Zlepšení přežití spolu s proapoptotickou molekulární a patologickou
Transkript
Zlepšení přežití spolu s proapoptotickou molekulární a patologickou
ROČNÍK 3 Journal • ČÍSLO of 1 • 11. ú nora 2011 Clinical Oncology P Ů V O D N Í S D Ě L E N Í Zlepšení přežití spolu s proapoptotickou molekulární a patologickou odpovědí při cílené duální blokádě mTOR a receptoru pro epidermální růstový faktor v preklinickém modelu kancerogeneze neuroendokrinních nádorů pankreatu Christopher W. Chiu, Hiroaki Nozawa a Douglas Hanahan Viz související editorial na str. 1 University of California, San Francisco, CA. Podáno 6. ledna 2010; přijato 12. července 2010; publikováno online před tiskem na www.jco.org 7. září 2010. Podpořeno granty, které byly poskytnuty D.H. organizací National Cancer Institute a nadací William K. Bowes Jr. Charitable Foundation. D.H. je profesorem American Cancer Society Research. Termíny vytištěné modře jsou definovány ve slovníčku na konci tohoto článku a online na www.jco.org. Prohlášení autorů o možném střetu zájmů a podíl jednotlivých autorů na přípravě článku se nacházejí na jeho konci. Adresa pro korespondenci: Douglas Hanahan, PhD, Swiss Institute for Experimental Cancer Research, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne, Life Sciences Building (SV), Rm SV‑2816, Lausanne, CH‑1015, Switzerland; e‑mail: [email protected]. © 2010 by American Society of Clinical Oncology 0732‑183X/10/2829‑4425/$20.00 DOI: 10.1200/JCO.2010.28.0198 S O U H R N Cíl Neuroendokrinní nádory pankreatu (pancreatic neuroendocrine tumor, PNET), ač vzácné, často metastazují a chirurgická resekce, jediná potenciálně kurativní léčba, tak u nich není možná. Pro nemocné s pokročilými PNET není doposud k dispozici účinná systémová terapie. Z tohoto důvodu jsou potřebné nové léčebné strategie. S tímto cílem realizovali autoři výzkum s využitím preklinic‑ kých myších modelů PNET, zaměřený na posouzení potenciálního prospěchu terapeutické duální inhibice kinázy receptoru pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor, EGFR) a mTOR (mammalian target of rapamycin – savčí rapamycinový cílený receptor). Materiál a metody Transgenním myším RIP‑Tag2 s pokročilými multifokálními PNET byl aplikován inhibitor mTOR rapa‑ mycin a inhibitor EGRF erlotinib. Monitorován byl nádorový růst a přežití a dále bylo prováděno vyšetření tumorózních tkání s cílem nalézt potenciální biomarkery odpovědi na podávanou terapii. Výsledky Monoterapie rapamycinem byla výrazně účinná, došlo k prodloužení přežití současně se stabili‑ zací nádorového růstu (stabilní onemocnění). Nakonec však došlo k rozvoji rezistence nádorového onemocnění, což dokazovala progrese růstu tumoru. Monoterapie erlotinibem navodila zpomalení růstu a přinesla hraniční zlepšení přežití. Při použití kombinace obou látek bylo u tohoto agresiv‑ ního multifokálního nádoru v porovnání s každou z monoterapií zaznamenáno nebývalé zlepšení přežití, přičemž nebyl patrný rozvoj adaptační rezistence. Kromě toho bylo zjištěno, že antiapo‑ ptotický protein survivin může sloužit jako biomarker senzitivity a příznivé odpovědi na cílenou duální inhibiční terapii. Závěr Preklinické studie na myších modelech endogenních PNET naznačují, že kombinovaná cílená blo‑ káda signálních drah mTOR a EGFR by mohla přinášet v terapii PNET potenciální klinický prospěch. Uvedené výsledky povzbudily přípravu a realizaci klinické studie fáze II zaměřené na zhodnocení účinnosti tohoto terapeutického režimu u lidských neuroendokrinních nádorů. J Clin Oncol 28:4425‑4433. © 2010 by American Society of Clinical Oncology ÚVOD Neuroendokrinní nádory pankreatu (pancrea‑ tic neuroendocrine tumor, PNET) mají nízkou (1–2%) incidenci, jejich prevalence mezi nádory pankreatu činí 10 % a velmi často jsou diagnosti‑ kovány v pokročilém stadiu, kdy po selhání che‑ moterapie jsou k dispozici pouze omezené léčebné možnosti.1,2 Z tohoto důvodu je zde naléhavá potřeba zavedení nových terapeutických postupů. V této studii zkoumali autoři na preklinických Journal of Clinical Oncology, Vol 28, No 29 (October 10), 2010: pp 4425–4433 modelech PNET dvě rozdílné, ale vzájemně pro‑ pojené signální dráhy uplatňující se v nádorové patogenezi: dráhu receptoru pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor recep‑ tor, EGFR/ErbB1; receptor 1 pro lidský epider‑ mální růstový faktor u lidí) a mTOR (mamma‑ lian target of rapamycin – savčí rapamycinový cílený receptor). Tento mTOR je všudypřítomná, vysoce zakonzervovaná serinová/threoninová kináza, která reguluje řadu buněčných funkcí, včetně syn‑ © 2010 by American Society of Clinical Oncology 9 Chiu, Nozawa a Hanahan tézy proteinů a buněčné proliferace, a její aktivace je prokazatelná u mnoha nádorů.3‑5 Rapamycin je potentní a specifický inhibitor mTOR a v tumorózních buněčných liniích a na myších modelech prokázal schopnost inhibovat nádorový růst, angiogenezi a metasta‑ zování, stejně jako schopnost indukovat apoptózu.6‑8 Dva rapamy‑ cinové analogy (tzv. „rapalogy“), everolimus a temsirolimus, již byly schváleny pro léčbu pokročilého karcinomu ledvin v případě selhání chemoterapie.9 U PNET prokázal everolimus v klinické stu‑ dii fáze II účinnost u metastatických forem onemocnění po selhání chemoterapie a v současnosti probíhá jeho hodnocení v klinické stu‑ dii fáze III coby léčby první linie u PNET.1,10,11 Popsán je i mecha‑ nismus adaptační rezistence vůči inhibitorům mTOR, který zahr‑ nuje ztrátu mTOR‑dependentní zpětnovazebné inhibice předřazené signální molekuly Akt kinázy,12‑14 jejíž zvýšená aktivita může zvrá‑ tit některé z efektů inhibice mTOR. Signální dráha EGFR ovlivňuje řadu vlastností nádorových buněk, včetně schopnosti proliferace, přežití, angiogeneze a invaze. Nadměrná exprese a/nebo zvýšená aktivita EGFR je u nádorů obvyklá a u mnoha typů lidských maligních tumorů koreluje se zhoršením přežití; mezi přenašeče signálu zařazené v této dráze patří též již výše zmíněná Akt kináza. Inhibitory EGFR, včetně erlotinibu, již byly schváleny pro léčbu duktálního karcinomu pan‑ kreatu a nemalobuněčného karcinomu plic.15 V jedné klinické stu‑ dii fáze II bylo prokázáno, že inhibitor EGFR gefitinib je účinný u progredujících