ankyrinový receptor – iontový kanál v nocicepčních drahách

Pøehledné èlánky
ANKYRINOVÝ RECEPTOR – IONTOVÝ KANÁL
V NOCICEPÈNÍCH DRAHÁCH
ANKYRIN RECEPTOR – ION CHANNEL IN NOCICEPTIVE
PATHWAYS
LUCIE SURÁ1, VLASTIMIL ZÍMA2, FILIP TOUŠKA1 A VIKTORIE VLACHOVÁ1
1
AV ÈR, Fyziologický ústav, v.v.i., Praha
Univerzita Karlova, Matematicko-fyzikální fakulta, Fyzikální ústav, Praha
2
SOUHRN
Nové smìry výzkumu mechanizmù nocicepce, motivované snahou nalézt nové úèinnìjší látky k léèbì bolesti, jsou v posledním desetiletí silnì poznamenány objevem významné skupiny TRP (transient receptor potential) iontových kanálù. Tyto proteiny se typicky vyskytují v plazmatických
membránách primárních aferentních neuronù nebo v keratinocytech a lze je aktivovat rùznými podnìty, které vyvolávají u èlovìka bolest. Jedním z takových iontových kanálù je ankyrinový receptor TRPA1, jehož exprese je specifická pro nociceptivní neurony periferních ganglií. TRPA1
je aktivován izothiokyanáty, pálivými substancemi obsaženými napø. v hoøèici a køenu, fytokanabinoidy, nikotinem, dráždivými aldehydy obsaženými ve výfukových i slzných plynech a v cigaretovém kouøi, ale také endogenními produkty oxidativního stresu a mediátory zánìtu. Tato práce
podává pøehled souèasných poznatkù o strukturálních, funkèních a farmakologických vlastnostech TRPA1 receptoru, zamìøuje se na jeho fyziologický význam v souvislosti s mechanizmy nocicepce a naznaèuje nové smìry dalšího výzkumu soustøedìného na využití souèasných poznatkù
o TRPA1 pro léèení bolesti.
Klíèová slova: nocicepce, ankyrinový receptor, bolest, chlad, senzorická transdukce, hyperalgezie
SUMMARY
The past decade has seen a progressive unraveling of the molecular identities of receptors implicated in transduction of painful stimuli. Among
the line-up of important ion channels involved in peripheral pain pathways, the family of the transient receptor potential (TRP) ion channels has
attracted considerable attention and research work as a target class for drug discovery. One of these channels, the ankyrin transient receptor potential TRPA1, which expression is restricted to nociceptive neurons of peripheral ganglia, can be activated by isothiocyanates, pungent products
from mustard oil and horse radish, phytocannabinoids, nicotin, environmental irritants contained in air polution, cigarette smoke and tear gas,
but also by inflammatory mediators and endogenous products of oxidative stress. The purpose of this paper is to give an overview of the pharmacological, structural and functional properties of the TRPA1 channel in mammalian sensory system and to summarize recent evidence regarding
its key properties that can be exploited for potential therapeutic advantage.
Key words: nociception, ankyrin receptor, pain, cold, sensory transduction, hyperalgesia
Úvod
Každý živý organizmus je zcela závislý na schopnosti reagovat na podnìty ve svém okolí. Dovednost rozpoznat míru
nebezpeèí a správnì zareagovat na pøíslušný podnìt rozhoduje èasto o jeho pøežití. Primární aferentní senzorické neurony typu A a C, umožòující odlišit potenciálnì poškozující podnìty od neškodných (nociceptory), exprimují na svých
periferních zakonèeních ‚specializované’ receptory, které svými vlastnostmi urèují, zda a za jakých podmínek bude pøijímaný signál (tepelný, chemický nebo mechanický) pøeveden
na nervový vzruch. Významnou skupinou tìchto transdukèních molekul jsou TRP (transient receptor potential) iontové
kanály. Kromì klasického mechanizmu aktivace prostøednictvím vazby ligandu lze TRP kanály aktivovat vnìjšími podnìty fyzikálního charakteru: zmìnou teploty, svìtlem, osmotickým tlakem, deformací nebo depolarizací bunìèné membrány. Takové vlastnosti pøedurèují TRP proteiny k pøímému zapojení do drah senzorické transdukce. Rùzné sestøihové varianty TRP receptorù jsou skuteènì exprimovány pravdìpodobnì ve všech savèích orgánech a tkáních, kde hrají dùleži80
tou roli v pøevodu senzorických informací rùzných modalit,
aś už se jedná o zrak, chuś, èich, sluch, mechanické èi teplotní vnímání. TRP kanály se podílejí také na celé øadì dalších bunìèných procesù, mezi které patøí napø. regulace cévního tonu, doplòování zásob intracelulárního vápníku, modulace bunìèného cyklu, regulace homeostázy Ca2+ a Mg2+
èi migrace bunìk.
