Návod k použití CRC RAScan™ Combination Kit

Transkript

Návod k použití
CRC RAScan™ Combination Kit
Souprava SURVEYOR® Scan KRAS a NRAS
Exons 2, 3 & 4 CE IVD
se systémy DHPLC
Tento návod k použití si důkladně přečtěte před použitím
tohoto produktu.
Uschovejte si tento návod k použití, abyste se k němu mohli v
případě potřeby vrátit.
Tato stránka je úmyslně ponechána prázdná.
Obsah
1 Výrobce ............................................................................................................................ 3
2 Souprava CRC RAScan™ Combination Kit ................................................................. 3
2.1 Použití.................................................................................................................................... 3
2.2 Indikace pro použití ............................................................................................................... 3
3 Principy testu pro detekci mutací CRC RAScan KRAS a NRAS ................................ 4
3.1 Geny KRAS a NRAS ................................................................................................................ 4
3.2 Analýza vzorků pacientů s použitím souprav SURVEYOR Scan.............................................. 4
3.3 Nukleáza SURVEYOR Nuclease .............................................................................................. 5
4 Původ kontrol v soupravě ............................................................................................. 6
5 Součásti ........................................................................................................................... 7
5.1 Krabice SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107) ............................................... 7
5.2 Krabice SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400) .............................................. 8
5.3 Počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy ..................................................... 8
5.4 Sekvenování DNA .................................................................................................................. 9
6 Další požadované vybavení a reagencie ...................................................................... 9
7 Příprava reagencií........................................................................................................... 9
8 Skladování a doba použitelnosti ................................................................................. 10
9 Upozornění a preventivní opatření ............................................................................. 10
10 Získání primárního vzorku, manipulace a uchovávání ........................................... 10
11 Postup testu ................................................................................................................ 11
11.1 Detekce somatických mutací s použitím souprav SURVEYOR Scan - přehled ................... 11
12 Pokyny pro jednotlivé kroky ...................................................................................... 12
12.1 POČÁTEČNÍ nastavení/kalibrace systému DHPLC ......................................................... 12
12.2 Před analýzou vzorků KRAS a NRAS................................................................................... 12
12.3 Templát ............................................................................................................................. 12
12.4 Pracovní schéma ............................................................................................................... 12
12.5 Amplifikační protokol ........................................................................................................ 15
12.6 Program termocykleru pro amplifikační protokol ............................................................. 17
12.7 Kontrola kvality produktů PCR .......................................................................................... 18
12.8 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease ........................................................................... 18
13 Kontrolní postupy ...................................................................................................... 20
13.1 Kontrola kvality soupravy CRC RAScan Combination Kit ................................................... 20
13.2 Použití kontrolních plasmidových DNA ............................................................................. 20
14 Interpretace výsledků ................................................................................................. 20
14.1 Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease .................... 20
14.2 Kontrola výsledků SURVEYOR Scan ................................................................................... 21
14.3 Příklady výsledků ............................................................................................................... 22
15 Co je třeba dodržovat ................................................................................................. 29
15.1 Detekční hladina mutací získaných soupravou SURVEYOR Scan ....................................... 29
15.2 Potvrzení sekvence ............................................................................................................ 29
15.3 Omezení testu ................................................................................................................... 30
Příloha A ........................................................................................................................... 31
A.1 Návrh uspořádání destičky pro soupravy SURVEYOR Scan ................................................. 31
A.2 Označení na kontrolní DNA ................................................................................................. 31
A.3 Požadavky pro denaturaci v systému HPLC (DHPLC) .......................................................... 32
A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR ................................................................................. 34
A.5 Odkazy na literaturu ........................................................................................................... 35
Příloha B ........................................................................................................................... 36
Pokyny pro řešení problémů ..................................................................................................... 36
Podrobnosti pro objednávku .......................................................................................... 43
Kontaktní údaje ................................................................................................................ 43
Překlad Prohlášení .......................................................................................................... 43
Licence, obchodní známky a autorská práva ............................................................... 44
1 Výrobce
1 Výrobce
Výrobce
M
Zástupce pro
EU
P
Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA
Tel: 1-402-452-5400
BS Partnerships Limited
41 Dan-Y-Coed Road
Cardiff CF23 6NB
Tel. +44-(0) 7837218920
2 Souprava CRC RAScan™ Combination Kit
2.1 Použití
Pouze pro profesionální použití. Souprava od společnosti Transgenomic CRC RAScan
Combination Kit tvoří diagnostický test in vitro, kterým se zjišťují somatické mutace v úsecích
Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Tyto mutace jsou indikovány píky, které jsou výsledkem
štěpení enzymem SURVEYOR Nuclease a zahrnují mutace známé svým potenciálním klinickým
významem. Tato souprava je určena pro použití v klinické diagnostické laboratoři příslušně
školenými pracovníky provádějícími testování DNA extrahované z tkání zalitých v parafínu a
fixovaných formalinem.
Souprava je identifikována katalogovým číslem 710077. Tento návod k použití je k dispozici ke
stažení na.
http://www.transgenomic.com/wp-content/uploads/482427-CS.pdf
2.2 Indikace pro použití
Kliničtí pracovníci mohou používat soupravu CRC RAScan Combination Kit se systémem DHPLC
jako vodítko k rozhodnutí, zda nádor kolorektálního karcinomu pacienta nebude vykazovat odezvu
vůči léčivům na bázi anti-EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor), jako je panitumumab.
Souprava CRC RAScan Combination Kit nesmí být používána k diagnóze kolorektálního ani
jiného druhu karcinomu.
Souprava CRC RAScan Combination Kit je testem používaným ke zjišťování možných
somatických mutací v úsecích Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS, avšak neumožňuje potvrzení
identity sekvence mutace. K identifikaci přesné zjištěné mutace je třeba použít další
analytickou metodu, jako je sekvenování DNA.
Ačkoli výsledky analýzy získané těmito soupravami ukáží mutační stav pacienta, je třeba zvážit i
další klinické faktory. Výsledky získané soupravou CRC RAScan Combination Kit nesmí být
jedinou cestou k učinění rozhodnutí o léčbě pacienta s kolorektálním karcinomem.
Je důležité mít na mysli, že použití systému DHPLC k identifikaci vzorků pozitivních na mutaci
genů KRAS a/nebo NRAS lze brát pouze jako vodítko a všechny mutace musí být potvrzeny
další analýzou, jako je např. sekvenování DNA.
Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy DHPLC
strana 3
3 Principy testu pro detekci mutací SURVEYOR Scan KRAS a NRAS
3 Principy testu pro detekci mutací CRC RAScan KRAS a
NRAS
3.1 Geny KRAS a NRAS
Léčivé přípravky cílící na receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) prokázaly svoji účinnost
vůči kolorektálnímu karcinomu. Výzkum ukázal, že přibližně 40 % kolorektálních nádorů obsahuje
somatické mutace genu KRAS a klinické studie ukázaly, že mutace v úseku KRAS exon 2 (kodony
12 a 13) předpovídají nedostatečnou odezvu vůči léčbě cílené na EGFR. Poslední výzkumné
studie ukázaly, že populaci pacientů lze dále specifikovat jako pacienty, jejichž metastazovaný
nádor mCRC obsahuje další mutaci v úseku KRAS exony 3 a 4 a/nebo v úseku NRAS exony 2, 3
a 4 rovněž vykazoval tendenci k nedostatečné odezvě vůči léčbě cílené na EGFR1-7. Tato
souprava je určena k použití v diagnostické analýze somatických mutací v úseku KRAS a NRAS
Exons 2, 3 a 4.
Souprava CRC RAScan Combination Kit tvoří test pro zjišťování všech sekvenčních a malých
inzerčních/delečních změn v Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Mutace v kodonech 12, 13, 59,
61, 117 a 146 genů KRAS a NRAS souvisejí s nedostatečnou účinností přípravku panitumumab.
Pro mutace v kodonech 12, 61, 117 a 146 jsou v této soupravě dodány kontroly Positive Control.
V této soupravě je použita chráněná technologie společnosti Transgenomic s názvem
SURVEYOR Nuclease, která spolu se systémem DHPLC poskytuje jednoduchou a citlivou detekci
potenciálních mutací. Tato technologie může zjistit 2-5% směs mutantů na pozadí nezmutované