metastatických forem PNET.16 Kvůli rozvoji růz‑ ných forem rezistence je však účinnost inhibitorů EGFR typicky pouze přechodná.17‑19 Ke studiu inhibice EGFR a mTOR, samostatně a v kombi‑ naci, na preklinických modelech PNET vedlo autory několik úvah. Za prvé pilotní studie autorů s rapamycinem a paralelní studie s erlotinibem20 prokázaly na modelech PNET účinnost každé z obou látek. Za druhé autoři předpokládali, že mechanismus adaptační rezistence na rapamycin může též zahrnovat zvýšenou aktivaci Akt kinázy, a pokud by tomu tak bylo, pak by bylo možno tuto rezi‑ stenci rušit erlotinibem, neboť v použitém modelu signální dráha EGFR aktivovala Akt.20 Třetí důvod pro realizaci tohoto preklinického výzkumu byl účelový: rozrůstající se paleta cílených léčiv, racionálních kombi‑ nací a sofistikovaných léčebných režimů zvyšuje logistické nároky ve smyslu nutnosti realizace instruktivních klinických studií spolu s potřebou upřednostňovat ty, které mají největší předpoklad úspě‑ chu. Preklinické pokusy na reprezentativních myších modelech lid‑ ských maligních nádorů mohou pravděpodobně představovat jednu z cest hodnocení léčiv na základě mechanismu účinku a přípravy návrhů klinických studií. Existuje skutečně důvod pro opatrný opti‑ mismus v tom smyslu, že preklinické studie na geneticky uprave‑ ných myších modelech maligních nádorů mohou jak podněcovat realizaci klinických studií, tak sloužit jako prediktor případného klinického prospěchu. Uvažujme např. o novém „chemo‑switch“ režimu publikovaném v tomto periodiku, který byl vyvinut na pro‑ totypu transgenního RIP1‑Tag2 myšího modelu PNET,21 zahrnu‑ jícím vysokodávkovanou chemoterapii (napodobující standardní léčbu) následovanou metronomickou (antiangiogenní) chemote‑ rapií kombinovanou se specifickým inhibitorem angiogeneze; uve‑ dený režim vyvolal parciální odpověď nádoru a vedl k prokazatel‑ nému zlepšení přežití.22 Výsledky nedávné, koncepčně obdobné klinické studie fáze II u karcinomu ledvin u lidí potvrdily klinický prospěch,23,24 což podporuje jak další klinický výzkum s použitím 10 © 2010 by American Society of Clinical Oncology „chemo‑switch“ režimu u karcinomu ledvin a dalších malignit, tak v širším smyslu využití geneticky upravených myších modelů lid‑ ských maligních tumorů pro hodnocení strategií cílené léčby zalo‑ žené na znalosti mechanismu účinku, což napomáhá při stanovení priorit a zdokonalování návrhů klinických studií. Předkládaná stu‑ die pokračuje v tomto přístupu. V dalším textu přinášejí autoři informaci o významném pro‑ spěchu cílené duální blokády EGFR a mTOR, která na myším modelu pokročilých PNET prokázala výraznou schopnost redukce nádorové masy a prodloužila očekávané přežití. V článku popsané preklinické pokusy inspirovaly realizaci právě probíhající klinické studie fáze II, která testuje bezpečnost a účinnost této kombino‑ vané cílené terapie u nemocných s neuroendokrinními nádory. MATERIÁL A METODY Laboratorní zvířata Všechny popsané studie na zvířatech byly schváleny komisí na ochranu zvířat při University of California, San Francisco. Od 12. týdne věku dostá‑ vali myši RIP1‑Tag2 potravu s 50% obsahem cukru (Harlan, Madison, WI) k úpravě hypoglykémie navozené nádorovou hyperprodukcí inzulinu. Experimentální studie Rapamycin (sirolimus; Rapamune; Wyeth, Madison, NJ) a erlotinib (Tarceva; Genentech, South San Francisco, CA) byly zakoupeny (univer‑ zitní lékárna, University of California, San Francisco). Erlotinib byl roz drcen a denně resuspendován v médiu (0,4% Tween‑20, NaCl 150 mmol/l a 0,5% karboxymethylcelulóza). Dávky léčiv byly zvířatům aplikovány denně pomocí žaludeční sondy, přičemž rapamycin byl podáván ráno a erlotinib odpoledne. Zvířata byla dvakrát týdně vážena a denně monitorována z hle‑ diska známek vyčerpání a kachexie a u moribundních jedinců bylo při‑ stoupeno k jejich utracení. Pankreas testovaných myší byl rozpreparován a všechny makro‑ skopicky patrné tumory (> 0,5 mm3) byly spočítány a změřeny. Objem tumoru (v) byl vypočítáván s využitím rovnice pro objem elipsoidu: v = 0,52 × (šířka)2 × (délka). Součet objemů všech nádorů u každé myši byl počítán jako tumorózní masa. Příprava tkání a imunohistochemické vyšetření Tkáně byly zality do parafínu25 a bylo provedeno značení protilátkami na imunohistochemické vyšetření a značení 3´‑OH konců DNA zlomů modi‑ fikovaným analogem báze pomocí terminální deoxynukleotidyltransferázy (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL), jak již bylo dříve popsáno.26 Primární protilátky zahrnovaly pan‑Akt, pAkt (ser473), pEGFR (tyr1068), pS6 ribosomální protein (Ser235/236) a survi‑ vin (Cell Signaling technology, Beverly, MA), anti‑CD31 a anti‑Meca‑32 (BD Biosciences, San Jose, CA), anti‑Desmin (Abcam, Cambridge, MA) a anti‑Ki67 (Novus, Littleton, CO). Řezy byly zpracovány pomocí DAB (Sigma‑Aldrich, St Louis, MO) nebo NovaRed (Vector labs, Burlingame, CA) a kontrastně nabarveny methylénovou zelení nebo hematoxylinem. Analýza životaschopnosti, apoptózy a buněčného cyklu S využitím Lipofectaminu 2000 byla provedena transfekce βTC3 buněk Birc5 nebo kontrolní siRNAs (Dharmacon, Lafayette, CO, L‑043690‑00‑0005) a tyto buňky byly následně analyzovány pomocí MTT testu životaschopnosti buněk (Invitrogen, Carlsbad, CA) a Annexin V testu apoptózy (BD Biosciences) podle protokolu výrobce. Pro účely analýzy buněčného cyklu byly buňky fixovány v 70% ledovém etanolu, promyty fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem, inkubovány ve fyziologickém roztoku s 0,1% Triton X‑100/fosfátovým pufrem spolu s propidium jodi‑ dem (20 μg/ml) a RNázou A (200 μg/ml) a následně analyzovány pomocí fluorescenčně aktivované separace buněk. Journal of Clinical Oncology Duální blokáda mTOR a EGFR v preklinickém modelu PNET VÝSLEDKY Zvýšená aktivace signálních drah mTOR a EGFR v průběhu onkogeneze PNET u Rip1‑Tag2 transgenních myší Autoři prováděli výzkum signálních drah mTOR a EGFR na RIP1‑Tag2 modelu, tj. dobře definovaném geneticky uprave‑ ném myším modelu PNET,21 přičemž daný výzkum byl motivo‑ ván jednak narůstajícími poznatky o úloze těchto vzájemně propo‑ jených signálních drah v procesu onkogeneze, jednak dostupností inhibitorů schválených pro