Sylabus Základy bioinženýrství N319002

Transkript

Sylabus Základy bioinženýrství N319002
Sylabus obsahuje souhrn základních faktů předmětu Základů bioinženýrství. Pro jejich
správnou interpretaci, pochopení a začlenění do kontextů je třeba mít znalosti základních
předmětů, jako jsou Fyzika, Matematika, Analytická a Fyzikální chemie, Biochemie,
Mikrobiologie, Chemické inženýrství. Před každou kapitolou jsou okruhy témat, u nichž je
doporučeno si osvěžit své znalosti pro smysluplné vstřebání probírané látky. Za každou
kapitolou jsou otázky, jejichž promýšlením (a ideálně správným zodpovězením) se lze o
významný kus přiblížit k cíli absolvování tohoto předmětu, tedy získání efektivních znalostí a
dovedností pro kultivaci buněk v průmyslovém měřítku a tedy i úspěšné absolvování zkoušky.
Začlenění vašich dosavadních znalostí do nových kontextů a jejich rozšířením o oblasti
technologického a inženýrského přístupu ke kultivacím buněk bude hlavní cíl přednášek
předmětu Základy bioinženýrství.
Přednášky
1. Problematika biotechnologie a bioinženýrství, struktura biotechnologického procesu.
2. Technologické aspekty využití intaktních buněk jako producentů (rostlinné vs.
živočišné vs. mikroorganismy). Typy produktů. Možnosti použití enzymů.
3. Přípravné operace biotechnologických výrob (uchovávání mikroorganismů, příprava
inokula, příprava a sterilizace kapalného média, sterilizace bioreaktoru, SIP, filtrace a
sterilace plynů).
4. Parametry pro popis kultivace mikroorganismů. Výtěžnost a produktivita procesů.
Přehled typů kultivací.
5. Vsádková kultivace (charakteristika, hmotová bilance, použití).
6. Vsádková kultivace s postupným živením (charakteristika, způsoby přítokování
média, hmotová bilance, použití).
7. Kontinuální kultivace (charakteristika, způsoby řízení procesu, hmotová bilance,
porovnání se vsádkovou kultivací, použití). Volbu typu kultivace na základě
požadovaného produktu.
8. Aerace a přestup kyslíku (realizace aerace, mechanismus přestupu kyslíku, KLa).
9. Míchání (typy míchání v biotechnologických provozech, specifika míchání
bioreaktorů).
10. Bioreaktory (rozdělení, konstrukce, použití).
11. Měřené a regulované veličiny při kultivaci buněk. Základy regulace bioprocesů
(regulační okruh, typy regulátorů, veličiny v regulaci).
12. Dokončovací operace biotechnologických výrob (konvenční separační technologie,
dezintegrace buněk, membránové separační technologie).
13. Dokončovací operace biotechnologických výrob (extrakce, srážení, destilace, sušení,
stripování, CIP). Výrobní linka biotechnologického procesu.
14. Biotechnologie a bioreaktory pro zpracování odpadů z biotechnologických výrob.
1
1. Problematika biotechnologie
biotechnologického procesu.
a
bioinženýrství,
struktura
Historie biotechnologií
před-Pasteur éra, před 1865
- alkoholické nápoje (pivo, víno)
- mléčné výrobky (sýry, jogurt)
- další fermentované potraviny
Pasteur éra, 1865 - 1940
- etanol, butanol, aceton, glycerol
- organické kyseliny (kyselina citronová)
- aerobní čištění odpadních vod
éra antibiotik, 1940 - 1960
- penicilin - submerzní kultivace
- rozšiřování palety druhů antibiotik
- technologie živočišných buněk; vakcíny proti virovým onemocněním
- biotransformace steroidů
post-antibiotická éra, 1960-1975
- amino kyseliny
- single cell proteiny (SCP)
- enzymy
- technologie imobilizace enzymů a buněk
- anaerobní čištění odpadních vod (bioplyn)
- bakteriální polysacharidy (xanthan, dextran)
éra nových biotechnologií, 1975- hybridomová technologie - monoklonální protilátky
- monoklonální diagnostické testy (1980)
- genetické inženýrství (1974)
- lidský insulin (1982)
- první klonovaný živočich - ovce Dolly (1997)
- publikování kompletního lidského genomu v Science and Nature (2001)
Historie biotechnologií je přehledně zpracována na http://biotechinstitute.org/what-isbiotechnology/timeline?tid=98
Biotechnologie



každý proces, který využívá živé organismy nebo jejich části k tvorbě nebo úpravě
produktů, k získání rostlin nebo zvířat s lepšími vlastnostmi, nebo k získání
mikroorganismů pro speciální účely
aplikace biologických systémů a organismů v technických a průmyslových procesech
zahrnuje procesy katalyzované čistým enzymem nebo směsí enzymů, intaktní
(funkční) mikrobiální, rostlinnou nebo živočišnou buňkou, nebo jednou či více
organelami izolovanými z buněk
2
Bioinženýrství
Bioinženýrství
je
jedna
z
částí
biotechnologie - interdisciplinární obor
(biochemie,
biologie,
mikrobiologie,
fyzikální chemie, chemické inženýrství,
biofyzika, konstrukce a stavba zařízení,
měření a regulace).
Bioinženýr zajišťuje průmyslovou realizaci
biotechnologických procesů.
Biotechnologie je průnik tří základních
disciplín: biologie, chemie a inženýrství.
Bioinženýrství je průnik dvou základních
disciplín: biologie a inženýrství.
Pro řízení biologických procesů je tedy
nutné ovládat jednotlivé disciplíny ale umět je propojit a používat znalosti jednotlivých
disciplín v kontextu ostatních.
Základní schéma operací v biotechnologickém procesu.
3
2. Technologické aspekty využití intaktních buněk jako
producentů (rostlinné vs. živočišné vs. mikroorganismy). Typy
produktů. Možnosti použití enzymů.
Podněty k zopakování si…
 Definice rychlosti; matematické a grafické vyjádření.
 Kinetika chemických reakcí 0. a 1. řádu (A→B). Řešení kinetických rovnic.
 Mechanismy reakcí, katalýza, řídící děj.
 Mechanismus katalyzovaných reakcí a typy katalyzátorů. Porovnání chemických a
biologických katalyzátorů.
 Enzymy – funkce, rozdělení, vlastnosti, kinetika enzymových reakcí. Význam a
stanovení konstant KM a vmax v kinetické rovnici Michaelis-Menten.
 Řád enzymové reakce.
 Inhibice enzymové reakce – druhy a význam.
 Základní druhy metabolismu mikroorganismů..
 Základní metabolické dráhy a jejich návaznost.
Kultivace mikroorganismů je proces, při kterém mikroorganismy spotřebovávají substrát a
živiny na rozmnožování a případné produkty. Cílem je produkce požadovaného produktu co
nejvyšší rychlostí, v co největším množství, nejjednodušší a nejlevnější cestou.
Využívají se následující schopnosti mikroorganismů:
 syntetická schopnost
 biokonverze
 biodegradace
 biosorbce (na povrchu)
 bioakumulace (uvnitř buňky)
Základní rozdělení produktů kultivace:
 biomasa
 primární produkty
o produkty primárního (základního) metabolismu
o spojeno s růstem buněk
o etanol, kyseliny mléčná, citrónová, octová, metan
 sekundární produkty
o produkty sekundárního (specifického) metabolismu; často biotransformace
o nerostoucí buňky
o antibiotika, steroidy, alkaloidy, vitamíny…
Příklady využití jednotlivých skupin mikroorganismů:
 plísně – sýry, antibiotika, alkaloidy (námel – paličkovice nachová)
 bakterie – mléčné kvašení, vitamíny, enzymy, rozpouštědla
 kvasinky – pekařské droždí, krmná biomasa, etanol
 jednobuněčné řasy – oleje, škrob, biologicky aktivní látky
Využívají formy a typy biokatalyzátorů:
 intaktní buňky
o rostlinné buňky
o živočišné buňky
o mikrobní buňky
4


buněčné organely
enzymy
Intaktní buňky charakterizuje:
 dlouhodobější účinek
 ochrana enzymů buněčnou stěnou a membránou
 možno buňky zvyknout na jiný substrát
 univerzálnější (menší specifita)
 mohou mutovat
Enzymy charakterizuje:
 možné vyšší koncentrace substrátu
 energeticky (provozně) méně náročné (než udržovat živou buňku)
 ale čisté enzymy poměrně drahé
o volné enzymy - v „roztoku“
o vázané enzymy - imobilizace
 nutno větší množství
 vícenásobné použití
 větší stabilita
Technologické aspekty specifik mikrobiálního metabolismu
Finální akceptor elektronů
Chemoorganotrofní organismy získávání energii oxidací organických látek (donory
elektronů). Jejich katabolismus produkuje vodík a elektrony (NADH+H+), které musí být
následně využity. Ať už je mechanismus nakládání s nimi jakýkoli, musí existovat – jako
poslední krok – jejich předání na finální akceptor elektronů.
Podle finálního akceptoru elektronů se metabolismus rozděluje na:
 respirace
akceptor - látky přijaté z prostředí za účelem použití jako finální akceptory elektronů
o aerobní (kyslík)
o anaerobní (dusičnan, síran, thiosíran), pouze některá prokaryota
 fermentace
akceptor – meziprodukt odbourávání degradované molekuly (např. pyrohroznová kyselina
nebo acetaldehyd)
Respirace
Zjednodušené schéma oxidativní fosforylace včetně finálního přenosu vodíku a elektronů při
respiraci.
5
Fermentace
Finálním akceptorem elektronů je část degradované molekuly - část molekuly se oxiduje (→ COOH, CO2) a část redukuje (→ ethanol, laktát). Příklady jsou například alkoholové kvašení
a mléčné kvašení prováděné některými anaerobní mikroorganismy a fakultativně anaerobními
mikroorganismy (nepřítomnost O2, Crabtreeho efekt - kvasinky).
Zjednodušené schéma finálního přenosu vodíku a elektronů při fermentaci (etanolové
kvašení).
Zjednodušení schéma finálního přenosu vodíku a elektronů při fermentaci (mléčné kvašení)
prováděné homofermentativními mléčnými bakteriemi např. Pediococcus, Streptococcus,
Lactococcus, Lactobacillus (některé druhy).
Udržovací (maintenance) energie
Udržovací (maintenance) energie je energie nutná k udržení homeostáze (vnitřního prostředí)
buněk a poskytuje ji tzv. basální metabolismus. Jakákoliv živá buňka představuje systém, kde
stále běží rozkladné a syntetické děje = endogenní metabolismus spotřebovávající udržovací
energii.
Hodnota udržovací energie je téměř konstantní. Ovlivňuje ji např. koncentrace O2, limitace
jinou živinou než zdrojem E. Neideální vnější prostředí znamená nutnost vydání většího
množství energie na udržení optimálního vnitřního prostředí.
Čím nižší růstové rychlosti tím vyšší procentuální zastoupení energie pro udržovací účely v
celkovém množství spotřebované energie.
6
Příklady technologií rozdělených podle finálního akceptoru elektronů
Metabolismus Příklad
Technologie
Základní
mikroorganismu
popis
Fermentace
Methanobacterium
produkce bioplynu CH3-COOH →
bryantii
čištění odpadů
CH4+CO2
Saccharomyces
produkce etanolu
Glukóza
→
cerevisiae
2CH3CH2OH +
2CO2
Lactococcus lactis
produkce mléčné Glukóza
→
kyseliny
2CH3-CHOHCOOH
Clostridium
produkce
složitý
acetobutylicum
biorozpouštědel
mechanismus vznik
směsi
CH3CH2OH,
CH3COCH3 a
CH3(CH2)2OH
Aerobní
většina
aerobní produkce C6H12O6 + 6
respirace
mikroorganismů
sekundárních
O2 → 6 CO2
používaných
v metabolitů
+ 12 H2O
biotechnologiích
produkce biomasy
(droždí)
(chemoorganotrofní) aerobní
čistění
odpadní vody a
plynu
Nitrosomonas sp.
odstranění
2 NH3 + 4 O2
amoniaku
→ 2 NO3- + 2
(chemolitotrofní)
z odpadní
vody H+ + H2O
nebo plynu
(dvoustupňový
proces)
Anaerobní
Paracoccus
odstranění
2
NO3+
respirace
denitrificans
dusičnanů/dusitanů organická látka
z odpadní vody
(zdroj e-+H+)
→ N2 + (CO2 +
H2O)
(zjednodušená
rovnice)
Methanothrix
produkce bioplynu CO2+4H2 →
soehngenii
čištění odpadů
CH4+2H2O
Poznámka
Více
viz
kapitola 14
alkoholová
fermentace
(kvašení)
mléčná
fermentace
(kvašení)
acetonbutanoletanolová
fermentace
Uhlíkatá látka
- zisk energie
a zdroj uhlíku
Proces
nitrifikace
Proces
denitrifikace
Více
viz
kapitola 14
7
Přehled metabolických efektů a jejich technologických důsledků
Pasteurův efekt
Crabtreeho efekt
Kyslíkový efekt
Glukózový efekt
Katabolická
represe
→ kvasinka Saccharomyces cerevisiae (fakultativně anaerobní) v
přítomnosti kyslíku zpomaluje kvašení (fermentace) a zrychluje se růst
kultury (využití aerobní respirace).
→ kvasinka Saccharomyces cerevisiae v médiu s velkou koncentrací
glukózy provádí fermentaci i v přítomnosti kyslíku tj. místo aerobní
respirace.
 Následkem je neefektivní využití glukózy-substrátu.
Metabolismus fakultativně anaerobních mikroorganismů v přítomnosti
kyslíku.
Podstatou je represe metabolických drah (fermentace nebo anaerobní
respirace) v přítomnosti kyslíku a indukce drah, které jsou třeba k jeho
využití jako finálního akceptoru elektronů.
Utilizace směsi glukózy a dalšího substrátu.
Podstatou je represe ostatních metabolických drah glukózou.
 Následkem je diauxie.
Utilizace směsi různě utilizovatelných substrátů.
Podstatou je represe metabolických drah hůře utilizovatelných
substrátů těmi snáze.
 Následkem je diauxie.
Způsoby technologického využití enzymů
Enzymy je možné použít jako volné („rozpustné”; disperze ve vodném médiu) enzymy nebo
imobilizované.
Volné enzymy
 jednorázová aplikace
 nízká stabilita volného enzymu
 drahé (jednorázové použití)
Imobilizované enzymy
Důsledkem imobilizace je částečná ztráta aktivity enzymu z důvodu možné blokace aktivního
centra (zvláště při náhodné imobilizaci). Proto se snažíme používat orientovanou imobilizaci
– kdy jsou cíleně aktivní centra imobilizovaného enzymu orientována od nosiče.
Výhody imobilizovaných enzymů oproti volným:
 opakované použití
 zvýšení stability enzymů a prodloužení doby jejich aktivity
 odpadá separace produktu a enzymu
 možnost kontinuálního provozu
 možnost účinnějšího řízení procesu
Způsoby imobilizace enzymů
 Fyzikální adsorpce – alumina, kaolin, ionexy (jednoduché ale uvolňování enzymů)
 Inkluze enzymů ve struktuře (bio)polymerního gelu (alginát, želatina…),
polopropustné membrány (semipermeabilní trubičky, ultrafiltrační membrány) nebo
nanomatric.
 Kovalentní imobilizace na nosiče nesoucí vhodné funkční skupiny (-NH2, COOH, SH, -OH)
Příklad:
8