DNA. Validační studie ukázaly extrémně vysokou konkordanci se sekvenováním kvalitně
charakterizovaných vzorků kolorektálního karcinomu. Použití soupravy CRC RAScan Combination
Kit sníží pro uživatele nároky na sekvenování a umožní zjištění sekvence, když software pro
automatické sekvenování nezjistí přítomnost mutace nízké hladiny.
Vzhledem vysoké citlivosti tohoto testu vůči Sangerově metodě sekvenování se doporučuje
uspořádat laboratoř tak, aby se zabránilo příčné kontaminaci vzorků a kontrol. Ukázku optimálního
uspořádání laboratoře naleznete v Příloze A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR.
3.2 Analýza vzorků pacientů s použitím souprav SURVEYOR Scan
Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pouze pro použití v rámci níže znázorněného
pracovního schématu.
Pracovní schéma
Vzorek pacienta
Test genů KRAS a
NRAS Exons 2, 3 a 4
Záznam výsledku
Obrázek 1 Pracovní schéma použití soupravy CRC RAScan Combination Kit
ke screeningu genů KRAS a NRAS
Návrh uspořádání 96jamkových destiček pro analýzu všech úseků KRAS and NRAS Exons 2-4
naleznete v příloze A.1 Uspořádání destiček v soupravě CRC RAScan Combination Kit
strana 4
3 Principy testu pro detekci mutací SURVEYOR Scan KRAS a NRAS
3.3 Nukleáza SURVEYOR Nuclease
Nukleáza SURVEYOR Nuclease od společnosti Transgenomic je mismatch - specifická
(specifická pro chybné párování) endonukleáza z rostlinné DNA, která skenuje známé i neznámé
mutace a polymorfismy v heteroduplexní DNA8. Tento enzym štěpí s vysokou specificitou DNA v
místech substituce báze chybným párováním a v místech jiných odchylek. Tato DNA
endonukleáza štěpí oba řetězce heteroduplexu DNA na straně 3’ chybně párovaného místa.
Rozpoznává se chybné párování vzniklé inzercí/delecí a substitucí bází, avšak účinnost štěpení se
mění podle sekvence chybného párování.
Obrázek 2. Obrázek 1.
Mechanismus účinku nukleázy
SURVEYOR Nuclease.
Endonukleáza rozpoznává chybné
párování a provádí štěpení na straně
3’ každé báze v chybném párování.
Tím je štěpena dvoušroubovice DNA
s přesahující jednou bází na konci 3’.
Nukleáza SURVEYOR Nuclease byla použita v širokém rozsahu situací pro přesnou detekci
mutací a genetického polymorfismu. SURVEYOR Nuclease byla například použita k ověření
přítomnosti známých mutací v řadě genů spojených s karcinomem ledvin, plic, hlavy a krku, s
leukémií, endometriálním karcinomem a s předpovědí výsledku radioterapie9,10,11.
Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pro štěpení chybných párování v genech
KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 před další analýzou v systému DHPLC.
Poznámka: Je-li vzorek 100% mutantní DNA, nebudou se tvořit žádné heteroduplexy a vzorek se
bude jevit jako Wild-Type. Avšak vzorky z biopsie nádoru budou obsahovat buňky typu WildType v důsledku heterogenity nádoru a/nebo kontaminace normální tkání; 5% a 95%
mutantní DNA budou mít identické chromatogram.
Poznámka: Pro část testu zahrnující PCR lze používat pouze polymerázu DNA Polymerase
dodávanou v soupravě.
Poznámka: Dodržujte konkrétní pokyny v příručce pro systém DHPLC.
V zájmu úspěšného používání této soupravy důrazně doporučujeme, abyste si tuto příručku
důkladně přečetli a pozorně postupovali podle pokynů a návodů v ní obsažených. Uživatelé
pracující s touto soupravou poprvé by měli provést kontrolní experimenty uvedené v části
Použití kontrolních plasmidových DNA.
Máte-li další dotazy nebo potřebujete-li asistenci, zatelefonujte na číslo (888) 233-9283 (pouze pro
severní Ameriku), +1 (402) 452-5400 nebo +44 (0) 141 892 8800 (Evropa) a požádejte o „KRAS a
NRAS support“ (podporu pro KRAS a NRAS). Další možností je poslat nám e-mail na:
[email protected]
Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy DHPLC
strana 5
4 Původ kontrol v soupravě
4 Původ kontrol v soupravě
Kontroly dodávané s těmito soupravami jsou plasmidové klony sekvencí exonů 2, 3 a 4 KRAS a
NRAS. Všechny klony byly sekvenovány, aby byla ověřena věrnost jejich sekvence ve srovnání s
referenčními NCBI Reference Sequences: NG_007524.1 (KRAS) a NG_007572 (NRAS). Kontroly
Wild-Type pro exony 2, 3 a 4 v KRAS a NRAS jsou obsažené v jednom zlinearizovaném plazmidu
poskytujícím fragmenty DNA o sekvencích přibližně 200-300 bp amplifikovatelného typu WildType. Kontroly mutantů, mutanty KRAS a NRAS a exony 2, 3 a 4 jsou obsaženy v jednom
plazmidu obsahujícím též příslušnou sekvenci typu Wild-Type pro daný exon. Dále je tento
plazmid linearizován na stejné fragmenty 200–300 bp, které budou amplifikovány jako směs
mutantů a typu Wild-Type v poměru 50:50.
Všechny kontroly obsahují genetické označení a sekvence pro restrikční enzymy. Viz (část A.2
Označení na kontrolní DNA).; tyto varianty sekvencí KRAS a/nebo NRAS Wild-Type v úseku,
kde se mutace nepředpokládají, lze použít k řešení problémů s kontaminací vzorků kontrolami
Mutant Controls. Přidání sekvencí pro restrikční enzymy jsou pozitivní kontroly a kontroly typu
Wild-Type obsahující především fragmentovaný plazmid a nikoli superhelikálně vinutou DNA. Viz
Příloha B – Pokyny k řešení problémů, 8, kde je uveden příklad elektroferogramů sekvenování
DNA s kontaminací značkovací sekvence nalezené v kontrolách ze soupravy.
Sekvence KRAS a NRAS Wild-Type Control byly vytvořeny syntézou a naklonováním exonů 2,
3 a 4 genů KRAS a NRAS do jednoho vektoru s použitím sekvencí NCBI Reference Sequences
NG_007524.1 (KRAS) a NG_007572 (NRAS). Na 5’- a 3’- konec každého z naklonovaných úseků
byla přidána sekvence pro restrikční enzym. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jedinou
změnu oproti referenční sekvenci tvoří změněné báze ve značkovacím úseku. (část A.2 Označení
na kontrolní DNA).
Sekvence KRAS a NRAS Mutant Control byly vytvořeny syntézou a naklonováním exonů 2, 3 a 4
genů KRAS a NRAS Wild-Type a mutantní sekvence pro každý amplikon do jednoho vektoru s
použitím sekvencí NCBI Reference Sequences NG_007524.1 (KRAS) a NG_007572 (NRAS).
Kontrolní sekvence Wild-Type byly stejné jako sekvence použité v plasmidu KRAS a NRAS
Control Wild-Type. Sekvence Mutant Control jsou stejné jako sekvence Wild-Type kromě mutace v
příslušném kodonu. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jedinou změnu oproti referenční
sekvenci tvoří mutace a značkovací úsek v případě kontrol Mutant Controls (část A.2 Označení
na kontrolní DNA).
strana 6
5 Součásti
5 Součásti
Souprava CRC RAScan Combination Kit se dodává ve dvou samostatných krabicích: (a) krabice
reagencií pro analýzu úseku KRAS exony 2, 3 a 4 a (b) krabice reagencií pro analýzu úseku
NRAS Exons 2, 3 a 4. Krabice společně obsahují dostatečné množství reagencií k provedení
počtů analýz uvedených v části 5.3.
5.1 Krabice SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107)
Krabice s komponentami pro analýzu úseku KRAS Exons 2, 3 a 4 obsahuje dvě další krabice:
(1) krabici s komponentami pro digesci SURVEYOR s 10 reagenčními zkumavkami a (2)
složky pro PCR a kontroly s nosičem zkumavek obsahujícím 17 reagenčních zkumavek.
h Číslo
Komponenta
Krabic s komponentami pro digesci SURVEYOR
(SURVEYOR Digestion Components Box)
710160
SURVEYOR Nuclease W
710161
SURVEYOR Enhancer W2
708049
SURVEYOR Enhancer Cofactor
708027
0.15 M MgCl2 Solution
708030
Stop Solution
Krabice s komponentami pro PCR a s kontrolami (PCR
Barva
víčka
zkumavky
Počet zkumavek v
soupravě
fialová
černá
růžová
jantarová
červená
3
2
2
2
1
červená
čirá
čirá
modrá
modrá
modrá
modrá
modrá
modrá
modrá
modrá
žlutá
zelená
oranžová
oranžová
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Components and Controls Box)
703310
703315
703065
710155F
710155R
710157F
710157R
710154F
710154R
710156F
710156R
710430
710431
710153F
710153R
DNA Polymerase
10x DNA Polymerase Reaction Buffer
dNTPs (10 mM)
KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µM)
KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µM)
KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µM)
KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µM)
KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µM)
KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µM)
KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µM)
KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µM)
K- & NRAS Wild-Type Control
K- & NRAS Mutants Positive Control
Universal Sequencing Primer 1 (10 µM)
strana 7
5 Součásti
5.2 Krabice SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400)
Krabice s komponentami pro analýzu úseku NRAS Exons 2, 3 a 4 obsahuje dvě další krabice:
(1) krabici s komponentami pro digesci SURVEYOR s 10 reagenčními zkumavkami bez
prázdných otvorů a (2) složky pro PCR a kontroly s nosičem zkumavek obsahujícím 12
reagenčních zkumavek.
Barva
víčka
zkumavky
Počet zkumavek v
soupravě
Krabic s komponentami pro digesci SURVEYOR
(SURVEYOR Digestion Components Box)
710160
SURVEYOR Nuclease W
710161
SURVEYOR Enhancer W2
708049
SURVEYOR Enhancer Cofactor
708027
0.15 M MgCl2 Solution
708030
SURVEYOR Stop Solution
710153F
710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µM)
fialová
černá
růžová
jantarová
červená
oranžová
oranžová
2
1
1
1
1
2
2
Krabice s komponentami pro PCR a s kontrolami
(PCR Components and Controls Box)
703310
DNA Polymerase (250 U)
703312
DNA Polymerase (50 U)
703315
DNA Polymerase 10X PCR Buffer
703065
dNTPs (10 mM)
710452F
NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µM)
710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µM)
710453F
710454F
710430
K- & NRAS Wild-Type Control
710431
K- & NRAS Mutants Positive Control
červená
červená
čirá
čirá
modrá
modrá
modrá
modrá
modrá
modrá
žlutá
zelená
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
h Číslo
Komponenta
5.3 Počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy
Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pro testování 230 reakcí. Celkový počet
vzorků, které lze testovat pomocí soupravy, závisí na průměrné velikosti testované dávky vzorků,
neboť v každé destičce s reakčními směsmi musí být zahrnuta jedna sada kontrolních reakcí
(kontroly Wild-Type Control, Positive Control a kontroly bez templátu). Níže uvedená tabulka
ukazuje počet vzorků, které lze analyzovat soupravou KRAS a NRAS v závislosti na průměrné
velikosti dávky vzorků. To zahrnuje (a) 21 kontrol (7x Wild-Type, 7x Positive Control, 7x kontroly
bez templátu) požadovaných pro každý běh a (b) limit 230 reakcí na jednu soupravu.
Poznámka: Analyzuje-li se více destiček, musí být na každé destičce zahrnuta každá sestava z
21 výše uvedených kontrol. Proto pro dvě destičky je zapotřebí 42 kontrolních reakcí; pro 3
destičky je zapotřebí 63 kontrolních reakcí, atd.
strana 8
5 Součásti
Zvýší-li se velikost dávky vzorků, zvýší se tím i počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné
soupravy a tím se sníží průměrné náklady na reagencie vztažené na jeden vzorek. Níže uvedená