klinickou praxi.7,27‑30 U sledovaných myší docházelo k synchronizované progresi od prekancerózních lézí až po invazivní tumory, což řešitelům umožnilo prověřovat stav akti‑ vace drah mTOR a EGFR v každé z těchto charakteristických fází vývoje PNET nádorů. Kromě toho byla rovněž hodnocena aktivita Akt kinázy – signálního převaděče zapojeného v obou okruzích. V normální pankreatické tkáni byla detekována pouze mini‑ mální aktivita dráhy mTOR a mírná aktivita dráhy EGFR a Akt (obr. 1). V průběhu tumorigeneze byla u RIP1‑Tag2 modelu pozo‑ rována výrazná, postupně narůstající aktivace mTOR, EGFR a Akt, což naznačuje, že tyto signální dráhy hrají v celém procesu zřejmě funkčně významné úlohy. Vzhledem k tomu, že jak signální dráha mTOR, tak EGFR jsou schopny modulovat expresi apoptotických regulačních fak‑ torů, sledovali autoři expresi inhibitorů apoptotických proteinů a faktorů přežití z rodiny Bcl2, přičemž v rámci této skupiny látek byla v průběhu nádorové progrese zjištěna zvýšená exprese pouze u proteinu Birc5 (survivinu) (obr. 2A až 2C, a nepublikovaná data). Stojí za pozornost, že survivin je ve zvýšené míře produkován u řady typů maligních nádorů a pro svoji omezenou expresi ve tkáních dospělých jedinců je považován za potenciální terapeutický cíl.31‑34 Jako úvod do studia možného významu uvedených pozorování v případě lidských PNET byla u vzorků normální tkáně lidských Langerhansových ostrůvků a vzorků z lidských PNET u provedena analýza kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí (polymerase chain reaction, PCR) .35 Ve většině testovaných vzorků lidských PNET (10 ze 14) byla zjištěna zvýšená exprese Birc5 (obr. 2D), což ukazuje na společné rysy s myšími PNET. Zmíněné výsledky jsou v souladu s předchozími studiemi u lidských neuroendokrinních tumorů, kde byla pozorována zvýšená exprese survivinu, a tento protein byl navržen za prediktivní biomarker nádorové progrese a přežití.36‑41 Studie účinnosti na molekulární úrovni (fáze 0) zahrnující duální inhibici signálních drah mTOR a EGFR Před zahájením studií dlouhodobé účinnosti provedli autoři na RIP1‑Tag2 myším modelu PNET výzkum modulace cílových struktur a kombinačního efektu. Byly vybrány dva inhibitory schvá‑ lené pro klinickou praxi: inhibitor EGFR erlotinib a inhibitor mTOR rapamycin. Transgenní myši RIP1‑Tag2 byly po tři dny léčeny rapa‑ mycinem v dávce 5 mg/kg nebo erlotinibem v dávce 80 mg/kg, popřípadě kombinací obou látek. Histochemické vyšetření buněk podstupujících programova‑ nou buněčnou smrt (apoptózu) prokázalo, že krátkodobá terapie rapamycinem vedla k významnému zvýšení výskytu nádorových buněk podléhajících apoptóze, zatímco léčba erlotinibem neměla v tomto smyslu žádný efekt (obr. 3A a 3C). Použití kombinace obou léčiv vedlo k výraznému nárůstu apoptózy v nádorové tkáni, při‑ čemž tento nárůst byl vyšší než v případě monoterapie rapamyci‑ nem. Imunohistochemické vyšetření s použitím markeru označují‑ cího proliferující buňky (Ki67) neprokázalo při léčbě rapamycinem žádný vliv na proliferaci, trend směrem ke snížení proliferační akti‑ vity při terapii erlotinibem a v kontrastu k tomu výraznou redukci proliferace v případě použití kombinace obou látek (obr. 3B a 3D). Poté se autoři snažili zjistit, zda použitá léčiva měla přímý vliv na nádorové buňky PNET, neboť v případě obou inhibitorů byly v jiných souvislostech publikovány informace o tom, že kromě tumorózních buněk ovlivňují nádorovou vaskulaturu a zánětlivé buňky.6,42‑44 Za tímto účelem testovali terapii na βTC3 – nádoro‑ vých buněčných linií odvozených z PNET.45 V souladu s výsledky in vivo snižoval každý z inhibitorů životaschopnost a zvyšoval frek‑ venci výskytu apoptózy nádorových buněk v kultuře, přičemž nej‑ účinnější v tomto smyslu byla kombinace obou látek (obr. 3E a 3F). Imunohistochemické vyšetření tumorózní tkáně prokázalo účinnou in vivo inhibici EGFR a mTOR jak v nádorových buňkách, tak v nádorové vaskulatuře (obr. 4A a 4C). Aktivita Akt kinázy, která je v dráze zařazena za EGFR a předřazena před mTOR, však byla při Normální stadium Hyperplastické stadium Angiogenní stadium pEGFR (Y1086) pAkt (S473) pS6 Rib. Prot (S235/236) www.jco.org Tumorózní stadium Obrázek 1. Progresivní aktivace signální dráhy Akt/mTOR (mammalian target of rapamycin – savčí rapamycinový cílený receptor) a dráhy receptoru pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor, EGFR) v průběhu onkogeneze neuroendokrinních nádorů pankreatu u myší RIP1‑Tag2. Pankreas byl odebírán nemodifikovaným zvířatům v 5. týdnu jejich věku a ve skupině myší RIP1‑Tag2 v 5., 7,5. a 12. týdnu věku, což postupně odpovídalo hyperplastickému, angiogennímu a nádorovému stadiu. Imunohistochemické vyšetření bylo prováděno pomocí protilátek označujících aktivaci EGFR, mTOR a Akt: fosforylovaný EGFR (pEGFR‑Y1086), fosforylovaný ribosomální protein S6 (Rib. Prot; pS6–S235/236) a fosforylovaná Akt kináza (pAkt–S473). Zobrazeny jsou reprezentativní léze. Měřítko 50 μm. © 2010 by American Society of Clinical Oncology 11 Chiu, Nozawa a Hanahan A Normální stadium Hyperplastické stadium Angiogenní stadium Tumorózní stadium Survivin 75 pAkt (S473) 50 75 Pan-Akt 50 20 Survivin 15 50 b Actin 37 Exprese hBirc5 (survivinu) jako procento exprese hGUS D C 10 Exprese Birc5 (survivinu) normalizovaná na L19 No rm á No lní s ta rm di ál u A n ní s m t ad gi og i en um Tu ní m s ta or di óz um ní st ad iu m B 7,5 5,0 2,5 0 Normální Hyperplastické Angiogenní Tumorózní stadium stadium stadium stadium 3,5 3,0 2,5 Obrázek 2. Zvýšená exprese survivinu v průběhu progrese nádorového růstu u myší RIP1‑Tag2 a lidských neuroendokrinních nádorů pankreatu (pancreatic neuroendocrine tumor, PNET). (A) Imunohistochemické vyšetření reprezentativních lézí zaměřené na expresi Birc5 (survivinu) v hyperplastickém, angiogenním a nádorovém stadiu. Měřítko 50 μm. (B) Western blot a (C) kvantitativní polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) potvrzují zvýšenou expresi Birc5 v průběhu progrese PNET u RIP1‑Tag2 transgenních myší. (D) Kvantitativní PCR analýza lidského Birc5 (hBirc5) u tří vzorků normální tkáně Langerhansových ostrůvků a 14 vzorků lidských PNET. Údaje byly normalizovány na expresi kontrolního genu lidské β‑glukuronidázy (human glucuronidase, hGUS). 