skupiny -NH2 na nosiči i enzymu + glutaraldehyd
-NH2 + HCO- → -N=CHZesítění - spojení aminoskupin patřících k různým enzymům (např. –NH2 +
glutaraldehyd) tvorba proteinových agregátů (→ submerzní proces ale relativně
snadná separace)
Imobilizace na magnetické nosiče - polymerní částice s magnetickými oxidy železa,
silanizovaný magnetovec (→ submerzní proces imobilizovaných enzymů a zároveň
snadná separace)
Aplikace imobilizovaných enzymů
• míchané reaktory
• náplňové reaktory
• reaktory s fluidním ložem
• ultrafiltrační membránové systémy
Vlivy na enzymovou aktivitu mají:
 inhibitory
 aktivátory
 koncentrace substrátu
 koncentrace enzymu
 fyzikálně-chemické vlastnosti prostředí
o pH
o teplota
o iontová síla
 mechanické vlivy
o střižné síly (míchání)
Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí…
 Porovnejte použití enzymů a intaktních buněk z technologického hlediska.
 Jaké jsou mechanismy působení pH, teploty a střižných sil na enzymovou aktivitu?
 Je rozdíl v nárocích na přesnost regulace teploty a pH mezi intaktními buňkami a
enzymy? Pokud ano tak proč?
 Porovnejte základní druhy metabolismu z hlediska finálního akceptoru elektronů.
 V jakém stavu, z chemického hlediska, musí být látka, aby
mohla sloužit jako finální akceptor elektronů?
 Jaké jsou důsledky metabolických efektů na kultivaci buněk?
 Jaké jsou technologické důsledky existence udržovací (maintenance) energie?
9
3. Přípravné operace biotechnologických výrob (uchovávání
mikroorganismů, příprava inokula, příprava a sterilizace
kapalného média, sterilizace bioreaktoru, SIP, filtrace a
sterilace plynů).
 Vztah mikroorganismů k teplotě a chemickým látkám v okolí, termorezistence
jednotlivých fyziologických stavů mikroorganismů.
 Výměníky tepla, transport tepla, prostup a přestup tepla.
Biotechnologický proces
Obecné schéma biotechnologického procesu.
Přípravné operace (upstream procesy)
•
•
•
•
•
uchovávání mikroorganismů
příprava inokula
příprava kapalného média
sterilace kapalného média
filtrace a sterilace plynů
10
Uchovávání mikroorganismů
Délka a podmínky uchovávání závisí na rychlosti změn vlastností buněk, tedy na typu a stavu
buněk a způsobu uchovávání.
Dlouhodobé - inaktivní buňky
–
lyofilizace (sublimace ledu za podtlaku + kryoprotektant)
–
pod vrstvou parafinu (plísně),
–
hluboké zmrazení -80°C hlubokomrazící box (+ kryoprotektant)
–
velmi hluboké zmrazení -140°C - tekutý dusík (+ kryoprotektant)
Krátkodobé - aktivní buňky
–
lednice 4-6°C (lépe odstředěné než v médiu)
–
na agaru či jiném pevném médiu (přeočkovávání každých 4-6
týdnů)
Kryoprotektanty zabraňují vzniku ledových krystalů, které by při svém vzniku zničily buňky
(její struktury). Ledové krystaly jsou ostré a mají větší objem než kapalná voda. Koncentrace
kryoprotektantů se liší podle konkrétního použití, ale jsou většinou v rozmezí 10-25 %.
 glycerol (zamrazování)
 dimethylsulfoxid (DMSO) (zamrazování)
 sacharóza (lyofilizace)
Příprava kapalného média
Mikroorganismy vyžadují určité spektrum chemických látek využívaných jako živiny a zdroje
energie:
 látky využívané pro výstavbu buněk (asimilace)
 látky využívané pro získávání energie (disimilace)
 některé látky plní obě funkce - často uhlíkaté látky využívané jako zdroj uhlíku a
energie (glukóza)
anorganické živiny
 základní prvky (C, N, O, H)
 makroprvky (zdroje S, P, Mg, K…)
 stopové prvky (Fe, Mn, Cu…)
organické živiny - organické zdroje C, N, P… a specifické látky např. AMK, vitamíny esenciální živiny (eukaryota)
Příprava kapalného média
 Rozpuštění navážených složek média v upravené vodě (demineralizace, odstranění
chloru) v míchané nádobě (vrtulové míchadlo)
 Úprava pH (před někdy nutné i po sterilaci)
 Odstranění O2 (anaerobní kultivace)
o sterilací (s teplotou klesá rozpustnost plynů)
o nahrazení jiným plynem (N2, CO2, H2).
o přídavek redukujících chemických látek (kyselina thioglykolová nebo
její sodné soli, cystein, redukované železo)
Sterilace
Destrukce (tepelná, chemická) nebo odstranění (filtrací) všech životaschopných forem
mikroorganismů. Je nutné ji provést co nejdříve po přípravě média (minimalizace změn média
kontaminací).
Provedení:
11
o
o
o
o
tepelná (suché, vlhké teplo)
(mikro)filtrace
záření
chemická
Sterilace teplem
Tepelná destrukce mikroorganismů - tepelná denaturace enzymů základního významu. Je
vhodná pouze pro termostabilní média!
Provedení:
 Průmyslové provozy – převážně separátně sterilovat médium (průtokový sterilizátor) a
bioreaktor.
 Experimentální/laboratorní reaktory - převážně sterilace reaktoru s médiem.
Účinnost sterilace je funkcí teploty, času, podmínek, druhu mikroorganismu, fyziologickém
stavu a koncentraci buněk.
Vliv vlastností média na účinnost sterilace teplem:
 vlhkost (↑↑)
 pH (↑↓)
 obsah lipidů, bílkovin a sacharidů (↑↓)
Vlastní provedení sterilace může být in-situ nebo ex-situ:
in-situ
 nepřímým ohřevem přes duplikátor (pára) nebo elektricky
 přímou aplikací ostré (přehřáté) páry do reaktoru (pozor na zředění média
zkondenzovanou párou!)
ex-situ
 suchá sterilace (suchým vzduchem) v sušárně nástroje - 160-180°C/2 hod
 vlhká sterilace (párou) - média, reaktory
o autokláv 0,2 MPa/121°C/15-45 min
o sterilace přímou parou, 135°C/5 minut
Kinetika procesu
r
dC
 k  C
dt
k… rychlostní konstanta odumírání
c… koncentrace buněk
T   k  log   q
k = f (teplota, podmínky, druh mikroorganismu, fyziologický stav buněk,)
Letalitní křivka je závislost mezi letální teplotou (T) a logaritmem doby působení (log τ).
Přímka spojuje body za daných podmínek, kdy jsou všechny mikroorganismy usmrceny.
Vyjadřuje základní vztah mezi teplotou a dobou sterilace: čím vyšší teplota tím kratší čas
nutný pro usmrcení mikroorganismů.
Při sterilaci teplem je nutné věnovat pozornost:
 obsahu termolabilních látek
 obsahu vzájemně spolu reagujících látek
 obsahu spor
 obsahu ochranných látek
 intenzitě vedení tepla
12
Termolabilní látky
 vitamíny, růstové faktory, bílkoviny
Řešením je jejich sterilace filtrací a aseptické přidání po zchladnutí média

-
ionty kovů prvky - srážení v neutrálním a zásaditém prostředí ionty OH a PO
3-
4
Řešením je:
o přídavek chelatačního činidla (EDTA, citrát) - sníží volnou koncentraci
o oddělená sterilace stopových prvků a fosforečnanů
o snížení pH média
Vzájemně spolu reagující látky
Při sterilaci může probíhat Maillardova reakce - karamelizace cukerné složky: reakce mezi
redukujícími cukry a volnými aminoskupinami proteinů. Produkty reakce mohou působit
inhibičně na růst mikroorganismů. Řešením je cukernou složku sterilovat zvlášť a asepticky
přidat po zchlazení média.
Obsah spor
Příkladem jsou spory rodu Clostridium - C. botulinum vytváří velmi tepelně odolné i při
120°C po dlouhou dobu. Řešením je:
 frakcionovaná (přerušovaná) sterilace
1. sterilace
zchlazení + čas na vyklíčení spor (~ 18-24 h)
2. sterilace
 snížení pH sterilovaného média
Obsah ochranných látek
Látky lipidy, bílkoviny a sacharidy mají ochranný účinek vůči působení tepla. Řešením je
prodloužení sterilace, vyšší teplota event. odstranění těchto látek.
Intenzita vedení tepla
Nutno počítat se zpožděním dosažení sterilační teploty např. v jádru velkých objemů
(nemíchaných) kapalin, potravin v obalech (konzervy, nápoje v lahvích atd.). Sterilační čas je
nutné počítat od dosažení sterilizační teploty v celém sterilovaném objemu.
Na to je třeba brát zřetel i v laboratorní praxi např. při sterilaci reaktoru s médiem nebo
velkých baněk v autoklávu:
1. problém
Teplota v jádru kapaliny se na požadovanou hodnotu dostane až se zpožděním z důvodu
pomalého vedení tepla v nemíchané kapalině, což je nutno zohlednit. Čím větší objem tím
delší čas prohřátí a tudíž sterilaci celého objemu.
2. problém
Při skončení sterilace se kapalný obsah reaktoru (velké baňky) chladí mnohem pomaleji než
okolní prostor v klávu (vedení tepla v nemíchané kapalině). Při příliš prudkém poklesu tlaku
se kapalina dostává do nové rovnováhy (kapalina-pára) tak, že prudce vyvře.
Řešením je:
 mírné a postupné snižování tlaku v klávu bez automatizace po skončení sterilace
 teplotní sonda, které se umístí do referenční podobně velké nádoby a podle její teploty
kláv upravuje program sterilace (moderní automatické klávy)
 vhodný teplotní program, který zohlední jak zahřívání tak chladnutí kapalného média
13
Sterilace filtrací
Používají se membránové filtry, běžné s velikosti pórů 0,2 μm (vegetativní formy a spory)
Materiál membrán:
 vodné roztoky - celulózo-acetátová membrána
 nevodné roztoky (ethanolové, DMSO) - hydrofóbní polymery rezistentní k
rozpouštědlům – nylon, teflon
Používají se pro:
 malé objemy kapalných médií s minimem suspendovaných pevných částic (kromě
mikroorganismů)
 média obsahující termolabilní látky (vitamíny, růstové faktory)
 médium obsahuje kovy, které se při sterilaci teplem vysrážejí
 filtrace plynů
Sterilace zářením
Používají se γ, β nebo UV záření. Mechanismus je v přímé denaturaci nebo ničení
(makro)molekul (bílkoviny, DNA) nebo rozkladu vody na peroxidy/radikály, které sterilují.
Používají se pro:
 termolabilní materiály/média
 γ event. β - hloubková sterilace
 UV - povrchy nebo plyny/kapaliny
Sterilace chemická
Používají se např. ethylenoxid, peroxid vodíku, kyselina peroctová, oxid chloričitý,
formaldehyd. Principem je chemická reakce nukleofilů nebo radikálů s molekulami v buňkách
= destrukce (makro)molekul.
Používá se pro:
 vybavení – Petriho misky (balení prázdných sterilních - kyselina peroctová)
 zařízení, laboratorní přístroje
 nástroje
Úprava a sterilace plynů
Vzduch z atmosféry obsahuje prachové částice, aerosol, mikroorganismy, chemické látky a je
nutné ho upravovat.
 záření (UV) - spíše (výrobní) prostory – haly, laboratoře…
 filtrace
1. odstranění hrubších nečistot filtrací + komprese
2. sterilace – mikrofiltrace (pro aseptické procesy)
o membránové filtry
o hloubkové filtry – dlouhý filtr naplněný sterilizovatelným vláknitým
(celuláza, skelná vata, syntetická vlákna) event. zrnitým materiálem
 obohacení kyslíkem (zvýšení parciálního tlaku kyslíku)
výroba kyslíku:
o molekulová síta (adsorbce menšího O2 průchod většího N2)
o destilace vzduchu
Příprava inokula
Inokulum je startovní množství buněk nebo spor. Jeho kvalita a množství je klíčový faktor
kultivace.
14
Získání inokula
 Vlastní výroba (propagační stanice) - velké podniky
 Nákup od velkých podniků nebo specializovaný podniků - malé podniky, kterým by se
nevyplatila propagační stanice - typicky malé pivovary
Nadnárodní potravinářské podniky mají většinou několik provozů vyrábějících stejný výrobek
a proto je nutná unifikace = centrální zásobování inokulem (např. zmražená suspenze, která se
dávkuje přímo do reaktoru)
Propagace je několika stupňová kultivace buněk ve speciálním technologickém celku
nazývaném propagační stanice, které následně slouží jako inokulum produkčního reaktoru.
Jedná se o série kultivačních nádob (baňky následně reaktory) přičemž každá následná je cca
5-10 x větší než předešlá. Buněčná suspenze z předchozího reaktoru slouží jako inokulum
následujícího. Kultura se při propagaci přeočkovává a provozní reaktor následně inokuluje
buňkami v exponenciálním růstu. Propagační poměr je poměr objemu inokula a čerstvého
kultivačního média, většinou 1:5-1:10.
Důvody propagace respektive propagační stanice tj. samostatné produkce inokula je získání
velkého množství inokula do produkčního reaktoru, přičemž benefity jsou:
 menší nebezpečí kontaminace
 zkrácení lag-fáze
 zkrácení doby kultivace
 vyšší produktivita produkčního reaktoru
(nekultivujeme inokulum v něm = odstranění tohoto neprodukčního času)
Proces propagace lze rozdělit na propagaci:
1. laboratorní - inokulum je skladovaná kultura (zamražená, lyofilizovaná, agary)
Začíná se baňkami a následně laboratorními reaktory, přičemž získáme ~ litry
suspenze.
2. provozní - jako inokulum je suspenze z laboratorní propagace.
Používají se malé provozní reaktory, přičemž získáme ~ m3 suspenze.
 Jak se při jednotlivých typech uchovávání mohou měnit vlastnosti mikroorganismů?
Jaké způsoby použijete pro krátkodobé a jaké pro dlouhodobé skladování?
 Jaký je rozdíl mezi základním a komplexním medium?
 Definujte složení média pro fototrofní vs. chemotrofní; aerobní vs. fakultativně
aerobní vs. anaerobní; autotrofní vs. heterotrofní; eukaryotní vs. prokaryontní
mikroorganismy. Jaké další požadavky na kultivaci - další nezbytné složky prostředí mají zástupci těchto skupin mikroorganismů?
 V jakých chemických formách dodáte do média základní prvky (C, N, O, H, P, S, K,
Mg)? Závisí forma na druhu použitého mikroorganismu?
 Jakého řádu je kinetika tepelné sterilizace?
 Jaká jsou omezení použití sterilace teplem při produkčních technologiích kultivace
buněk a v potravinářských výrobách?
 Jaký je rozdíl mezi pasterací a sterilací? Při jakých biotechnologických procesech se
používá pasterace a při jakých sterilace?
 Uveďte postup, jaký byste použili pro sterilizaci kapalného média s tepelně labilní
složkou s využitím tepelné sterilace.
 Uveďte postup přípravy sterilního reaktoru s médiem připraveného k inokulaci včetně
postupu přípravy (sterilního) média z výchozích látek.
15
4. Parametry pro popis kultivace buněk. Výtěžnost a produktivita
procesů. Přehled typů kultivací.
 Základní matematické funkce (lineární, exponenciální, logaritmické, parabolická,
hyperbolická) – matematické a grafické vyjádření.
 Integrace základních matematických funkcí.
 Disperzní soustavy.
 Lambert-Beerův zákon: matematické a grafické vyjádření, použití pro
spektrofotometrické stanovení barevných roztoků a suspenzí.
 Základní vlastnosti bakterií, kvasinek a plísní (stavba, nároky na prostředí a živiny,
metabolismus, tvorba spor).
 Nároky mikroorganismů na prostředí a jejich rozdělení podle jejich nároků na kyslík,
pH, vodní aktivitu, teplotu, zdroje uhlíku, zdroje energie.
 Základní termíny kinetiky rozmnožování mikroorganismů: doba zdvojení, generační
doba, synchronizovaný růst, růstová křivka.
 Jakými metodami lze stanovit počet buněk? Jakou vypovídací schopnost jednotlivé
metody mají?
Kultivace mikroorganismů
Faktory ovlivňující kultivaci:
 Fyzikální faktory (T, p, pH)
 Chemické faktory (kvantita a kvalita živin, O2, H2O, přítomnost dalších chemických
látek)
 Biologické faktory (stav a množství inokula, přítomnost dalších (mikro)organismů)
 Technologické faktory (uspořádání procesu – batch, fed-batch, kontinuální)
 Mechanické faktory (proudění kapalin/plynů, střižné síly)
 Prostorové faktory (koncentrace mikroorganismů, kontakt s pevným materiálem)
Důvody proč sledovat a regulovat parametry ovlivňující mikroorganismy jsou dvojího druhu:
 Využití optimálních podmínek – optimalizace podmínek kultivace = maximální
produkce (biomasa, produkty)
 Využití nepříznivých podmínek – potlačení/usmrcení nežádoucích mikroorganismů
Působení prostředí vede ke změnám ve vlastnostech mikroorganismů:
 Fyziologické a metabolické změny
– krátkodobé působení faktorů
reakce organismu (přizpůsobení) v rámci aktuálních regulačních mechanismů
(založených na aktuální genetické výbavě)
= rychlé reakce na fyziologické úrovni
krátkodobé změny (závisí na době působení faktoru)
 Evoluční změny
– dlouhodobé působení faktorů
selekční lépe přizpůsobených jedinců/populací
= změny na genetické úrovni
dlouhodobé změny
Podmínky a jejich působení na fyziologii mikroorganismů:
 Optimální podmínky
bez fyziologických změn, optimální růst/produkce
 Mírně vzdálené od optima (+ nebo -)
16

