejjas et al. (2007b) u hodnocených psů alelu 498 nezjistili, není
moţné tento výsledek s nimi diskutovat. Jediná práce, která přiřazuje k alele 498 určité
povahové vlastnosti, je studie Ito et al. (2004). Tito autoři se domnívají, ţe alela 498 je
charakteristická pro poměrně agresivní plemena psů. Příčiny výskytu této alely u plemene
border kolie jiţ byly diskutovány v předchozí části této kapitoly. Zajímavé je však zjištění
statistického testování číslo 22 (příloha 5), kde byly porovnávány stejné genotypy, ale u psůsamců. V tomto případě rozdíly nebyly statisticky průkazné a pravděpodobnost shody
dosahovala hodnoty p=0,653. Přestoţe tyto rozdíly nebyly statisticky průkazné, rovněţ
i samci s alespoň jednou alelou 498 vykazovali mírně vyšší hodnotu průměrného skóre pro
nepozornost (5,0) oproti samcům s genotypem 447a/447a (4,5).
Ze statistického testování 1 (příloha 5) vyplývá, ţe poměrně velké rozdíly mezi
průměrným skóre nepozornosti (p=0,065) byly zjištěny rovněţ mezi jedinci s genotypem
447a/447a a ostatními genotypy bez ohledu na pohlaví. Tento rozdíl nelze sice povaţovat za
statisticky významný na hladině významnosti α=0,05, ale z hlediska hodnocených dat se
jednalo o druhou nejvyšší zjištěnou diferenci. Homozygoti 447a/447a vykazovali niţší stupeň
skóre pro nepozornost oproti ostatním genotypům (příloha 5). Hejjas et al. (2007b) ve svých
analýzách zařadili do jedné skupiny všechny psy, kteří měli alespoň jednu alelu 447a. O této
alele se domnívali, ţe působí pozitivně na sniţování nepozornosti. Tento výsledek byl
77
v podstatě potvrzen i při řešení diplomové práce, přestoţe experimenty byly provedeny
s jiným plemenem psů.
V diplomové práci jsem se zaměřila rovněţ na hodnocení vlivu alelické kombinace
447a/447a u fen oproti ostatním fenám. Pro skóre nepozornosti tyto rozdíly sice nebyly
statisticky průkazné na hladině významnosti α=0,05, přesto získaná pravděpodobnost shody
p=0,068 odpovídala třetím nejvyšším rozdílům v rámci všech reprezentativních statistických
testování uvedených v příloze 5. I u fen bylo zjištěno výrazně niţší skóre pro nepozornost
(3,16) u genotypu 447a/447a oproti zbývajícím fenám (4,889). Tento výsledek je rovněţ
v souladu se závěry, které publikovali Hejjas et al. (2007b). Stejný typ analýzy (statistické
hodnocení 10, příloha 5) byl proveden rovněţ u psů samců. I v tomto případě samci
s genotypem 447a/447a měli niţší skóre pro nepozornost (4,5) oproti ostatním samcům
(5,538). Tyto rozdíly však vykazovaly menší diferenci, pravděpodobnost shody byla rovna
0,328. Z tohoto výsledku lze vyvodit hypotézu, ţe efekt alely 447a na schopnost se soustředit
při práci byl výrazně vyšší u fen neţ u psů. Rozdíl mezi fenami a psy však nelze zobecnit
z hlediska praxe chovatelů a cvičitelů border kolií, protoţe u tohoto specializovaného plemene
nebyly nikdy zjištěny rozdíly ve schopnosti se soustředit odvíjející se od příslušnosti
k pohlaví.
Ze statistických hodnocení uvedených v příloze 5 je rovněţ zřejmý vliv přítomnosti
alely 498 na stupeň hodnocené nepozornosti. Získané výsledky není moţné porovnat s jinými
autory, protoţe u psů jimi hodnocených se tato alela nevyskytovala. Ze statistického
hodnocení 8, ve kterém byla porovnávána nepozornost u zvířat s alespoň jednou alelou 498
a všech homozygotů s alelami 447a/447a, je patrné, ţe pravděpodobnost shody dosáhla pouze
hodnot p=0,069. Tento výsledek sice není statisticky průkazný na hladině významnosti
α=0,05, ale přesto lze konstatovat, ţe jedinci s alespoň jednou alelou 498 vykazovali výrazně
vyšší skóre pro nepozornost (5,2) oproti ostatním genotypům (3,816). Tento výsledek lze
porovnat pouze se závěry Ito et al. (2004), kteří předpokládají, ţe alela 498 je častější u psů
s vyšším stupněm agresivity. Absence agresivity u plemene border kolie jiţ byla popisována
a diskutována v předchozí části diplomové práce. Přesto je však moţné hledat souvislosti
mezi výskytem této alely, která je dle Ito et al. (2004) charakteristická pro asijská plemene
s malou schopností komunikace s člověkem, a mezi sníţenou pozorností border kolií
nesoucích tuto alelu oproti ostatním. Ze statistického hodnocení 15 (příloha 5), ve kterém
byly porovnávány z hlediska nepozornosti všechny feny s genotypem 447a/498 se všemi
homozygotními fenami 447a/447a rovněţ vyplývá, ţe přítomnost alely 498 zvyšovala skóre
pro nepozornost (5,267) oproti homozygotním fenám 447a/447a (3,16). Tento výsledek
78
odpovídá závěrům, které jsem diskutovala v předchozím odstavci. Pokud z pohledu tohoto
hodnocení byla provedena statistická analýza u psů (samců), která je prezentována testováním
14 v příloze 5, byly oproti fenám zjištěny výrazně menší diference mezi porovnávanými
skupinami. Pravděpodobnost shody průměrných skóre pro nepozornost u psů byla rovna
p=0,795. Tento výsledek můţe částečně podporovat jiţ vyřčenou teorii, ţe pozitivní efekt
alely 447a na schopnost border kolií udrţet pozornost, je výrazně vyšší u fen neţ u psů.
Tomuto závěru svědčí i výsledek statistického hodnocení 26, ve kterém bylo porovnáváno
průměrné skóre pro nepozornost mezi fenami s genotypem 447a/447a psy (samci)
s genotypem 447a/447a. Pravděpodobnost shody průměrných skóre dosáhla pouze hodnoty
p=0,078. Tento rozdíl není statisticky významný na hladině významnosti α=0,05, ale přesto je
moţné konstatovat, ţe průměrné skóre fen (3,16) bylo niţší oproti průměrnému skóre psů
(4,5). Tento výsledek je moţné konfrontovat se závěry, které publikovali Hejjas et
al. (2007b). Tito autoři zjistili, ţe pravděpodobnost shody průměrných skóre psů a fen byla
rovna p=0,955. Je však nutné podotknout, ţe tito autoři se ve své analýze zabývali
porovnáním psů a fen nejenom s homozygotním genotypem 447a/447a. Další moţný důvod
rozdílu jsou specifické vlastnosti německých ovčáků, které Hejjas et al. (2007b) pouţili pro
své experimenty.
V této části diplomové práce budou diskutována taková statistická testování, která pro
skóre nepozornosti vykazovala minimální diference. Z testování 20 uvedeného v příloze 5, ve
kterém byly porovnávány všechny feny s genotypem 435/498 s fenami s genotypem 447a/498
vyplývá, ţe pravděpodobnost shody průměrných skóre dosáhla hodnoty 0,982. Tento typ
porovnání genotypů nebylo moţné provést u psů (samců), protoţe u nich se tyto alelické
kombinace nevyskytovaly v reprezentativním počtu. Přesto je tento výsledek u fen důkazem
toho, ţe pokud je k alele 498 v genotypu připojena alela 435 nebo alela 447a, nelze nalézt
vliv na výsledné průměrné skóre pro nepozornost.
Zajímavý výsledek vyplývá z porovnání statistických testování 11 a 17. Testování 11
(příloha 5) jiţ bylo diskutováno v předchozí části kapitoly. Vyplynul z něj u fen pozitivní
efekt homozygotní sestavy 447a/447a na sníţení průměrného skóre pro nepozornost. Tyto
homozygotní feny byly ve statistickém testování porovnávány s fenami ostatních genotypů.
Ve statistickém testování 17 byly s ostatními fenami porovnávány heterozygotní feny
435/447a. V tomto případě však průměrné hodnoty skóre pro nepozornost se shodovaly
s vysokou pravděpodobností p=0,871 (příloha 5). Tento výsledek by mohl podpořit jiţ dříve
vyslovenou hypotézu, ţe alela 447a v homozygotní sestavě u fen působí pozitivně na sníţení
průměrné hodnoty skóre pro nepozornost.
79
7 ZÁVĚR
Pro řešení diplomové práce bylo získáno celkem 92 vzorků buněk bukální sliznice od
psů plemene border kolie v dostatečné kvalitě (38 vzorků od psů, 54 vzorků od fen).
Izolace vysokomolekulární genomické DNA z buněk bukálních sliznic pomocí setu
NucleoSpin® Tissue XS (Marchery-Nagel, SRN) se ukázala být vhodnou metodou získání
DNA v dostatečné kvalitě a kvantitě pro následnou detekci polymorfismu genu DRD4.
Pro amplifikaci PCR markeru jednotlivých alel exonu 3 genu DRD4 byla pouţita Pfu
polymeráza v kombinaci s 7-deaza-dGTP, coţ se ukázalo být nutné pro amplifikaci fragmentu
s tendencí vytvářet sekundární struktury. Pro odlišení polymorfismu v rámci alely 447 byla
nutná druhá amplifikace, kde byl s úspěchem pouţit jiný reversový primer.
Primery pouţité při PCR reakcích byly fluorescenčně značeny barvou 6FAMTM(Applied Biosystems), coţ umoţnilo následnou detekci a identifikaci velikosti PCR
amplikonů proti hmotnostnímu standardu nesoucím odlišnou barvu LIZ® programem
GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems).
Detekce jednotlivých alel genu DRD4 byla provedena metodou kapilární gelové
elektroforézy přístrojem ABI PRISM 310® (Applied Biosystems). U plemene border kolie
byly nalezeny celkem tři alely 435, 447a a 498 genu DRD4 v šesti různých genotypech:
435/435, 435/447a, 435/498, 447a/447a, 447a/498, 498/498.
Pro přesnou identifikaci nalezených alel byla provedena jejich sekvenační analýza.
Fragmenty PCR byly nejprve purifikovány pomocí agarózové elektroforézy, následně z nich
byla extrahována DNA pomocí MiniElute PCR Purification Kit (Qiagene). Pro sekvenační
analýzu byl pouţit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).
Všechny tyto postupy se ukázaly jako velice vhodné a úspěšné. Následná sekvenace byla
provedena taktéţ přístrojem ABI PRISM 310® (Applied Biosystems) za pomocí softwaru
DNA Sequencing Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems).
Sekvenované alely byly programem CLC Main Workbench 6.0.1 (CLC) porovnány
graficky s jiţ publikovanými výsledky. Ve všech třech typech námi nalezených alel se
sekvence shodovala s dříve publikovanými výsledky. Byla tak přesně ověřena totoţnost
především alely 447a proti publikované sekvenci alely 447b.
V rámci hodnoceného vzorku populace border kolií byly nalezeny celkem tři alely
genu DRD4, přičemţ největší frekvenci výskytu zjištěné programem Cervus 3.0.3 vykazovala
alela 447a, alela 498 byla zastoupena méně a alela 435 minoritně. Vysoká četnost alely 447a
odpovídá původu plemene pocházejícího z evropského kontinentu. Do následujících
80
statistických studií bylo zařazeno 89 psů, ke kterým majitelé psů ochotně vyplnili ADHD
dotazník validovaný pro majitele psů. Programem Statistica 9.1 byly zpracovány parametrické
t-testy výsledných skóre aktivity-impulzivity a nepozornosti pro 27 testovaných skupin psů
vytvořených na základě zjištěných genotypů a příslušnosti k pohlaví.
Výsledky námi provedené statistické analýzy je moţné shrnout do následujících bodů:
Aktivita-impulzivita