tabulka slouží jako vodítko pro počet vzorků, které lze testovat pomocí souprav.
Celkový
počet běhů
dávek
vzorků
na soupravu
Celkový
počet
vzorků
testovaný
ch
jednou
soupravo
u
Velikost
dávky
vzorků
Počet kontrolních reakcí +
Počet amplikonů vzorků
Počet
vyžadovanýc
h
na jeden běh
1
21 + 7
28
8
8
2
21 + 14
35
6
12
3
21 + 21
42
5
15
4
21 + 28
49
4
16
5
21 + 35
56
4
20
5.4 Sekvenování DNA
Pro sekvenování DNA všech testovaných vzorků jsou k dispozici primery (PN 710153F a
710153R). Pro sekvenování je třeba používat amplikony PCR vytvořené před digescí nukleázou
SURVEYOR Nuclease.
6 Další požadované vybavení a reagencie
Další komponenty a vybavení potřebné k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se
systémem DHPLC zahrnují následující:
Systém DHPLC, kolona, pufry, velikostní standard DNA
- viz Příloha A.3.1 Specifikace systému DHPLC pro aplikace SURVEYOR Scan, kde
naleznete popis vhodného systému DHPLC pro použití s touto soupravou
Voda jakosti pro molekulární biologii
0,2 ml zkumavky pro PCR, pásy nebo 96jamková destička
Mikropipety
Pipetové špičky
Ledová lázeň
Míchadlo vortex
Mikrocentrifuga
Termocykler
Agarózové gely a zařízení pro elektroforézu v agarózovém gelu
10% chlornan nebo podobný čisticí přípravek
7 Příprava reagencií
Všechny reagencie dodávané v soupravě jsou připravené k použití. Některé komponenty je nutné
před použitím rozmrazit, zamíchat na vortexu a/nebo odstředit v mikrocentrifuze; příslušné
podrobnosti naleznete v níže uvedeném postupu testování. Sloučením reagencií se získají
výchozí směsi a reakční směsi; úplné podrobnosti jsou uvedené v níže popsaném postupu
testování.
strana 9
8 Skladování a doba použitelnosti
8 Skladování a doba použitelnosti
Souprava se skladuje až do použití při teplotě mezi –18 ºC a -25 °C v mrazáku s konstantní
teplotou. Poznamenejte si datum použitelnosti u každé dodané soupravy. Po vypršení data
použitelnosti soupravu nepoužívejte.
Směs s nukleázou SURVEYOR Nuclease připravená v kroku 7 Digesce nukleázou SURVEYOR
Nuclease se musí použít okamžitě, neboť nukleáza SURVEYOR Nuclease W se v přítomnosti
ostatních složek reakční směsi nukleázy SURVEYOR Nuclease během času deaktivuje.
9 Upozornění a preventivní opatření
Žádná z reagencií v této soupravě není v dodaném množství nebezpečná pro lidské zdraví.
Dokument společnosti Transgenomic pod číslem SDS-710077 lze stáhnout z
http://www.transgenomic.com/wp-content/uploads/710077-CS.pdf
Souprava neobsahuje žádné látky lidského nebo živočišného původu, které by mohly způsobit
infekci.
Tuto soupravu mohou používat pouze osoby, které jsou vyškolené v příslušných laboratorních
metodách. Při práci s komponentami této soupravy vždy používejte laboratorní plášť, jednorázové
rukavice a ochranu očí. Po použití soupravy zlikvidujte komponenty, jako je např. nemocniční
odpad, v souladu s místními pravidly a předpisy.
Alikvotní množství reagencií odpipetovaná ze zkumavek v soupravě jsou určená pouze pro jedno
použití. Komponenty soupravy zůstávají stabilní i po 25 cyklech zmrazení-rozmrazení. Po
překročení tohoto počtu cyklů zmrazení-rozmrazení soupravu nepoužívejte.
10 Získání primárního vzorku, manipulace a uchovávání
Souprava CRC RAScan Combination Kit je validována pro použití s DNA extrahovanou ze vzorků
nádorů kolorektálního karcinomu zalitých v parafínu a fixovaných formalinem (FFPE). V zájmu
optimální extrakce DNA je třeba tkáň 14-24 hodin před zalitím v parafinu fixovat ve formalinu.
Biopsie z nádorů jsou heterogenní směsi nádorových a nenádorových buněk. Nádor samotný je
navíc heterogenní směsí národových buněk s mutacemi a nádorových buněk bez mutací.
Vzhledem k tomu, že tyto somatické mutace nemusí být rozptýleny v nádoru rovnoměrně, mohou
být výsledné analýzy mutací z různých částí stejného nádoru různé. Aby se zvýšila
pravděpodobnost detekce mutace, je třeba izolovat DNA z nádorové části tkáně oddělením pouze
nádorové části ze sklíčka pomocí čerstvě sterilizovaného skalpelu pro každé nové sklíčko.
V zájmu úspěšného použití této soupravy musí extrahovaná DNA splňovat kritéria v části
Templát.
POZNÁMKA: Extrahované vzorky DNA neurčené k okamžité analýze touto soupravou je třeba
uchovávat zmrazené při teplotě od -20 ºC do -80 ºC.
strana 10
11 Postup testu
11 Postup testu
11.1 Detekce somatických mutací s použitím souprav SURVEYOR
Scan - přehled
Detekce mutace a potvrzení nukleázou SURVEYOR Nuclease zahrnuje tři kroky:
.
Krok 1 - Připravte amplikony PCR z mutantní (testované) a normální (referenční) DNA, v
návaznosti na konečný amplifikační cyklus PCR rozpusťte veškeré dvoušroubovice a poté
pomalu ochlazujte, čímž dojde k optimalizované tvorbě heteroduplexů a homoduplexů
(heteroduplexy se tvoří, když jeden řetězec se sekvencí Wild-Type se spáruje s jedním
řetězcem mutantní sekvence).
Krok 2 - Aplikujte na směs spárovaných heteroduplexů/homoduplexů nukleázu
SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease rozštěpí oba dva řetězce heteroduplexní
DNA za vzniku fragmentů DNA. DNA Control Wild-Type, vystavená obdobnému postupu,
slouží jako kontrola na pozadí.
Krok 3 - Proveďte analýzu fragmentů DNA v systému DHPLC. Tvorba nových produktů
štěpení je v důsledku jednoho nebo více chybných párování indikována přítomností
dodatečných chromatografických píků. Migrační časy produktů štěpení indikují velikost
fragmentů a tím i přibližné umístění chybného nebo více chybných párování.
strana 11
12 Pokyny pro jednotlivé kroky
12.1 POČÁTEČNÍ nastavení/kalibrace systému DHPLC
Při přípravě destičky SURVEYOR Nuclease pro analýzu v DHPLC se obraťte na Přílohu A.3
Požadavky pro denaturaci v systému HPLC (DHPLC).
12.2 Před analýzou vzorků KRAS a NRAS
Před analýzou vzorků v systému DHPLC se musí provést běh s velikostním standardem DNA, aby
se ověřila správná funkce systému. Před analýzou musí laboratorní pracovník používající přístroj
zkontrolovat kvalitu rozlišení velikostního standardu DNA.
12.3 Templát
1. U izolované templátové FFPE DNA proveďte pomocí běžných laboratorních postupů
kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení extrahované DNA, aby bylo jisté, že je k dispozici
dostatečné množství templátu pro PCR.
2. Poměr absorbance 260/280 musí být >1,80.
3. Pro optimální nastavení PCR musí být pracovní koncentrace templátu přibližně 12,5 ng/µl.
Je-li třeba, zřeďte templátovou DNA ve vodě o jakosti pro molekulární biologii.
12.4 Pracovní schéma
Souprava umožňuje analýzu 230 reakcí. Lze analyzovat i menší dávky vzorků, avšak s každou
dávkou vzorků musí být zahrnuty kontroly ze soupravy i kontrola bez templátu. Souprava obsahuje
dostatečný materiál pro kontrolu 230 reakcí všech kombinací používaných velikostí dávek vzorků.
Zpracování vzorků musí být všeobecně prováděno od zahájení až do konce podle popisu v tomto
návodu k použití. Musí-li být před dokončením celého postupu zpracování vzorku zastaveno, je
nutné DNA uložit do -20 °C, jak je ukázáno. Avšak zmrazené vzorky nemají být vystavovány
opakovanému zmrazování a rozmrazování a zmrazená DNA amplifikovaná pomocí PCR ani
produkty digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease nemají být skladovány při teplotě od -18 do 25 °C po delší dobu (>1 týden).
strana 12
Analýza vzorků se provádí podle níže znázorněného pracovního schématu:
Oddělení
tkáně
1
Izolace
DNA a
PCR
2
Gelová elektroforéza
3
Vyhodnocení robustní/slabá PCR
4
5
Neúspěšný
SURVEYOR
Scan
SURVEYOR Nuclease a
analýza v DHPLC
SURVEYOR Scan
Pozitivní
SURVEYOR Scan
Negativní
6
7
NVD
(varianta
nedetekována)
Potvrzení
sekvence
8
Kvalita
sekvence
neúspěšná
Kvalita sekvence
prošla
9
Mutace v kodonech
G12, G13, A59, Q61,
K117 nebo A146
NVD
Obrázek 3: Pracovní schéma analýzy se soupravou CRC RAScan Combination Kit
strana 13
Poznámky k obr. 3
1. DNA izolujte z FFPE (tkáň zalitá v parafínu a fixovaná formalinem) podle standardních
laboratorních postupů.
2. Proveďte PCR a ověřte kvalitu DNA gelovou elektroforézou.,
3. Vyhodnoťte a proveďte záznam, zda je proužek PCR Robustní (≥20 ng/µl) nebo Slabý
(<20 ng/µl).
Dojde-li k vytvoření více proužků PCR, připravte čerstvou genomickou DNA z FFPE.
4. U vzorků vyhodnocených po amplifikaci pomocí PCR buď jako Robustní PCR nebo Slabá
PCR proveďte krok s nukleázou SURVEYOR Nuclease a analýzu v systému DHPLC.
Se slabou PCR může být množství DNA k získání smysluplných výsledků systémem
DHPLC nedostatečné, avšak může být dostatečné pro sekvenování.
5. Viz Příloha B – Pokyny k řešení problémů, kde naleznete příklady neúspěšných
výsledků ze SURVEYOR Scan. Všechny vzorky s neúspěšným výsledkem ze
SURVEYOR Scan musí být znovu zpracovány jedním z následujících způsobů:
a. opakování PCR, zbývá-li dostatečné množství genomické DNA
b. nová extrakce DNA z FFPE; to by měla být až sekundární volba, neboť obvykle
není žádoucí řezat další blok FFPE.
c.
použije-li se další řez nebo blok, musí být celý test znovu opakován, neboť
vzhledem k heterogenní povaze nádoru může dojít k odchylkám při digesci.
6. Nejsou-li žádné viditelné píky v důsledku štěpení, zaznamenejte si negativní výsledek ze
SURVEYOR Scan, tj. NVD = varianta nedetekována.
7. Ukazuje-li vzorek produkty štěpení enzymem SURVEYOR Nuclease (neshodující se s
příslušnou kontrolou Wild-Type Control), je třeba je předat k ověření sekvenováním.
8. Je-li ověřovací analýza sekvence nevyhovující, poté zvolte jeden z následujících kroků:
a. opakujte PCR, zbývá-li dostatečné množství genomické DNA
b. proveďte novou extrakci DNA z FFPE; to by měla být až sekundární volba, neboť
obvykle není žádoucí oddělovat další řezy z bloku FFPE.
9. Je-li ověřovací analýza sekvence vyhovující, potom výsledky znamenají jedno z
následujícího:
a. Sekvence Wild-Type, tzn. varianta nedetekována (NVD); nebo
b. Varianta detekována. Ukazuje-li ověření sekvence jakoukoli změnu báze s
výsledkem změny aminokyseliny v:
i. kodonech 12 nebo 13
ii. kodonech 59 nebo 61
iii. kodonu 117; nebo
iv. kodonu 146
vyhodnoťte jako pozitivní mutaci v KRAS o/nebo NRAS.
Poznámka: je možné získat pozitivní výsledek ze SURVEYOR Scan, který bude sekvenováním
zároveň potvrzen jako „varianta nedetekována“. Hladina detekce (LOD) pro SURVEYOR Nuclease
v systému DHPLC je pro některé mutace 2% mutantů v 98% typu Wild-Type, zatímco hodnota
LOD sekvenování je přibližně 10-25% mutantů v 90-75% typu Wild-Type.
Pozn: Je-li vzorek 100% mutantní DNA, nebudou se tvořit žádné heteroduplexy a vzorek se bude
jevit jako Wild-Type. Avšak vzorky z biopsie nádoru budou obsahovat buňky typu Wild-Type v
důsledku heterogenity nádoru a/nebo kontaminace normální tkání.
Poznámka: vzorky s 5% a 95% mutantní DNA budou mít identické chromatogram.
strana 14
Poznámka: pozitivní výsledky SURVEYOR Scan lze získat i v důsledku jiných změn bází než jsou
ty, které aktivují geny KRAS a/nebo NRAS. Tyto mutace jsou sice vzácné, avšak je nutné
potvrzení další metodou, jako je např. sekvenování DNA, aby se určilo, zda pozitivní výsledek ze