stres, produkce stresových faktorů,
fyziologické i metabolické změny,
pokles růstu/produkce
Zásadně vzdálené od optima (+ nebo -)
o mikrobistatické podmínky způsobují
zastavení rozmnožování
o mikrobicidní podmínky způsobují smrt
Přehled
základních
vlivů
prostředí
na
mikroorganismy a možnost jejich využití proti
mikroorganismům.
Vliv prostředí
Možnost využití proti mikroorganismům
Chemické látky
mytí a sanitace, dezinfekce (NaOH, detergenty, Cl2, NaClO)
antimikrobiální účinky (antibiotika, detergenty)
ovlivnění fyzikálně-chemických vlastností prostředí např. pH
Teplota
sterilace
pasterace
skladování za snížené teploty nebo zamražením
pH
snížení pH potravin = zvýšení trvanlivosti (hlavně proti bakteriím)
tepelná sterilace účinnější při nižším pH
Vodní aktivita
snížení obsahu vody - sušení (maso, ovoce…)
zvýšení koncentrace rozpustných látek (nasolení, vysoká koncentrace
cukrů)
Oxidoredukční
uchovávání v ochranné atmosféře (CO2, N2) - eventuální anaerobní
potenciál
rozklad je mnohem pomalejší.
Záření
UV záření – sterilizace prostor (laminární boxy, místnosti…); germicidní
lampy – 260-270 nm
γ-záření – speciální sterilizace – proniká do hloubky – např. potravin
(čerstvé maso) – nemění organoleptické vlastnosti potravin
Hydrostatický
vliv mají až vysoké hodnoty - tlaky vyšší než cca 10 MPa zpomalení až
tlak
zastavení rozmnožování
usmrcení až řádově stovky MPa po dlouhou dobu
Mechanické vlivy mechanická dezintegrace buněk.
Elektrický proud střídavý – zahřívání
stejnosměrný – elektrolýza, vznik biocidních látek (Cl2, atomární kyslík)
Ultrazvuk
mechanická dezintegrace buněk.
Model růstu a množení, rychlost růstu buněk, růstová křivka
Kinetické rovnice růstu mikroorganismů
Kinetické rovnice růstu mikroorganismů je ekvivalentem chemické kinetiky 1. řádu.
Kinetická konstanta se nazývá specifická růstová rychlost a značí se malým řeckým
písmenem μ. Jednotkou je čas-1.
dx
 x
dt
X
ln
Výpočet specifické růstové rychlosti
X0
Úpravou (integrací) kinetické rovnice získáme rovnici přímky, kde μ je směrnicí:  
dX
X
dt

X
ln
  t
X0
t
17
Vlastnosti specifické růstové rychlosti
μ závisí především na:
• druhu mikroorganismu
• složení média
• zdroji C a E
• zdroji N
• přítomnost O2
• teplota
• pH
Kinetika odumírání mikroorganismů
Kinetické rovnice odumírání mikroorganismů je ekvivalentem chemické kinetiky 1. řádu.
Kinetická konstanta se nazývá specifická rychlost odumírání a značí se malým řeckým
písmenem δ. Jednotkou je čas-1.
dX
   X
dt
Po spojení s rovnicí pro růst získáme komplexnější popis kinetiky mikrobní populace (růst i
odmírání):
dX
   X    X       X
dt
Závislost specifické růstové rychlosti na koncentraci substrátu
Závislost specifické růstové rychlosti na koncentraci substrátu vyjadřuje Monodova rovnice:
   max 
S
Ks  S
Lze vyjádřit pro každou živinu – S pak představuje koncentraci substrátu, dusíkatého zdroje,
kyslíku.
Grafickým vyjádřením je hyperbolická závislost:
1


KS

1
 max S

1
 max
linearizace
→
KS vyjadřuje afinitu buňky k substrátu (čím menší hodnota tím větší afinita)
μmax vyjadřuje maximální hodnotu µ za daných podmínek
18
Růstová křivka
Růstová křivka je grafické vyjádření závislosti počtu mikroorganismů na čase v průběhu
vsádkové kultivace.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
lag-fáze
fáze zrychleného růstu
exponenciální fáze
fáze zpomaleného růstu
stacionární fáze
fáze odumírání
Růstová křivka
Pro celou růstovou křivku platí obecný vztah:
dX
   X    X       X
dt
V různých fázích nabývají rychlostní konstanty různých hodnot nebo i závislosti na čase
(konstantnosti)
Změny fyziologie buněk v různých fázích růstu
Je třeba si uvědomit, že existují zásadní rozdíly ve fyziologii buněk při jednotlivých fázích
růstové křivky, které se projevují například rozdílnou citlivostí buněk ke změnám prostředí:
 největší citlivost je ve fázi zrychleného růstu a exponenciální fázi (největší buněčná
aktivita – metabolická aktivita i výměna mezi buňkou a prostředím)
= řízení kontinuálních procesů je náročné
 nejmenší citlivost je ve stacionární fázi a fázi odumírání (nejmenší buněčná aktivita)
19
Fáze
Lag fáze
Fáze
zrychleného
růstu
Exponenciální
fáze
Fáze
zpomaleného
růstu
Stacionární
fáze
Fáze odumírání
Charakteristika
Buňky se nerozmnožují, buňky rostou - zvětšují hmotnost a objem –
příprava na rozmnožování
Délka lag-fáze závisí na:
 druh mikroorganismu
 fyziologický stav buněk
 velikost inokula
 složení média
 podmínkách prostředí
Obecně lze říci, že čím větší je rozdílnost podmínek v kterých je kultura
před zaočkováním a po zaočkování tím delší bývá lag-fáze.
Délka lag-fáze neovlivní zbytek růstové křivky
Přechodová fáze
začínající rozmnožování jeho postupné zrychlování
Příčiny
Mat. popis
adaptace na nové prostředí - přestavba buňky
z klidového stavu na buňku rozmnožující se exponenciálně rostoucí.
μ=δ=0
postupný náběh metabolismu na plnou rychlost
event. rozdíly v adaptaci mezi jednotlivými
buňkami (nesynchronizované) kultury
Buňky se rozmnožují největší rychlostí (μ = μmax) za daných podmínek; splněny všechny požadavky buněk – fyzikálněpočet buněk roste exponenciálně.
chemické parametry i složení média – pro růst
Charakteristická veličina je specifická růstová rychlost μ.
maximální rychlostí
Produkční fáze při získávání biomasy nebo primárních metabolitů.
Přechodová fáze
začínající působení příčin zmíněných ve
zpomalování rozmnožování
stacionární fázi
Makroskopicky se projevuje jako konstantní koncentrace buněk.
 koncentrace buněk je konstantní
 zastavuje se růst a poté množení
 přestavba buněk z rostoucích na klidové
 v buňkách se hromadí zásobní látky
 může docházet k přípravě ke sporulaci
Produkční fáze při získávání sekundárních metabolitů.



buňky se nerozmnožují
pokles koncentrace buněk
odumírání – lyze buněk
μ≠0
μ = f(t)
δ=0
μ≠0
μ ≠ f(t)
δ=0
μ≠0
μ = f(t)
δ=0
μ→0
 spotřebovaný substrát
 hromadění metabolitů (přímá nebo nepřímá a buď
μ=δ=0
toxicita (změna pH, redox potenciálu…)
stacionární stav
 inhibice produktem
nebo
 limitace živinou (jinou než substrát)
9
 vysoká koncentrace buněk (bakterie max. 10 , μ = δ ≠ 0
dynamická
kvasinky max. 108 .mL-1)
rovnováha
Viz stacionární fáze.
μ=0
δ≠0
20
Vliv specifický aspektů mikrobiálního metabolismu na kultivaci buněk
Diauxie
Reakce mikroorganismů na více zdrojů uhlíku, energie nebo minerálních živin může být
dvojí:
 postupná utilizace = diauxie
 souběžná utilizace
Obecně jde o směs různě utilizovatelných živin. Typickými příklady je utilizace směsí:
 glukóza/fruktóza + laktóza/maltóza…
 NH4+ + NO3Podle tohoto pohledu se jednoduché cukry mohou rozdělit na dvě skupiny:
I. Glukóza, manóza, fruktóza (přednostně utilizované)
II. Laktóza, xylóza, maltóza
Směs cukrů z I a II skupiny dojde k diauxii, směs cukrů z jedné skupiny nevyvolá diauxii.
Vysvětlení jevu je efekt katabolické represe a glukózový efekt.
Jedná se o projev regulačních schopností buňky - výběr „nejekonomičtějšího“ substrátu:
• minimalizace počtu a/nebo délky metabolických drah
• přednostní využití konstitutivních enzymů
• nesyntetizování induktivních enzymů (represe přítomností lépe využitelného substrátu
nebo nějakého meziproduktu jeho metabolické dráhy)
Represe ostatních drah je na úrovni transportu, syntézy enzymů i genetické.
Růstová křivka pro dva růstové substráty bez diauxie (vlevo) s diauxií (vpravo).
Růstová křivka pro tři růstové substráty s diauxií – polyauxie
(více než 2 substráty).
21
Inhibice růstu substrátem
Vysoká (inhibiční) koncentrace substrátu se vyskytuje:
 typicky u batch-kultivací na počátku
 typicky pro alkoholy, organické kyseliny, uhlovodíky
Důsledkem je:
 prodlužuje se lag-fáze
 snižuje hodnoty μ v exponenciální fázi
 snížení celkového nárůstu buněk
Řešením je použití fed-batch kultivace.
Pokud je cílem produkce biomasy je pro požadovanou koncentraci biomasy (vysokou) je
potřeba dodat odpovídající množství substrátu. Tudíž požadovaná vysoká konečná
koncentrace biomasy znamená i nutnost vysoké počáteční koncentrace při batch procesu. Tato
koncentrace substrátu by téměř jistě byla inhibiční. Proto se používá fed-batch kultivace, tedy
přítokovaná, kdy se substrát přidává postupně tak aby jeho koncentrace nedosáhla inhibiční
hodnoty.
Tento jen lze i využít například při konzervaci potravin vysokými koncentracemi cukru
(inhibice + osmotický efekt). Konzervace vysokou koncentrací soli způsobí pouze osmotický
efekt.
   max 
S

S2 
 Ks  S 



K
i 

Grafické znázornění Monodovy rovnice při inhibici substrátem (bez fáze růstu v přebytku).
Toxický substrát jako například fenol.
22
Grafické znázornění Monodovy rovnice při inhibici substrátem (s fází růstu v přebytku). Pro
substrát typu glukóza.
Inhibice růstu produktem
Hromadění jednoho nebo více produktu metabolismu při kultivaci (hlavně u batch kultivací)
může vyvolat inhibice růstu produktem.
Mechanismus je dvojí:
 přímá inhibice produktem (toxicita, zpětnovazebný efekt)
 nepřímá inhibice změnou parametrů prostředí zapříčiněnou produktem (změna pH
(kyseliny), redox potenciálu…)
Důsledky jsou:
 Nižší tvorba produktu nebo biomasy
 Nevyužití limitující živiny (ztráty)
Pozor: Neovlivňuje délku lag-fáze ani hodnotu μ v exponenciální fázi.
Řešením může být:
 kontinuální kultivace (vyplavování metabolitů)
 kontinuální odstraňování produktu
o srážení (kys. citronová)
o mikrofiltrace – odstraňování média (v podstatě recykl buněk)
o stripování těkavých metabolitů (ethanol, biorozpouštědla)
23
   max 
S

P
 K s  S  
Ki 

Růstová křivka pro kultivaci s inhibicí produktem.
Parametry kultivace




biologické
 max , K S 
růstová rychlost
YP / O2
YX / O2
YX / S YP / S YP / X
výtěžnostní koeficienty
produktivita
Pr
fyzikálně-chemické
pH, T, redox potenciál
koncentrace X, S, P, CL
technologické
parametry reaktoru/kultivační nádoby (objem celkový a pracovní, výška hladiny,
pracovní tlak, typ míchadla, typ distributoru vzduchu…)
RPM (revolutions per minute) otáčky míchadla za minutu
VVM (volume per volume per minute) míra aerace - objem plynu na objem vsádky za
minutu
fyzikální
V, m, ρ
.
m, F
Výtěžnostní koeficienty
24
Typy kultivací podle stavu buněk
 povrchová kultivace
na povrchu kapaliny nebo imobilizované na pevném médiu - biofilm
 submerzní kultivace
suspenze mikroorganismů - jednotlivé buňky nebo shluky buněk - flokule
Typy kultivací podle technologie
 jednorázová (batch)
 jednorázová s postupným živením (fed-batch)
 semikontinuální
 kontinuální
 Vysvětlete pojmy asimilace i disimilace živiny a uveďte příklady.
 Z jakého důvodu je potřeba ke konstatování „Buňky se rozmnožují největší rychlostí (μ
= μmax)“ přidat „za daných podmínek“?
 Rozveďte jednotlivé body seznamu vlivů na specifickou růstovou rychlost (μ) – str. 18
nahoře.
 Jak lze vyjádřit a jaké jsou jednotky „X“ při měření růstové křivky?
 Jaké metody stanovení množství buněk byste pro měření růstové křivky použily a jaké
jsou jejich výhody a omezení?
 Jaké je limit využití Lambert-Beerova zákona při měření koncentrace buněk (obecně
suspenzí)?
 Jaký je rozdíl mezi termíny „historie“ buněk a „stáří“ buněk.
 Je možné nastavit podmínky tak aby růstová křivka začínala přímo exponenciální fází,
a tedy nebyla lag-fáze? Jak byste to případně realizovali?
 Z jakého parametru kultivace poznáte, že se jedná o inhibici produktem?
 Jakých hodnot dosahuje koeficient výtěžností YX/S a na jakých parametrech to závisí?
 Jaké jsou příčiny a podstata lýze buněk a jaké jsou její technologické důsledky?
 Popište postup laboratorního experimentu a jeho vyhodnocení pro získání závislosti
specifické růstové rychlosti na neinhibičním a inhibičním substrátu.
25
5. Vsádková kultivace (charakteristika, hmotová bilance, použití).
 Diferenciální rovnice: metody řešení, počáteční a okrajové podmínky. Totální
diferenciál.
 Řešení soustav diferenciálních rovnic.
 Základní pojmy bilancování hmoty a energie: výchozí vztahy, bilancovaný systém,
období a veličina, předpoklady a zjednodušení.
 Vsádkový chemický reaktor.
 Ideálně míchaný reaktor.
Charakteristika vsádkové kultivace
•
•
•
•
•
nazývá se také jednorázová nebo batch kultivace
jednorázová kultivace
inokulace na začátku kultivace
kompletní médium na počátku kultivace; celý pracovní objem reaktoru
koncentrace extracelulárních produktů na počátku kultivace je nulová
Realizace vsádkové kultivace
naplnění reaktoru médiem o finálním složení i objemu
sterilace (přímá, nepřímá pára + míchání)
ochlazení média na kultivační teplotu
konečná úprava pH
očkování (zahájení kultivace)
spuštění aerace (přetlak oproti atmosféře)
kultivace (kontrola, měření, regulace, vzorkování)
Měří se a případně reguluje: pH, kyslík, redox potenciál, teplota, koncentrace
biomasy, substrátů, živin, složení plynů (O2, CO2…).
8. ukončení kultivace (vypnutí měřících a regulačních obvodů, aerace a míchání)
9. vypuštění vsádky
10. mytí, čištění a výplach reaktoru (zbavení pevných nečistot, v případě kontaminace
desinfekce a provedení perfektního výplachu, aby se odstranily iontově aktivní mycí
prostředky a desinfekce)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Použití vsádkové kultivace



produkce biomasy (ne vždy vhodné – inhibice substrátem)
produkce primárních metabolitů
produkce sekundárních metabolitů
Hodnocení vsádkové kultivace
Výhody
 mírně nižší investiční náklady
 relativně jednoduchý proces
 flexibilní
Nevýhody
 vysoké náklady na opakovanou přípravu inokula
 malá produktivita
 jednotlivé kultivace se mohou dost lišit
26


zatěžování zařízení opakovaným mytím a sterilacemi
nevhodné v případě:
o inhibice substrátem
o inhibice produktem
o glukózový efekt
Hmotová bilance jednorázové kultivace
Předpoklady a zjednodušení bilance
 dokonale míchaný reaktor
 bilanční období: začátek je právě inokulovaný reaktor a konec ukončení kultivace
(nezahrnuty přípravné operace jako napouštění media, inokulace, finální úprava media
ani následné operace jako vypouštění, zpracování suspenze aj.)
 ρ = konstantní
 zanedbání úbytku objemu v důsledku odparu vody (aerovaný systém) a odběru vzorků
 zanedbání zvýšení objemu v důsledku přídavků kyseliny/hydroxidu při pH regulaci
Akumulace
mcelk (ρ = konst.)
𝑑(𝜌 ∙ 𝑉)
𝑑𝑉
𝑑𝑉
=𝜌∙
=0
𝑉 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡. =>
=0
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑𝑡
ms
𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)
𝑑𝑆
=𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
mx
𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)
𝑑𝑋
=𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
mp
𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)
𝑑𝑃
=𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
Bilance celkové hmoty
[vstup] + [zdroj] = [výstup] + [akumulace]
0  0  0    dV 
 dt 
dV
0
dt
Bilance biomasy
0  . X .V   0  V . dX 
 dt 
dX
 X
dt
Bilance substrátu