nebyly statisticky prokázány významné rozdíly na úrovni výsledných skóre pro
aktivitu-impulzivitu mezi testovanými skupinami na hladině významnosti α=0,05

nebylo potvrzeno, ţe jedinci s alelou 435 vykazují niţší průměrnou hodnotu skóre pro
aktivitu-impulzivitu oproti ostatním genotypům (p=0,298)

alela 498 nemá ve sledované populaci border kolií vliv na stupeň aktivity-impulzivity
(p=0,967)

na stupeň aktivity-impulzivity nemá vliv ani homozygotní sestava 447a/447a, coţ
potvrdilo srovnání skóre těchto jedinců se skóre jedinců s ostatními genotypy
(p=0,519)

homozygotní jedinci bez ohledu na typ alely vykazovali nepatrně vyšší průměrnou
hodnotu skóre pro aktivitu-impulzivitu oproti heterozygotním jedincům, hodnoty ale
nebyly statisticky průkazné na hladině významnosti α=0.05

samci border kolií vykazovali vyšší hodnoty skóre aktivity-impulzivity neţ feny,
výsledky ale nebyly statisticky průkazné průkazné na hladině významnosti α=0,05;
zároveň byl vyvrácen efekt pohlaví na výši aktivity-impulzivity testováním fen
homozygotů 447a/447a a psů stejnýcho homozygotů, kde byla výsledná hodnota
p=0,939
Nepozornost

Alela 447a v homozygotní sestavě 447a/447a působí pozitivně na sniţování
nepozornosti u border kolií, především u fen tohoto plemene

Feny s alespoň jednou alelou 498 měly statisticky průkazně (p=0,043) vyšší skóre pro
nepozornost neţ feny s genotypem 447a/447a U stejného testování samců tento rozdíl
pozorován nebyl (p=0,653); i tak samci s alelou 498 vykazovali vyšší skóre pro
nepozornost oproti samcům 447a/447a
81

Byly zjištěny velké rozdíly mezi průměrnými skóre nepozornosti mezi jedinci
s genotypem 447a/447a a ostatními jedinci (p=0,065) a zároveň mezi jedinci
s genotypem 447a/447a a jedinci s alespoň jednou alelou 498 (p=0,069), coţ potvrzuje
teorii o pozitivním vlivu homozygotní sestavy alely 447a na sniţování nepozornosti
u border kolií.