SURVEYOR Scan je či není KRAS a/nebo NRAS aktivující mutací.
Pozn: proces fixace ve formalinu, požívaný při přípravě FFPE, může vést k deaminaci cytosinů.
Během této deaminace se cytosin převádí na uracil. Polymeráza bude detekovat tento uracil jako
thymin a začlení do kopírovaných řetězců adenin. To může být považováno za mutaci, při které se
normální G nahrazuje za A s výsledkem mutace GC na AT, což je uměle vytvořená mutace, nikoli
skutečná somatická mutace. Jedná se o vzácné případy, avšak dojde-li k brzkému kopírování při
cyklování PCR, mohou být považovány za mutace. Při duplikované analýze se neopakují.
Příklady potenciálních mutací vyvolaných deaminací cytosinu, které by byly zvažovány při
rozhodování o léčbě pacienta, jsou v případě KRAS:
-
Kodon 12: AGT (G12S) a GAT (G12D)
-
Kodon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) a GGT (G13G, tichá mutace)
-
Kodon 146: GCA>ACA (A146T)
Příklady potenciálních mutací vyvolaných deaminací cytosinu, které by byly zvažovány při
rozhodování o léčbě pacienta, jsou v případě NRAS:
-
Kodon 12: GGT> AGT (G12S) nebo GAT (G12D)
-
Kodon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) nebo GGC (G13G, tichá mutace)
-
Kodon 146: GCC>ACC (A146T)
Proto se doporučuje ověřit takové mutace duplikovanou analýzou stejné genomické DNA nebo
podrobením všech vzorků duplikované analýze od začátku analýzy.
12.5 Amplifikační protokol
1. K dispozici jsou předmíchané roztoky dNTP od Transgenomic (PN 703065 a 705020) s
celkovou pracovní koncentrací deoxynukleotidů 10 mM (2,5 mM na každý ze čtyř
deoxynukleotidů).
2. Primery KRAS a NRAS Forward a Reverse PCR (KRAS PN 710155F/R, 710157F/R,
710154F/R a 710156F/R; NRAS PN 710452F/R, 710453F/R a 710454F/R) se dodávají o
koncentraci 10 µM.
3. Vyjměte 10µM primery, 10mM dNTP a pufr DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN
703315) z mrazáku a nechte rozmrazit na ledu.
4. Po rozmrazení důkladně promíchejte všechny složky soupravy na vortexu (~10 sekund),
krátce odstřeďte (~10 sekund), aby na víčkách zkumavek nezůstala žádná kapalina, a
umístěte do ledu.
5. Na ledu připravte výchozí směsi.
6. Podle následující tabulky jako vodítka připravte výchozí směs pro každou z reakcí: KRAS
Exon 2, KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A, KRAS Exon 4B, NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 a
NRAS Exon 4:
Počet reakcí (7 vzorků + 3 kontroly):
10
Výpočet objemu:
Objem vody (µl)
DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl)
dNTP (µl)
Forward Primer (µl)
Forward Primer (µl)
DNA Polymerase (µl)
330**
50
40
25
25
10
Celkový objem výchozí směsi
48,0
strana 15
**Poznámka: Je třeba dosáhnout minimálního množství 25 ng DNA na 50 µl reakční
směsi PCR. Je-li koncentrace extrahované DNA nižší než 12,5 ng/µl, zvyšte úměrně
objem extrahované DNA, abyste zajistili množství 25 ng na reakční směs. Rovněž snižte
odpovídajícím způsobem objem vody ve výchozích směsích, abyste získali 50 µl na
reakční směs. Ve všech vzorcích připravených s použitím těchto výchozích směsí
bude muset být extrahovaná DNA naředěna na přibližně stejnou nejnižší hladinu
koncentrace. Nedoporučuje se používat extrahovanou DNA o koncentraci <5 ng/µl.
7.
Pro každou výchozí směs vypočítejte požadované objemy s použitím výše uvedené
tabulky a dbejte na následující:
(a) Pro výchozí směs 1 KRAS Exon 2 se vyžadují tři další reakce na jednu destičku
se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 a kontrola
KRAS Exon 2 bez templátu (NTC1).
(b) Pro výchozí směs 2, KRAS Exon 3, se vyžadují tři další reakce na jednu destičku
se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 3 a kontrola
KRAS Exon 3 bez templátu (NTC2).
(c) Pro výchozí směs 3 KRAS Exon 4Ase vyžadují tři další reakce na jednu destičku
se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4A a kontrola
KRAS Exon 4A bez templátu (NTC3).
(d) Pro výchozí směs 4 KRAS Exon 4B se vyžadují tři další reakce na jednu destičku
se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4B a kontrola
KRAS Exon 4B bez templátu (NTC4).
(e) Pro výchozí směs 5, NRAS Exon 2 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři
další reakce pro kontroly NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2
a kontrolu NRAS Exon 2 bez templátu (NTC5).
(f) Pro výchozí směs 6, NRAS Exon 3 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři
(g) Pro výchozí směs 7, NRAS Exon 4 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři
Poznámka: vezměte na vědomí, že bude zapotřebí poněkud větší objem výchozí
směsi, aby se tak kompenzovaly ztráty během pipetování.
8. Označte 0,2ml zkumavky pro PCR a/nebo jamky na 96jamkové destičce údajem
příslušného vzorku.
9. Označte 2,0ml centrifugační zkumavky pro přípravu výchozí směsi.
10. Přidejte do 2,0ml centrifugačních zkumavek s označením „Výchozí směs“ požadovaný
objem vody o jakosti pro molekulární biologii.
11. Přidejte do zkumavek s výchozí směsí požadované množství pufru DNA Polymerase 10X
PCR Buffer .
12. Přidejte do zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem 10mM nukleotidů dNTP.
13. Přidejte do příslušných zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem primerů KRAS
a/nebo NRAS Forward Primer.
14. Přidejte do příslušných zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem primerů KRAS
a/nebo NRAS Reverse Primer.
15. Vyjměte enzym DNA Polymerase (PN 703310) z mrazáku.
16. Odstřeďte enzym DNA Polymerase přibližně 10 sek.
17. Zamíchejte enzym DNA Polymerase na vortexu přibližně 10 sek.
18. Přidejte požadovaný objem polymerázy DNA Polymerase do zkumavek s výchozí směsí.
19. Zavřete zkumavky s výchozí směsí víčkem.
strana 16
20. Před použitím zkumavky s výchozí směsí zamíchejte na vortexu přibližně 30 sek. a poté
krátce odstřeďte přibližně 10 sek.
21. Až do použití uložte do ledu.
22. Odpipetujte 48,0 µl (viz poznámka v kroku 6 výše) výchozí směsi do příslušných jamek;
používáte-li jednokanálovou pipetu, vyměňujte špičky pipety mezi jednotlivými jamkami.
Používáte-li opakovací pipetu, nesmí mezi jamkami docházet k úniku nebo rozstřiku.
Uložte destičku na led.
23. Do příslušných jamek přidejte 2,0 µl (viz poznámka výše v kroku 6) templátové DNA ze
všech vzorků nebo vodu (kontrola bez templátu, NTC). Pro každý vzorek použijte novou
pipetovou špičku; snažte se zabránit kontaminaci mezi vzorky v důsledku rozstřikování.
Zakryjte jamky obsahující DNA ze vzorků a NTC pásem s 8 kryty (používáte-li
96jamkovou destičku) a/nebo uzavřete 0,2ml zkumavky pro PCR. Zkontrolujte, že kryty
jsou bezpečně utěsněny.
24. AŽ PO DOKONČENÍ KROKU 23 OTEVÍREJTE POSTUPNĚ KONTROLNÍ TEMPLÁTOVÉ
DNA ze soupravy (PN 710430 a 710431). Odpipetujte 2,0 µl kontroly KRAS a NRAS WildType Control (PN 710430) do příslušné jamky s kontrolou Wild-Type Control a každou
jamku nebo zkumavku před otevřením kontroly KRAS a NRAS Mutants Positive Control
(PN 710431) uzavřete. Po uzavření kontrol Wild-Type Controls otevřete kontrolu KRAS a
NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) a odpipetujte 2,0 µl do jamky nebo
zkumavky s kontrolou Mutant Control a každou jamku nebo zkumavku uzavřete. Přidání
kontrol ze soupravy jako posledních vzorků snižuje možnost kontaminace DNA ve
vzorcích. Znovu zakryjte všechny jamky pásy s 8 kryty (používáte-li 96-jamkovou destičku)
a/nebo uzavřete 0,2ml zkumavky pro PCR. Zkontrolujte, že kryty jsou bezpečně utěsněny.
POZNÁMKA: Správnou praxí je umístit kontroly bez templátu (NTC) do jamek, které
nesousedí s kontrolou Positive Control ani se vzorky.
POZNÁMKA: Návrh uspořádání 96jamkových destiček pro analýzu všech úseků KRAS
and NRAS exony 2-4 naleznete v Příloze A.1 Uspořádání destiček v soupravách
SURVEYOR Scan.
25. Zamíchejte na vortexu 10 sek. (při přibližně poloviční rychlosti).
26. Odstřeďte 1-2 minuty, aby se všechny roztoky shromáždily na dně jamek a/nebo
zkumavek. Přesvědčte se, že roztoky jsou na dně každé jamky a/nebo zkumavky. Pokud
tomu tak není, odstřeďte znovu.
12.6 Program termocykleru pro amplifikační protokol
1. Pro amplifikaci PCR a tvorbu heteroduplexů použijte následující protokol pro termocykler:
15 cyklů
30 cyklů
1 cyklus
Počáteční denaturace
95 °C
„Touchdown“ amplifikace
95 °C
62 °C, -0,5 ºC/cyklus
72 °C
Amplifikace
95 °C
55 °C
72 °C
Konečné prodloužení
72 °C
Tvorba heteroduplexů
95 ºC
12 °C
5 minut
30 sekund
30 sekund
25 sekund
30 sekund
30 sekund
25 sekund
2 minuty
2 minuty
Ponechat
strana 17
12.7 Kontrola kvality produktů PCR
1. Před digescí nukleázou SURVEYOR Nuclease se doporučuje zkontrolovat kvalitu a
množství amplikonů gelovou elektroforézou (nebo jí ekvivalentním způsobem).
2. Proveďte analýzu alikvotního podílu produktu PCR s různým množstvím hmotnostního
žebříčku 100-bp DNA.
3. S použitím žebříčku proveďte odhad koncentrace amplifikované DNA.
4. Měl by být zřetelný pouze jediný proužek >20 ng/µl odpovídající hlavnímu produktu PCR.
5. Je-li přítomno více proužků, zkontrolujte, že byla dostačující kvalita vstupní templátové
DNA (viz Příloha B – Pokyny k řešení problémů).
6. Není-li přítomen žádný produkt, zkontrolujte, že byla dostačující kvalita vstupní templátové
DNA (viz Příloha B – Pokyny k řešení problémů). Splňuje-li kvalita požadované
specifikace, zvyšte objem templátu na 4,0 µl/ 50µl reakci (snižte množství vody na reakci
na 31,0 µl).
7. V kontrolním vzorku bez templátu by neměly být viditelné žádné produkty PCR. Jsou-li v
této kontrole produkty DNA zřetelné, je pravděpodobná kontaminace; viz Příloha B –
Pokyny k řešení problémů.
8. Vyhodnoťte, zda PCR je robustní nebo slabá.
a. Robustní PCR se projevuje jedním proužkem > 20 ng/µl.
b. Slabá PCR se projevuje jedním proužkem < 20 ng/µl.
c.
Pro obě vyhodnocení, robustní i slabou PCR, přejděte k digesci nukleázou
SURVEYOR Nuclease.
RADA: v této fázi mohou být produkty PCR skladovány při teplotě < -20 ºC až 1
týden.
12.8 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease
1. Je-li PCR vzorku o dostatečné kvalitě a množství, proveďte digestivní reakci s nukleázou
SURVEYOR Nuclease podle níže uvedeného popisu. K optimální digesci enzymem
SURVEYOR Nuclease je zapotřebí vzorek o koncentraci >40 ng/µl.
2. Rozmrazte na ledu zkumavky obsahující roztok 0.15 M MgCl2 Solution a SURVEYOR
Enhancer Cofactor
3. Do nové 0,2ml zkumavky pro PCR a/nebo do jamky v 96 jamkové destičce přidejte 10,0 µl
z každého vzorku amplifikovaného pomocí PCR.
4. Připravte čerstvou směs z následujícího: roztok 0,15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR
Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 a SURVEYOR Nuclease W (směs
SURVEYOR Nuclease).
Použijte následující tabulku jako vodítko pro přípravu výchozí směsi pro digesci nukleázou
SURVEYOR Nuclease k analýze více vzorků. Níže uvedený příklad představuje objem výchozí
směsi pro 10 vzorků.
strana 18
Vezměte na vědomí, že bude zapotřebí mírně větší objem výchozí směsi než je tento výpočet, aby
se tak kompenzovaly ztráty během pipetování.