0   . X .V   0  V . dS 
 dt 
 YX / S 
dS
X

dt
YX / S
27
Bilance produktu vázaného na růst
𝜇∙𝑋
𝑑𝑃
[0] + [𝑌𝑃/𝑆
∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙ ]
𝑌𝑋/𝑆
𝑑𝑡
𝑑𝑃
𝜇∙𝑋
= 𝑌𝑃/𝑆
𝑑𝑡
𝑌𝑋/𝑆
Bilance produktu nevázaného na růst – probíhá ve stacionární fázi
𝑑𝑃
[0] + [𝛽 ∙ 𝑋 ∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙ ]
𝑑𝑡
𝑑𝑃
= 𝛽∙𝑋
𝑑𝑡
Produktivita jednorázové kultivace
Množství biomasy
m  X final  X 0 VL
(g)
Výtěžnost
g
X X final  X 0
 
YX / S 

S
S 0  S final
g
Produktivita
𝛥𝑚𝑋 (𝑋 − 𝑋𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡 ) ∙ 𝑉
𝑃𝑅 =
=
(𝑔 ∙ 𝑙 −1 ∙ ℎ−1 )
𝑉∙𝑡
𝑉 ∙ (𝑡𝑔 + 𝑡𝑑 )
𝛥𝑚𝑃 (𝑃 − 𝑃𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡 ) ∙ 𝑉
𝑃𝑅 =
=
(𝑔 ∙ 𝑙 −1 ∙ ℎ−1 )
𝑉∙𝑡
𝑉 ∙ (𝑡𝑔 + 𝑡𝑑 )
td - mrtvý čas (čištění, sterilace,
lag fáze, zpomalení růstu)
tg - exponenciální fáze
 Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování vsádkové kultivace od
reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a sterilního včetně média) až po
konec kultivace.
 Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro vsádkovou kultivaci. Klaďte důraz na
přesné kreslení – tvar a umístění křivek jednotlivých závislostí v kontextu osy x a y
(začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu jednotlivých závislostí mezi sebou.
 Ujasněte si, jak se při vsádkové kultivaci mění hodnoty základních parametrů (S, X, V,
P) jak v čase a tak v objemu reaktoru.
 Před sestavováním vlastní bilance si nakreslete schéma bilancovaného systému včetně
definování a zakreslení bilancovaných veličin.
 Definujte, pro jaké bilancované období bude bilance sestavována.
 Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci vsádkové kultivace.
 Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro jednorázovou
kultivaci a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací.
28
vstup
zdroj
výstup
akumulace
mX
mS
mP
mcelk



Jaké jednotky mají jednotlivé členy bilance?
Jaké jsou počáteční a okrajové podmínky pro odvozené kinetické rovnice bilance?
Je potřeba doplnit výsledné bilanční rovnice ještě dalšími vztahy, a pokud ano tak
jakými?
29
6. Vsádková kultivace s postupným živením (charakteristika,
způsoby přítokování média, hmotová bilance, použití).
Charakteristika vsádkové kultivace s postupným živením
 nazývá se také jednorázová s postupným živením nebo fed-batch kultivace
 vsádková kultivace s řízeným přítokem média (většinou koncentrát substránu event. i s
minerálními živinami) - do zaplnění pracovního objemu reaktoru.
 start jako batch kultivace ale pouze s částečně naplněným reaktorem (např ¼)
 koncentrace extracelulárních produktů na počátku kultivace je nulová
Použití vsádkové kultivace s postupným živením



produkce biomasy
produkce primárních metabolitů
produkce sekundárních metabolitů – výhody:
o možnost řízení nástupu stacionární fáze (limitace živinou např. fosforečnanem)
o možnost na začátku stacionární fáze začít dávkovat prekurzor
o možnost řízeného základního živení (maitenance energy) během stacionární fáze
Hodnocení vsádkové kultivace s postupným živením
Výhody
 eliminace inhibice substrátem, glukózového efektu nebo problémům s viskozitou
média (viskózní substrát) na počátku kultivace
 zkrácení lag-fáze
 možnost lepší optimalizace procesu produkce biomasy a primárních i sekundárních
metabolitů (optimální přísun živin)
 možnost přítokovat další látky ve vhodnou dobu např. prekurzory - sekundární
metabolity ve stacionární fázi
Nevýhody
 větší riziko kontaminace (přítokování)
 komplikovanější technologie (regulace)
Realizace přítokování média
Cílem je zajistit optimální živení. Příliš velká
koncentrace substrátu způsobí inhibici naopak
příliš malá koncentrace limitaci. Optimální je
růst v (mírném) přebytku pak je maximální růst
přítoku média lze realizovat jako:
 Konstantní
stálá hodnota přítoku média
 Exponenciální
zvyšování rychlosti přítoku média s
časem kultivace, tak aby se zajistil
exponenciální růst
hodnota přítoku se spočítá pro
µ=µmax (nejen exponenciální ale i maximální růst)
 Proměnná (regulovaná)
30
hodnota přítoku média na základě aktuálních požadavků
procesu
Konstantní přítokování média
Konstantní přítok média se vyznačuje:
 nejjednodušší provedení
 postupné plynulé zvyšování objemu bioreaktoru = zředění produkovaného metabolitu.
 vhodné pro kultivace, kde má koncentrace produktu negativní vliv na metabolickou
aktivitu.
Má ale značné nevýhody:

nejméně efektivní přítokování média (µ<µmax)

nereaguje na aktuální stav buněk

se vzrůstající koncentrací buněk roste spotřeba substrátu, ale dodávka je konstantní.
Exponenciální přítokování média
 přítok limitujícího substrátu zvyšován úměrně k rychlosti exponenciálního růstu
(matematický vztah pro kinetiku zvyšování lze vyjádřit z bilance pro µmax)
 konstantní μ, konstantní S, exponenciální přítok
 možnost udržet vysokou růstovou rychlost po dlouhou dobu
 získání maximálního množství buněk za nejkratší čas v systémech se substrátovou
inhibicí
Má ale nevýhodu v tom, že nereaguje na aktuální stav a potřeby buněk – je založená na
předpokládaném chování buněk.
31
Proměnná rychlost přítokování média
Proměnná rychlost přítokování média se vyznačuje:
 přítokování média se během kultivace mění podle požadavků mikroorganismů
(regulovaný kontinuální nebo diskontinuální přítok)
 cílem je optimalizace procesu - růstové rychlosti, výtěžku metabolitu, produktivity
procesu na základě skutečných a aktuálních (ne vypočtených nebo předpokládaných)
požadavků mikroorganismů
 použití pro speciální produkty - enzymy, antibiotika, aminokyseliny, rekombinantních
proteiny (regulace nákladná investičně i provozně)
Eliminuje všechny nevýhody předešlých způsobů přítokování ale za cenu vyšších nákladů.
Je nutné zvolit vhodnou veličinu pro měření a použití pro následnou regulaci přítoku, která
nejlépe vypovídá o aktuálním stavu systému. Optimální je měřit koncentraci substrátu ale
možné je měřit i jiné (nepřímé) parametry:
 Přímé stanovení koncentrace substrátu
o přímé měření koncentrace substrátu (periodické vzorkování nebo kontinuální
měření)
o optimální ale ne vždy snadno proveditelné
 Nepřímé stanovení - parametry úzce spojené s růstem a metabolismem buněk (lineární
závislost změn a minimální prodleva reakce na změnu) a optimálně snadno a on-line
měřitelné a zárověň s vysokou přesností a citlivostí měřitelné
o měření vznikajících metabolitů (S↓ P↓)
o CO2; měření v odplynech (S↓ CO2↓)
o měření rozpuštěného kyslíku (S↓ CL↑)
o měření kyslíku v odplynech (S↓ Cg↑)
o měření pH (S↓ pH↑)
32
Příklad diskontinuálního regulovaného přítokování včetně časového průběhu výstupu
z regulátoru (regulace 0/1). Vlastní provedení regulace je podrobně popsáno v Kapitole 11.
Hmotová bilance vsádkové kultivace s postupným živením
Předpoklady, zjednodušení a bilanční období viz vsádková kultivace.
Akumulace
mcelk (ρ = konst.)
𝑑(𝜌 ∙ 𝑉)
𝑑𝑉
=𝜌∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
ms
𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)
𝑑𝑉
𝑑𝑆
=𝑆∙
+𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑𝑡
mx
𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)
𝑑𝑉
𝑑𝑋
=𝑋∙
+𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑𝑡
mp
𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)
𝑑𝑉
𝑑𝑃
=𝑃∙
+𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑𝑡
Bilance celkové hmoty
  F   0  0    dV
dV
F
dt
Bilance biomasy

dt
V
0  . X .V   0  V . dX

dX
F.X
 . X 
dt
V
dt
d 
dt 
 X.
dV 
dt 
33
Bilance substrátu


F  Sin    . X .V   0  V . dS  S . dV 
dt 
 dt
 YX / S 
dS F  S in F  S   X



dt
V
V
YX / S
Bilance produktu vázaného na růst
𝜇∙𝑋
𝑑𝑃
𝑑𝑉
[0] + [𝑌𝑃/𝑆
∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙
+𝑃∙ ]
𝑌𝑋/𝑆
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑𝑃
𝜇∙𝑋 𝐹∙𝑃
= 𝑌𝑃/𝑆
−
𝑑𝑡
𝑌𝑋/𝑆
𝑉
Bilance produktu nevázaného na růst – probíhá pouze ve stacionární fázi
𝑑𝑃
𝑑𝑉
[0] + [𝛽 ∙ 𝑋 ∙ 𝑉] = [0] + [𝑉 ∙
+𝑃∙ ]
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑𝑃
𝐹∙𝑃
= 𝛽∙𝑋−
𝑑𝑡
𝑉
Produktivita
Viz vsádková kultivace.
 Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování vsádkové kultivace
s postupným živením od fáze reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a
sterilního včetně média) až po konec kultivace.
 Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro vsádkovou kultivaci s postupným
živením. Klaďte důraz na přesné kreslení – tvar a umístění křivek jednotlivých
závislostí v kontextu osy x a y (začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu
jednotlivých závislostí mezi sebou.
 Ujasněte si, jak se při vsádkové kultivaci s postupným živením mění hodnoty
základních parametrů (S, X, V, P) jak v čase a tak v objemu reaktoru.
 V jaké fázi růstové křivky a proč v ní se začíná s přítokováním média.
 Jaké vlastnosti musí splňovat měřený parametr, aby ho bylo možné použít pro
nepřímou regulaci? Uveďte příklady.
 Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci vsádkové kultivace s postupným
živením.
 Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro jednorázovou
kultivaci s postupným živením a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací.
34
vstup
zdroj
výstup
akumulace
mX
mS
mP
mcelk




jakými?
Z bilance celkové hmoty získáte výslednou diferenciální rovnice dv/dt=F. Jak přítok
(F) zrealizujete a jakou konkrétní hodnotu/vztah dosadíte do rovnice za F?
35
7. Kontinuální a semikontinuální kultivace (charakteristika,
způsoby řízení procesu, hmotová bilance, porovnání se
vsádkovou kultivací, použití). Volbu typu kultivace na základě
požadovaného produktu.
 Kontinuální chemický reaktor.
 Doba zdržení, zřeďovací rychlost.
 Terminologie: ustálený a neustálený stav, rovnováha, dynamická rovnováha.
Semikontinuální kultivace
Charakteristika semikontinuální kultivace







řada batch kultivací bez nutnosti inokulace (pouze první)
start jako batch kultivace
inokulace se provádí jen u startovní vsádky
inokulum každé následné vsádky je část objemu předchozí vsádky
bez dávkování média v průběhu jednotlivých kultivací
buňky v exponenciální fázi růstu (kromě startu – lag fáze)
koncentrace extracelulárních produktů na počátku první kultivace je nulová, další
kultivace už ne
Realizace semikontinuální kultivace
1. batch kultivace
2. ve vhodnou dobu (cca v 1/2 exponenciální fáze
– za inflexním bodem = vysoká koncentrace
biomasy) se vypustí 20-80 % obsahu reaktoru a
doplní na původní objem novým médiem
3. Před koncem exponenciální fáze (před
vyčerpáním substrátu – aby buňky byly v exp.
fázi) se opakuje vypuštění části média a
doplnění novým
periodické odebírání a zpracovávání produktu
(4.
ukončení, vypuštění, mytí, dezinfekce…
(teoreticky nikdy)
Hodnocení semikontinuální kultivace
Výhody
 snížení nákladů na inokulum (pouze na startu)
 úspora času a provozních prostředků
 „nekonečné“ udržování exponenciální (= produkční) fáze
 eliminace inhibice produktem (ředění)
 žádná lag fáze mezi jednotlivými vsádkami (pouze na startu)
 vysoká produktivita
Nevýhody
 nebezpečí kontaminace
36


nebezpečí mutací buněk při dlouhodobém provozu
pouze produkce biomasy a primárních metabolitů
Použití semikontinuální kultivace


Produkce biomasy
Produkce primárních metabolitů
Kontinuální kultivace
Charakteristika kontinuální kultivace






„nekonečná” kultivace
inokulace se provádí jen na začátku
start jako batch kultivace
buňky v exponenciální fázi růstu (kromě startu – lag fáze)
kontinuální přívod živin a odvod buněk, produktů a metabolitů
koncentrace produktů není nulová (kromě startu)
Realizace kontinuální kultivace
1. batch kultivace
2. ve vhodnou dobu (konec exponenciální fáze – za inflexním bodem = vysoká
koncentrace biomasy) se začne přítokovat čerstvé médium + otevřít přepad –
tranzientní stav
3. provozování kultivace - udržování dynamické rovnováhy + následující kontinuální
odebírání a zpracovávání produktu
(4. ukončení, vypuštění, mytí, dezinfekce… teoreticky nikdy)
Hodnocení kontinuální kultivace
Výhody
 snížení nákladů na inokulum (pouze na startu)
 odstranění lag-fáze (pouze na startu)
 úspora času a provozních prostředků
37