Feny s genotypem 447a/447a měly taktéţ výrazně niţší skóre pro nepozornost oproti
ostatním fenám (p=0,068). U stejného testování samců border kolií byly zjištěny
menší diference (p=0,328), nicméně stále psi genotypu 447a/447a vykazovali niţší
skóre pro nepozornost proti ostatním psům. Zároveň při testování fen 435/447a proti
ostatním fenám byla pravděpodobnost shody p=0,871. Tento výsledek podporuje
závěr, ţe alela 447a působí na sniţování nepozornosti pouze v homozygotní sestavě.

Největší shoda byla nalezena v hodnotách skóre pro nepozornost fen 435/498 a fen
447a/498, a to p=0,982. Lze tedy konstatovat, ţe heterozygotní sestava má stejný vliv
na stupeň nepozornosti v přítomnosti alely 447a jako ostatní heterozygotní sestavy.
Vysoký výskyt alely 447a můţe být vysvětlován i jako následek selekce border kolií
zaloţené na pracovních schopnostech. V následných studiích doporučuji zaměřit se především
na populaci border kolií pocházející z pracovních chovů. Border kolie v pracovních chovech
jsou do chovu zapojovány nebo vyřazovány pouze na základě pracovních schopností. Z toho
důvodu by bylo zajímavé podobnou studii provést ve skupině border kolií, které úspěšně
pracují na farmách, a ve skupině, které byly vyřazeny z chovu pracovních psů na základě
povahy a pracovních vlastností a tyto dvě skupiny porovnat.
82
8 SEZNAM LITERATURY
Altria, K.D. 1999. Overview of capillary electrophoresis and capillary electrochromatography. Journal
of Chromatography A, 856, 443-463.
Benes, F.M. 2001. Carlsson and the discovery of dopamine. Trends in Pharmacological Sciences, 22
(1), 46-47.
Benjamin, J., Li, L., Patterson, C., Greenberg, B. D., Murphy, D. L., & Hamer, D. H. 1996. Population
and familial association between the D4 dopamine receptor gene and measures of Novelty
Seeking. Nature Genetics, 12 (1), 81-84.
Bialleck, K.A., Schaal, H.P., Kranz, T.A., Fell, J., Elger, C.E., Axmacher, N. 2011. Ventromedial
prefrontal cortex activation is associated with memory formation for predictable rewards. PloS
ONE, 6(2), e16695.
Blaschko, H. 1942. The activity of l(-)-DOPA decarboxylase. The Journal Of Physiology, 101, 337349.
Bressan, R.A., Crippa, J.A. 2005. The role of dopamine in reward and pleasure behaviour – review of
data from preclinical research. Acta Psychiatr Scand, 111 (Suppl. 427), 14–21.
Brown, P., Marsden, C.D. 1998. What do the basal ganglia do? The Lancet, 351, 1801-04.
Brown, T. A. 2007. Klonování genů a analýza DNA: Úvod, Univerzita Palackého v Olomouci,
Olomouc, 389 s. ISBN: 978-80-244-1719-6
Carlsson, A., Lindqvist, M., Magnusson, T., Waldeck, B. 1958. On the presence of 3-hydroxytyramine
in brain. Science, 127 (3296), 471.
Coren, S. 2007. Inteligence psů, Práh, 319 s. ISBN: 978-80-7252-186-9
Curatolo, P., D’Agati, E., Moavero, R. 2010. The neurobiological basis of ADHD. Italian Journal of
Pediatrics, 36 (1), 79.
Dansk Kennel Klub. 2010. World Dog Chow 2010 - Obedience World Championship [online].
Vystaveno 2010 [cit. 15. března 2011]. Dostupné na <http://www.worlddogshow2010.dk>.
Deutscher Verband der Gebrauchshundsportvereine. 2010. Agility World Championship 2010 Results
[online]. Vystaveno 2010 [cit. 11. března 2011]. Dostupné na <http://www.agilitywm.de/2010/content/results.en.html>.
Ding, Y. C., Chi, H. C., Grady, D. L., Morishima, A., Kidd, J. R., Kidd, K. K., Flodman, P., Spence,
M. A., Schuck, S., Swanson, J. M., Zhang, Y., Moyzis, R. K. 2002. Evidence of positive
selection acting at the human dopamine receptor D4 gene locus. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 99 (1), 309-314.
Divišová, K., Podešťová, M., Benda, J. 2003. AGILITY První krůčky, Nakladatelství PLOT, Praha,
153 s.
Dostál, J. 2007. Genetika a šlechtění psů, Dona, České Budějovice, 260 s. ISBN 978-80-7322-104-1
83
Drtílková, I., Šerý, O., Balaštíková, B., Theiner, P., Uhrová, A., Ţáčková, M. 2007. Hyperkinetická
porucha / ADHD, Galén, Praha, 268 s.
Dulawa, S. C., Grandy, D. K., Low, M. J., Paulus, M. P., Geyer, M. A. 1999. Dopamine D4 Receptorknock-out mice exhibit reduce exploration of novel stimuli. Journal of Neuroscience, 19 (21),
9550-9556.
Ebstein, R. P., Novick, O., Umansky, R., Priel, B., Osher, Y., Blaine, D., Bennett, E. R., Nemanov, L.,
Katz, M., Belmaker, R. H. 1996. Dopamine D4 receptor (DRD4) exon III polymorphism
associated with the human personality of Novelty Seeking. Nature Genetics, 12 (1), 78-80.
Faraone, S. V., Perlis, R. H., Doyle, A. E., Smoller, J. W., Gorlanick, J. J., Holmgren, M. A., Sklar, P.
2005. Molecular genetics of attention-deficit/hyperactivity disorder. Biological Psychiatry, 57,
1313-1323.
Federation Cynologique Internationale. 2007. Agility regulations of the Federation Cynologique
Internationale
[online].
Vystaveno
9.1.2007
[cit.
6.
března
2011].
Dostupné
na
<http://www.fci.be/uploaded_files/33-2010-annex-agi-en.pdf>.
Flyball Club České republiky. 2010. Pravidla flyballu [online]. Vystaveno 10. ledna 2010 [cit. 15.
března 2011]. Dostupné na <http://www.flyball.cz/soubory/flyballovapravidla2011.pdf>.
Gaš, B. 2001. Kapilární elektroforéza - Separační analytická metoda pro věk mikročipů. Vesmír, 80
(7), 370-372.
Griffin, H. G., Griffin, A. M. 1994. PCR Technology – Current Innovations, PCR Press, London, p.
370.
Hanačíková, N. 2000. Dílčí plemenná kniha ČMKU pro border collie, Borderholic, 5, 15-19
Hejjas, K., Vas, J., A., Kubinyi, E., Sasvari-Szekely, M., Miklosi, Ronai, Z. 2007a. Novel repeat