Počet digestivních reakcí s nukleázou SURVEYOR
Nuclease:
Výpočet objemu:
0.15 M MgCl2 Solution (µl)
SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl)
SURVEYOR Enhancer W2 (µl)
SURVEYOR Nuclease W (µl)
Celkový objem výchozí směsi:
Přidejte 5 µl výchozí směsi SURVEYOR Nuclease do
každého
vzorku amplifikovaného pomocí PCR (µl)
Celkový objem digestivní reakce s nukleázou
SURVEYOR Nuclease:
10
10,0
10,0
10,0
20,0
50,0
10,0
15,0
a. Před použitím každou reagencii odstřeďte.
b. Před pipetováním každou reagencii mírně promíchejte na vortexu; po každém
promíchání krátce odstřeďte asi 10 sekund.
c.
Pro každou digesci přidejte do 0,2 ml (nebo větší) mikrocentrifugační zkumavky pro
PCR následující komponenty.
1,0 µl 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027)
1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049)
1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161)
2,.0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN 710160)
A/nebo přidejte 5 µl výchozí směsi připravené podle výše uvedené tabulky.
5. Mírně zamíchejte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease na vortexu po dobu
10 sek. při nízké rychlosti.
6. Mírně odstřeďte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease po dobu 10 sek. při
nízké rychlosti.
7. Uložte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease do ledu, dokud ji nepoužijete.
Poznámka: Výchozí směs pro digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease připravená v
kroku 7 musí být použita okamžitě, neboť u enzymu SURVEYOR Nuclease W dochází za
přítomnosti ostatních složek této reakční směsi SURVEYOR Nuclease k jeho deaktivaci.
8. Odpipetujte 5,0µl alikvotní podíl výchozí směsi pro digesci se SURVEYOR Nuclease do
každé zkumavky a/nebo jamky obsahující 10,0µl alikvotní podíl amplifikovaného produktu
PCR (viz krok 3 výše).
9. Po dokončení pipetování odstřeďte 0,2ml zkumavky PCR nebo 96jamkovou destičku po
dobu 10 sek.
10. Mírně zamíchejte na vortexu 0,2ml zkumavky PCR a/nebo 96jamkovou destičku se vzorky
po dobu 10 sek.
11. Odstřeďte po dobu 10 sekund při nízké rychlosti (tento krok je velmi důležitý, je-li digesce
prováděna v přístroji bez zahřívaného krytu).
12. Inkubujte při teplotě 42 °C po dobu 30 min.
13. Do každé zkumavky nebo jamky přidejte 1,0 µl roztoku SURVEYOR Stop Solution (PN
708030) a mírně zamíchejte na vortexu (celkový reakční objem s nukleázou SURVEYOR
Nuclease je 16,0 µl).
RADA: Produkty digesce SURVEYOR lze uchovávat po dobu až jednoho týdne při
teplotě ≤ -20 ºC.
14. Umístěte digestované vzorky do systému DHPLC.
strana 19
13 Kontrolní postupy
13.1 Kontrola kvality soupravy CRC RAScan Combination Kit
Souprava obsahuje kontrolní plasmidovou DNA pro provádění kontroly kvality během specifických
kroků testu. V Amplifikačním protokolu se pomocí těchto kontrol ověřuje, zda jsou výchozí
směsi správně připraveny a zda amplifikace probíhá správně. Vyžaduje se používat i kontroly bez
templátu (s vodou místo templátové DNA), aby se tak mohla zjistit možná kontaminace složek
souprav jakýmkoli cizorodým templátem DNA.
Během kroku digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease umožňují amplikony z kontrolní
plasmidové DNA účinnou kontrolu, zda podmínky při štěpící reakci (příprava výchozí směsi pro
digesci enzymem SURVEYOR Nuclease a podmínky inkubace) byly uspokojivé. Ve fázi analýzy
poskytují chromatogram digestovaných kontrolních amplikonů nukleázou SURVEYOR Nuclease v
systému DHPLC vodítko, zda se píky produktů digesce odpovídající těmto mutacím v úseku
KRAS and NRAS Exons 2, 3 a 4 budou eluovat i při nízké hladině (viz obr. 4-10). Píky produktů
štěpení odpovídající jiným mutacím v úseku KRAS a/nebo NRAS Exons 2, 3 a 4 se mohou eluovat
v mírně odlišných pozicích.
Pokud amplikony PCR neodpovídají výsledkům uvedeným v části Kontrola kvality produktů
PCR, obraťte se na Přílohu B - Pokyny pro řešení problémů nebo kontaktujte technickou
podporu společnosti Transgenomic, než přejdete k dalším krokům analýzy vzorků.
13.2 Použití kontrolních plasmidových DNA
Sada se dodává se dvěma kontrolní DNA PN 710430, K & vnitrostátních regulačních orgánů
přirozeného -Regulační a PN 710431, K & vnitrostátních regulačních orgánů Mutanti pozitivní
kontrola.
Tyto kontrolní DNA jsou digestovány restrikčním enzymem, aby z plasmidové DNA byly získány
fragmenty. Wild-Type Control je tvořena jedním plasmidem obsahujícím všechny sekvence KRAS
a NRAS Wild-Type Control. Mutant Control je tvořena jedním plasmidem obsahujícím směs všech
kontrolních sekvencí KRAS a NRAS Wild-Type spolu s mutovanou sekvencí každého z exonů 2, 3
a 4 z KRAS aNRAS . Tyto mutované sekvence se liší od Wild-Type v jednom páru bází pro každý
exon. Digestované kontroly se dodávají v samostatných lahvičkách o koncentraci 105 kopií/µL.
KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 a primery PCR Forward a Reverse pro amplifikaci pomocí PCR se
dodávají v soupravách samostatně. Při používání těchto kontrol dodržujte pokyny uvedené v
částech Amplifikační protokol, Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease a Analýza KRAS a
NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease.
PŘI PRVNÍM POUŽITÍ SOUPRAVY DŮRAZNĚ DOPORUČUJEME PROVÉST PŘED
TESTOVÁNÍM GENOMICKÝCH VZORKŮ NEJPRVE EXPERIMENTY SE SAMOTNÝMI
KONTROLAMI
14 Interpretace výsledků
14.1 Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR
Nuclease
Pro účely porovnání a kontroly VŽDY proveďte digesci enzymem SURVEYOR Nuclease u každé
kontroly (Wild-Type a Positive Control) a u kontroly bez templátu (NTC), u DNA vzorků a
analyzujte je na stejné destičce pro vzorky v systému DHPLC.
Během kroku digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease umožňují amplikony z těchto kontrolních
plazmidových DNA účinnou kontrolu, zda podmínky při štěpící reakci (příprava směsi SURVEYOR
Nuclease a podmínky inkubace) byly uspokojivé. Ve fázi analýzy umožňují křivky digestovaných
kontrolních amplikonů nukleázou SURVEYOR Nuclease v systému DHPLC vodítko, kde dojde k
eluci fragmentů DNA vzniklých štěpením v místech specifických mutací v důsledku chybného
párování, a to i při jejich nízké koncentraci (viz obr. 4-10).
Pokud ani amplikony PCR ani fragmenty štěpení nukleázou SURVEYOR Nuclease odvozené z
kontrolní DNA neodpovídají uvedeným výsledkům, obraťte se na Přílohu B - Pokyny pro řešení
strana 20
13 Kontrolní postupy
problémů nebo kontaktujte technickou podporuTransgenomic, než přejdete k dalším krokům
analýzy vzorků.
Níže uvedené ukázky jsou pouze pro účely ilustrace a NEJSOU určeny pro stanovení identity
jakékoli konkrétní mutace. Potvrzení identity mutace je nutné, aby se jednoznačně stanovila
přítomnost specifické záměny bází v Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS.
Enzym SURVEYOR Nuclease štěpí ve všech místech chybného párování vzniklých v
důsledku tvorby heteroduplexů mezi typem Wild-Type a mutovanou DNA, nikoli pouze v
mutacích v Exons 2, 3 a 4. Enzym SURVEYOR Nuclease umožňuje potvrzení přítomnosti
chybného párování. Identita změny bází specifická pro danou mutaci se požaduje ke stanovení
KRAS a NRASaktivujícího stavu a musí být ověřena jiným způsobem, např. sekvenováním.
14.2 Kontrola výsledků SURVEYOR Scan
Prohlédněte chromatogramy a porovnejte náležející kontrolám Wild-Type a Positive Control s
chromatogramem vzorku. Určete, zda chromatogram vzorku je svým charakterem podobný nebo
odlišný od kontroly Wild-Type. Je-li odlišný, potom vzorek je „Pozitivní SURVEYOR Scan“ a bude
předán k analýze DNA sekvenováním. Příklady ukazují obr. 4-10 a příklady takových vzorků
ukazuje Příloha B – Pokyny pro řešení problémů, 7 a 8.
Každý vzorek s charakterem SURVEYOR Nuclease odlišným od Wild-Type by měl být předán k
ověření sekvence, i když není identický s kontrolou Positive Control. Viz příklad takového vzorku v
Příloze B – Pokyny pro řešení problémů, 7.
Je-li třeba, zvětšete zkoumanou oblast a překryjte chromatogram vzorku chromatogramem
kontroly Wild-Type Control pro daný amplikon.
Pozorujte rozdíly mezi kontrolou Wild-Type Control a analyzovaným vzorkem.
Důležité! Po důkladném prozkoumání každého vzorku vyhodnocující ověří, zda sousedící vzorky
v analytické destičce mají identické pozitivní výsledky SURVEYOR Scan. Vyskytují-li se identické
pozitivní výsledky, mohou být důsledkem příčné kontaminace mezi vzorky nebo kontrolami a
analýza se musí zopakovat.
strana 21
14.3 Příklady výsledků
Příklady výsledků získaných pomocí soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémem
DHPLC jsou ukázány na obr. 4-10 níže. Tyto ukázky byly získány systémem WAVE® 4500HT-HS
System s použitím UV a fluorescenčních detektorů a s přesným dodržením pokynů v části Pokyny
pro jednotlivé kroky. Pokyny pro navrhované nastavení gradientu v systému DHPLC pro analýzu
produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease naleznete na.
Obrázek 4A
Průtok
systémem
DHPLC
KRAS Control Wild-Type
KRAS Control Exon 2
Vzorek 1, KRAS Exon 2
Velikostní standard DNA
G12D tvoří
fragmenty
74 a 116-bp
Nerozštěpený
amplikon
190-bp
Promytí
systému
DHPLC
Obrázek 4B
G12D tvoří
fragmenty
74 a 116-bp
KRAS Control Exon 2
Nerozštěpený
amplikon
190-bp
Obrázky 4A a 4B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (obr. 4A) a fluorescenční (obr. 4B)
detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control
Exon 2 a kontroly KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním
s kontrolou
prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci
KRAS Control
Wild-TypeWild-Type Control
(hnědá čára). Kontrola KRAS Positive Control Exon (modrá
čára)
je Exon
směsí
KRAS
Control
3 typu Wild-Type a
Vzorek
KRAS
Exon 3 ukazuje, že krok
mutantních plasmidů G12D dávající digesční píky 74 a 116
bp; 1,
tato
kontrola
2, KRAS Exon
3 chromatogramu,
digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správněVzorek
a ukazuje
oblast
kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl býtVelikostní
vzorek standard
předánDNA
k analýze sekvence
DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1-3 s elektroferogramem typu Wild-Type bez
digesce je zřejmé, že vzorky 1 a 2 (červená a tyrkysová čára) obsahují pravděpodobné mutace a
měly by být sekvenovány, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu.
Vzorek 3 (zelená čára) má podobný chromatogram jako kontrola Wild-Type Control a není třeba
jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se
mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.
strana 22
Obrázek 5A
Průtok
systémem
DHPLC
Q61H tvoří
fragmenty
65 a 135-bp
Nerozštěpený
amplikon
200-bp
Promytí
systému
DHPLC
Obrázek 5B
KRAS Control Exon 3
Q61H tvoří
fragmenty
65 a 135-bp
Nerozštěpený
amplikon
200-bp
detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control
Exon 3 a kontroly KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním
prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control