„nekonečné“ udržování exponenciální (= produkční) fáze
eliminace inhibice produktem (vyplavování)
velmi vysoká produktivita, nízké provozní náklady
Nevýhody
 nebezpečí kontaminace
 nebezpečí mutací buněk při dlouhodobém provozu
 pouze produkce biomasy a primárních metabolitů (jednostupňová)
 málo flexibilní
Použití kontinuální kultivace (jednostupňové)
 produkce biomasy
 produkce primárních metabolitů
Obecně pro:
 nízká koncentrace substrátu zvláště v kombinaci s velkou D
o nízká záměrně, z důvodu zamezení inhibice vznikajícím produktem
o nízká vyplívající ze specifik použitého média (např. odpadní vody)
o nízká z důvodu špatně rozpustného substrátu
 inhibiční substrát
 kultivace mikroorganismů s nízkým μ
Parametry pro popis kontinuální kultivace
Zřeďovací rychlost (D)
𝐹
[ℎ−1 ]
𝐷=
𝑉
Doba zdržení (t)
𝑉 1
[ℎ]
𝑡= =
𝐹 𝐷
Stavy systému při kontinuální kultivaci


neustálený (tranzientní) stav
o parametry kultivace jsou časově závislé
o přechod mezi vsádkovou a kontinuální kultivací v ustáleném stavu
o přechodový stav při změně podmínek - D, koncentrace živin, teplota, pH...
ustálený stav – stav dynamické rovnováhy, anglicky „steady state“
o parametry kultivace jsou časově nezávislé
Způsoby řízení kontinuální kultivace


chemostat
samoregulace pomocí limitace jednou živinou
turbidistat
regulace přítoku (D) na základě měření X
není limitace
Chemostat
• platí, že D = μ a zároveň μ < μmax
• koncentrace všech živin na vstupu jsou konstantní
• zřeďovací rychlost je konstantní
• jedna živina je limitující a její koncentrace je pak → 0; ostatní živiny nelimitující
38
•
•
řídící reakce je v katabolismu a je jí rychlost spotřeby limitující živiny (S je mnohem
menší než KS)
za daných podmínek se ustaví ustálený
stav a systém schopný samoregulace
Turbidistat
• platí, že D = μ a zároveň μ = μmax
= buňky rostou maximální rychlostí
• koncentrace všech živin na vstupu jsou
konstantní
• zřeďovací rychlost není konstantní (je
regulována) - měření X a podle toho
regulace F (a tedy D)
• všechny živiny v přebytku - žádná není
limitující
• řídící reakce nemusí být v katabolismu
(S může být i větší než KS)
• použití je při vysokých hodnotách D,
kdy malá změna D znamená velkou změnu koncentrace buněk což je potenciálně
nestabilní, špatně samoregulovatelný systém.
Porovnání chemostatu a turbidistatu a řízení procesu v kontextu závislosti μ na S
39
Časový průběh hodnot S, X, V při řízení procesu pomocí chemostatu
Časový průběh hodnot X, S a V při startu a následného provozování kontinuální kultivace
řízené na principu chemostatu. Dva mezní stavy po spuštění čerpadla pro (I) D a (II) D
Hmotová bilance kontinuální kultivace - produkce biomasy
Předpoklady, zjednodušení a bilanční období viz vsádková kultivace.
Akumulace
mcelk (ρ = konst.)
𝑑(𝜌 ∙ 𝑉)
𝑑𝑉
=𝜌∙
=0
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑝𝑟𝑜 𝑉 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡.
ms
𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)
𝑑𝑆
=𝑉∙
(𝑛𝑒𝑢𝑠𝑡á𝑙𝑒𝑛ý 𝑠𝑡𝑎𝑣)
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑(𝑆 ∙ 𝑉)
𝑑𝑆
=𝑉∙
=0
(𝑢𝑠𝑡á𝑙𝑒𝑛ý 𝑠𝑡𝑎𝑣)
𝑑𝑡
𝑑𝑡
mx
𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)
𝑑𝑋
=𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑(𝑋 ∙ 𝑉)
𝑑𝑋
=𝑉∙
=0
𝑑𝑡
𝑑𝑡
mp
𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)
𝑑𝑃
=𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
𝑑(𝑃 ∙ 𝑉)
𝑑𝑃
=𝑉∙
=0
𝑑𝑡
𝑑𝑡
Bilance celkové hmoty (ustálený stav)
40
[𝜌 ∙ 𝐹] + [0] = [𝜌 ∙ 𝐹] + [𝜌 ∙
𝑑𝑉
]
𝑑𝑡
𝑑𝑉
=0
𝑑𝑡
Bilance biomasy (ustálený stav)
0  . X .V   F  X   V  dX 
dt 

dX
 0    D   X
dt
Bilance (limitujícího) substrátu (ustálený stav)


 YX / S

F  S in    . X .V   F  S   V  dS 

dt 
dS
X
 0  S in  S   D 
dt
YX / S
Bilance produktu vázaného na růst (ustálený stav)
𝜇∙𝑋
𝑑𝑃
[0] + [𝑌𝑃/𝑆
∙ 𝑉] = [𝐹 ∙ 𝑃] + 𝑉 ∙
𝑌𝑋/𝑆
𝑑𝑡
𝑑𝑃
𝜇∙𝑋
= 0 = 𝑌𝑃/𝑆
−𝐷∙𝑃
𝑑𝑡
𝑌𝑋/𝑆
Produktivita kontinuální kultivace (ustálený stav)
𝑃P𝑅R =
𝐷 ∙ X
𝑋
D
𝑃𝑅 = 𝐷 ∙ 𝑃
(𝑔 ∙ 𝑙 −1 ∙ ℎ−1 )
(𝑔 ∙ 𝑙 −1 ∙ ℎ−1 )
Porovnání kontinuální a batch kultivace
Výhody kontinuální kultivace oproti batch:
 minimum ztrátových časů = vyšší produktivita
 homogennější produkce (jednotlivé vsádky batch kultivace se mohou dosti lišit) =
menší nároky na dokončovací operace
 vhodnější pro produkci biomasy a primárních metabolitů
 obecně řečeno čím vyšší µ tím vhodnější kontinuální kultivace
nicméně kontinuální kultivace má i nevýhody:
 jednostupňovou kontinuální kultivaci nelze použít pro produkci sekundárních
metabolitů (možno ale použít vícestupňovou kontinuální kultivaci)
 dlouhodobý kontinuální provoz technologie je náročný na údržbu zařízení a s časem
roste riziko poruchy (kdekoli v celé technologii)
 vysoké nároky na sterilitu
 nebezpečí mutací buněk
 nevhodný (těžko řiditelný) pro kultivace buněk s malým µ (možno ale použít recykl
biomasy)
 malá flexibilita systému – spíše pro dlouhodobé a velkotonážní výroby
Kontinuální vícestupňová kultivace
Kontinuální vícestupňová kultivace znamená zapojení dvou a více reaktorů v sérii. Má dvě
základní využití a to produkce sekundárních metabolitů a v případě směsí substrátů
vyvolávajících diauxii.
41
Produkce sekundárních metabolitů
První reaktor nárůst biomasy čímž se spotřebuje substrát (exponenciální fáze) ve druhém
reaktoru kultura přejde do stacionární fáze a produkce sekundárních metabolitů. Možný je
přídavek prekurzorů před druhým reaktorem.
Použití při diauxii
Je možno nastavit různá D pro jednotlivé reaktory. Například pokud při F=konst. a ustáleném
stavu je μ1=2.μ2 pak musí D1=2D2 a tedy V1=1/2V2.
Kontinuální kultivace s recyklem biomasy
Cílem je zvýšit koncentraci buněk v reaktoru což vede k vyšší produktivitě a možnosti využít
vyšší D, protože vyplavené buňky se do reaktoru vrací (externí recykl) nebo v něm zůstávají
(interní recykl). Umožňuje tedy kultivaci za podmínek D > μ.
 interní recykl (mikrofiltrační modul)
 externí recykl (mikrofiltrace, sedimentace, kontinuální odstředivka)
Použití
Viz obecně kontinuální kultivace a speciálně pro kultivace mikroorganismů kde μ je velmi
malé – mikroorganismy s malou μ nebo malé μ jako důsledek nepříznivého prostředí (média)
např. limitace nebo inhibice (toxická substrát), obtížně degradovatelný substrát. Nízké
hodnoty μ zapříčiňují nestabilitu a špatnou regulovatelnost kontinuální kultivace – malé μ
znamená i malá D. Typické použití je v technologii čištění odpadních vod.
42
Výhody
 rychlejší start kultivace
 dosažení vysoké koncentrace produktu
 snížení spotřeby C-zdroje (odpadá tvorba části biomasy)
 úspora jednoho kroku dokončovacích operací - separace buněk od média
 Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování kontinuální kultivace
od fáze reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a sterilního včetně média)
až po konec kultivace.
 Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro kontinuální kultivaci provozovanou jako
chemostat. Klaďte důraz na přesné kreslení – tvar a umístění křivek jednotlivých
závislostí v kontextu osy x a y (začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu
jednotlivých závislostí mezi sebou.
 Porovnejte ztrátové časy všech tří typů kultivací. V jakém klíčovém parametru pro
popis kultivace se případné rozdíly projeví?
 Ujasněte si rozdíl mezi startovními (Xstart, Sstart, Vstart, Pstart), aktuálními (X, S, V, P) a
vstupní (Xin, Sin, Pin) hodnotami parametrů kultivace nejen u kontinuální kultivace ale i
obou předchozích.
 Ujasněte si, jak se při kontinuální kultivaci mění hodnoty základních parametrů (S, X,
V, P) jak v čase a tak v objemu reaktoru. Jaký na to má vliv to, jestli se systém nachází
v ustáleném nebo neustáleném stavu?
 V jaké fázi růstové křivky a proč v ní se začíná se startem kontinuální kultivace
(spuštění čerpadla)? Porovnejte start jednotlivých typů kultivací.
 Vysvětlete podstatu samoregulace u chemostatu.
 Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci kontinuální kultivace.
 Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro kontinuální
kultivaci v ustáleném stavu a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací.
vstup
zdroj
výstup
akumulace
mX
mS
mP
mcelk


43





jakými?
Jak by se změnily výsledné rovnice bilance, pokud by měly být použity pro neustálený
stav?
Jaká živina a z jakého důvodu se nejčastěji v chemostatu používá jako limitující?
Uvědomte si rozdílné nároky na přípravné a dokončovací operace pro jednotlivé typy
kultivací (vsádkové vs. kontinuální)
Jaké jsou důvody pro použití kontinuální kultivace s recyklem biomasy a kontinuální
vícestupňové kultivace?
44
8. Aerace a přestup kyslíku (realizace aerace, mechanismus
přestupu kyslíku, KLa).
 Vlivy na rozpustnost plynů ve vodě. Henryho zákon.
 Kinetika sdílení hmoty. Difuze, konvekce, přestup a prostup hmoty.
 Disperzní soustavy – plyn-kapalina.
 Jaké jsou funkce kyslíku v (mikro)organismu?
Distributory vzduchu
Systémy bez mechanického míchání
• porézní materiály (keramika, sklo, sintrovaná legovaná ocel)
• trubkové distributory
Systémy s mechanickým mícháním
• trysky (menší průtoky vzduchu)
• aerační věnce (větší průtoky vzduchu)
(otvory 1-5 mm podle typu mikroorganismu – riziko zarůstání)
Umístěny jsou centrálně pod míchadlem a alespoň jedna řada otvorů je
na spodní straně aby mohla kapalina vytéct.
45
Vliv rychlosti proudění na přestup hmoty
Proudění v kapalině
Proudění v plynu
Dispergace
Dispergací se rozumí rozbíjení plynových bublin na menší. Tímto procesem se větší
mezifázového rozhraní a intenzifikuje přestup hmoty (a tepla).
Smykové napětí
Vyvolání smykového napětí:
 vysoká výtoková rychlost plynu do kapaliny (otvory – aerační věnec, frita, tryska…)
systémy s pneumatickým mícháním (nutný vysoký tlak plynu)
 mechanické míchadlo (malá výtoková rychlost plynu = menší tlak = menší náklady na
aeraci)
Vlastnosti disperze (z hlediska přenosu hmoty)
 stupeň dispergace
 velikost zádrže dispergované fáze
 doba zdržení zádrže plynu v kapalině
 stabilita disperze (koalescence bublin)
Koalescence
Koalescencí se rozumí spojování se plynových bublin ve větší, čímž dochází ke zmenšení
mezifázového rozhraní a tím snížení přestupu hmoty (a tepla). Oba procesy dispergace i
koalescence probíhají ve vsádce souběžně.
Disperzní systémy z hlediska koalescence bublin jsou:
 koalescentní systémy (čistá voda)
 nekoalescentní systémy (voda + sole, alkoholy, povrchově aktivní látky)
Velikost bublin
Velikost bublin je jedním ze základních parametrů ovlivňujících přestup hmoty.
Bubliny se podle velikosti dělí na:

 malé bubliny Db  0,5 mm
o dlouhá doba zdržení
o malý objem
46

o rigidní povrch
o velké mezifázové
rozhraní

střední bubliny Db  0,5 - 6 mm
o nejlepší pro přestup hmoty - optimální kombinace velikosti mezifázového
povrchu, objemu a velikosti (umožňující deformace bubliny při pohybu)
o optimální velikost je

Db  2 - 3 mm


velké bubliny Db  6 mm
o krátká doba zdržení
o velký objem
o oscilace tvaru při pohybu
o malé mezifázové rozhraní
Mechanismus přenosu kyslíku
Podle typu proudění je možné rozdělit sdílení hmoty difúzí nebo konvekcí (prouděním).
Čím turbulentnější proudění tím slabší stacionární vrstva a tím lepší přestup hmoty přes
fázové rozhraní a zároveň lepší sdílení hmoty konvekcí (prouděním) v kapalině.
Veličiny pro kvantitativní popis spotřeby kyslíku
Výtěžnostní koeficienty (O2)
vztažený na biomasu
YX / O2  
dX
dCL
úprava 
dCL
1
dX
1



 X
dt
YX / O2 dt
YX / O2
vztažený na produkt
YP / O2  
dP
dCL
úprava 
dCL
1 dP


dt
YP / O2 dt
Spotřeba kyslíku
𝑞𝑂, 2
Celková rychlost spotřeby kyslíku vztažená na jednotkový objem reaktoru [mg.gsuš-1.h-1]
qO, 2 
1
YX / O2
 X
47
𝑞𝑂2
Specifická (měrná) rychlost spotřeby kyslíku tzv. respirace buněk vztažená na jednotku
sušiny buněk [mg.L-1.h-1]
𝑞𝑂, 2 = 𝑞𝑂2 ∙ 𝑋
Kinetika přestupu kyslíku přes mezifázové rozhraní g/l
Přestup hmoty přes mezifázové rozhraní závisí na:
 plocha mezifázového rozhraní
 rozdíl koncentrací (hnací síla)
 konstanta úměrnosti (závisí na látce, prostředí a podmínkách)
Kinetickou rovnici popisující kinetiku přestup kyslíku (hmotnostní tok) lze tedy napsat ve
tvaru:
𝑑𝑚𝑂2
= 𝐾𝐿 𝑎 ∙ (𝐶 ∗ − 𝐶𝐿 ) ∙ 𝑉
𝑑𝑡
Kde:
KLa je objemový součinitel přestupu kyslíku (h-1)
KL
je celkový součinitel přestupu kyslíku z plynu do kapaliny (m.h-1)
a
je měrný mezifázový povrch (m-1) (m2/m3)
C*
je rovnovážná koncentrace rozpuštěného kyslíku (mg.L-1)
CL
je aktuální koncentrace rozpuštěného kyslíku (mg.L-1)
Hmotová bilance kyslíku
Za předpokladu že není produkt a není chemická reakce spotřebovávající kyslík, můžeme pro
jednotlivé kultivace sestavit rovnice popisující změnu koncentrace kyslíku v čase:
Vsádková kultivace
Akumulace (vsádková kultivace)
𝑑(𝐶𝐿 ∙ 𝑉)
𝑑𝐶𝐿
=𝑉∙
𝑑𝑡
𝑑𝑡
Bilance kyslíku (vsádková kultivace)
1
𝑑𝐶𝐿
[𝐾𝐿 𝑎 ∙ (𝐶 ∗ − 𝐶𝐿 ) ∙ 𝑉] + [−
∙ 𝜇 ∙ 𝑋] = [0] + [𝑉 ∙
]
𝑌𝑋/𝑂2
𝑑𝑡
𝑑𝐶𝐿
1
= 𝐾𝐿 𝑎 ∙ (𝐶 ∗ − 𝐶𝐿 ) −
∙𝜇∙𝑋
𝑑𝑡
𝑌𝑋/𝑂2
Rovnovážná koncentrace kyslíku ve vodě je v závislá především na teplotě a množství solí a
její hodnota je ~ 9 mg.L-1 (POUZE!).
Bilance kyslíku pro vsádkovou kultivaci s postupným živením a kontinuální kultivaci se
odvodí postupem ekvivalentním k bilanci substrátu pro tyto typy kultivací. Není třeba je znát
u zkoušky.
Pěnění média
Pěna vzniká aerací nebo vývinem plynu v médiu obsahujícím pěnotvorné činidlo, které se
hromadí na mezifázovém rozhraní a tvoří tam stabilizující film a tím podporuje vznik a
stabilitu pěny. Pěnotvorná činidla jsou především proteiny a jiné látky (detergenty, saponiny).
48
Metody odpěňování
 mechanické – nástavec na hřídeli míchadla nad hladinou = mechanické rozbíjení pěny
 chemické – přídavek povrchově aktivních látek – odpěňovadel (vyšší alkoholy,
mastné kyseliny, speciální minerální oleje)
Narušují film nebo vytěsňují pěnotvorné činidlo z fázového rozhraní l-g nebo
mění povrchové napětí v opačném směru než pěnotvorné činidlo a tím
destabilizují pěnu. Často ale výrazně zhoršují přestup hmoty mezi plynnou a
kapalnou fází (zvyšují odpor tím, že tvoří vrstvu na mezifázovém rozhraní) a
tím především zhoršují přestup kyslíku.
Stanovení KLa, c* a 𝒒,𝑶𝟐 .
Existuje několik metod stanovení konstant pro popis přestupu kyslíku, jednou z nich je
dynamická metoda.
Provedení dynamické metody
Výpočty konstant
49
Příklad
Vypočtěte konstanty C*, q,O2 a KLa z hodnot naměřených při dynamické metodě:
Přerušení dodávky vzduchu:
čas s
0
6
12
-1
DOC mg.L 5,2
4,6
4,0
Obnovení vzdušnění:
čas
s
42
-1
DOC mg.L 1,2
48
2,3
54
3,1
18
3,3
60
3,7
24
2,5
66
4,0
72
4,3
30
1,8
78
4,5
36
1,1
84
4,7
90
5,0
96 102 108 114
5,1 5,2 5,3 5,4
 Jakými způsoby je možné zvýšit dodávku kyslíku buňkám při kultivaci?
 Za jakých podmínek kultivace se zvyšuje riziko limitace kyslíkem?
 Z čeho se skládá člen bilanční rovnice popisující kinetiku přestupu kyslíku z plynu do
kapaliny?
 Jaké jsou pozitivní a negativní vlastnosti jednotlivých velkostí bublin (malé, střední a
velké) z hlediska přestupu kyslíku z plynné do kapalné fáze? Proč je velikost 2-3 mm
nejlepší?
 Cvičně sestavte bilanční rovnice pro kyslík pro vsádkovou kultivaci s postupným
živením a kontinuální kultivaci (nebudou vyžadovány u zkoušky).
 Definujte pěnu z hlediska disperzních soustav.
 Jaké látky způsobují pěnění média při kultivaci? Jaký je zdroj těchto látek při kultivaci
buněk? Jaký vliv má aerace na pěnění média?
 Popište laboratorní pokus (dynamická metoda) a jeho vyhodnocení pro získání
konstant KLa, c* a 𝑞𝑂, 2 .
50
9. Míchání (typy míchání v biotechnologických
specifika míchání bioreaktorů).
provozech,
 Newtonowské vs. nenewtonovské kapaliny.
 Hydromechanické procesy. Proudění tekutin.
 Bezrozměrná kritéria podobnosti.
Míchání je hydromechanický proces, při němž dochází k přemisťování částic systému, aby se
získala nebo zachovala rovnoměrnost rozložení vlastností
Účel míchání