polymorphisms of the dopaminergic neurotransmitter genes among dogs and wolves.
Mammalian Genome, 18 (12), 871-879.
Hejjas, K., Vas, J., Topal, J., Szantai, E., Ronai, Z., Szekely, A., Kubinyi, E., Horvath, Z., SasvariSzekely, M., Miklosi, A. 2007b. Association of polymorphisms in the dopamine D4 receptor
gene and the activity-impulsivity endophenotype in dogs. Animal Genetics, 38 (6), 629-633.
Hillebrand, L. 2000. LHB Agility - uitslagen [online]. Vystaveno 2000-2011 [cit. 15. března 2011].
Dostupné na < http://www.lhbsystems.nl/uitslagen/default.asp>.
Hornykiewicz, O. 2010. A brief history of levodopa. J Neurol, 257 (Suppl 2), 249–S252.
Innis, M. A., Myambo, K. B., Gelfand, D. H., Brow, M. A. 1988. DNA sequencing with Thermus
aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified
DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85
(24), 9436-9440.
84
Ito, H., Nara, H., Inoue-Murayama, M., Shimada, M. K., Koshimura, A., Ueda, Y., Kitagawa, H.,
Takeuchi, Y., Mori, Y., Murayama, Y., Morita, M, Iwasaki, T., Ota, K., Tanabe, Y., Ito, S.
2004. Allele Frequency Distribution of the Canine Dopamine Receptor DR Gene Exon III and I
in 23 Breeds. Journal of Veterinary Medical Science, 66 (7), 815-820.
Jaber, M., Robinson, S.W., Missale, C., Caron, M.G.1996. Dopamine receptors and brain function.
Neuropharmacology, 35(11), 1503-19.
Jeţková, J. 2010. Hodnocení genetické variability plemene bearded kolie pomocí molekulárních
markerů. Diplomová práce. Česká zemědělská univerzita v Praze. Agronomická fakulta. Praha.
85 s.
Kalinowski, S.T., Taper, M.L., Marshall, T.C. 2007. Revising how the computer program CERVUS
accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology,
16, 1099-1006.
Kašička, V. 1997. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod.
Chemické Listy, 91 (5), 320-329.
Kebir, O., Joober, R. 2011. Neuropsychological endophenotypes in attention-deficit/hyperactivity
disorder: a review of genetic association studies [online]. European Archives of Psychiatry and
Clinical Neuroscience. Vystaveno 16. března 2011 [cit. 21. března 2011]. Dostupné na
<http://www.springerlink.com.infozdroje.czu.cz/content/g3804756458h7xl2/fulltext.pdf >.
Klub agility České republiky. 2009. Řád agility České republiky [online]. Vystaveno 1.1.2009 [cit. 6.
března 2011]. Dostupné na <http://www.klubagility.cz/rad-agility.html>.
Klub pracovních ovčáckých psů České republiky. 2004. Chov pod ISDS - Informace [online].
Vystaveno
2004
[cit.
7.
března
2011].
Dostupné
na
<http://www.kpop.cz/documents.php?mid=a6665ce6-e5d4-102c-a7db-0030483144ba>
La Fédération Cynologique Internationale, 2011. Nomenclature des races [online]. Vystaveno 1998 2010 [cit. 27. února 2011]. Dostupné na <http://www.fci.be/uploaded_files/297g01-fr.doc>.
Lemos, N.P., Bartolotti, F., Manetto, G., Anderson, R.A., Cittadini, F., Tagliaro, F. 2001. Capillary
electrophoresis: a new tool in forensic medicine and science. Science & Justice, 41, 203-210.
Livak, K. J., Rogers, J., Lichter, J. B. 1995. Variability of dopamine D4 receptor (DRD4) gene
sequence within and among nonhuman primate species. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 92 (2), 427-431.
Loučka, R. 1999. Úvodní slovo, Borderholic, 1999 (2), 1-3.
Loučka, R. 2001. Pasení s klubem BCCCZ, Borderholic, 2001 (9), 1-3.
Loučka, R. 2008. Pasení se psem, Svaz chovatelů ovcí a koz v ČR, Brno, 88 s.
Mikulica, V. 2004. Poznej svého psa, Dialog, Litvínov, 305 s. ISBN: 80-85843-00-5
Missale, C., Nash, S. R., Robinson, S. W., Jaber, M., Caron, M. G. 1998. Dopamine Receptors: From
structure to function. Physiological Reviews, 78 (1), 189-225.
85
Mlnařík, J. 2006. Czech Database Of Border Collie [online]. Vystaveno 2006 [cit. 21. března 2011].
Dostupné na <http://www.bcccz.cz/gen/genealogie.php>.
Momozawa, I., Takeuchi, Y., Kusunose, R., Kikusui, T., Mori, Y. 2005. Association between equine
temperament and polymorphism in dopamine D4 receptor gene. Mammalian Genome, 16, 538534.
Műller, H. A. 2001. Border kolie, Timy, spol. s.r.o., Bratislava, 124 s. ISBN: 80-8065-014-4
Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., Erlich, E. 1986. Specific enzymatic
amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on
Quantitative Biology, 51 (1), 263-273.
Nara, H., Inoue-Murayama, M., Koshimura, A., Sugiyama, A., Muryama, Y., Maejima, M., Ueda, Y.,
Ito, H., Randi, E., Kim, H., Ha, J., Kitawaga, H., Takeuchi, Y., Mori, Y., Iwasaki, T., Morita,
M., Ota, K., Ito, S. 2005. Novel polymorphism of the canine dopamine receptor D4 gene intron
II region. Animal Science Journal, 76 (1), 81-86.
Niimi, Y., Inoue-Murayama, M., Kato, K., Matsuura, N., Murayama, Y., Ito, S., Momoi, Y., Konno,
K., Iwasaki, T. 2001. Breed Differences in Allele Frequency of the Dopamine Receptor D4
Gene in Dogs. The Journal of Heredity, 92 (5), 433-436.
Niimi, Y., Inoue-Murayama, M., Murayama, Y., Ito, S., Iwasaki, T. 1999. Allelic variation of the D4
dopamine receptor polymorphic region in two dog breeds, Golden Retriever and Shiba. Journal
of Veterinary Medical Sciences, 61 (12), 1281-1286.
Noble, E.P., Ozkaragoz, T.Z., Ritchie, T.L., Zhang, X., Belin, T.R., Sparkes, R.S. 1998. D2 an D4
dopamine receptor polymorphisms and personality. American Journal of Medical Genetics
(Neuropsychiatric Gen.), 81 (3), 257-267.
North American Flyball Association, 2010. Flyball Rulebook [online]. Vystaveno 2005, poslední
revize
16.
prosince
2010