(hnědá čára). Kontrola KRAS Positive Control Exon 3 (zelená čára) je směsí typu Wild-Type a
mutantních plasmidů Q61H dávající digesční píky 65 a 135 bp; tato kontrola ukazuje, že krok
digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu,
kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence
DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1-3 s elektroferogramem typu Wild-Type bez
digesce je zřejmé, že vzorek 2 (černá čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být
sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorky 1 a 3
(modrá a červená čára) mají podobné chromatogramy jako kontrola Wild-Type Control a není
třeba jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování,
neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.
strana 23
Obrázek 6A
KRAS Control Exon 4A
Průtok
systémem
DHPLC
K117N tvoří
fragmenty
80 a 88-bp
Nerozštěpený
amplikon
168-bp
Promytí
systému
DHPLC
Obrázek 6B
KRAS Control Exon 4A
K117N tvoří
fragmenty
80 a 88-bp
Nerozštěpený
amplikon
168-bp
detekcí produktů digesce SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control Exon 4A a
KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení
chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control (zelená čára).
Kontrola KRAS Positive Control Exon 4A (modrá čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních
plasmidů K117N dávající digesční píky 80 a 88 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce
enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je
třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z
porovnání charakteru digesce u vzorků 1a 2 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je
zřejmé, že vzorek 1 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být sekvenován,
aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorek 2 (červená čára) má
podobný chromatogram jako kontrola Wild-Type Control a není třeba jej předávat k sekvenční
analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné
nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.
strana 24
Obrázek 7A
Průtok
systémem
DHPLC
KRAS Control Exon 4B
Nerozštěpený
amplikon
194-bp
Promytí
systému
DHPLC
A146T tvoří
fragmenty
78 a 116-bp
Obrázek 7B
KRAS Control Exon 4B
A146T tvoří
fragmenty
78 a 116-bp
Nerozštěpený
amplikon
194-bp
detekcí produktů digesce SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control Exon 4B a
KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení
chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control (hnědá čára).
Kontrola KRAS Positive Control Exon 4B (tmavozelená čára) je směsí typu Wild-Type a
mutantních plasmidů A146T dávající digesční píky 78 a 116 bp; tato kontrola ukazuje, že krok
digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu,
kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence
DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1 -3 s elektroferogramem typu Wild-Type bez
digesce je zřejmé, že vzorek 3 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být
sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorky 2 a 3
(černá a světlezelená čára) mají podobné chromatogramy jako kontrola Wild-Type Control a není
strana 25
Obrázek 8A
Průtok
systémem
DHPLC
G12D tvoří
fragmenty
88 a 148-bp
NRAS Control Wild-Type
NRAS Control Exon 2
Vzorek 1, NRAS Exon 2
Nerozštěpený
amplikon
236-bp
Promytí
systému
DHPLC
Obrázek 8B
G12D tvoří
fragmenty
88 a 148-bp
NRAS Control Exon 2
Nerozštěpený
amplikon
236-bp
Obrázky 8A a 8B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (Obrázek 8A) a fluorescenční
(Obrázek 8B) detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly NRAS
Positive Control Exon 3 a kontroly Wild-Type Control a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při
vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou NRAS
Control Wild-Type (modrá čára). Kontrola NRAS Positive Control Exon 2 (zelená čára) je směsí
typu Wild-Type a mutantních plasmidů G12D dávající digesční píky 88 a 148 bp; tato kontrola
ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast
chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k
analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1 a 2 s elektroferogramem typu
Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorek 1 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a
měl by být sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu.
Vzorek 2 (černá čára) má podobný chromatogram jako kontrola NRAS Control Wild-Type a není
strana 26
Obrázek 9A
Průtok
systémem
DHPLC
Q61K tvoří
fragmenty
78 a 125-bp
NRAS Control Exon 3
Promytí
systému
DHPLC
Nerozštěpený
amplikon
203-bp
Obrázek 9B
NRAS Control Exon 3
Q61K tvoří
fragmenty
78 a 125-bp
Nerozštěpený
amplikon
203-bp
Control Wild-Type (zelená čára). Kontrola NRAS Positive Control Exon 3 (modrá čára) je směsí
typu Wild-Type a mutantních plasmidů Q61K dávající digesční píky 78 a 125 bp; tato kontrola
analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1 a 2 s elektroferogramem typu
Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorek 1 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a
měl by být sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu.
Vzorek 2 (černá čára) má podobný chromatogram jako kontrola NRAS Control Wild-Type a není
strana 27
Obrázek 10A
Průtok
systémem
DHPLC
NRAS Control Exon 4
Nerozštěpený
amplikon 233-bp
Promytí
systému
DHPLC
A146T tvoří
fragmenty
68 a 165-bp
Obrázek 10B
NRAS Control Exon 4
A146T tvoří
fragmenty
68 a 165-bp
Nerozštěpený
amplikon 233-bp
Control Wild-Type (zelená čára). Kontrola NRAS Positive Control Exon 4 (modrá čára) je směsí
typu Wild-Type a mutantních plasmidů A146T dávající digesční píky 68 a 165 bp; tato kontrola
analýze sekvence DNA. Ze srovnání charakteru digesce u vzorků 1 a 2 s elektroferogramem
digestovaného typu Wild-Type je zřejmé, že vzorky 1 a 2 (červená a černá čára) mají podobné
chromatogramy jako NRAS Control Wild-Type a není třeba je předávat k analýze DNA
sekvenováním. U pozitivních výsledků SURVEYOR Scan je konečným výsledkem výsledek
sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné
velikosti.
strana 28
15 Co je třeba dodržovat
15.1 Detekční hladina mutací získaných soupravou SURVEYOR Scan
Validace souprav SURVEYOR Scan pro platformy DHPLC pomocí plasmidových klonů všech
indikovaných mutací ukázala, že píky pro SURVEYOR Nuclease lze detekovat ve směsi 2-5%
mutantu na pozadí Wild-Type.
Automatické zjišťování sekvenováním přímého a zpětného řetězce často selhává v detekci mutací
o koncentraci ve směsi s DNA typu Wild-Type nižší než 10 %. Společně s výsledky získanými
nukleázou SURVEYOR Nuclease lze důvěryhodněji interpretovat chromatogram sekvenování
obsahující 5-10 % mutantů.
Ukáže-li analýza vzorku pro SURVEYOR Scan pozitivní výsledek, avšak sekvenování DNA
neukáže žádnou detekovatelnou mutaci v KRAS nebo NRAS, doporučujeme takový
výsledek vyhodnotit a zaznamenat jako „Žádná varianta nezjištěna“. Viz více podrobností v
části Pracovní schéma.
15.2 Potvrzení sekvence
U všech pozitivních výsledků ze SURVEYOR Scan přejděte k ověření sekvence, aby se určila
identita sekvence mutací v KRAS a/nebo NRAS Exons 2, 3 a 4. Obrázek 11 ukazuje důležitost
ověření sekvence pro stanovení přesné mutace.
Nepostupujte ověřování sekvence s negativními výsledky ze SURVEYOR Scan. Takový vzorek
lze vyhodnotit jako Wild-Type nebo „varianta nezjištěna“.
Primery Universal Sequencing Primer dodávané v soupravě jsou určeny k použití při ověřování
sekvence. Přímý primer je PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) a zpětný primer je PN
710153R (Universal Sequencing Primer 2).
Vzorek 1: G13C
Vzorek 2: G13D
Obrázek 11 Analýza sekvence vzorků se stejným charakterem digesce v KRAS Exon 2
enzymem SURVEYOR Nuclease. Výše ukázané vzorky 1 a 2 vykázaly v systému DHPLC stejný
charakter píků po digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease a byly dále analyzovány
sekvenováním DNA. Sekvenování potvrzuje dvě odlišné mutace: G13C a G13D. Na těchto
vzorcích lze ilustrovat (a) schopnost enzymu SURVEYOR Nuclease detekovat potenciální mutace
a (b) neschopnost určit jejich přesné umístění ani konkrétní změnu bází mutace(í) v testovaném
vzorku.
Poznámka: V každém sekvenačním elektroferogramu je důležité ověřit absenci „značkovací“
sekvence, aby se potvrdilo, že mutace není výsledkem kontaminace vzorku některou z kontrol
dodaných v soupravě.
Poznámka: Je-li testovaný vzorek v příslušných kodonech typu Wild-Type a je přítomna
„značkovací“ sekvence, potom je testovaný vzorek kontaminovaný a musí být znovu analyzován.
Přítomnost „značky“ ukazuje, že testovaný vzorek může být kontaminován některou kontrolou
Wild-Type Control ze souprav; tato kontaminace může zakrýt mutaci o nízkém výskytu ve vzorku.
Bližší informace o značkovacích sekvencích v kontrolách naleznete v příloze A.2 Označení na
kontrolní DNA.
strana 29
15.3 Omezení testu
Kontaminující látky přenesené ze vzorků zalitých v parafínu a fixovaných formalinem mohou
narušovat amplifikaci metodou PCR a digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease. Postupy kontroly
kvality uvedenými v části Kontrola kvality produktů PCR se zajistí, že extrahovaná DNA bude
vhodná pro použití s touto soupravou.
Tato souprava byla validována pro analýzu vzorků získaných z nádoru kolorektálního karcinomu
zalitých v parafínu a fixovaných formalinem. Není validována pro diagnostické použití s jinými
druhy karcinomů ani pro čerstvé nebo zmrazené vzorky získané biopsií.
Řešení problémů s nestandardními výsledky a podrobnosti k faktorům, které ovlivňují tento test,
naleznete v části Příloha B - Pokyny pro řešení problémů v následujícím textu.
Během práce se soupravou je nutné věnovat pozornost zabránění přenosu a křížové kontaminaci.
Extrémní citlivost metody testování vyžaduje v následujících bodech preventivní opatření:
•
Manipulaci se vzorky je nutné provádět tak, aby mezi vzorky nemohlo dojít ke křížové
kontaminaci
•
Pracujte na pracovišti pro PCR nebo na jiném vhodném místě, které lze před přípravou
amplifikačních reakcí PCR vystavit UV záření.
•
K otevření vzorků po amplifikaci pomocí PCR určených ke kontrole kvality gelovou
elektroforézou použijte oddělené pracoviště pro PCR.
•
Příprava k digesci enzymem SURVEYOR Nuclease má být provedena v oddělené
místnosti nebo na jiném pracovišti pro PCR, než kde byla provedena původní PCR.
•
Během všech kroků testu se s plasmidovými kontrolami v soupravě musí manipulovat
odděleně od testovaných vzorků.
•
o
Všechny roztoky a jamky pro kontrolu bez templátu a pro DNA vzorků musí být
před otevřením zkumavek s kontrolní plasmidovou DNA uzavřeny.
o
MANIPULACI S KONTROLAMI PROVÁDĚJTE JAKO POSLEDNÍ. Kontrolní
plasmidovou DNA přidávejte do příslušných zkumavek pouze AŽ PO uzavření
všech jamek s kontrolou bez templátu a se vzorky.
o
Po uzavření zkumavek s kontrolní DNA otřete VŠECHNY zkumavky a víčka před