Savèí TRP receptory jsou kódovány 28 geny a podle strukturální pøíbuznosti je lze zaøadit do šesti skupin: kanonické
(TRPC), vaniloidní (TRPV), melastatinové (TRPM), ankyrinové (TRPA), polycystinové (TRPP) a mukolipinové (TRPML) (viz souèasná nomenklatura (Clapham et al., 2010)
a citace prùbìžnì aktualizované v této databázi). Molekulární identifikace teplotnì aktivovaných zástupcù skupin TRPV,
TRPA a TRPM kanálù z genových knihoven získaných ze savèích senzorických ganglií otevøela zcela nové smìry výzkumu
zamìøeného na poznání vlastností proteinù, které detekují
a vyhodnocují zvláštì ty podnìty, které mohou poškodit nebo
ohrozit integritu živého organizmu (Nilius et al., 2007). Dosud nejlépe prozkoumaným TRP iontovým kanálem specificBOLEST  ROÈNÍK 13  2010  ÈÍSLO 3
Ankyrinová podrodina TRP kanálù
TRPA1 je jediným zástupcem ankyrinového podtypu TRP
kanálù u savcù (Story et al., 2003). Své oznaèení získal díky
opakujícímu se sekvenènímu motivu nazývanému ankyrinová
doména, který nacházíme na N-konci tohoto receptoru. Repetice 17 ankyrinových domén zabírá pøibližnì 80 % pomìrnì dlouhého cytoplazmatického N-konce. Ankyrinová doména je velmi bìžný strukturní motiv popsaný u tisícù proteinù
napøíè živou pøírodou. Obecnì se pøedpokládá, že jde o místo protein-proteinové interakce, ale mùže také zprostøedkovávat vazbu s ligandy neproteinové povahy, jako je napø. vazba
adenosintrifosfátu na ankyrinovou doménu TRPV1 receptoru (Gaudet, 2008). Existují studie, které podporují hypotézu,
že ankyrinové repetice mají mechanické vlastnosti pružiny,
a mohly by tudíž hrát úlohu v pøevodu mechanických podnìtù. Proto se s objevem rozsáhlé distribuce TRPA1 receptoru
BOLEST  ROÈNÍK 13  2010  ÈÍSLO 3
ve vnitøním uchu pøedpokládalo, že by tento iontový kanál
mohl pøedstavovat dlouho hledaný mechanicky aktivovatelný transdukèní kanál pøevádìjící akustické podnìty ve vláskových buòkách (Corey et al., 2004). Tato hypotéza byla však
brzy vyvrácena dvìma nezávislými studiemi, které následnì
potvrdily, že myši s vyøazeným funkèním genem pro TRPA1
receptor mají zachovány všechny sluchové funkce (Bautista et al., 2006; Kwan et al., 2006). Úloha TRPA1 jako možného mechanosenzitivního iontového kanálu na nociceptorech však stále zùstávala ve høe. Pozdìji bylo na nervovì-kožních preparátech prokázáno, že TRPA1 se skuteènì úèastní
transdukce mechanických podnìtù na periferních zakonèeních nociceptivních vláken (Kwan et al., 2009).
TRPA1 je teplotnì aktivovaný iontový kanál (termo-TRP)
TRPA1 je stejnì jako vìtšina TRP receptorù neselektivním iontovým kanálem, který propouští jak monovalentní, tak
divalentní kationty. Procházející vápenaté ionty mají kromì
své úlohy nosièù náboje navíc dvì speciální role: silnì aktivují kanál z intracelulární strany, zøejmì vazbou na specifickou doménu N-konce, a souèasnì aktivitu naopak postupnì
snižují zatím neznámým mechanizmem (obr. 1A a B). První studie popsaly TRPA1 jako iontový kanál aktivovaný chladem (<17 °C) (Bandell et al., 2004; Macpherson et al., 2006;
Story et al., 2003), jiné práce ale úlohu TRPA1 v teplotní citlivosti zpochybnily (Jordt et al., 2004; Nagata et al., 2005).