[cit.
15.
března
2011].
Dostupné
na
<http://www.flyball.org/rules/nafa_rules_2010-10-01.pdf>.
Oberbauer, A.M., Grossman D.I., Eggleston, M. L., Irion, D. N., Schaffer, A. L., Pedersen, N. C.,
Belanger, J. M. 2003. Alternatives to Blood as a Source of DNA for Large-scale Scanning
Studies of Canine Genome Linkages. Veterinary Research Communications, 27 (1), 27-38.
OBEDIENCE CZ. 2010. Zkušební řád & pravidla obedience v České republice (3. verze) studies
[online].
Vystaveno
2010
[cit.
21.
března
2011].
Dostupné
na
<
http://www.obedience.cz/pravidla/ >.
Olds, J., Milner, P. 1954. Positive reinforcement produced by electrical stimulation of septal area and
other regions of rat brain. Journal of Comparative and Physiological Psychology, 47, 419-427.
O'Malley, K. L., Harmon, S., Tang, L., Todd, R. D. 1992. The rat dopamine D4 receptor: sequence,
gene structure and demonstration of expression in the cardiovascular system. The New
Biologist, 4 (2), 136-146.
86
Petitdidier, J.P. 1999. Résultats Individuel Standard et parcours [online]. Vystaveno 1999 [cit. 11.
března 2011]. Dostupné na <http://cnea.chez.com/cdm_dortmund99.html>.
Raita-aho, T. 1998. FCI World Championchip 1996 - Results [online]. Vystaveno 28.1.1998 [cit. 11.
března 2011]. Dostupné na <http://www.finagility.com/wc96/>.
Raita-aho, T. 1998. Results of Maxi (Standard) Individuals in Finnish of FCI World Championchips.
October 1998 in Maribor, Slovenia [online]. Vystaveno 29.10.1998 [cit. 11. března 2011].
Dostupné na <http://www.finagility.com/wc98/resindmaxi.html >.
Saiki, R. K., Gelfand, D., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., A., Erlich
H. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science, 239 (4839), 487-491.
Sambrook, J., Maniatis, T., Fritsch, E. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. (Second
edition), Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, p. 1659.
Satoh, Tak., Matsumoto, N., Nakai, S., Satoh, Tat., Minamimoto, T., Kimura, M. 2003. Dopamine
neurons encode teaching signals for learning reward-based decision strategy. International
Cpngress Series, 1250, 311-318.
Savolainen, P., Zhang, Y. P., Luo, J., Lundeberg, J., Leitner, T. 2002. Genetic evidence for an East
Asian origin of domestic dogs. Science, 298 (5598), 1610-1613.
Seamans, J. 2007. Dopamine anatomy. Scholarpedia, 2(6), 3743.
Schultz, W. 1997. Dopamine neurons and their role in reward mechanisms. Current Opinion in
Neurobiology, 7, 191-197.
Schultz, W. 1999. The reward signal of midbrain dopamine neurons. News Physiol. Sci., 14, 249-255.
Schultz, W., Dayan, P., Montague, P.R. 1997. A neural substrate of prediction and reward. Science,
275 (5306), 1593-1599.
Slovenská kynologická jednota. 2009. World Dog Show 2009 - Obedience výsledky celkové [online].
Vystaveno 2009 [cit. 15. března 2011]. Dostupné na
<http://www.worlddogshow2009.com/fileadmin/Media/Svetova_vystava/doc/obedience/result_
ms_ob_2009.doc>.
Smeets, W.J.A.J., González, A. 2000. Catecholamine systems in the brain of vertebrates: new
perspectives through a comparative approach. Brain Research Reviews, 33, 308–379.
Smith, H. O., Wilcox, K. 1970. Restriction endonuclease from Haemophilus influenzae. Journal of
Molecular Biology, 51 (2), 379-391.
Snustad, D. P., Simmons, M. J. 2009. Genetika, Masarykova Univerzita, Brno, 864 s. ISBN 978-80210-4852-2
Sűdhof, T.C., Starke, K. 2008. Handbook of experimental pharmacology: Pharmacology of
neurotransmital release, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, p. 582.
87
Swanson, J.M., Sunohara, G.A., Kennedy, J.L., Regino, R., Fineberg, E., Wiga, T., Lerner, M.,
Williams, L., LaHoste, G.J., Wigal, S. 1998. Association of the dopamine receptor D4 (DRD4)
gene with a refined phenotype of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD): a familybased approach. Molecular Psychiatry, 3, 38-41.
The International Sheep Dog Society. Associate Societies [online]. Vystaveno 2007, poslední revize 8.
prosince
2010
[cit.
7.
března
2011].
Dostupné
na
<http://www.isds.org.uk/society/foreign_contacts.html>.
The International Sheep Dog Society. History - Early Beginnings [online]. Vystaveno 2007, poslední
revize
8.
prosince
2010
[cit.
30.
ledna
2011].
Dostupné
na
<http://www.isds.org.uk/society/function_purpose/history.html>.
The International Sheep Dog Society. The Dog [online]. Vystaveno 2007, poslední revize 8. prosince
2010
[cit.
30.
ledna
2011].
Dostupné
na
<http://www.isds.org.uk/society/function_purpose/the_dog.html>.
The International Union of Basic and Clinical Pharmacology. 2010. Database: IUPHAR-DB Ligand:
940 [online]. Vystaveno 2010 [cit. 16. března 2011]. Dostupné na <http://www.iuphardb.org/DATABASE/LigandDisplayForward?tab=summary&ligandId=940 >.
Ugaz, V.M., Christensen, J.L. 2007. Electrophoresis in Microfluidic Systems,in Hardt, S., Schönfeld ,
F., (eds.), Microfluidic Technologies for Miniaturized Analysis Systems, Springer
Science+Business Media, LLC, New York, pp. 393-438. ISBN 978-0-387-28597-9
US Disc Dog Nationals. 2010. Results. [online]. Vystaveno 20. října 2010 [cit. 15. března 2011].
Dostupné na <http://www.usddn.com/results10.htm>.
Vas, J., Topal, J., Pech, E., Miklosi, A. 2007. Measuring attention deficit and activity in dogs: A new
application and validation of a human ADHD questionnaire. Applied Animal Behavior Science,
103 (1-2), 105-117.
Vejrosta, F. Historie border collie [online]. Vystaveno 1. prosince 2009 [cit. 30. ledna 2011].