přenesením na jiné pracoviště přípravkem destruujícím DNA (např. 10%
chlornanem).
Pipetování vzorků do 96jamkových destiček nesmí umožnit kontaminaci sousedících
jamek vzorkem, ke které by mohlo dojít vystříknutím během míchání nebo opomenutím
vyměnit špičku pipety.
strana 30
Příloha A
Příloha A
A.1 Návrh uspořádání destičky pro soupravy SURVEYOR Scan
Níže znázorněný návrh uspořádání destičky je určen pro analýzu SURVEYOR Scan všech sedmi
Exons v KRAS a NRAS současně v deseti vzorcích.
Legenda: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutace; NTC = kontrola bez templátu.
A.2 Označení na kontrolní DNA
Sekvence s „označením“ jsou ukázány níže.
Legenda: Úseky s nejčastější mutací jsou zvýrazněny růžově. Sekvenci ve VELKÉM písmu
tvoří kódující báze; malým písmem jsou nekódující báze.
Kontroly obsahují genetické označení zvýrazněné žlutě; tuto odchylku od sekvence
KRAS a/nebo NRAS Wild-Type v úseku, kde se mutace neočekávají, lze využít k řešení
problémů s kontaminací vzorků kontrolami Positive Control. Ukázku takové
kontaminace ukazuje křivka SURVEYOR Scan v Příloze B - Pokyny pro řešení
problémů, 8.
Označení v exonu KRAS Exon 2
Velikost amplikonu: 190 bp. V kontrolním plasmidu pro KRAS Exon 2 je genetické označení
vytvořeno změnou TAT na ATA. Kodony 12 a 13 jsou zvýrazněny níže.
GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT
Označení v exonu KRAS Exon 3
Velikost amplikonu: 200 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu KRAS Exon 3 je genetické
označení ACC změněno na TGG. Kodony 59 a 61 jsou zvýrazněny níže.
GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG
Označení v exonu KRAS Exon 4A
Velikost amplikonu: 168 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu KRAS Exon 4A je genetické
označení AGA změněno na TCT. Kodon 117 je zvýrazněn níže.
AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC
strana 31
Příloha A
Označení v exonu KRAS Exon 4B
Velikost amplikonu: 194 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu KRAS Exon 4B je genetické
označení agt změněno na tca. Kodon 146 je zvýrazněn níže.
TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac
Označení v exonu NRAS Exon 2
Velikost amplikonu: 236 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu NRAS Exon 2 je genetické
označení aca změněno na tgt. Kodony 12 a 13 jsou zvýrazněny níže.
ccatgtggttcttgctggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAGGTGGTGTT
označení GAC změněno na CTG. Kodony 59 a 61 jsou zvýrazněny níže.
ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA
označení CAA změněno na GTT. Kodony 117 a 146 jsou zvýrazněny níže.
AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG
ATTCCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG
A.3 Požadavky pro denaturaci v systému HPLC (DHPLC)
A.3.1 Specifikace systému DHPLC pro aplikace v rámci SURVEYOR Scan
Následující specifikace představují minimální požadavky pro specifikace systému
provádění testů s použitím soupravy SURVEYOR Scan KRAS a NRAS.
DHPLC k
Systém dávkování gradientového rozpouštědla do HPLC
• Funkce binárního gradientu; vysoký tlak nebo nízký tlak
• Ovládání rychlosti průtoku, minimální rozsah: 0,7 – 1,6 ml/min
• Přesnost rychlosti průtoku: ± 2% (H2O při 20 ºC)
• Odplyňovač rozpouštědla
Automatický vzorkovač
• Ovládání teploty k chlazení destiček, nastavitelné: 4 až 14 ºC
• Objem vstřiku: 5–50 µl
Separační kolona
• Určena k separaci fragmentů dsDNA různých velikostí, fragmenty od 50 bp do 250 bp
Inkubátor s velmi přesným nastavením teploty
• Teplotní rozsah: 40 až 70 ºC
• Přesnost teploty: ± 0.2 ºC
• Reprodukovatelnost teploty: ± 0.2 ºC
• Linearita v celém rozsahu teplot: ± 2.0 ºC
Alternativa detekce 1
• UV/VIS detektor
• Rozsah vlnových délek: 190 – 700 nm
• UV zdroj: Deuteriová lampa
strana 32
Příloha A
Alternativa detekce 2
• Fluorescenční detektor
• Rozsah vlnových délek: buzení: 200 – 850 nm; emise: 250 – 900 nm
• Fluorescenční zdroj: 150W xenonová lampa
•
Pumpa pro fluorescenční barvivo
• Fixní rychlost průtoku 0,.1 ml/min – 20 %/+50 %
• Nízkopulzní průtok
A.3.2 Obsluha systému
Při nastavení a obsluze systému DHPLC dodržujte doporučení výrobce pro analýzu fragmentů
dsDNA o velikosti od 50 bp to 250 bp s dosaženým rozlišením velikosti 10 bp nebo vyšším.
Takový je rozsah velikostí fragmentů po digesci enzymem SURVEYOR Nuclease s použitím této
soupravy.
A.3.3 Údržba kolon v systému DHPLC
Při údržbě kolon v DHPLC dodržujte doporučení výrobce.
Poznámka: analýza reakcí se SURVEYOR Nuclease vyžaduje dodržování častějších a
přísnějších protokolů ve srovnání s analýzou standardních vzorků PCR. Další podrobnosti
naleznete v pokynech pro systém DHPLC
strana 33
Příloha A
A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR
V zájmu získání spolehlivých a nekontaminovaných výsledků PCR dodržujte při přípravě
laboratoře pro PCR správnou laboratorní praxi.
Při přípravě laboratorního uspořádání dbejte na prostorové oddělení činností během přípravy pro
PCR od činností po amplifikaci. Je důležité oddělit (i) izolaci DNA; (ii) amplifikaci PCR; a (iii)
činnosti následující po PCR, které zahrnují otevírání zkumavek obsahujících amplifikované vzorky
při přípravě analýzy v gelu a při přípravě ostatních testů, jako je analýza produktů digesce
enzymem SURVEYOR Nuclease a sekvenování DNA.
Je rovněž důležité mít laboratorní potřeby a zařízení určené pro jednotlivé prostory a používat je
pouze v těchto prostorech. Utírání ploch 10% (obj/obj) chlornanem, připravovaným jednou týdně,
pomůže eliminovat fragmenty DNA ≤ 500 bp jako templáty pro PCR. Dále může být vhodné ošetřit
plastové potřeby a roztoky expozicí krátkovlnnému UV záření s použitím UV síťovadla po dobu 710 minut.
Poznámka: enzymy a DNA určené k amplifikaci nesmí být vystavovány UV záření.
K minimalizaci kontaminace velmi pomůže nošení náležitého ochranného oděvu, častá výměna
rukavic a utírání rukavic na rukou 10% (obj/obj) roztokem chlornanu před vstupem na pracoviště.
Mělo by být dodrženo uspořádání alespoň o dvou místnostech znázorněné na schématu níže,
které je určeno specificky pro PCR a pro analýzu s použitím enzymu SURVEYOR Nuclease.
strana 34
Příloha A
A.5 Odkazy na literaturu
1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix®
(panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer.
http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728
2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate
response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer.
Clin Cancer Res. 19 1902-12.
3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients
with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA
304 1812-20.
4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic
colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to
panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65.
5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR
efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9.
6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to
cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal
cancer. Br J Cancer 101 715-21.
7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the
efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal
cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62.
8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702707
9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib
resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6
10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in
haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9
11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant
resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706
strana 35
Příloha B
Příloha B
Pokyny pro řešení problémů
Efektivní použití souprav SURVEYOR Scan pro systém DHPLC závisí na úspěšném provedení
celé řady kroků. Jedním z nejdůležitějších kroků je amplifikace metodou PCR, která musí vést k
tvorbě specifické DNA o jednotné velikosti a v dostatečném množství, aby byla po hybridizaci a
štěpení detekovatelná. To závisí na kvalitě původního vzorku. Provádění testu s DNA, která
nesplňuje kritéria kvality a množství, se nedoporučuje.
Poznámka: Používáte-li enzym SURVEYOR Nuclease poprvé, prostudujte si Pokyny pro
jednotlivé kroky a proveďte experimenty v části Použití kontrolních plasmidových DNA. Před
kontaktováním technické podpory společnosti Transgenomic mějte výsledky získané pomocí
kontrolní plasmidové DNA připravené u sebe.
Tyto pokyny po řešení problémů obsahují seznam problémů, se kterými se můžete setkat při
používání souprav SURVEYOR Scan pro DHPLC a také návrhy jejich řešení. Jsou použité
příklady z Exons KRAS i NRAS.
Podrobné informace k obsluze a údržbě přístroje naleznete v příručce pro systém DHPLC.
Příručka obsahuje konkrétní pokyny pro kontrolu a udržování funkčnosti kolony a podrobnosti k
řešení problémů.
Problém 1 – nízký výtěžek PCR nebo analýza na agarózovém gelu neukazuje
žádný produkt PCR
NÍZKÝ VÝTĚŽEK
PCR
Správný
výtěžek
PCR
Nízký
výtěžek
PCR
MOŽNÁ PŘÍČINA
ŘEŠENÍ
Špatná kvalita
templátové DNA
Opakujte purifikaci DNA; ověřte používanou
purifikační metodu. Je-li DNA extrahovaná z
FFPE příliš fragmentovaná, mohou být
zapotřebí další bloky FFPE.
Velké množství RNA
ve vzorku zvyšující
odhadovanou
koncentraci DNA
Opakujte ošetření vzorku DNA RNázou a
purifikaci DNA.
Termocykler není
zkalibrován
Zkalibrujte termocykler.
Není dostatek templátu
Zvyšte množství templátu.
Proužek
RNA
Poznámka: Je třeba používat DNA vysoké kvality z FFPE. Podle měření absorbance při 260
nm musí mít DNA koncentraci 25 ng/µl, absorbanční poměr při 260/280 nm >1,8 a čistotu >90 %
DNA (tj. neobsahovat kontaminaci tRNA a rRNA na základě pozorování agarózového gelu).
Vzorky s DNA uchovávejte při teplotě od -20 °C do -80 °C.
Analýza templátu DNA extrahované z tkání zalitých v parafínu vyžaduje některá preventivní
opatření. Extrahovanou DNA lze ošetřit uracil DNA glykosylázou a tím zabránit amplifikaci
fragmentů DNA obsahujících deaminovaná C residua. Často dochází k tomu, že vysoký podíl
materiálu extrahovaného z tkáně zalité v parafinu a adsorbujícího při A260 není během PCR
správně amplifikován. Použití většího množství počáteční DNA často napomůže tvorbě správného
produktu amplifikace. Další možností je vybrat nádorovou tkáň z FFPE s vyšším podílem nádorových
buněk. Lze též použít mikrořez, avšak to je velmi časově náročný postup a nedoporučuje se pro
běžnou laboratorní analýzu.
strana 36
Příloha B
Problém 2 – analýza na agarózovém gelu ukazuje více produktů PCR
VÍCE PRODUKTŮ PCR
Správný
výtěžek
PCR
MOŽNÁ PŘÍČINA
ŘEŠENÍ
Příliš nízká teplota párování
Zkontrolujte kalibraci
termocykleru.
Více
proužků z
PCR
Poznámka: PCR musí poskytnout dostatečně vysoký výtěžek (> 20 ng/µl) JEDINÉHO
amplifikovaného druhu správné velikosti. Pro PCR se musí používat enzym DNA Polymerase a