homogenizace (koncentrace, teplota)
suspendace
dispergace (jedné fáze do druhé)
intenzifikace (sdílení hybnosti, tepla a hmoty – snížení tloušťky laminární podvrstvy)
Typy míchání
o Mechanické
 vibrační
 rotační
o Pneumatické
o Hydraulické
Mechanické míchání – rotační míchadla
Typy rotačních míchadel
• Pomaloběžná
o
o
• Rychloběžná
o
o
kotvové
šnekové
axiální – vrtulové
radiální – turbínové (otevřené, uzavřené),
lopatkové, listové
Rotační pomaloběžná míchadla
kotvové míchadlo
šnekové míchadlo
Použití: husté, viskózní, nenewtonovské kapaliny
51
Rotační rychloběžná míchadla
Axiální
lopatkové míchadlo
vrtulové míchadlo
Radiální
turbínové míchadlo bez dělícího kotouče
turbínové míchadlo s dělícím kotoučem
Schéma mechanicky míchaného reaktoru – geometrie
systému s turbínovým míchadlem
b - šířka narážek
C - vzdálenost míchadla nade dnem
d - průměr míchadla
h - výška lopatek míchadla
H - výška plnění vsádky
b = 0,1D
C = 0,2D – 0,5D
d = 0,25D – 0,5D
h = 0,2d
H=D
viskózní kapaliny = větší d
Proudění v mechanicky míchaném
reaktoru (turbínové míchadlo)
 primární (většina E)
o tangenciální (rotační)
 sekundární (kvalita míchání)
o radiální
o axiální
52
Použití vrtulového a turbínového míchadla v biotechnologických procesech
Turbínové míchadlo
 větší střižné síly → dispergace plynu
 lepší distribuce bublin
 v aerovaných bioreaktorech
Vrtulové míchadlo
 intenzivnější
míchání,
lepší
homogenizace - velká tzv. čerpací
kapacita
 příprava médií (rozpouštění solí),
příprava suspenze křemeliny (viz
filtrace)
Narážky
Narážky brání vzniku středového výru a roztočení kapaliny tj. tangenciálnímu proudění.
Standardně jsou osazovány 4
narážky o šířce 0,1D.
Mechanické míchání - vibrační míchadla a kývavé míchání
53
Výpočet příkonu rotačního míchadla - příkonová charakteristika
kritéria
Re
Fr
Po
Re, Fr, Eu
Reynoldsovo
Froudovo
příkonové kritérium
Po  f Re, Fr , 1, 2 ...  f ( P)
Turbínové míchadlo vyžaduje vyšší příkon.
Míchání v aerovaném bioreaktoru
V aerovaném systému je menší hustota promíchávané vsádky tj.
příkon míchadla může být menší. Čím větší je
plynová zádrž tím menší příkon je potřebný.
(graf a funkce jsou ilustrativní – není třeba je
znát u zkoušky)
N – počet otáček
D – průměr míchadla
Vg – objemový průtok plynu
Smykové napětí
V okolí míchadla je velké smykové napětí, které vyvolává střižné
síly, což může vést až k poškození buněk. Náchylné tento typ
mechanického namáhání hlavně vláknité mikroorganismy. Ty
reagují změna morfologie - vytvářejí tzv. klubíčka (pelety).
Velikost poškození závisí na:
• intenzitě
• době setrvání
• frekvenci průchodu
54
Hydraulické a hydrodynamické míchání
V případě hydraulického míchání se přečerpává
velký objem kapaliny za malého tlaku. V případě
hydrodynamického míchání malý objem kapaliny
za velkého tlaku přičemž vstup do reaktoru je řešen
tryskou. Kapalina je do reaktoru přiváděna
tangenciálně, což způsobí tangenciální proudění.
Pneumatické míchání
U aerovaných systémů jde zároveň o míchání i
aeraci. Využívá se i u anaerobních systémů např.
metanogeneze, kdy je plynem (vznikajícím
metanem)
přiváděným
dospod
reaktoru
promícháván obsah.
Méně účinný systém míchání i přestupu kyslíku ale
pro řadu biotechnologických procesů dostačující.
Výhodou je jednoduchost, nízké investiční i
provozní náklady a absence pohyblivých částí
(menší poruchovost).
 Do jakého typu proudění se transformuje většina mechanické energie dodané
míchadlem? Je to žádoucí? Lze to ovlivnit?
 Promyslete rozdíly funkce vrtulového a lopatkového míchadla a vhodnosti jejich
použití.
 Jaký typ míchadla byste použily v aerovaném mechanicky míchaném reaktoru a proč?
 Jaké jsou důvody odolnosti mikroorganismů proti mechanickým vlivům prostředí? Jak
se liší mechanická odolnost základních typů mikroorganismů (bakterie, kvasinky,
plísně)?
 Jaká je reakce vláknitých mikroorganismů na mechanický stres při míchání? Jaké má
tato reakce negativní důsledky? Jaké vláknité mikroorganismy jsou technologicky
významné?
 Jakému mechanicky míchanému systému je třeba dodat více energie (příkon
míchadla)? Systému bez nebo s narážkami. Systému aretovanému nebo bez aerace.
Jaké jsou důvody?
 Jak vysoká koncentrace buněk, především vláknitých mikroorganismů, ovlivňuje
hydromechanické vlastnosti vsádky?
55
10. Bioreaktory (rozdělení, konstrukce, použití).
 Chemické reaktory.
 Pístovým tok.
Rozdělení bioreaktorů
Z hlediska velikosti
• na laboratorní (asi do 30 dm3)
• čtvrtprovozní (30 – 100 dm3)
• poloprovozní (100 dm3 – 5 m3)
• provozní (větší než 5 m3)
Podle způsobu provádění procesu
• vsádkové reaktory
• vsádkové reaktory s postupným živením
• kontinuální reaktory
Podle druhu použitého biokatalyzátoru
• reaktory pro kultivaci buněk
• reaktory pro enzymové reakce
Podle formy použitého biokatalyzátoru
• reaktory pro kultivaci volných buněk nebo enzymů
• reaktory s vázanými buňkami nebo enzymy
Z hlediska potřebnosti aerace
• aerobní
• anaerobní
Podle způsobu míchání
• s mechanickým mícháním
• s pneumatickým mícháním
• s hydraulickým mícháním
Konstrukční materiály bioreaktorů
Požadavky na konstrukční materiály bioreaktorů:
 kvalita povrchu (leštěné)
 mechanické odolnost - tvrdost (tlakové nádoby)
 chemická odolnost (pH médií, pH při mytí)
produkty metabolismu - pH 1 (citronová kyselina) – 10 (lyze buněk)
(naleptání = ztenčení, nerovnosti povrchu, uvolňování iontů do média)
Při projektování a realizaci reaktorů je třeba se vyvarovat rohů (konstrukce) a štěrbin nebo
spár (spojování materiálů).
56
Materiál
Železo
Měď
Hliník
Sklo
Plasty
Pryže
Silikonové
pryže
Keramika
Dřevo
Charakteristika
Použití
hlavní konstrukční
 litina – C ~ 1%, S ~ 0,5%
materiál bioreaktorů
křehká, poměrně odolná proti korozi
dalšího
méně ušlechtilý materiál, některé konstrukční a
přístrojového
prvky
vybavení
 ocel – snížený obsah C a S
kujná, tažná – vlastnosti podle obsahu C a S a biotechnologického
provozu
legujících prvků
• uhlíková
• legovaná
Označení a rozdělení ocelí - třídy oceli 10-19 (první
dvojčíslí z pětimístného kódu)
XX XXX
Třída 17 (17 XXX) zahrnuje legované „nerez“ oceli –
mimo jiné pro výrobu potravinářských strojů a zařízení.
Legujícími prvky jsou převážně Cr, V, W, Mo, Ni, Mn.
• odolné proti korozi
• legování způsobí, že jsou mechanicky
méně odolné s horší vodivostí tepla,
houževnatější (hůře se obrábí), náročnější
na svařování
pružná, tažná, málo mechanicky odolná, pasivuje se dnes
specifická
vrstvou oxidu/hydroxidu
uplatnění – varny,
destilační aparatury
tažný, poměrně málo mechanicky a chemicky odolný téměř nepoužívaný
(rozpouští se v zásaditém prostředí)
průhledné, chemicky odolné, relativně levné, tlakově potrubí, průhledy,
odolné
laboratorní
fermentory,
kultivace
fototrofních
organismů
PE, PP, PVC, Teflon
potrubí,
hadičky,
podle technologie výroby a použitého monomeru široká membrány, kyvety,
škála vlastností a tím i použití, levné, klávovatelné (PP, laboratorní vybavení
teflon)
= vulkanizovaný kaučuk
pružné, chemicky méně odolné
chemicky odolné, stárnutí pomalejší oproti pryžím
zátky, těsnění
chemicky a mechanicky (pevnost) velmi odolné
filtry,
(malé)
distributory vzduchu
specifické použití starší ocetnice, sudy,
kádě (pivo, víno…)
mechanicky poměrně odolné, pružné, podléhá zkáze
sterilovatelné zátky,
hadičky, těsnění
57
Osazení nádoby reaktoru
Vlastní nádoba reaktoru je osazena množstvím prvků:
 měřící sondy
 vstupy/výstupy kapalných médií
 vstupy/výstupy plynů
 pojistný ventil
 armatury
 narážky
 distributor vzduchu
 míchadlo + pohon/převodovka
 duplikátor/chladící registry
Základní typy bioreaktorů podle konstrukce
Vsádkový míchaný reaktor (submerzní)
Základní charakteristiky jsou:
• Koncentrace živin, buněk i
metabolických produktů se
mění v čase je ale shodná
v celém objemu reaktoru.
• Cyklický provoz, nízká
produktivita, náročné na
obsluhu,
nejčastěji
průmyslově používané.
• Speciální
a
aseptické
technologie – výroby
antibiotik,
organických
kyselin,
potravinářský
průmysl…
Kontinuální míchaný reaktor (submerzní)
• Koncentrace všech složek se nemění v čase
(ustálený stav) ani s polohou v reaktoru.
• Kontinuální provoz, vysoká produktivita,
většinou technologie méně náročné na
asepticitu procesu.
• Průmyslová
aplikace
pro
produkci
mikrobiální biomasy nebo primárních
produktů;
čištění odpadních vod (v
kombinaci s recyklem biomasy).
58
Biofilmový reaktor (náplňový s imobilizovanými
buňkami)
• Koncentrace všech složek není časově závislá
(ustálený stav). Koncentrace všech složek závisí na
poloze v systému (obdoba pístového toku).
• Poměrně obtížná regulace množství biomasy
v systému.
• Průmyslová aplikace pro starší způsob výrobu octa
(moderní submerzně) a zpracování odpadních vod
nebo plynů.
Reaktor s fluidní vrstvou
Fluidní vrstvu tvoří s vločky aktivovaného kalu nebo
shluky buněk nebo buňky imobilizované na nosiči.
• Koncentrace všech složek není časově závislá
(ustálený stav). Koncentrace všech složek
nezávisí na poloze v systému (obdoba
mechanicky míchaného reaktoru).
• Vsádkový - výroba piva (CKT)
(vznos – vývin CO2, konvexní proudění –
rozdíly teplot)
Kontinuální - čištění odpadních vod.
(vznos – vzestupné proudění média)
 Proč jsou vyžadovány materiály pro konstrukci bioreaktorů s co nejhladším
povrchem?
 Proč se snažíme minimalizovat počet koutů a vestaveb uvnitř bioreaktoru?
 Jakými základními prvky je bioreaktor osazen?
 Ujasněte si rozdíl mezi celkovým a pracovním objemem reaktoru. Jaké jsou důvody
jejich rozdílných hodnot?
 Ujasněte si, jak mění základní parametry (S, X, V, T) jednak v čase a jednak v objemu
reaktoru a výšce nebo délce lože reaktoru v jednotlivých typech bioreaktorů.
59
11. Měřené a regulované veličiny při kultivaci buněk. Základy
regulace bioprocesů (regulační okruh, typy regulátorů, veličiny
v regulaci).
 Čidla pro měření teploty, pH, redox potenciálu, kyslíku.
Základní pojmy regulace
Regulační obvod
 regulovaná soustava
zařízení, na kterém se provádí regulace (reaktor)
 regulátor
zařízení, které uskutečňuje regulaci. Na základě změřených veličin rozhoduje
jak reagovat na danou situaci a v jaké intenzitě
 akční člen
zařízení, které na základě výstupu z regulátoru vlastní akci provede (ventil,
čerpadlo)
Veličiny v regulaci
 regulovaná veličina – y
je výstupní veličinou regulované soustavy
 řídicí veličina – w
její hodnota vyjadřuje požadovanou hodnotu veličiny regulované
 poruchová veličina - z
každá veličina, jejíž změna způsobí změnu regulované veličiny
 akční veličina – u
akční člen převádí výstup z regulátoru (v) na akční veličinu, jejímž působením
na regulovanou soustavu se uskutečňuje regulace
Regulační odchylka
Regulační odchylka (e) je základem regulace a vypočítá se jako rozdíl mezi veličinou řídící
(požadovanou) a aktuální hodnotou regulované veličiny.
e=w-y
Regulační odchylka může být kladná nebo záporná s různě velkou absolutní hodnotou,
vyhodnocuje ji regulátor a na jejím základě rozhodne o zásahu. Znaménko určuje směr zásahu
(např. zvýšení nebo snížení průtoku dávkovacího čerpadla) a velikost absolutní hodnoty
určuje intenzitu zásahu (↑↑).
Cílem regulace je odstranit (minimalizovat) regulační odchylku.
60
Blokové schéma zpětnovazebního regulačního obvodu
Základní druhy regulace
 Spojitá regulace
o spojitá změna akční veličiny (PID regulátory)
o regulátor ovládá akční člen spojitě
o příklad: turbidistat, regulace teploty
 Nespojitá regulace
Dvoupolohová regulace (0/1 – zavřeno/otevřeno)
o regulátor ovládá akční člen dvoupolohově
o příklad: regulace pH, teploty (na obrázku)
Spojitý PID regulátor
Výstup z regulátoru se počítá na základě aktuální hodnoty
regulační odchylky pomocí matematické funkce, jejíž obecný
tvar je (netřeba umět):