Dostupné na <http://www.bcccz.cz/>.
Verhoeff -Verhallen, E. 2002. Border Kolie, Rebo Productions, Čestlice, 127 s.
Wong, A.H.C., Buckle, C.E., Van Tol, H.H.M. 2000. Polymorphisms in dopamine receptors: what do
they tell us? European Journal of Pharmacology, 410 (2-3), 183-200.
Xiaoyan, W., Villar, V. A. M., Armando, I., Eisner, G.M., Felder, R.A., Jose , P.A. 2008. Dopamine,
kidney, and hypertension: studies in dopamine receptor knockout mice. Pediatric Nephrology,
23, 2131–2146.
88
9 SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ
ADHD
hyperkinetický syndrom s poruchou pozornosti
BCCCZ
Border Collie Club Czech Republic
BOB
best of breed, nejlepší z plemene, titul zadávaný na výstavách
bp
počet párů bází v molekule nukleové kyseliny
CEA
Collie eye anomaly, anomálie oka kólií, dědičná nemoc, hypoplazie choroidey
oka
CL
Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
COMT
gen pro katechol-o-metyltransferázu degradující katecholaminy dopamin
a noradrenalin
ČMKU
Českomoravská kynologická unie
DAT1
gen pro proteinový dopaminový transportér, navrací dopamin zpět ze synapse
do presynaptické části
dATP
deoxyadenosin-5’-trifosfát
DBH
gen pro β-hydroxylázu katalyzující konverzi dopaminu na adrenalin
dCTP
deoxycitidin-5’-trifosfát
ddH20
dvakrát deionizovaná voda
dGTP
deoxyguanosin-5’-trifosfát
DNA
deoxyribonukleová kyselina
DRD4
gen pro dopaminový receptor D4
dTTP
deoxytymidin-5’-trifosfát
FCI
Mezinárodní kynologická federace (Fédération Cynologique Internationale)
F-primer
přímý primer, forwardový
HE
očekávaná heterozygotnost
HO
pozorovaná heterozygotnost
ISDS
International Sheep Dog Society
L-DOPA
3,4-dihydroxyfenylalanin
MAOA
gen pro monoaminooxidázu deaminující katecholaminy na aldehydy
PCR
polymerázová řetězová reakce
Pfu
termostabilní polymeráza pocházející z Pyrococcus furiosus
PRA
progresivní retinální atrofie, dědičná nemoc, odumírání fotoreceptivních buněk
sítnice
89
R-primer
zpětný primer, reversový
Taq
termostabilní polymeráza pocházející z Thermus aquaticus
TBE
tris-borátový pufr (Sambrook et al., 1989)
UV
ultrafialový
VK
variační koeficient
VNTR
variabilní počet tandemových repetic
90
PŘÍLOHY
Příloha 1 - Plemenný standard plemene border kolie
FCI Standard N° 297 / 28.10.2009 / GB
BORDER COLLIE
ZEMĚ PŮVODU : Velká Británie.
DATUM PUBLIKACE PLATNÉHO ORIGINÁLNÍHO STANDARDU : 24.06.1987.
POUŢITÍ : Ovčácký pes.
KLASIFIKACE FCI :
Skupina 1 – Psi ovčáci a honáčtí (kromě psů švýcarských
salašnických)
Sekce 1 – Ovčáci
S pracovní zkouškou
CELKOVÝ VZHLED: Pes dobrých proporcí a ladných rysů ukazujících kvalitu, půvab a dokonalou
vyváţenost, které ve spojení s dostatečnou tělesnou stavbou demonstrují jeho výkonnost. Sklon
k robustnosti i k přílišné lehkosti je neţádoucí.
DŮLEŢITÉ PROPORCE :
Délka čenichu a mozkovny je přibliţně stejná. Délka těla je mírně větší, neţ je výška v kohoutku.
POVAHA :
Vytrvalý ovčácký pes k tvrdé práci u stáda, výborně ovladatelný, ţivý, pozorný, poslušný a inteligentní.
Nesmí být ani nervózní ani agresivní.
HLAVA
MOZKOVNA :
Lebka : Dosti široká, týlní hrbol nevýrazný.
Stop : Velmi výrazný.
LÍCNÍ ČÁST :
Nos : Nos černý, u hnědých a čokoládově zbarvených jedinců smí být hnědý. U modrých psů by měl být
břidlicové barvy. Dobře vyvinuté nosní dírky.
Čenich : Čenich se směrem k nosu zuţuje, je středně krátký a silný.
Čelisti/zuby : Silné zuby a čelisti s dokonalým pravidelným a úplným nůţkovým skusem. To znamená, ţe
řezáky horní čelisti těsně přesahují řezáky spodní čelisti, přičemţ jsou vsazeny kolmo do čelisti.
Líce : Líce nejsou ani plné, ani zaoblené.
Oči : Posazené daleko od sebe, oválného tvaru, středně velké. Barva hnědá, jen u merle zbarvených psů
mohou být jedno nebo obě oči zcela, nebo částečně modré. Jemný, bystrý, pozorný a inteligentní výraz.
Uši : Středně velké a středně silné, nasazené dostatečně daleko od sebe. Jsou neseny vztyčeně nebo
polovztyčeně. Při naslouchání jsou výrazně pohyblivé.
KRK : Dobré délky, silný a svalnatý, mírně klenutý a rozšiřující se směrem k lopatkám.
TRUP : Atletický vzhled. Mírně delší, neţ je výška v kohoutku.
Bedra : Široká a svalnatá, ne však vystouplá.
Hrudník : Hluboký a poměrně široký s dobře klenutými ţebry.
OCAS : Středně dlouhý, svým posledním obratlem dosahující minimálně k hleznu. Je nízko nasazený, dobře
osrstěný, směrem ke špičce se stáčí vzhůru a doplňuje tak ladnou linii a vyváţenost psa.
Při vzrušení můţe být vztyčen, nikdy však není nesen nad hřbetem.
KONČETINY
PŘEDNÍ ČÁST TĚLA : Hrudní končetiny jsou při pohledu zpředu rovnoběţné. Kosti jsou pevné, ne však
mohutné.
Lopatky : Uloţeny vzad.
Lokty : Přiléhají k tělu.
Zápěstí: Při pohledu z boku mírně šikmé.
Přední tlapky : Oválného tvaru s vysokými polštářky, pevné a dobře stavěné. Prsty klenuté a těsně navzájem
přiléhající. Drápky krátké a silné.
ZADNÍ ČÁST TĚLA : Široká a svalnatá v profilu ladně přecházející k nasazení ocasu.
Stehna : dlouhá, silná a svalnatá.
Kolena : Dobře zaúhlená.
Hlezení kloub: Pevný, hluboce uloţený.
Zápěstí : Od hlezna k zemi jsou zadní nohy stavěny z pevných při pohledu zezadu rovnoběţných kostí.
Zadní tlapky : Oválného tvaru s vysokými polštářky, pevné a dobře stavěné. Prsty klenuté a těsně navzájem
přiléhající. Drápky krátké a silné.
CHŮZE/POHYB: Volný, plynulý a neúnavný. Nízko zvedané tlapky vzbuzují dojem, ţe je pes schopen
pohybovat se nenápadně a velmi rychle.
SRST
OSRSTĚNÍ : Dvě varianty : Středně dlouhé a Krátké.