2,0 1,5 1,0 0,5 0 Normální tkáň ostrůvků PNET použití každé z monoterapií inhibována jen minimálně. V ostrém kontrastu k tomuto zjištění měla duální inhibice signálních drah mTOR a EGFR za následek výrazné potlačení aktivity Akt kinázy, což korelovalo se snížením proliferační aktivity (obr. 4A, 3B a 3D). Podníceni pozorováním, že antiapoptotický protein survivin je v procesu tumorigeneze u těchto nádorů produkován ve zvýšené míře, hodnotili autoři vliv terapie na jeho expresi. Při léčbě rapamy‑ cinem došlo k významnému snížení exprese survivinu, přičemž toto snížení se ještě prohloubilo při použití kombinované terapie (obr. 4A až 4C). Významné je, že exprese survivinu korelovala inverzně s rozsahem programované buněčné smrti (obr. 3A a 3B), což je v souladu s jeho popsanou rolí coby faktoru predikujícího přežití. Aby autoři zjistili, zda by mohl survivin ovlivňovat životaschop‑ nost tumorózních buněk, vyřadili v nádorových buněčných liniích PNET jeho genovou expresi pomocí siRNA proti Birc5. Tento zásah vedl k výraznému snížení životaschopnosti a zvýšení míry apo‑ ptózy (Dodatek, obr. 1A‑1D). Kromě toho byl zaznamenán osmi‑ násobný nárůst počtu buněk v G2/M fázi buněčného cyklu, což ukazuje na zástavu buněčného dělení (Dodatek, obr. 1E).46,47 Sur‑ vivin tak má v nádorových buňkách PNET prokazatelný funkční význam pro usnadnění průchodu buněk cyklem buněčného dělení a při omezování míry programované buněčné smrti. 12 © 2010 by American Society of Clinical Oncology Studie účinnosti duální inhibice signálních drah mTOR a EGFR Následně zahájili autoři realizaci preklinických studií navr‑ žených s cílem zjistit, zda použitá terapeutická kombinace bude u laboratorních zvířat schopna vyvolat protinádorovou odpověď a prodloužit přežití. Regresní studie s definovaným cílovým para‑ metrem48 byla nejprve provedena na zvířatech nesoucích sledované nádory léčených erlotinibem v dávce 80 mg/kg. Ačkoli terapie erlo‑ tinibem vedla k významnému zpomalení nádorového růstu, pou‑ žitá dávka byla při chronickém podávání toxická, což mělo za násle‑ dek ztrátu hmotnosti a zkrácení přežití (Dodatek, obr. 2). Když byla dávka erlotinibu snížena na dobře tolerovanou hodnotu 50 mg/kg, nádorový růst byl bržděn stále, ale ztráta hmotnosti již byla mini‑ mální. Rapamycin byl v monoterapii vysoce účinný, vedl ke stabi‑ lizaci onemocnění bez zjevných projevů toxicity. Špatně tolerovaný, vysokodávkovaný erlotinib vedl při použití v kombinaci s rapa‑ mycinem v takto léčené kohortě v porovnání s výchozím stavem a kohortami s monoterapií k výraznému zmenšení nádorové masy. Nižší, dobře tolerovaná dávka erlotinibu v kombinaci s rapamyci‑ nem byla v redukci nádorové masy i exprese survivinu a ve zvýšení míry apoptózy méně účinná (Dodatek, obr. 2 a 3), ale výrazně nižší toxicita diktuje nutnost použití této dávky i v následujících studiích. Journal of Clinical Oncology Duální blokáda mTOR a EGFR v preklinickém modelu PNET A Vehikulum Rapamycin (5 mg/kg) Erlotinib (80 mg/kg) Rapamycin plus erlotinib TUNEL B Ki67 D p < 0,01 10 Ki67 pozitivní buňky (%) 7,5 p < 0,001 5,0 2,5 0 p < 0,001 0,3 p < 0,001 0,2 p < 0,001 p < 0,001 0,1 0 Vehikulum Rapamycin Erlotinib Rapamycin (50 nmol/l) (10 µmol/l) + erlotinib 7,5 5,0 p < 0,01 2,5 0 Vehikulum Rapamycin Erlotinib Rapamycin (5 mg/kg) (80 mg/kg) + erlotinib E MTT test (O.D. 570) 10 p < 0,0001 F Podíl z celkového počtu buněk TUNEL pozitivní buňky (%) C Vehikulum Rapamycin Erlotinib Rapamycin (5 mg/kg) (80 mg/kg) + erlotinib Pozdní stadium apoptózy Časné stadium apoptózy Celkový počet apoptotických buněk 7 6 5 4 3 2 1 0 m ulu hik Ve cin my pa Ra Pozdní stadium apoptózy Vehikulum 0,4 Rapamycin 0,77 Erlotinib 1,24 Rapamycin plus erlotinib 0,67 V dalším kroku byla, počínaje 12. týdnem věku zvířat, realizo‑ vána studie přežití, jejímž smyslem bylo posoudit prospěch terapie rapamycinem, nízkodávkovaným erlotinibem a kombinací obou látek. Myši, kterým bylo podáváno pouze vehikulum, se dožívaly průměrného věku 16,7 týdne (obr. 5A). Monoterapie erlotinibem vykazovala podobně jako ve studiích u lidí49 pouze hraniční účin‑ nost. Významného prodloužení života bylo naproti tomu dosa‑ ženo u zvířat léčených rapamycinem (z 16,7 na 22,7 týdne). Kom‑ binovaná terapie vedla k dalšímu prodloužení průměrného přežití z 16,7 na 28 týdnů, což bylo významné i v porovnání s účinnou monoterapií rapamycinem. Při každé příležitosti byla z moribundních zvířat odebírána tumorózní tkáň. Zvířata v kontrolní skupině a ve skupině léčené pouze erlotinibem umírala krátce po 16. týdnu života a nebyla www.jco.org b ini lot Er in yc inib am rlot p e Ra + Časné stadium apoptózy 3,18 4,36 4,35 6,3 Celkový počet apoptotických buněk 3,58 5,13 5,59 6,97 Obrázek 3. Studie účinnosti na molekulární úrovni: kombinační účinky krátkodobé inhibice signálních drah mTOR a receptoru pro epidermální růstový faktor. Myším RIP1‑Tag2 ve věku 12 týdnů bylo po dobu tří dnů podáváno vehikulum, rapamycin (5 mg/kg), erlotinib (80 mg/kg) nebo kombinace obou inhibitorů. (A) Apoptóza byla detekována analýzou zlomů DNA značením 3´‑OH konec zlomu modifikovaným analogem báze pomocí terminální deoxynukleotidyltransferázy (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end‑labeling, TUNEL) a kvantifikována (C). Proliferační aktivita byla podobně analyzována imunohistochemickým průkazem Ki67 (B) a kvatifikována (D). Údaje byly odečítány z pěti polí u dvou až tří nádorů, které byly odebrány vždy od tří myší v každé léčebné skupině a analyzovány pomocí Mannova‑Whitneyova dvoustranného testu (InStat, GraphPad Software, San Diego, CA). Měřítko 100 μm. (E) Životaschopnost buněk byla posuzována s použitím laboratorního MTT testu, který měřil viabilitu (započítávaje jak proliferaci buněk, tak buněčnou smrt) v βTC3 buněčných liniích odvozených z neuroendokrinních tumorů pankreatu myší RIP1‑Tag2 a vystavených po dobu 72 h působení vehikula, rapamycinu (50 nmol/l, rozpuštěného v 95% ethylalkoholu), erlotinibu (10 μmol/l, rozpuštěného v dimethylsulfoxidu) nebo kombinaci obou inhibitorů. (F) Hodnocení časných (annexin V+/PI–) a pozdních (annexin V +/PI +) stadií apoptotické