v  r0 .e(t )  r1. e(t ).dt  r1.
0
P
I
de(t )
dt
D
Má Proporcionální, Integrační a Derivační složku proto PID regulátor.
Velmi přesná regulace ale také náročná na nastavení (konstanty regulátoru); ne vždy nutná.
Dvoupolohový regulátor
Regulátor ovládá akční člen dvoupolohově - vypnuto/zapnuto, zavřeno/otevřeno. Regulátor
musí být vybaven hysterezí (necitlivostí ) aby neustále nekmital okolo požadované
hodnoty.
Jednoduchá, méně přesná ale často dostačující regulace.
61
Typový příklad - regulace pH
Příklad regulace pH na 70,2. To znamená, že pokud pH klesá tak regulátor sepne (= reguluje
= spustí přítok zásady) až na 6,8 (ne na 7) a pokud dojde k vzestupu hodnoty pH regulátor
sepne (= reguluje = spustí přítok kyseliny) při pH 7,2 (ne na 7). Pásmo necitlivosti regulátoru
(hystereze) je tedy mezi 6,8 a 7,2.
Typový příklad - regulace turbidistatu
Kontinuální míchaný reaktor v režimu turbidistat – produkce biomasy:
 regulovaná veličina (y) = koncentrace buněk
 poruchová veličina (z) = změna růstové rychlosti buněk => změna koncentrace buněk
 výstup z regulátoru (v) = impulz do regulačního ventilu (akční člen), který se více
nebo méně otevře a tím ovlivní akční veličinu v tomto případě průtok média
 akční veličina (u) = zvýšení nebo snížení průtoku média, které má za následek
zvětšení nebo zmenšení hodnoty zřeďovací rychlost a tím změnu koncentrace buněk
na požadovanou hodnotu
1. Zvolíme, jakou hodnotu koncentrace v reaktoru požadujeme např. 5 mg.L-1 (= řídící
veličina)
2. Měřící člen regulátoru zaznamenává aktuální hodnotu koncentrace buněk v reaktoru a
porovnávací člen kontinuálně počítá regulační odchylku. Pokud je například aktuální
koncentrace buněk v reaktoru 5,2 mg.L-1 je regulační odchylka 5-5,2 = -0,2 mg.L-1.
Ústřední člen regulátoru na základě matematického vztahu vypočítá, jaký signál se má poslat
do akčního členu.
(podstatné je znaménko – podle toho rozhodne, jestli akční člen sníží nebo zvýší hodnotu
akční veličiny = např. otevře více nebo přivře regulační ventil na přívodním potrubí
kapalného média a také absolutní hodnota odchylky – čím je větší tím více otevře nebo přivře
ventil)
3. Akční člen na základě informace ústředního členu regulátoru upraví akční veličinu v našem
případě průtok kapalného média konkrétně při regulační odchylce -0,2 sníží přítok média a
tím sníží zřeďovací rychlost, čímž se přítokuje méně substrátu a tím klesne koncentrace buněk
v reaktoru (optimálně přesně na požadovaných 5 mg.L-1).
Obdobný postup je pro ostatní regulované veličiny - pH, teplotu, výšku hladiny, rozpuštěný
kyslík.
Typový příklad - regulace na základě hodnoty rozpuštěného kyslíku
Pro účinnou regulaci koncentrace
substrátu (udržování
koncentrace v optimálním intervalu)
pomocí CL je potřeba znát vztah mezi
mini. Stanoví se empiricky změřením
nebo i výpočtem z matematického
modelu.
62
Regulované veličiny a k nim náležející akční veličiny
regulovaná veličina
akční veličina
teplota
Q nebo 0/1 chladícího/ohřevného média nebo elektrický příkon
pH
Q nebo 0/1 kyseliny nebo louhu
rozpuštěný kyslík
Q vzduchu/O2
výška hladiny
Q nebo 0/1 přítok média
množství pěny
0/1 dávkování odpěňovacího prostředku
koncentrace substrátu
koncentrace produktu
koncentrace buněk
Q nebo 0/1 přítok média (Q - turbidistat)
akční člen (změna): Q… průtok 0/1… vypnuto/zapnuto
Regulace technologického procesu jako celku
Technologická linka obsahuje množství jednotlivých technologií, které je potřeba regulovat
jednak jednotlivě, tak i jako celek. Regulace jednotlivých technologií/procesů se vzájemně
ovlivňují a proto je velmi náročné sladit regulace jednotlivých procesů tak aby bylo dosaženo
dlouhodobě optimálního a stabilního provozu dané technologie. Většinou je tato regulace
realizována na zakázku specializovanými firmami s dlouholetými zkušenostmi.
 Vysvětlete pojem „zpětnovazebná regulace“.
 Popište regulaci teploty, pěnění, rozpuštěného kyslíku, výšku hladiny v bioreaktoru.
 Koncentrace rozpuštěného kyslíku se často využívá při regulaci procesu. Proč právě
ona je vhodná pro tento účel? U jakých typů kultivací byste tento způsob použili?
 Uveďte příklady poruchových veličin (z).
 Jak vzrůst koncentrace buněk v průběhu kultivace ovlivňuje parametry kultivace a její
regulaci?
63
12. – 13. Dokončovací operace biotechnologických výrob
(konvenční separační technologie, dezintegrace buněk,
membránové separační technologie, extrakce, srážení, destilace,
sušení, stripování, CIP). Výrobní linka biotechnologického
procesu.
 Základy procesů a popis zařízení filtrace, odstřeďování, destilace, extrakce, srážení,
sušení, výměníky tepla – chemické inženýrství.
Integrované systémy biotechnologického procesu
Integrované systémy znamenají spojení bioprocesu a separace produktu. Výsledkem je
snížení nákladů na dokončovací operace a tím i celé výroby. Mohou být realizovány:
 interním recyklem buněk
 kontinuálním stripováním těkavého produktu z média vhodným plynem (vzduch, N2)
a jeho následnou separací z plynu (kondenzace, vymražení, sorpční nebo membránové
procesy). Jedná se např. o produkci kyselin, ethanolu, biorozpouštědel (aceton,
butanol).
Dokončovací operace biotechnologických výrob (downstream procesy)
Dokončovací operace obecně zahrnují:
 separace biomasy z médií po fermentaci
(usazování, odstřeďování, filtrace)
 izolace, čištění a stabilizace produktů
o extracelulární produkty - separační procesy jako filtrace, srážení,
membránové a chromatografické techniky
o intracelulární produkty - dezintegrace buněk + separační procesy
 čištění odpadních produktů (pevných, kapalných a plynných)
Separační procesy
• separace buněk z kultivačního média
• separace produktu z kultivačního média
• separace produktu z buněk
• separace produktu od nečistot
Filtrace
Odstranění pevných částic z plynu nebo kapaliny
64
Dělení filtrace podle velikosti pórů
Základní pojmy separačních technik. Filtrace - dělení suspenzí a membránové procesy –
dělení převážně roztoků.
Účelem procesu filtrace může být:
• získání plynu nebo kapaliny
• získání pevných částic
• získání plynu nebo kapaliny i pevných částic
Z hlediska provedení se rozděluje na:
• kontinuální
• diskontinuální
Hnací síla je rozdíl tlaků (Δp); může být i gravitace. Realizace rozdílu tlaků je možná dvojí:
• přetlak nad filtrační přepážkou
• podtlak pod filtrační přepážkou (vakuový filtr)
Materiál filtrační přepážky:
• vrstva zrnitého materiálu (písek, koks, naplavovací filtry)
• porézní materiály (porézní keramika, plasty, kov)
• vláknité materiály (filtrační plachetky – textilní, papírové, skleněná vlákna)
65
Filtrace kapalin
 Pískový filtr
Provozuje se v cyklu filtrace – zpětný proplach.
Náplní je praný písek o definované velikosti (a specifickém
vrstvení).
Typické nasazení je při úpravě pitné vody nebo v čističkách
odpadních vod.
 Svíčkový filtr
Materiál svíček jsou speciální syntetické vláknité materiály.
Provozuje se v cyklu filtrace - výměna svíček
 Svíčkový naplavovací filtr
Materiál svíček je keramika nebo legovaná ocel. Vlastní filtrační vrstva je naplavená vrstva
zrnitého materiálu typicky křemelina.
Provozuje se v cyklu naplavení křemeliny - filtrace - odstřelení křemeliny a filtračního koláče
66
 Deskový filtr
Podstatou konstrukce je střídání desky a rámu, mezi nimiž je tzv. plachetka jako filtrační
materiál.
Provozuje se v cyklu filtrace – rozebrání + vyčištění.
 Vakuový rotační filtr
Konstrukčně může být realizován jako bubnový nebo pásový.
Provozuje se v cyklu přisátí suspenze ve vaně – propláchnutí – odříznutí filtračního koláče.
Filtrace plynů
 Rukávový filtr
Materiál svíček jsou speciální textilie.
Provozuje se v cyklu filtrace – oklepání* nebo výměna filtrační textilie
 Svíčkový filtr
Viz filtrace kapalin.
67
Usazování
Oddělení dispergovaných částic od plynu nebo kapaliny působením objemové síly (gravitační
nebo odstředivá síla).
Účelem procesu může být:
• získání plynu nebo kapaliny
• získání pevných částic
• získání plynu nebo kapaliny i pevných částic
• roztřídění částic různých vlastností (různá rychlost usazování)
Hnací síla procesu je gravitační zrychlení (g).
g
Vu
Vf
Vp
gravitační zrychlení
rychlost usazování
rychlost proudění
výsledná rychlost usazování
Usazováky vertikální a horizontální
Usazováky s rotací suspenze
Usazováky se změnou toku suspenze
Usazováky se provozují s periodickým nebo
kontinuálním odebíráním separovaných pevných
částí.
68
Odstřeďování
Oddělení dispergovaných částic od plynu nebo kapaliny působením objemové síly (odstředivá
síla).
Hnací síla je odstředivé zrychlení (ω2r).
ω
r
Vu
Vt
Vp
úhlová rychlost
poloměr
rychlost usazování
tečná rychlost
výsledná rychlost usazování
Odstředivá síla (P)
𝑃 = 𝑚. 𝑟. 𝜔2
Relativní odstředivá síla (R)
• Vyjadřuje poměr mezi odstředivým zrychlením a zrychlením tíhovým = násobky g
(bezrozměrné). Různé „g“ v různých částech kyvety!
𝑃 = 1,117. 𝑟. 𝑁 2 . 10−5
Monogram pro zjištění „g“
Provozují se ve:
• vsádkovém (diskontinuálním) uspořádání
cyklus odstředění – oddělení odstředěné kapaliny a pevného podílu
• kontinuálním uspořádání
kontinuální odvádění odstředěné kapaliny a pevného podílu
Speciální odstředivky (v mikrobiologii a biochemii)
• Chlazené
69
•
Ultracentrifugy (100 000 x g - oddělení biopolymerů a subcelulárních částic v
hustotním gradientu - diskontinuální a kontinuální - (glukóza…) - nutno
podtlak/vakuum v prostoru s rotorem!
izopyknický bod – stejná hustota prostředí a částice
separace fragmentů buněk
• gradientová centrifugace (gradient hustoty v kyvetě)
• diferenciální centrifugace (postupné zvyšování otáček)
Oddělení
• Suspenzí (buňky, fragmenty buněk, kaly…)
• Emulzí (extrakce, odstřeďování mléka)
•
Podle konstrukce rotory
• úhlové
o úhel k ose otáčení 45-50°
o pro větší otáčky („g“)
• výkyvné
o kyvety volně zavěšeny v čepech (kyveta vodorovně při
centrifugaci)
o velké tření
o dlouhá sedimentační dráha částice
Membránové procesy
Hnací silou každého membránového procesu je transmembránový gradient.
• procesy s gradientem tlaku
o mikrofiltrace
o ultrafiltrace
o nanofiltrace
o reversní osmóza - transport rozpouštědla membránou (díky vysokému tlaku –
vyššímu než osmotický), soli a nízkomolekulární složky neprocházejí
• procesy s gradientem chemického potenciálu
o pervaporace – dělení kapalné směsi organických látek průchodem membránou
do vakua nebo nosného plynu na principu různé rozpustnosti a rychlosti
migrace par směsi membránou
o permeace plynů – oddělení plynů na základě různé rychlosti pronikání
jednotlivých plynů skrze membránu
o dialýsa - oddělení látek s různou rozpustností a velikostí přes polopropustnou
membránu
o osmósa – přechod rozpouštědla přes polopropustnou membránu proti směru
koncentračního spádu (do roztoku s vyšší koncentrací látek)
• procesy s gradientem elektrického potenciálu
o elektrodialýza migrace iontů v elektrickém poli mezi katodou a anodou. Mezi
roztoky jsou dvě membrány polopropustné ionexové membrány, které
propouštějí selektivně pouze kationty (katexové membrány) nebo anionty
(anexové membrány) – v prostoru mezi nimi se kumuluje rozpuštěná látka
(sůl)
o membránová elektrolysa – produkty elektrolýzy (na katodě a anodě jsou
oddělené dvěma polopropustnými membránami (pro ionty migrující k
elektrodám)
70
•
procesy s gradientem teploty
o membránová destilace - dělení par horké směsi látek průchodem mikroporézní
nesmáčivou membránou do chladnějšího prostoru (např. šetrné odvodňování)
Dezintegrace buněk
Slouží k získání intracelulárních produktů (enzymy, organely).
Mechanické způsoby dezintegrace
• Střídavé zmražování a rozmražování
• French press
(protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)
• X-press
(protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)
• Ultrazvuk
• Mlýnek se skleněnými balotinami (kuličky)
Fyzikální, chemické způsoby dezintegrace
• Osmotický šok (koncentrovaný roztok → velmi zředěný extrakce intracelulárních
látek)
• Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány)
• Přídavek toluenu (rozpouštění fosfolipidů buň. stěny a cytoplazmatické membrány)
Enzymové způsoby dezintegrace
• Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)
enzym z vaječného bílku (dále např. krev, sliny) selektivně štěpící glykosidové
vazby v peptidoglykanech v buněčné stěně bakterií
Extrakce
Antibiotika, nepolární látky, organické makromolekuly mohou být isolovány/čištěny extrakcí
vhodným rozpouštědlem a jeho následným odpařením.
Srážení
Srážení znamená převedení rozpustné formy na nerozpustnou s následnou filtrací. Sráží je
buď produkt nebo naopak nečistoty.
• Ca(OH)2 - organické kyseliny
• změnou pH, zvýšení obsahu vody - organické makromolekuly
Destilace
Destilace znamená oddělení těkavých produktů od média a jejich zakoncentrování.
ethanol, kyselina octová, biorozpouštědla (aceton, butanol)
Stripování
Stripování těkavých produktů (těkavé kyseliny, biorozpouštědla, ethanol) plynem např.
dusíkem.
Stabilizace
Pro stabilizaci se používá sušení, lyofilizace, navázání na nosič a jiné metody.
Sanitace
Souhrn činností, které zabezpečují plnění hygienických a technologických požadavků
biotechnologických výrob:
• Úklid - odstranění nečistot (nejen) v interiéru technologické haly
• Čištění - odstranění nečistot (zbytky média, biomasy, stěnové nárůsty…)
71
• Dezinfekce – odstranění/usmrcení mikroorganismů
• Dezinsekce - odstranění/usmrcení hmyzu
• Deratizace - odstranění/usmrcení hlodavců
Důležité je pořadí kroků:
1. čištění
2. výplach/oplach vodou
odstranění sanitačních látek - agresivní a často mikrobicidní/mikrobistatické látky
3. dezinfekce/sterilace (vždy pouze čistého zařízení)
Postup čištění reaktoru
(propaření)
(výplach)
čištění cirkulací čistícího roztoku (vhodně umístěné trysky)
výplach
Čistící (sanitační) činidla lze rozdělit do tří skupin:
• kyselé prostředky HNO3 (~ 0,5%), H3PO4
• zásadité prostředky NaOH (~ 1%)
• detergenty
Většinou se čištění prování za vyšších teplot, někdy téměř 100°C z důvodu vyšší účinnosti.
Z výše uvedeného je evidentní, že konstrukční materiály bioreaktorů, armatur, elektrod, sond
musejí být značně odolné.
CIP stanice
CIP (Cleaning In Place) je technologický celek pro provádění sanitace technologie. Skládá se
ze zásobníků sanitačních prostředků a vody, ohřevu, čerpadel, potrubí a armatur.
Je nutné satinovat celou výrobní technologii:
• reaktor, pomocná zařízení (tlakové mytí, vestavěné trysky)
• potrubí, armatury (cirkulace sanitačního prostředku)
Příklad průmyslové CIP stanice
Sterilizace – SIP stanice
SIP (Sterilization In Place) je technologický celek pro provádění sterilizace technologie.
Někdy je SIP a CIP jeden technologický celek.
72
Pro udržení asepticity procesu je nutné dezinfikovat/sterilovat celou část výrobní technologie
kde je aseptický provoz:
• celá technologie párou (reaktor často znovu se sterilací média)
• potrubí/armatury párou a reaktor spolu s médiem nepřímím ohřevem (sterilace média)
 Jaká je hnací síla filtrace, odstřeďování, usazování a jak ji zrealizujete.
 Jaký je mechanismus působení kyselých, zásaditých látek a detergentů na buňky?
 Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení pro získání
biomasy jako finálního produktu.
 Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení při produkci
primárního produktu s ohledem na to.
 Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení při produkci
sekundárního produktu s ohledem na to, jestli jsou intracelulární nebo extracelulární.
73
14. Biotechnologie a bioreaktory pro zpracování odpadů
z biotechnologických výrob.
 Rozpustnost organických látek ve vodě, hydrofobicita, Henryho zákon.
Porovnání produkčních a dekontaminačních biotechnologií
Biotechnologie a bioreaktory při čištění odpadů mají specifické odlišnosti v porovnání
s technologiemi produkčními:
Substrát a minerální živiny
 Jako substrát (zdroj uhlíku a energie) pro mikroorganismy jsou polutanty – často
toxické nebo inhibující, což způsobuje malé μ.
 V některých případech polutant slouží jako finální akceptor elektronů – odstraňování
dusičnanů/dusitanů z vody nebo vysoce halogenovaných látek; je tedy nutná
přítomnost substrátu – zdroje uhlíku a energie.
 Často směsné polutanty, někdy vyžadující významně odlišné degradační schopnosti
nebo podmínky prostředí. Příklady:
o H2S + NH3 + VOCs – emise z ČOV: H2S degradují chemolitotrofové a VOCs
chemoorganotrofové mikroorganismy; navíc degradací H2S vzniká H2SO4,
výrazně snižující pH, což nevyhovuje většině chemoorganotrofů.
o Methanogeneze (viz níže).
o Jednotlivé polutanty ve směsi
 Často pouze částečná znalost složení polutantů a přítomnosti minerálních živin.
Mikroorganismy
 Téměř vždy použití směsných mikrobiálních kultur
o nelze udržet aseptický provoz
o směs mikroorganismů má mnohem širší spektrum degradačních schopností a je
mnohem flexibilnější při změnách prostředí, polutantů a parametrů odpadních
plynů nebo kapalin
 Změny (často výrazné) v poměru a zastoupení jednotlivých taxonů směsné
mikrobiální kultury v průběhu dlouhodobého provozu.
 Často ustavení komplexního ekosystému - mikrobiální eukaryota a prokaryota
(degradéři; z pohledu ekosystému - producenti, kořist), protozoa a někdy i členovci
(z pohledu ekosystému - dravci).
Parametry a řízení procesu
 Kolísání parametrů vstupujících médií způsobuje stres mikrobiální populaci a obtížné
řízení procesu:
o průtok (mění se zřeďovací rychlost a doby zdržení!)
o koncentrace a přítomnost jednotlivých složek – minerální živiny, substrát,
toxické látky…
o fyzikálně-chemické vlastnosti média (pH, T, redox potenciál…)
o periody bez vstupující odpadní vody nebo vzduchu nebo s malou až žádnou
koncentrací polutantů a tedy hladovění - mikroorganismy bez zdroje
energie nebo i kyslíku (směnné nebo periodicky pracující technologiezdroje znečištění).
 Omezené možnosti ovlivnění a úpravy parametrů vstupujících médií.
 Omezené možnosti řízení procesu.
74