U obou variant je krycí srst hustá a střední textury s měkkou a hustou podsadou, která vytváří výbornou
ochranu proti povětrnostním vlivům. U středně dlouhé varianty vytváří bohatá srst hřívu, kalhoty a prapor.
V obličejové části, na uších, na hrudních končetinách (s výjimkou praporců) a na pánevních končetinách od
hlezen k zemi má být srst krátká a hladká.
BARVA : Dovoleno je mnoţství barev, přičemţ nikdy nesmí převládat bílá.
VÝŠKA A VÁHA :
Ideální výška v kohoutku : Psi : 53 cm (21 palců),
Feny : o něco méně.
VADY : Kaţdá odchylka od výše uvedených poţadavků musí být povaţována za vadu a posouzení její
závaţnosti musí být přímo úměrné stupni odchylky, jejímu vlivu na zdraví a pohodu psa a na jeho schopnost
vykonávat jeho tradiční práci.
VYŘAZUJÍCÍ VADY :
 Agresivní nebo příliš bázlivý.
 Z chovu má být vyřazen kaţdý pes, který zřetelně vykazuje abnormality fyzické nebo v chování.
POZNÁMKA : Psi mají mít dvě zřetelně normální varlata, plně sestouplá v šourku.
Příloha 2 - Odběr vzorku DNA ze sliznice dutiny ústní
Odběr vzorku DNA ze sliznice dutiny ústní se provádí stěrem sliznice vnitřní strany tváře psa.
Provádí se v dostatečném časovém odstupu od posledním příjmu krmiva aby nedošlo ke
kontaminaci vzorku. Rukou odtáhneme koutek pysků psa, vloţíme sterilní kartáček tak, aby
se dotýkal pouze bukální sliznice, pysk psa přidrţujeme zvenku rukou tak aby tvořil záhyb
pro kartáček a pohybujeme kartáčkem cca 10 vteřin tam a zpět a zároveň s ním otáčíme.
Kartáček následně vyndáme tak aby nedošlo ke kontaminaci vzorku a konec kartáčku
s nanesenými bukálními buňkami odštípneme do připravené zkumavky.
Příloha 3 - ADHD dotazník validovaný pro majitele psů
Dotazník pro majitele psů, kterým byl odebrán vzorek DNA
Otázky v dotazníku jsou zaměřeny na schopnost psa se soustředit a jeho aktivitu a impulzivitu.
Jméno psa (dle PP): .................
Pohlaví: □ pes □ fena
Prosím
vyznačte jak
často
projevuje
Váš pes
následující
chování:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12
13
Datum narození psa: .................
Můj pes má potíţe s učením, protoţe je
nepozorný nebo je jeho pozornost snadno
odvedena jinými podněty:
Je snadné upoutat pozornost mého psa, ale
brzy ztratí zájem:
Soustředit se na cvik nebo hru je pro mého psa
obtíţné:
Můj pes opouští místo, kde měl zůstat:
Můj pes neumí být v klidu, je těţké ho
uklidnit:
Můj pes je neposedný:
Zdá se, ţe pes často neposlouchá, i kdyţ ví, ţe
na něj někdo mluví:
Můj pes je divoký, hůře ovladatelný, kdyţ
vyrazí vpřed, je těţké ho udrţet:
Můj pes by si pořád hrál a běhal:
Lehké úkoly vyřeší můj pes snadno, ale často
má problémy se sloţitými cviky, i kdyţ je zná
a často s ním byly procvičovány:
Ve vykonávání cviků selhává, protoţe má
tendenci reagovat zbrkle:
Pozornost mého psa můţe být snadno
rozptýlena
Neumí čekat, protoţe nemá kontrolu nad
sebou samým:
Nikdy
Občas
Často
Velmi
často
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
0
1
1
2
2
3
3
0
0
1
1
2
2
3
3
0
1
2
3
0
0
1
1
2
2
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
Příloha 4 - Schéma syntézy katecholaminů
Zdroj: http://www.wikipedia.org
Příloha 5 - Výsledky jednotlivých testování uvedených v kapitole 4.6.2 – 1. část
1
Skupina A:
Skupina B:
všichni ostatní
2
Skupina A: všichni s alespoň jednou alelou 447a
Skupina B: všichni ostatní
aktivita-impulzivita
t
-0,647177 průměr A
7,795918 průměr B
8,300000
t
0,130949 průměr A
p
0,519221 sm.odch A
3,322772 sm.odch B 4,026833
p
0,896118 sm.odch A 3,713672 sm.odch B 2,714160
nepozornost
8,036145 průměr B
7,833333
nepozornost
t
-1,86782 průměr A
3,816327 průměr B
5,100000
t
-1,38251 průměr A
p
0,065153 sm.odch A
2,666720 sm.odch B 3,801484
p
0,170353 sm.odch A 3,324280 sm.odch B 1,722401
3
Skupina A:
4
Skupina B: všichni s genotypem 447a/498
6,166667
Skupina A: všichni s genotypem 447a/447a
Skupina B: všichni s genotypem 435/447a
7,795918 průměr B
4,265060 průměr B
t
-0,263988 průměr A
8,040000
t
-1,270000 průměr A
p
0,792544 sm. odch. A 3,322772 sm.odch B 4,513683
p
0,209300 sm.odch A 3,322772 sm.odch B 3,427827
t
-1,54710 průměr A
3,816327 průměr B
5,080000
t
-0,62830 průměr A
p
0,126223 sm.odch A
2,666720 sm.odch B 4,348563
p
0,532400 sm.odch A 2,666720 sm.odch B 3,244654
nepozornost
5
9,333333
nepozornost
Skupina A: všichni s alespoň jednou alelou 435
Skupina B:
7,795918 průměr B
6
všichni ostatní
3,816327 průměr B
4,444444
Skupina B: všichni ostatní
t
1,047500 průměr A
9,000000 průměr B
7,855263
t
-0,041259 průměr A
p
0,297800 sm.odch A
3,291403 sm.odch B 3,693973
p
0,967184 sm.odch A 4,258865 sm.odch B 3,326830
nepozornost
t
0,62990
p
0,530400 sm.odch A
7
průměr A
4,923077 průměr B
8,000000 průměr B
8,033898
nepozornost
4,302632
t
1,67640
2,956956 sm.odch B 3,330745
p
0,097250 sm.odch A 4,012051 sm.odch B 2,769859
Skupina A: všichni s genotypem 435/447a
8
Skupina B: všichni s genotypem 447a/498
0,779500 průměr A
9,333333 průměr B
p
0,441400 sm.odch A
5,200000 průměr B
3,983051
Skupina B: všichni s genotypem 447a/447a
t
průměr A
8,040000
t
0,237723 průměr A
3,427827 sm.odch B 4,513683
p
0,812728 sm.odch A 4,258865 sm.odch B 3,322772
nepozornost
8,000000 průměr B
7,795918
nepozornost
t
-0,39870 průměr A
4,444444 průměr B
5,080000
t
1,84238
průměr A
5,200000 průměr B
p
0,692800 sm.odch A
3,244654 sm.odch B 4,348563
p
0,069269 sm.odch A 4,012051 sm.odch B 2,666720
3,816327
10
Skupina A:
všichni psi s genotypem 447a/447a
Skupina B:
všichni ostatní psi
11
t