buněčné smrti v βTC3 buněčných kulturách vystavených po dobu 24 h působení vehikula, rapamycinu (10 nmol/l), erlotinibu (10 μmol/l) nebo kombinace obou inhibitorů bylo prováděno pomocí Annexin V testu/průtokové cytometrie se značením propidium jodidem. do analýzy zařazena, protože jejich nádory byly analogické nálezům v regresních studiích (Dodatek, obr. 1–3). Z tohoto důvodu byly ve studii přežití tkáně porovnávány pouze mezi zvířaty z kohorty s monoterapií rapamycinem a kohorty s kombinovanou terapií. Průměrný věk při odběru tkáně byl ve skupině léčené pouze rapa‑ mycinem 22,6 týdne a ve skupině léčené kombinací inhibitorů 26,9 týdne. Zvířata ze skupiny léčené kombinací inhibitorů měla, nehledě na skutečnost, že myši v této kohortě byly o více než měsíc starší než ve skupině s monoterapií rapamycinem, třikrát menší tumorózní masu s nižším počtem nádorů (obr. 5B a 5C). Kombinovaná léčba vedla v porovnání s monoterapií rapa‑ mycinem k výraznému snížení proliferační aktivity a exprese sur‑ vivinu a ke zvýšení míry apoptózy (obr. A1 v příl., pouze online). Významné je, že snížení exprese survivinu a zvýšení míry buněčné © 2010 by American Society of Clinical Oncology 13 Chiu, Nozawa a Hanahan A Vehikulum Rapamycin (5 mg/kg) Erlotinib (80 mg/kg) Rapamycin + erlotinib pEGFR (Y1086) pS6 Rib. Prot (S235/236) pAkt (S473) C 30 p < 0,05 Ve Survivin-pozitivní buňky (%) B hi Ra kul pa um m Er y lo cin tin ( Ra ib 5 m pa (8 g/ 0 k m yc mg g) in /k g + er ) lo tin ib Survivin 20 37 p < 0,01 p < 0,01 10 0 25 75 50 20 Vehicle Rapamycin (5 mg/kg) Erlotinib (80 mg/kg) Rapamycin + erlotinib 15 50 37 smrti byly obdobné pozorováním učiněným v průběhu regresních studií, což ukazuje, že tento terapeutický režim byl schopen navo‑ dit dlouhodobou stabilizaci onemocnění (obr. A1 v příl., pouze online; Dodatek, obr. 3). Je zajímavé, že u zvířat léčených pouze rapamycinem byla pozorována výrazná reaktivace signální dráhy mTOR svědčící o rozvoji adaptivní rezistence vůči této monotera‑ pii, přičemž vzniku uvedené rezistence bylo možno zabránit použi‑ tím kombinované léčby (Dodatek, obr. 4). DISKUSE V této studii využili její autoři preklinický myší model PNET ke zhodnocení účinnosti kombinovaných terapeutických režimů zaměřených na inhibici signálních drah mTOR a EGFR v léčbě pokročilých PNET. Základní úvaha je založena na předpokladu, že inhibice EGFR by mohla potlačit vznik adaptační rezistence zahr‑ nující ztrátu zpětnovazebné inhibice a následnou hyperaktivaci Akt kinázy, ke které dochází v případě, že je blokována pouze sig‑ 14 © 2010 by American Society of Clinical Oncology pS6 Rib. Prot. 32 kDa Obrázek 4. Inhibice receptoru pro epider‑ mální růstový faktor (epidermal growth factor receptor, EGFR), mTOR (mamma‑ lian target of rapamycin – savčí rapamy‑ cinový cílený receptor) a Akt, a snížení exprese survivinu u neuroendokrinních tumorů pankreatu (pancreatic neuroendo‑ crine tumor, PNET) při krátkodobé terapii erlotinibem a rapamycinem. Transgenním myším RIP1‑Tag2 ve věku 12 týdnů bylo po dobu tří dnů podáváno vehikulum, rapa mycin (5 mg/kg), erlotinib (80 mg/kg) nebo kombinace obou inhibitorů. (A) Imunohis‑ tochemické vyšetření tkáňových řezů PNET na survivin a dále na pEGFR, pS6 a pAkt za účelem posouzení aktivace EGFR, mTOR a Akt. Měřítko 100 μm. (B) Exprese survivinu vyjádřená jako procento survivin‑pozitivních buněk v nádorech. Údaje byly odečítány z pěti polí u dvou až tří nádorů, které byly odebrány vždy od tří myší v každé léčebné skupině a porovnávány proti kontrolní skupině s využitím Mannova‑Whitneyova dvou stranného testu (InStat, GraphPad Soft‑ ware, San Diego, CA). (C) Stanovení pS6, pAkt a survivinu pomocí vyšetření Western blot v extraktech z PNET u každé z léčebných skupin. pAkt (S473) 60 kDa Survivin 16kDa b Actin 42 kDa nální dráha mTOR.12‑14 Ačkoli se tato rezistence podílela na koneč‑ ném přechodu do progresivního onemocnění, byla inhibice dráhy mTOR formou monoterapie překvapivě účinná, odrážejíc tak neo‑ čekávané léčebné odpovědi pozorované při léčbě analogem rapa‑ mycinu everolimem v klinických studiích PNET u lidí, kde byly zaznamenány jak stabilizace onemocnění, tak prodloužení celko‑ vého přežití.1 V současnosti probíhá klinická studie fáze III, jejímž cílem je posoudit možné použití inhibitorů mTOR v terapii první linie u PNET.1,11 Zajímavé je, že ačkoli autoři předpokládali, že by rapamycin mohl oslabit zánětlivou reakci a/nebo angiogenezi,6,8 byl jeho primární účinek zaměřen na nádorové buňky, kde vyvo‑ lával zvýšení míry apoptózy a potlačoval buněčné dělení, přičemž neměl žádný prokazatelný vliv na nádorovou vaskulaturu (Doda‑ tek, obr. 5). Mírná účinnost pozorovaná při monoterapii inhibitorem EGFR erlotinibem je v souladu s výsledky nedávné studie zkoumající sig‑ nální dráhu EGFR u PNET na myších RIP‑Tag2,20 a navíc odráží sní‑ žení dávky, jehož cílem bylo zmírnění toxicity. Důležité je, že u inhi‑ Journal of Clinical Oncology Duální blokáda mTOR a EGFR v preklinickém modelu PNET A 120 Vehikulum Rapamycin (5 mg/kg) Erlotinib (50 mg/kg) Rapamycin + erlotinib 100 Přežití (%) 80 60 p < 0,0001 40 p < 0,0001 p < 0,0001 20 * 0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Čas (týdny) C 300 200 p < 0,05 100 0 Rapamycin Rapamycin + erlotinib Objem nádoru Objem nádoru B 15 10 p < 0,05 5 0 Rapamycin bitorů EGFR, včetně erlotinibu, již byly zaznamenány problémy s toxicitou v klinických studiích, patrně odrážející jejich roli v nor‑ mální orgánové homeostáze.49‑52 Data získaná autory naznačují, že ačkoli mohou inhibitory EGFR přinášet v monoterapii u lidských PNET jen omezený prospěch, vykazují při použití v nižších dávkách v kombinaci s léčivy inhibujícími mTOR, včetně analogů rapamycinu nacházejících se v konečných stadiích klinického vývoje a možná též novějších generací inhibitorů obou nedávno identifikovaných mTOR kinázových komplexů mTORC1 a mTORC2, slibné výsledky.53‑55 Inhibitory mTOR a EGFR vykazovaly v kombinaci výborné výsledky, jejich použití vedlo k významnému zlepšení přežití a pro‑ dloužení období tumorózní regrese a stabilního onemocnění. Studie přežití ukázaly, že ačkoli byla monoterapie rapamycinem překvapivě účinná, po určitém období