Často kombinace nízké koncentrace polutantu (limitace), špatně degradovatelného
polutantu (= malá μ) a vysokých průtoků kapaliny (= velká D) tj. nutnost použití
recyklu biomasy nebo imobilizovaných buněk.
Reaktory
 Většinou konstrukčně jednoduché a provozně nenáročné bioreaktory.
 Převážně kontinuální (i když kolísavá) produkce znečištěné odpadní vody nebo
vzduchu tj. použití kontinuálních procesů a reaktorů.
 Často využívané náplňové reaktory a submerzní reaktory s recyklem biomasy.
Z těchto odlišností vyplívají specifika přístupu k návrhu a provozování dekontaminačních
technologií v porovnání s produkčními technologiemi.
Čištění odpadních vod
Čistírny odpadních vod (ČOV)
Odpadní vody podniků se mohou smluvně čistit v komunální ČOV (malé podniky, málo
toxické nebo hygienicky závadné odpadní vody) nebo v podnikové ČOV (velké podniky,
toxické nebo hygienicky závadné odpadní vody). Podnikové ČOV někdy smluvně čistí i
komunální odpadní vody vesnic/měst, kde stojí.
Vodu znečišťuje široké spektrum organických látek biologického (biomakromolekuly nebo
jejich fragmenty) nebo průmyslového (uhlovodíky nebo kyslíkaté, halogenované nebo
nitrované organické látky) původu nebo anorganických látek (dusičnany, dusitany,
fosforečnany, rozpuštěný amoniak nebo sulfan, těžko kovy). Často je chemické znečištění
doprovázeno mikrobiálním – například přítomnost koliformních bakterií.
Vyjadřování znečištění vody
CHSK
Udává množství kyslíku (mg.L-1), které se přepočte ze spotřeby oxidačního činidla
(manganistan nebo dichroman draselný), a které je třeba k úplné oxidaci organických látek
obsažených ve vodě.
BSK5
Udává množství kyslíku (mg.L-1), které je třeba k degradaci biologicky odbouratelných
organických látek obsažených ve vodě za pět dní za pomoci mikrobiální populace.
Čím vyšší hodnoty parametrů tím větší organické znečištění vody. Pouze v některých
případech specifických nebo vysoce toxických látek se používá jejich koncentrace (mg.L-1).
Technologická linka malých ČOV
Č
LP
BČ
DN
TČ
UN
česle
lapač písku
biologické čištění
dosazovací nádrž
terciální čištění
uskladňovací nádrž
na přebytečný kal
75
Technologická linka velkých ČOV
Č
VN
LP
UN
LT
BČ
DN
TČ
KH
OD
česle
vyrovnávací nádrž
lapač písku
usazovací nádrž
lapač tuku
biologické čištění
dosazovací nádrž
terciální čištění
kalové hospodářství
odstředivka
Biologické čištění
Aerobní (organické znečištění → CO2 a H2O)
 Skrápěný náplňový reaktor (biofilm)
 Rotační biofilmové reaktory (biofilm) – malé ČOV u rodinných domků
 Aktivační nádrž = submerzní probublávaný reaktor (aktivovaný kal)
 Vegetační čištění (kořenové čistírny)
Anaerobní (organické znečištění → CO2 a CH4)
 Anaerobní submerzní reaktory
Terciální čištění
 Stabilizační nádrže (anaerobní, aerobní – převážně bakterie a řasy)
 Vegetační čištění (kořenové čistírny)
Metanogeneze
Metanogeneze (produkce bioplynu z biomasy) není jeden proces, ale skládá se z několika
procesů, vyžadujících značně rozdílné podmínky i mikroorganismy. Řízení tohoto procesu je
tedy technologicky náročné.
Proces
Hydrolýza
Acidogeneze
Acetogeneze
Popis procesu
Mikroorganismy
hydrolýza biopolymerů na monomery, spotřeba Fermentační
fakultativně
O2, částečná acidogeneze
anaerobní bakterie
Bacillus,
Clostridium,
Micrococcus,
Pseudomonas
Produkce octové kyseliny a dalších nižších Syntrofní
mastných kyselin z monomerů
Syntrophobacter,
Produkce octové kyseliny z nižších mastných Syntrophomonas,
kyselin
Syntrophus
syntrofní druhy - acidogeneze, acetogeneze, Acetogenní
produkce CO2 a H2
Clostridium,
homoacetogeny - acetogeneze, acidogeneze, Lactobacillus,
Bifidobacterium,
76
Metanogeneze
produkce CO2
Hydrogenotrofní metanogeny
CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O
Acetotrofní metanogeny
CH3COOH → CH4 + CO2
Butyribacterium
Metanogenní
Methanobacterium,
Methanocuccus,
Methanobacter,
Methanogenium
(striktně anaerobní
bakterie)
Kalové hospodářství (stabilizace kalu)
Aktivovaný kal je podle legislativy odpad a musí se s ním také tak zacházet.
Zpracování
• kompostování
• anaerobní zpracování (methanogeneze)
Čištění odpadních plynů
Znečišťující látky plynů jsou těkavé organické (uhlovodíky, kyslíkaté, halogenované sirné
organické látky) nebo anorganické látky (NH3, H2S). Těkavé organické látky jsou známé pod
zkratkou VOCs (Volatile Organic Compounds). Vedle jejich přímé toxicity, zapojení do
chemických a fotochemických v atmosféře (vznik toxických produktů a finálně smogu) nebo
negativního ovlivňování funkcí atmosféry (skleníkový efekt, ničení stratosférického ozónu) se
sleduje i obtěžování zápachem.
Vyjadřování znečištění plynu
Většinou se vyjadřuje jako kombinace hmotnostního toku z kontaminující technologie a
maximální dosahované koncentrace a často bez rozlišení jednotlivých látek ze směsi
polutantů – například tzv. suma VOCs – těkavých organických látek (Volatile Organic
Compounds). V případech specifických nebo vysoce toxických látek se používá a sleduje
jejich přesná koncentrace (např. u tzv. dioxinů).
Bioreaktory pro čištění odpadních plynů
Biofilmové reaktory
 náplňové
biofiltr
biotrickling filtr (skrápěná kolona)
 rotační diskový filtr
Submerzní reaktory
 biologická pračka plynů
 probublávaná kolona
 airlift
Vedle přestupu kyslíku do vodné fáze a následně do buněk je klíčový proces dekontaminace i
kinetika přestupu polutantů do vodné fáze a do buněk (na rozdíl od čištění odpadních vod).
V tomto ohledu jsou při dekontaminaci zvýhodněné dobře rozpustné polutanty a kinetika
přestupu hmoty špatně rozpustných polutantů (např. uhlovodíky) může být limitujícím
faktorem celého procesu.
Základní typy reaktorů používaných při čištění odpadní vody a plynu
Čištění odpadních vod má mnohem hlubší historii a vzhledem k podobnosti (aerobních)
procesů byly základní typy reaktorů pro čištění vody převzaty a modifikovány pro použití při
čištění odpadních plynů.
77
Při zpracovávání odpadních plynů je vedle přestupu kyslíku z plynné fáze do kapalné (stejně
jako při čištění odpadní vody) klíčový i přestup polutantů z plynné fáze do kapalné (není u
čištění odpadní vody). Rozpustnost ve vodě a Henryho konstanta polutantu hrají zásadní roli
v přestupu hmoty a tím i v odstranění polutantu z odpadního plynu. Polutanty s malou
rozpustností a vysokou Henryho konstantou jsou tedy znevýhodněny a kinetika jejich
přestupu do kapalné fáze může být limitující proces pro dekontaminační technologii. Většinou
však je limitujícím krokem vlastní biodegradace nebo kinetika přestupu kyslíku. Z důvodu
kinetiky přestupu polutantu z plynné fáze do kapalné jsou bioreaktory s nízkým obsahem
vodné fáze (biofiltr) vhodnější pro špatně rozpustné polutanty (uhlovodíky) zatímco
bioreaktory s vysokým obsahem vodné fáze (skrápěný bioreaktor, probublávaná kolona,
airlift) jsou vhodnější pro velmi dobře rozpustné polutanty.
Odpadní vody
Odpadní plyny
Biofiltr
Znečištěná voda kontinuálně proudí skrze Znečištěný vzduch kontinuálně proudí skrze
náplňový materiál lože s imobilizovanou lože, kde polutanty přestupují do vodné fáze a
mikrobiální kulturou, která degraduje jsou degradovány imobilizovanou mikrobiální
obsažené polutanty (tzv. ponořené lože).
kulturou.
Nutno použít imobilizaci buněk – D > μ.
Voda s přídavkem minerálních živin je
Aerace má za úkol pouze dodávku kyslíku. periodicky dávkována (1-2 x denně) a zajišťuje
dostatečnou vlhkost lože (biofilmu) a přísun
minerálních živin.
Skrápěný bioreaktor (biotrickling filtr)
Znečištěná voda kontinuálně stéká po Znečištěný vzduch kontinuálně proudí skrze
náplňovém materiálu s imobilizovanou lože, kde polutanty přestupují do vodné fáze a
mikrobiální kulturou, která degraduje jsou degradovány imobilizovanou mikrobiální
obsažené polutanty.
kulturou.
Nutno použít imobilizaci buněk – D > μ.
Voda s přídavkem minerálních živin je
Aerace má za úkol pouze dodávku kyslíku; cirkulována a zajišťuje dostatečnou vlhkost lože
může být i pasivní s využitím komínového (biofilmu) a přísun minerálních živin a lepší
efektu.
distribuci kyslíku a polutantů.
78
Submerzní bioreaktory - probublávaná kolona; airlift
Do znečištěné vody je před vstupem do Znečištěný vzduch je kontinuálně probubláván
reaktoru dávkována biomasa pomocí skrze vodu s přídavkem minerálních živin, kde
recyklu biomasy (tzv. aktivace/aktivační polutanty přestupují z bublin plynu do vodné
technologie – využití aktivovaného kalu). fáze a jsou degradovány suspendovanou
Vzniklá suspenze pak kontinuálně proudí mikrobiální kulturou (submerzní proces).
reaktorem, kde jsou degradovány obsažené
polutanty. Po výstupu je biomasa oddělena Voda slouží jako prostředí pro mikroorganismy
od vyčištěné vody a vracena na začátek a pro rozpuštění polutantů a kyslíku.
procesu.
Nutno použít recykl buněk – D > μ.
Aerace má za úkol míchání (pneumatické)
a dodávku kyslíku.
Poznámka:
- kapalina;
- plyn (vzduch)
79
 Jaké typy mikroorganismů byste museli použít pro odstranění H2S, NH3, VOCs z
plynných emisí z čističek odpadních vod z hlediska jejich rozdělení na základě
získávání energie.
 Jaký je účel jednotlivých výchozích látek v metabolismu vzniku metanu při
metanogenezi (4H2 + CO2 → CH4 + H2O a CH3COOH → CH4 + CO2) z hlediska
zisku energie a finálního akceptoru elektronů. Jak byste pojmenovali tyto bioreakce
z hlediska finálního akceptoru elektronů?
 Co způsobuje kolísání zřeďovací rychlosti v biologickém stupni - submerzním reaktoru
- ČOV? Jaké problémy v řízení procesu to způsobuje? Jak lze toto kolísání (alespoň
částečně) omezit?
 Jak se projeví různý obsah vody u různých typů bioreaktorů na čištění odpadních
plynů na odstraňování hydrofobních a hydrofilních polutantů? Jak to ovlivní
transportní pochody?
 Charakterizujte typ reaktoru, stav biomasy a typ procesu u jednotlivých bioreaktorů
pro čištění odpadních vod a vzduchu.
 Ujasněte si, jak mění základní parametry (S, X, V, T, CL) jednak v čase a jednak v
objemu/výšce nebo délce lože reaktoru v bioreaktorech pro čištění odpadních vod a
plynu pro vzduch i vodu. V čem se z tohoto hlediska liší submerzní reaktory pro čištění
odpadní vody a plynu?
80

Sylabus Základy bioinženýrství N319002

Transkript

Podobné dokumenty

Inkluzní tělíska - Škola molekulárních biotechnologií Profession

Tabulka chemických odol- ností slouží jako průvodce odolností pro

5. Metabolismus

Untitled

Téma 14 - Excerpta z teoretické chemie

Prezentace 02-02a_slad_pivo

3 TECHNICKÁ MIKROBIOLOGIE 3.1 Základní pojmy

Membrány a membránové procesy Výzkum, vývoj, výroba a

Kompostování odpadů a potencionální riziko mikrobiální

článek 2008_03

Biotechnologie v ochraně životního prostředí

Potravináˇrské inˇzenýrstv´ı a bioinˇzenýrstv´ı

Celý článek v pdf

Odkaz ke stažení - Metodiky

Vizualizace jako nástroj studia chování modelů přírodních systémů

1 Příručka systému kritických bodů (HACCP) Vyplňte tabulku: 1

progresivní materiály - Personalizace výuky prostřednictvím e

Dítě v náhradní rodinné péči očima pediatra

BMW řady 7 Test Ladislav Špaček Občas nadávám jak špaček Opel

LIHOVARNICTVÍ A VÝROBA LIHOVIN

Sborník 2011 - Ústav biotechnologie

AVCR 2007.cdr - Akademie věd České republiky