0,570155 průměr A
p
0,572215 sm.odch A
Skupina A: všechny feny s genotypem 447a/447a
Skupina B: všechny ostatní feny
7,833333
průměr B
7,230769
t
-0,943841 průměr A
2,987898
sm.odch B
3,218536
p
0,349789 sm.odch A
nepozornost
7,760000
průměr B
8,814815
3,677409
sm.odch B
4,323790
nepozornost
t
-0,99230 průměr A
4,500000
průměr B
5,538462
t
-1,86790 průměr A
3,160000
průměr B
4,888889
p
0,327861 sm.odch A
2,889260
sm.odch B
3,306947
p
0,067642 sm.odch A
2,303620
sm.odch B
4,060441
12
Skupina A: všichni psi s alespoň jednou alelou 447a
13
Skupina B: všichni ostatní psi
Skupina A: všechny feny s alespoň jednou alelou 447a
t
0,293527 průměr A
7,657143
průměr B
7,000000
t
0,029564 průměr A
8,312500
průměr B
8,250000
p
0,770853 sm.odch A
3,114887
sm.odch B
1,414214
p
0,976532 sm.odch A
4,105815
sm.odch B
3,304038
t
-1,27189 průměr A
7,500000
t
-0,87715 průměr A
3,937500
průměr B
5,500000
p
0,211799 sm.odch A
0,707107
p
0,384600 sm.odch A
3,503228
sm.odch B
1,732051
nepozornost
14
nepozornost
4,714286
průměr B
3,054133
sm.odch B
Skupina A: všichni psi s genotypem 447a/447a
15
Skupina B: všichni psi s genotypem 447a/498
Skupina B: všechny feny s genotypem 447a/498
t
0,793900 průměr A
7,830000
průměr B
6,900000
t
-0,750100 průměr A
7,760000
průměr B
8,800000
p
0,433100 sm.odch A
2,987900
sm.odch B
3,446400
p
0,457900 sm.odch A
3,677400
sm.odch B
5,073700
nepozornost
nepozornost
t
-0,26140 průměr A
4,500000
průměr B
4,800000
t
-0,18258 průměr A
3,160000
průměr B
5,266800
p
0,795500 sm.odch A
2,889300
sm.odch B
3,425400
p
0,075800 sm.odch A
2,303600
sm.odch B
4,978000
16
17
Skupina B: všechny feny s genotypem 435/447a
t
0,917900 průměr A
p
0,365700 sm.odch A
9,125000
průměr B
3,603100
sm.odch B
Skupina A: všechny feny s genotypem 435/447a
7,760000
t
0,621000 průměr A
9,125000
průměr B
8,159100
3,677400
p
0,537400 sm.odch A
3,603100
sm.odch B
4,114000
nepozornost
t
0,71430
průměr A
p
0,480400 sm.odch A
nepozornost
3,875000
průměr B
3,160000
t
-0,16290 průměr A
3,875000
průměr B
4,091000
2,949000
sm.odch B
2,303600
p
0,871200 sm.odch A
2,949000
sm.odch B
3,522800
18
19
Skupina B: všechny feny s genotypem 435/498
t
0,253150 průměr A
p
0,802200 sm.odch A
Skupina A: všechny feny s genotypem 435/498
8,330000
průměr B
7,760000
t
0,011263 průměr A
4,041500
sm.odch B
3,677400
p
0,991059 sm.odch A
nepozornost
8,333333
průměr B
8,306122
4,041452
sm.odch B
4,063066
nepozornost
t
0,66280 průměr A
5,333333
průměr B
3,979592
t
0,66280 průměr A
5,333333
průměr B
3,979592
p
0,510503 sm.odch A
2,081666
sm.odch B
3,479043
p
0,510503 sm.odch A
2,081666
sm.odch B
3,479043
20
Skupina A: všechny feny s genotypem 435/498
21
Skupina B: všechny feny s genotypem 447a/498
Skupina A: všechny feny s alespoň jednou alelou 498
Skupina B: všechny feny s genotypem 447a/447a
t
-0,148869 průměr A
8,333333
průměr B
8,800000
t
0,734096 průměr A
8,684211
průměr B
7,760000
p
0,883517 sm.odch A
4,041452
sm.odch B
5,073742
p
0,466969 sm.odch A
4,679181
sm.odch B
3,677409
t
0,02236 průměr A
5,266667
t
2,08770 průměr A
5,315789
průměr B
3,160000
p
0,982438 sm.odch A
4,978047
p
0,042929 sm.odch A
4,447879
sm.odch B
2,303620
nepozornost
22
nepozornost
5,333333
průměr B
2,081666
sm.odch B
Skupina A: všichni psi s alespoň jednou alelou 498
23
Skupina B: všichni psi s genotypem 447a/447a
Skupina A: všichni homozygoti, nezáleţí na typu alely
Skupina B: všichni heterozygoti, nezáleţí na typu alely
t
-0,905325 průměr A
6,818182
průměr B
7,833333
t
-0,775663 průměr A
7,769231
průměr B
8,378378
p
0,371856 sm.odch A
3,280798
sm.odch B
2,987898
p
0,440051 sm.odch A
3,233497
sm.odch B
4,172338
nepozornost
nepozornost
t
0,45393 průměr A
5,000000
průměr B
4,500000
t
-1,35112 průměr A
4,000000
průměr B
4,945946
p
0,652849 sm.odch A
3,316625
sm.odch B
2,889260
p
0,180161 sm.odch A
2,700762
sm.odch B
3,908296
24
Skupina A: feny homozygoti, nezáleţí na typu alely
25
Skupina B: feny heterozygoti, nezáleţí na typu alely
t
-0,964715 průměr A
p
0,339331 sm.odch A
7,769231
průměr B
3,603417
sm.odch B
Skupina A: psi homozygoti, nezáleţí na typu alely
Skupina B: psi heterozygoti, nezáleţí na typu alely
8,846154
t
0,449012 průměr A
7,769231
průměr B
7,272727
4,406289
p
0,656191 sm.odch A
2,888705
sm.odch B
3,495452
nepozornost
nepozornost
t
-1,69514 průměr A
3,269231
průměr B
4,846154
t
-0,40793 průměr A
4,730769
průměr B
5,181818
p
0,096269 sm.odch A
2,324783
sm.odch B
4,134657
p
0,685808 sm.odch A
2,892164
sm.odch B
3,487641
26
9
Skupina B: všichni psi s genotypem 447a/447a
t
-0,076425 průměr A
p
0,939406 sm.odch A
Skupina A: všichni psi
Skupina B: všechny feny
7,760000
průměr B
7,833333
t
0,874426 průměr A
3,677409
sm.odch B
2,987898
p 0,384294 sm.odch A
nepozornost
8,307692
průměr B
7,621622
4,022186
sm.odch B
3,040023
4,057692
průměr B
4,864865
3,415153
sm.odch B
3,038294
nepozornost
t
-1,79883 průměr A
3,160000
průměr B
4,500000
t
-1,14963 průměr A
p
0,078468 sm.odch A
2,303620
sm.odch B
2,889260
p 0,253447 sm.odch A
Příloha 6 – fotografie laboratoře sekvenčních analýz Katedry genetiky a šlechtění
FAPPZ ČZU a přístroje ABI PRISM 100® (Applied Biosystems)
Příloha 7 - Autoři fotografií
Následující fotografie byly pouţity se svolením autorů.
Obrázek 1 - autor Ivan Linhart
Obrázek 2 - autor Milena Topinková
Obrázky 5, 6, 7, 8, 9 - autor Tomáš Seeman

Polymorfismus genu pro dopaminový receptor DRD4

Transkript

Podobné dokumenty

Borderholic 18

Cyklokilometry 2011 - Ha

Německé dogy v mém životě