stabilizace/regrese se nakonec nádory staly vůči této léčbě rezistentními, což vedlo ke vzniku objemných tumorů s vysokou proliferační aktivitou a nízkou mírou apoptózy. Naproti tomu kombinovaná inhibice navodila jak v regresních stu‑ diích, tak ve studiích přežití dlouhodobou supresi nádorového růstu a omezila vznik adaptační rezistence. Při pátrání po vhodném biomarkeru léčebné odpovědi autoři zjistili, že kombinovaná terapie snižovala jinak zvýšenou expresi antiapoptotického faktoru a ukazatele mitotické aktivity survivinu, což korelovalo se zvýšenou mírou apoptózy a potlačením prolife‑ www.jco.org Obrázek 5. Studie přežití u myší RIP1‑Tag2 léčených rapamycinem a erlotinibem. (A) Přežití u zvířat léčených vehikulem (n = 16), rapamycinem (5 mg/kg, n = 11), erlotinibem (50 mg/kg, n = 16) nebo kombinací rapamycinu a erlotinibu (n = 15). Údaje byly analyzovány pomocí log‑rank testu (Russell Thompson: The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, http://bioinf.wehi.edu.au/software/russell/ logrank/index.html). Objem tumoru (B) a počet nádorů (C) ze vzorků odebraných při utracení myší léčených rapamycinem (n = 7; průměrný věk 22,6 týdnů) nebo kombinací rapamycinu s erlotinibem (n = 8; průměrný věk 26,9 týdne). Data byla analyzována pomocí Mannova‑Whitneyova dvoustranného testu (InStat, Graph‑Pad Software, San Diego, CA). Rapamycin + erlotinib race v takto léčených nádorech. Inhibice exprese Birc5 vedla pro‑ střednictvím zvýšení míry apoptózy a navozením zástavy buněč‑ ného cyklu k významnému snížení životaschopnosti tumorózních buněk PNET, což je v souladu s jeho funkční rolí u těchto nádorů. Survivin je vzhledem ke zvýšení své exprese u různých lidských maligních nádorů považován za biomarker a funkčně významnou molekulu; navíc je známo, že zvýšení exprese survivinu je odpo‑ vědí na aktivaci řady onkogenních signálních drah, včetně dráhy mTOR.31‑34,39,56 Bylo by jistě zajímavé zjistit, zda má survivin též význam coby biomarker vhodný pro hodnocení účinnosti této a dal‑ ších terapií u lidských neuroendokrinních nádorů. Výsledky uvedené preklinické studie vedly k zahájení právě probíhající klinické studie fáze II, navržené za účelem zhodnocení bezpečnosti a účinnosti léčby everolimem a erlotinibem u pacientů s neuroendokrinními tumory nízkého stupně malignity.57 Kromě standardních sledovaných parametrů bezpečnosti a účinnosti bude zkoumána též využitelnost možných biomarkerů aktivity signál‑ ních drah mTOR a EGFR. V archivovaných vzorcích nádorové tkáně bude stanovována počáteční úroveň exprese PTEN, pAkt, p70S6K1, pEGFR, p‑IRS, p‑mTOR a p‑4E‑BP, přičemž v současné době je prověřována možnost stanovení exprese survivinu. Prekli‑ nické výsledky předvídají, že kombinovaná léčba inhibitory mTOR a nižší, lépe tolerovanou dávkou erlotinibu (a dalších inhibitorů © 2010 by American Society of Clinical Oncology 15 Chiu, Nozawa a Hanahan EGFR) přinese u nemocných s PNET a možná i dalšími malig‑ ními nádory klinický prospěch. Poslední preklinické studie nazna‑ čují, že obdobného prospěchu je možno dosáhnout u karcinomu prostaty26 a adenokarcinomu biliárního traktu.58 Důležité však je, že ne u všech typů nádorů lze očekávat příznivou odpověď na tuto kombinovanou léčbu, neboť klinické studie s kombinacemi inhi‑ bitorů mTOR a EGFR u glioblastomu59 a karcinomu prsu60 proká‑ zaly nejistou účinnost. Využití geneticky modifikovaných myších modelů jiných lidských nádorů může umožnit identifikaci dalších typů, které budou odpovídat na tuto léčbu, čímž mohou podní‑ tit realizaci klinických studií v těchto indikacích, jak to ilustruje předkládaná prototypová preklinická studie a její prvotní translace. PROHLÁŠENÍ AUTORŮ O MOŽNÉM STŘETU ZÁJMŮ Všichni autoři vyplnili toto prohlášení; následující autoři udali finanční nebo jiný zájem, který je relevantní pro látku posuzovanou v tomto článku. Určité vztahy označené písmenem „U“ jsou ty, za něž nebyla obdržena žádná kompenzace; vztahy označené písmenem „C“ byly kompenzovány. LITERATURA 1. Yao JC, Lombard‑Bohas C, Baudin E, et al: Daily oral everolimus activity in patients with meta‑ static pancreatic neuroendocrine tumors after failure of cytotoxic chemotherapy: A phase II trial. J Clin Oncol 28:69‑76, 2010 2. Yao JC, Eisner MP, Leary C, et al: Population‑ based study of islet cell carcinoma. Ann Surg Oncol 14:3492‑3500, 2007 3. Seeliger H, Guba M, Kleespies A, et al: Role of mTOR in solid tumor systems: A therapeutical target against primary tumor growth, metastases, and angio‑ genesis. Cancer Metastasis Rev 26:611‑621, 2007 4. Albanell J, Dalmases A, Rovira A, et al: MTOR signalling in human cancer. Clin Transl Oncol 9:484‑493, 2007 5. Missiaglia E, Dalai I, Barbi S, et al: Pancreatic endocrine tumors: Expression profiling evidences a role for AKT‑mTOR pathway. J Clin Oncol 28:245‑255, 2010 6. Guba M, Yezhelyev M, Eichhorn ME, et al: Rapamycin induces tumor‑specific thrombosis via tissue factor in the presence of VEGF. Blood 105: 4463‑4469, 2005 7. Konings IR, Verweij J, Wiemer EA, et al: The applicability of mTOR inhibition in solid tumors. Curr Cancer Drug Targets 9:439‑450, 2009 8. Guba M, Koehl GE, Neppl E, et al: Dosing of rapamycin is critical to achieve an optimal antiangio‑ genic effect against cancer. Transpl Int 18:89‑94, 2005 9. Dancey J: MTOR signaling and drug develop‑ ment in cancer. Nat Rev Clin Oncol 7:209‑219, 2010 10. Yao JC, Phan AT, Chang DZ, et al: Efficacy of RAD001 (everolimus) and octreotide LAR in advanced low‑ to intermediate‑grade neuroendocrine tumors: Results of a phase II study. J Clin Oncol 26:4311‑4318, 2008 11. Novartis: Efficacy and Safety of Everolimus (RAD001) in Female or Male Patients 18 Years or Older With Advanced Neuroendocrine Tumors (RADIANT‑3). National Institutes of Health, 2009. http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00510068 12. O’Reilly KE, Rojo F, She QB, et al: MTOR inhi‑ bition induces upstream receptor tyrosine kinase signaling and activates Akt. Cancer Res 66:1500‑1508, 2006 13. Sun SY, Rosenberg LM, Wang X, et al: Acti‑ vation of Akt and eIF4E survival pathways by 16 © 2010 by American Society of Clinical Oncology Pro detailní popis kategorií prohlášení nebo