Autoøi, kteøí nepozorovali proudové odpovìdi pøi ochlazení okolního roztoku, se domnívali, že nízké teploty mohou
aktivovat TRPA1 kanál nepøímo prostøednictvím výlevu vá-
Obrázek 1: Chemická aktivace TRPA1 receptoru. (A) Membránové proudy vyvolané aktivací TRPA1 receptoru v buòce HEK 293T (angl. human
embryonic kidney) v pøítomnosti 1 mM vápenatých iontù v extracelulárním prostøedí. Proudová odpovìï snímaná technikou patch-clamp
v konfiguraci „whole-cell“ byla vyvolána allylisothiokyanátem (200 μM)
aplikovaným na buòku v èasovém intervalu oznaèeném nad záznamem.
Z prùbìhu je patrné, že první pozvolná fáze proudové odpovìdi pøechází
v prudší (potenciace proniknuvším vápníkem) a následuje úplná inaktivace zpùsobující uzavøení iontových kanálù. (B) Membránový proud
vyvolaný aktivací TRPA1 receptorù cinnamaldehydem (skoøicový aldehyd, organická slouèenina, která dává skoøici její chuś a vùni) v roztoku neobsahujícím vápenaté ionty a poté (již bez pøítomnosti cinnamaldehydu) v roztoku obsahujícím 2 mM vápník, jak je vyznaèeno nad
záznamy. (C) Strukturní vzorce nìkterých aktivátorù TRPA1 receptoru.
81
Pøehledné èlánky
kým pro nociceptory je vaniloidní receptor typu 1 (TRPV1;
døíve nazývaný kapsaicinový receptor nebo VR1). Specifický agonista tohoto receptoru, alkaloid kapsaicin, obsažený
v pálivých paprikách, je jedním ze spolehlivých indikátorù,
kterým lze odlišit nociceptivní neurony, jež zprostøedkovávají
informaci o podnìtech vyvolávajících u èlovìka palèivou bolest. TRPV1 receptor je aktivován teplem (>43 °C) a dalšími
látkami, které obvykle doprovázejí zánìtlivé stavy (Boukalová a Vlachová, 2008).
V pøibližnì polovinì malých a støedních neuronù ganglií zadních koøenù míšních savcù, v nichž jsou typicky exprimovány vaniloidní receptory typu 1, se vyskytuje také strukturálnì pøíbuzný ankyrinový receptor TRPA1 a tyto dva receptory mohou dokonce funkènì interagovat (Staruschenko
et al., 2010). Molekulární mechanizmy aktivace ankyrinového receptoru TRPA1 jsou detailnì studovány od roku 2003,
kdy byl tento iontový kanál identifikován v nociceptivních drahách (Story et al., 2003), vyklonován však byl již o ètyøi roky
døíve z lidských fibroblastù (Jaquemar et al., 1999). Pøestože se správnì pøedpokládalo, že jde o nový podtyp iontových
kanálù rodiny TRP a že aktivita tohoto receptoru mùže mít
urèitou souvislost s intracelulární regulací vápenatých iontù,
autorùm se jej nepodaøilo exprimovat v eukaryotických buòkách. V souèasné dobì jsou pøi studiu TRPA1 intenzivnì využívány poznatky, které byly nashromáždìny o pøíbuzných
TRP receptorech, a proto se mnoho informací o jeho distribuci, struktuøe, farmakologických vlastnostech a mechanizmech aktivace podaøilo získat mnohem rychleji na základì
èetných analogií. Jedním z takových charakteristických znakù, který je spoleèný mnoha TRP kanálùm, je jejich polymodalita, tedy schopnost integrovat signály rùzné povahy (chemické èi fyzikální) a rùzného pùvodu (intra- a extracelulární). TRPA1 lze aktivovat chemickými podnìty, ale také chladem, zmìnami osmotického tlaku nebo depolarizací bunìèné membrány.
Cílem tohoto pøehledného èlánku je informovat ètenáøe o souèasných znalostech týkajících se farmakologických,
strukturálních a funkèních vlastností ankyrinového receptoru TRPA1 a uvést nejdùležitìjší poznatky, na které je v souvislosti s tímto receptorem a jeho možnou fyziologickou úlohou zamìøena hlavní pozornost a o kterých se nejvíce diskutuje v kontextu budoucích smìrù ve vývoji nových pøístupù
k léèbì bolestivých stavù u lidí.