pufr DNA Polymerase 10X PCR Buffer , které jsou součástí soupravy. Amplikony z kontrol
musí být digestovány enzymem SURVEYOR Nuclease a analyzovány odděleně, aby se zamezilo
jejich rušivému pozadí při vizuálním srovnávání profilů na elektroferogramech (viz Příklady
výsledků, obr. 4-10). Před digescí zkontrolujte všechny produkty amplifikované DNA gelovou
elektroforézou (nebo analýzou v systému DHPLC), abyste si ověřili přítomnost jednoho druhu o
předpokládané velikosti.
strana 37
Příloha B
Problém 3 – Po působení nukleázy SURVEYOR Nuclease na heteroduplexy
a analýze nejsou pozorovány žádné produkty štěpení
ŽÁDNÉ PRODUKTY ŠTĚPENÍ
Pozice
chybějících
heteroduplexů
MOŽNÁ
PŘÍČINA
ŘEŠENÍ
Příliš malý podíl
chybně
párovaných bází
Ověřte test pomocí
kontrol.
Neefektivní
tvorba
heteroduplexů
Dodržujte správný
postup při PCR a
hybridizaci. Pro
digesci nukleázou
SURVEYOR
Nuclease používejte
čerstvě
hybridizovanou DNA.
Proveďte novou
amplifikaci PCR s
použitím (1)
templátové DNA
stejného množství; (2)
zvýšeného množství
počáteční DNA; nebo
(3) izolujte čerstvou
DNA ze stejného
nebo jiného řezu
FFPE.
Pík
nerozštěpeného
homoduplexu
Neaktivní
nukleáza
SURVEYOR
Nuclease
Pro ověření funkčnosti
enzymu proveďte
kontrolní reakci s
kontrolou Positive
Control. Používejte
pouze čerstvě
připravené výchozí
směsi enzymu
SURVEYOR
Nuclease.
Poznámka: SURVEYOR Nuclease provádí štěpení především v heteroduplexech v místech s
chybným párováním. Podíl heteroduplexu vůči homoduplexu v hybridizovaném vzorku určuje
velikost signálu digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease. Je-li ve vzorku genomické DNA
přítomna mutace genu KRAS a/nebo NRAS ve velmi nízké koncentraci, signál může být příliš
nízký na to, aby vytvořil pozitivní výsledek.
Důležité je zajistit zahrnutí kroku hybridizace do programu termocykleru (viz Amplifikační
protokol), aby byla maximalizována účinnost tvorby heteroduplexu. Heteroduplexy se během
standardních reakcí PCR tvoří velmi neefektivně.
Poznámka: poměr signálu vůči šumu je všeobecně dosti vysoký pro detekci mutací přítomných v
nízkém procentu celkového templátu DNA; je možné detekovat i 2% mutantní DNA. Obr. 4-10
ukazují produkty štěpení vzniklé s použitím homoduplexní a heteroduplexní kontrolní DNA KRAS a
NRAS Positive Control (obsažené v soupravě) a vzorků FFPE v systému WAVE DHPLC 4500
System. Lze zřetelně pozorovat produkty štěpení jako dva nové píky eluující o předpokládaných
velikostech, které lze odhadnout v porovnání s velikostním markerem DNA.
strana 38
Příloha B
Pozor: komerčně dostupné pufry pro PCR mají výrazně rozdílný obsah a jejich složení často není
dodavatelem definováno. Některé pufry NEJSOU kompatibilní s nukleázou SURVEYOR Nuclease
vzhledem k pH nebo přítomnosti přísad, povrchově aktivních činidel a jiných přidaných složek.
NEPOUŽÍVEJTE žádnou jinou polymerázu ani 10X polymerázový pufr než ty, které jsou
dodávané v soupravě.
Problém 4 – Silné pozadí po působení nukleázy SURVEYOR Nuclease
SILNÉ POZADÍ
MOŽNÁ PŘÍČINA
ŘEŠENÍ
Neoptimální
hybridizace
Proveďte následující:
1. Zkontrolujte, zda
koncentrace DNA je v
rozsahu >25 ng/µl.
2. Zopakujte vytvoření
heteroduplexu a dbejte
na dodržování
doporučeného postupu;
viz bod 12.7.1.
Průtok
systémem
DHPLC
Vzorek s
rušivou
základní
linií
Promytí
systému
DHPLC
Příliš nízké množství
DNA
Ověřte výtěžek a kvalitu
templátové DNA
Nespecifické
produkty PCR
Ověřte výtěžek a kvalitu
templátové DNA.
SURVEYOR
Enhancer W2 a/nebo
SURVEYOR
Enhancer Cofactor
ztratili svojí aktivitu
Zkontrolujte datum
vypršení použitelnosti
soupravy.
Poznámka: Nukleáza SURVEYOR Nuclease někdy štěpí dvouřetězcovou DNA v náhodně
párovaných místech pouze v jednom řetězci. To způsobuje vznik pozadí po digesci. Tato aktivita
je potlačována zesilovačem SURVEYOR Enhancer W2 a jeho kofaktorem Cofactor, aniž by došlo
k negativnímu ovlivnění reakce štěpení v místě chybného párování. SURVEYOR Enhancer W2 a
SURVEYOR Enhancer Cofactor jsou obsaženy v soupravě a tyto je třeba vždy používat.
Dochází-li k tomuto štěpení pouze na jednom řetězci, vytváří se tak v systému DHPLC menší píky.
Produkty digesce kontroly Wild-Type Control budou vykazovat stejné malé píky. Toto srovnání se
používá při hledání rozdílů v elektroferogramech mezi Wild-Type Control a testovaným vzorkem a
při srovnávání charakteristiky vzorku s charakteristikou kontroly Wild-Type Control.
strana 39
Příloha B
Problém 5 – píky po digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease u negativních
kontrol
PÍKY DIGESCE U NEGATIVNÍCH KONTROL
Píky digesce Wild-Type
Control se
slabým signálem
Průtok
systémem
DHPLC
Pík
neštěpeného
homoduplexu
MOŽNÁ PŘÍČINA
ŘEŠENÍ
Kontaminace
obsahu soupravy
amplikony genu
KRAS a/nebo NRAS
nebo plasmidovými
kontrolami.
Zlikvidujte
všechny
komponenty
soupravy a
použijte novou
soupravu.
Obraťte se na
technickou podporu
společnosti
Transgenomic a
poraďte se o
možných příčinách
a zdrojích
kontaminace.
Promytí
systému
DHPLC
Problém 6 – Neúspěšné výsledky s nukleázou SURVEYOR Nuclease
DIGESCE KONTROL POSITIVE CONTROL S
NUKLEÁZOU SURVEYOR NUCLEASE SE
NEZDAŘILA
Nejasné píky po
digesci
Pík
nerozštěpeného
homoduplexu
MOŽNÁ PŘÍČINA
ŘEŠENÍ
SURVEYOR
Nuclease nebyla
přidána
Proveďte digesci
nového vzorku
Digesce
nukleázou
SURVEYOR
Nuclease
proběhla při
nesprávné teplotě
Proveďte digesci
nového vzorku
strana 40
Příloha B
Problém 7 – Neočekávané píky na křivce digesce nukleázou SURVEYOR
Nuclease
DIGESCE KONTROL POSITIVE CONTROL S
NUKLEÁZOU SURVEYOR NUCLEASE SE NEZDAŘILA
Pík neštěpeného
homoduplexu
MOŽNÁ
PŘÍČINA
ŘEŠENÍ
Mutace v
neobvyklém
místě
Ověřte mutaci
sekvenováním
vzorku
Neočekávaný
pík po digesci
Průtok
systémem
DHPLC
Očekávané píky
po digesci
Promytí
systému DHPLC
strana 41
Příloha B
Problém 8 – Kontaminace vzorků kontrolami Positive Control
CHARAKTER DIGESCE ODPOVÍDÁ PŘÍTOMNOSTI
OZNAČENÉHO ÚSEKU SMÍŠENÝCH KONTROL
POSITIVE CONTROL A HETERODUPLEXŮ WILDTYPE
MOŽNÁ
PŘÍČINA
Nesprávný
způsob
pipetování
Vzorek 1
Vzorek 2
Vzorek 3
ŘEŠENÍ
Při pipetování vzorků
je třeba věnovat
pozornost zabránění
příčné kontaminaci.
Zkontrolujte úseky
se sekvencí
kontrolního
označení, zda
nedošlo ke
kontaminaci
kontrolou Positive
Control.
Sekvenování odhaluje úseky s označením v NRAS Exon
2 kontaminující testovaný vzorek.
Oblast kodonů 12 a
13 v
NRAS Exon 2
Úsek s označením v
plasmidové kontrole
NRAS Exon 2
Vzorek je typu WildType
Je přítomna značkovací
sekvence.
Kontaminováno
Vzorek je mutantní
Bez značkovací sekvence
Platný vzorek
Nesprávný
způsob
pipetování
Při pipetování vzorků
je třeba věnovat
pozornost zabránění
příčné kontaminaci.
Zkontrolujte úseky
se sekvencí
kontrolního
označení, zda
nedošlo ke
kontaminaci
kontrolou Positive
Control.
Vzorek je typu Wild-Type
Není přítomna značkovací
sekvence.
Platný vzorek
strana 42
Podrobnosti pro objednávku
Podrobnosti pro objednávku
Číslo
produktu
Název produktu
Velikost
710104
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD
100 reakcí
710106
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD
100 reakcí
710400
SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD
100 reakcí
710077
CRC RAScan Combination Kit
230 reakcí
Kontaktní údaje
Hlavní sídlo
Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street
Omaha
Nebraska 68164
United States of America
Evropa
ADS Biotec Limited
40 Watt Road
Hillington Park, Hillington
Glasgow G52 4RY
United Kingdom
Tel.:
(888) 233-9283* nebo +1 (402) 452-5400
Fax:
+1 (402) 452-5401
E-mail: [email protected]
Tel.:
+44 141 892 8800
Fax:
+44 141 883 5967
E-mail: [email protected]
*Pouze v Severní Americe
www.Transgenomic.com
Překlad Prohlášení
Transgenomic, as vynaložila veškeré úsilí, aby zajistila přesnost tohoto překladu. Pokud máte dotazy týkající se jakékoli
informace uvedené v této přeložené verze této příručky naleznete na anglické verzi Instructions for Use for the
CRC RAScan™ Combination Kit CE IVD with DHPLC Systems – 482427(EN) http://www.transgenomic.com/wpcontent/uploads/482427-EN.pdf a / nebo kontaktujte Transgenomic na [email protected].
strana 43
Licence, obchodní známky a autorská práva
Licence, obchodní známky a autorská práva
SURVEYOR Nuclease: Tento produkt je vyroben pod exkluzivní licencí podle patentů USA 6,699,980, 6,391,557,
5,869,245, jejich zahraničních protějšků a dalších patentů podaných k přihlášení. K používání nukleázy SURVEYOR
Nuclease je vyžadována licence od společnosti Transgenomic. Akademické, neziskové a ziskové organizace mají na
základě koupě tohoto produktu omezená práva na používání nukleázy SURVEYOR Nuclease pro výzkumné účely. Další
prodej a jiná použití se přísně zakazují. Pro více podrobností se obraťte na společnost Transgenomic.
Polymeráza DNA Polymerase: Použití tohoto produktu podléhá jednomu nebo více z následujících patentů USA a
příslušným patentovým nárokům mimo USA: 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 a nárokům mimo USA příslušným patentu
USA č. 4,889,818. Zakoupení tohoto produktu zahrnuje omezené a nepřenositelné zproštění od soudního postihu podle
výše uvedených patentových nároků za použití pouze tohoto množství produktu k vlastnímu internímu výzkumu kupujícího.
Neuděluje se žádné právo , ať výslovně či odvozeně nebo jako překážka v uplatnění žalobního nároku podle žádného z
patentových nároků (jako jsou např. patentované nároky v patentech USA č. 5,210,015 a 5,487,972 na způsob s 5'
nukleázou), žádné právo provádět žádný patentovaný způsob ani žádné právo provádět komerční služby jakéhokoli druhu,
včetně, kromě jiného, předávání výsledků činnosti kupujícího za poplatek či jiné komerční ohodnocení. Tento produkt je
určen pouze pro výzkumné účely. Pro diagnostické použití podle patentů společnosti Roche se vyžaduje samostatná
licence od společnosti Roche . Další informace k nákupu licencí lze obdržet kontaktováním ředitele pro licence: Director of
Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.
Transgenomic, SURVEYOR a WAVE jsou registrované obchodní známky a Navigator, CRC RAScan, logo šroubovice a
Advancing Personalized Medicine jsou obchodní známky společnosti Transgenomic, Inc. Všechny ostatní známky jsou
obchodní známky jejich příslušných držitelů.
© 2013 Transgenomic, Inc. Všechna práva vyhrazena. Vytištěno v USA.
Dokument č. 482427(CS) rev-01
strana 44

Návod k použití CRC RAScan™ Combination Kit

Transkript

Podobné dokumenty

Návod k použití soupravy SURVEYOR® Scan NRAS Kit Exons 2, 3

Návod k Použití Soupravy SURVEYOR® Scan

Blazkova_Comparison of in vivo and in vitro digestibility in horses

JARNÍ MANEKO NOVINY 2009

CMV TM PCR

SYNTÉZA PEPTID Ů NA PEVNÉ FÁZI A KOMBINATORIÁLNÍ

Vyšetření syndromu Noonanové - Ústav biologie a lékařské genetiky

QIAsymphony DSP DNA Kits: Charakteristika účinnosti

věstník klubu za starou prahu

ČAS 2008 - Czech Aerosol Society

Souhrn údajů o přípravku Vectibix

Žádanka na genetické vyšetření

znalecký posudek - Soudní exekutor Mgr. Martin Slavata Mladá