pro více informací o politice střetu zájmů ASCO odkazujeme čtenáře na Author Disclosure Declaration a kapitolu Disclosures of Potential Conflicts of Interest v informacích pro autory. Zaměstnání nebo vedoucí pozice: Nikdo Funkce konzultanta nebo poradce: Douglas Hanahan, Pfizer (C) Vlastnictví akcií: Nikdo Honoráře: Nikdo Financování výzkumu: Nikdo Znalecký posudek: Nikdo Jiné odměny: Nikdo PODÍL AUTORŮ NA ČLÁNKU Koncepce a návrh: Christopher W. Chiu, Douglas Hanahan Finanční podpora: Hiroaki Nozawa, Douglas Hanahan Sběr a kompletace údajů: Christopher W. Chiu, Hiroaki Nozawa Analýza a interpretace údajů: Christopher W. Chiu, Douglas Hanahan Psaní rukopisu: Christopher W. Chiu, Douglas Hanahan Konečné schválení rukopisu: Christopher W. Chiu, Hiroaki Nozawa, Douglas Hanahan rapamycin‑mediated mammalian target of rapamycin inhibition. Cancer Res 65:7052‑7058, 2005 14. Carracedo A, Ma L, Teruya‑Feldstein J, et al: Inhibition of mTORC1 leads to MAPK pathway acti‑ vation through a PI3K‑dependent feedback loop in human cancer. J Clin Invest 118:3065‑3074, 2008 15. Ciardiello F, Tortora G: EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med 358:1160‑1174, 2008 16. Hobday TJ, Holen K, Donehower R, et al: A phase II trial of gefitinib in patients (pts) with progressive metastatic neuroendocrine tumors (NET): A Phase II Consortium (P2C) study. J Clin Oncol 24:189s, 2006 (suppl; abstr 4043) 17. Morgillo F, Bareschino MA, Bianco R, et al: Primary and acquired resistance to anti‑EGFR targeted drugs in cancer therapy. Differentiation 75: 788‑799, 2007 18. Moore MJ, Goldstein D, Hamm J, et al: Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: A phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clin‑ ical Trials Group. J Clin Oncol 25:1960‑1966, 2007 19. von Wichert G, Jehle PM, Hoeflich A, et al: Insulin‑like growth factor‑I is an autocrine regu‑ lator of chromogranin: A secretion and growth in human neuroendocrine tumor cells. Cancer Res 60:4573‑4581, 2000 20. Nolan‑Stevaux O, Truitt MC, Pahler JC, et al: Differential contribution to neuroendocrine tumori‑ genesis of parallel EGFR signaling in cancer cells and pericytes. Genes Cancer 1:125‑141, 2010 21. Hanahan D: Heritable formation of pancre‑ atic beta‑cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature 315:115‑122, 1985 22. Pietras K, Hanahan D: A multitargeted, metro‑ nomic, and maximum‑tolerated dose “chemoswitch” regimen is antiangiogenic, producing objective responses and survival benefit in a mouse model of cancer. J Clin Oncol 23:939‑952, 2005 23. Bellmunt J, Trigo JM, Calvo E, et al: Activity of a multitargeted chemo‑switch regimen (sorafenib, gemcitabine, and metronomic capecitabine) in metastatic renal‑cell carcinoma: A phase 2 study (SOGUG‑02‑06). Lancet Oncol 11:350‑357, 2010 24. Ravaud A, Grossgoupil M: Metronomic chemo‑ therapy for renal cancer in the landscape of targeted therapy. Lancet Oncol 11:307‑308, 2010 25. Lopez T, Hanahan D: Elevated levels of IGF‑1 receptor convey invasive and metastatic capability in a mouse model of pancreatic islet tumorigenesis. Cancer Cell 1:339‑353, 2002 26. Kinkade CW, Castillo‑Martin M, Puzio‑Kuter A, et al: Targeting AKT/mTOR and ERK MAPK signaling inhibits hormone‑refractory prostate cancer in a preclinical mouse model. J Clin Invest 118:3051‑3064, 2008 27. Wang MY, Lu KV, Zhu S, et al: Mammalian target of rapamycin inhibition promotes response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors in PTEN‑deficient and PTEN‑intact glioblastoma cells. Cancer Res 66:7864‑7869, 2006 28. Abraham RT, Eng CH: Mammalian target of rapamycin as a therapeutic target in oncology. Expert Opin Ther Targets 12:209‑222, 2008 29. Herberger B, Berger W, Puhalla H, et al: Simul‑ taneous blockade of the epidermal growth factor receptor/mammalian target of rapamycin pathway by epidermal growth factor receptor inhibitors and rapamycin results in reduced cell growth and survival in biliary tract cancer cells. Mol Cancer Ther 8:1547‑1556, 2009 30. Gemmill RM, Zhou M, Costa L, et al: Syner‑ gistic growth inhibition by Iressa and Rapamycin is modulated by VHL mutations in renal cell carcinoma. Br J Cancer 92:2266‑2277, 2005 31. Altieri DC: New wirings in the survivin networks. Oncogene 27:6276‑6284, 2008 32. Ambrosini G, Adida C, Altieri DC: A novel anti‑apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med 3:917‑921, 1997 33. Carelli S, Lesma E, Paratore S, et al: Survivin expression in tuberous sclerosis complex cells. Mol Med 13:166‑177, 2007 34. Vaira V, Lee CW, Goel HL, et al: Regulation of survivin expression by IGF‑1/mTOR signaling. Onco‑ gene 26:2678‑2684, 2007 35. Olson P, Lu J, Zhang H, et al: MicroRNA dynamics in the stages of tumorigenesis correlate with hallmark capabilities of cancer. Genes Dev 23:2152‑2165, 2009 36. Tanaka K, Iwamoto S, Gon G, et al: Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas. Clin Cancer Res 6:127‑134, 2000 37. Kawasaki H, Toyoda M, Shinohara H, et al: Expression of survivin correlates with apop‑ tosis, proliferation, and angiogenesis during human colorectal tumorigenesis. Cancer 91:2026‑2032, 2001 38. Xing N, Qian J, Bostwick D, et al: Neuroendo‑ crine cells in human prostate over‑express the anti‑ apoptosis protein survivin. Prostate 48:7‑15, 2001 Journal of Clinical Oncology Duální blokáda mTOR a EGFR v preklinickém modelu PNET 39. Grabowski P, Griss S, Arnold CN, et al: Nuclear survivin is a powerful novel prognostic marker in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor disease. Neuroendocrinology 81:1‑9, 2005 40. Koch CA, Vortmeyer AO, Diallo R, et al: Survivin: A novel neuroendocrine marker for pheo‑ chromocytoma. Eur J Endocrinol 146:381‑388, 2002 41. Monzó M, Rosell R, Felip E, et al: A novel anti‑apoptosis gene: Re‑expression of survivin messenger RNA as a prognosis marker in non‑small‑cell lung cancers. J Clin Oncol 17:2100‑2104, 1999 42. Pore N, Jiang Z, Gupta A, et al: EGFR tyro‑ sine kinase inhibitors decrease VEGF expression by both hypoxia‑inducible factor (HIF)‑1‑independent and HIF‑1‑dependent mechanisms. Cancer Res 66:3197‑3204, 2006 43. Lübbe J, Masouyé I, Dietrich PY: General‑ ized xerotic dermatitis with neutrophilic spongi‑ osis induced by erlotinib (Tarceva). Dermatology 216:247‑249, 2008 44. Lee DF, Hung MC: All roads lead to mTOR: Integrating inflammation and tumor angiogenesis. Cell Cycle 6:3011‑3014, 2007 45. Radvanyi F, Christgau S, Baekkeskov S, et al: Pancreatic beta cells cultured from individual preneo‑ plastic foci in a multistage tumorigenesis pathway: A potentially general technique for isolating physi ologically representative cell lines. Mol Cell Biol 13:4223‑4232, 1993 46. Temme A, Rieger M, Reber F, et al: Localiza‑ tion, dynamics, and function of survivin revealed by expression of functional survivinDsRed fusion proteins in the living cell. Mol Biol Cell 14:78‑92, 2003 47. Kappler M, Bache M, Bartel F, et al: Knock‑ down of survivin expression by small interfering RNA reduces the clonogenic survival of human sarcoma cell lines independently of p53. Cancer Gene Ther 11:186‑193, 2004 48. Bergers G, Javaherian K, Lo KM, et al: Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogen‑ esis in mice. Science 284:808‑812, 1999 49. Bareschino MA, Schettino C, Troiani T, et al: Erlotinib in cancer treatment. Ann Oncol 18:vi35‑vi41, 2007 (suppl 6) 50. Morgillo F, Cantile F, Fasano M, et al: Resist ance mechanisms of tumour cells to EGFR inhibitors. Clin Transl Oncol 11:270‑275, 2009 51. LoRusso P: Toward evidence‑based manage‑ ment of the dermatologic effects of EGFR inhibitors. Oncology (Williston Park) 23:186‑194, 2009 52. Eriksen JG, Overgaard M: Late onset of skin toxicity induced by EGFr‑inhibitors. Radiother Oncol 90:280‑281, 2009 53. Feldman ME, Apsel B, Uotila A, et al: Activesite inhibitors of mTOR target rapamycin‑resistant outputs of mTORC1 and mTORC2. PLoS Biol 7:e38, 2009 54. Garber K: Targeting mTOR: Something old, something new. J Natl Cancer Inst 101:288‑290, 2009 55. Meric‑Bernstam F, Gonzalez‑Angulo AM: Targeting the mTOR signaling network for cancer therapy. J Clin Oncol 27:2278‑2287, 2009 56. Guo R, Wang T, Shen H, et al: Involvement of mTOR and survivin inhibition in tamoxifen‑induced apoptosis in human hepatoblastoma cell line HepG2. Biomed Pharmacother 64:249‑253, 2010 57. Bergsland E, Venook A, Ko A, et al: RAD001 and erlotinib in patients with neuroendocrine tumors. National Institutes of Health, 2009. http://clinical‑ trials.gov/ct2/show/NCT00843531 58. Herberger B, Puhalla H, Lehnert M, et al: Activated mammalian target of rapamycin is an adverse prognostic factor in patients with biliary tract adenocarcinoma. Clin Cancer Res 13:4795‑4799, 2007 59. Doherty L, Gigas DC, Kesari S, et al: Pilot study of the combination of EGFR and mTOR inhibitors in recurrent malignant gliomas. Neurology 67: 156‑158, 2006 60. Mayer I, Means‑Powell J, Shyr Y, et al: A phase Ib trial of erlotinib, an EGFR inhibitor, and everolimus (RAD001), an mTOR inhibitor, in patients with meta‑ static breast cancer. Presented at the 2009 Breast Cancer Symposium, San Francisco, CA, October 8‑10, 2009 (abstr 254) Slovníček termínů Apoptóza: Rovněž označovaná jako programovaná buněčná smrt, je proces vedoucí k organizované sebedestrukci buněk. Pro apoptotický proces jsou specifické některé faktory a receptory. Výsledným efektem je svraštění buňky, vznik „puchýřků“ na jejím povrchu a fragmentace DNA. mTOR je serinová/threoninová kináza, jež je aktivována Akt a reguluje syntézu proteinů na základě dostupnosti živin. Molekula byla objevena, když bylo zjištěno, že rapamycin, léčivo užívané po transplantacích, blokuje buněčné dělení pravděpodobně inhibicí činnosti mTOR. Biomarker: Funkční biochemický či molekulární indikátor Akt/PKB: Proteinkináza B je součástí dráhy odpovědné za buněčné biologického nebo patologického procesu, který má prediktivní, diagnostické a/nebo prognostické využití. EGFR (epidermal growth factor receptor): Také známý jako HER1, patří do rodiny receptorů (dalšími členy rodiny jsou HER2, HER3, HER4) a váže EGF, TGFα a další příslušné proteiny, což v buňce indukuje signalizaci pro proliferaci a přežití. Náleží rovněž do širší rodiny tyrosinkinázových receptorů a obecně bývá nadměrně exprimován u řady solidních nádorů epiteliálního původu. Erlotinib: Známý též pod označením Tarceva, je nízkomolekulární inhibitor tyrosinkinázové aktivity EGFR/HER1, který byl intenzivně sledován v rámci klinických studií u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic, karcinomem pankreatu a glioblastoma multiforme. IAP (inhibitors of apoptosis proteins): Inhibitory apoptotických proteinů potlačují v odpovědi na virovou infekci smrt hostitelské buňky. Vazbou na kaspázy přímo inhibují apoptózu. Členy této rodiny jsou survivin a xIAP lišící se nejspíše vazbou na specifické kaspázy. mTOR: Mammalian target of rapamycin (savčí rapamycinový cílený receptor) patří k proteinovému koplexu (spolu s regulačním proteinem Raptor a GβL), který je buňkami využíván k detekci živin v prostředí – www.jco.org přežití. Po své aktivaci (tj. fosforylaci) prostřednictvím PI3K blokuje aktivovaná Akt kináza činnost molekul zapojených v apoptotických procesech tím, že je následně fosforyluje. Rapamycin: Látka se silným imunosupresivním účinkem užívaná po transplantacích, která inhibuje postup buněčným cyklem, čímž zastavuje proliferaci. Survivin: Inhibitory apoptotických proteinů potlačují v odpovědi na virovou infekci smrt hostitelské buňky. Vazbou na kaspázy přímo inhibují apoptózu. Členy této rodiny jsou survivin a xIAP lišící se nejspíše vazbou na specifické kaspázy. Neuroendokrinní nádory pankreatu (pancreatic neuroendocrine tumor, PNET): Reprezentují relativně vzácný typ maligních nádorů pankreatu, které vycházejí z Langerhansových ostrůvků a jsou tvořeny transformovanými buňkami těchto ostrůvků, jež produkují (nebo někdy produkovaly) inzulin či další polypeptidové hormony. Tyto hormonálně aktivní buňky Langerhansových ostrůvků (a z nich vycházející tumory) exprimují celou řadu neuronálních genů, odrážejíce tak evoluční spojitost s neuronálními buňkami, a jsou proto označovány jako neuroendokrinní, aby se tak odlišily od častěji se vyskytujícího typu lidských maligních nádorů pankreatu – duktálního adenokarcinomu. © 2010 by American Society of Clinical Oncology 17