Pøehledné èlánky
penatých iontù z intracelulárních zásob. Studie z jiných laboratoøí však pozdìji pøinesly jednoznaèné dùkazy o tom,
že heterolognì i nativnì exprimovaný TRPA1 je pøímo aktivován teplotami <20 °C, a to zpùsobem, který není závislý na extracelulární koncentraci vápenatých iontù ani na jejich výlevu z intracelulárních zásob (Karashima et al., 2009;
Sawada et al., 2007). Na základì behaviorálních studií bylo
dokázáno, že myši postrádající funkèní TRPA1 vykazují zmìny v reaktivitì na pùsobení bolestivého chladu (Kwan et al.,
2006), což podporuje hypotézu, že TRPA1 pøedstavuje senzor pro bolestivý chlad in vivo.
Chemická aktivace TRPA1
TRPA1 je aktivován širokou škálou exogenních i endogenních látek (Baraldi et al., 2010). Mezi nì patøí slouèeniny, jež mají schopnost zpùsobovat bolest èi neurogenní zánìt. Pøíkladem jsou izothiokyanáty – pálivé substance hoøèice, wasabi a køenu (obr. 1C). Prostøednictvím TRPA1 pùsobí
dráždivì také akrolein, látka obsažená ve výfukových plynech
a døíve souèást slzných plynù. Stejnì pùsobí prakticky všechny dnes i døíve používané slzné plyny elektrofilní povahy
a alfa, beta-nenasycené aldehydy v cigaretovém kouøi. Øada
elektrofilních látek aktivuje TRPA1 kovalentní modifikací cysteinových zbytkù na N-konci receptorových podjednotek, ale
pro mnohé aktivátory typu alkylfenolù nebyl mechanizmus
aktivace dosud urèen. K fytochemickým látkám, které pùsobí jako plní agonisté TRPA1 receptoru, patøí aktivní látky
obsažené v èesneku (alicin), skoøici (cinnamaldehyd), seèuánském pepøi (hydroxy--sanshool), tymiánu (tymol), dobromysli (karvakrol též nazývaný cymofenol), mátì (mentol)
nebo v zázvoru (gingerol). Jako agonisté, nebo èásteèní agonisté pùsobí na TRPA1 také nìkteré návykové psychotropní
látky, jako jsou kanabinoidy a nikotin. Z klinického hlediska
jsou významnými aktivátory TRPA1 celková anestetika: látky jako napø. izofluran, desfluran èi propofol. Tyto slouèeniny aktivují nociceptivní neurony, èímž pøispívají ke zvýšení
nežádoucí pooperaèní bolesti pacientù.
Kromì dráždivých exogenních látek pùsobí na TRPA1
jako agonisté také endogenní mediátory zánìtu a cystein-reaktivní látky, které vznikají vlivem oxidativního stresu (nerovnováha mezi produkcí volných kyslíkových radikálù a jejich
odstraòováním antioxidanty): protony, oxid dusnatý (NO),
peroxid vodíku (H2O2) a prostaglandin (15-deoxy-12,14-prostaglandin J2). Významný mediátor zánìtu bradykinin aktivuje TRPA1 nepøímo prostøednictvím bradykininového receptoru B2, který stimuluje signální dráhu fosfolipázy C. Tato
aktivita zvyšuje vnitrobunìèné koncentrace vápníkových iontù a pøedpokládá se, že právì vápník je bezprostøední podnìt,
který aktivuje TRPA1 (Bautista et al., 2006). Vápenaté ionty
jsou následnì dùležitým faktorem urèujícím aktivitu TRPA1,
ovlivòují jeho jednotkovou vodivost, pravdìpodobnost otevøení, pøispívají ke zvýšení úèinnosti chemické aktivace,
ale v pozdìjších fázích aktivace se naopak podílejí na postupném snižování odpovìdí v pøetrvávající pøítomnosti chemického podnìtu (Nagata et al., 2005; Wang et al., 2008).
TRPA 1 receptor je modulován napìtím
Na klidovém membránovém potenciálu je aktivita kanálu jen málo ovlivòována napìtím, avšak na pozitivních membránových potenciálech výraznì usmìròuje proud. Obr. 2A
82
ukazuje odpovìdi vyvolané sérií napìśových pulzù (-100 až
+200 mV po +20 mV) na buòce, která je transfekována TRPA1
a jejíž membránový potenciál je v intervalech mezi jednotlivými pulzy udržován na -70 mV. Hyperpolarizaèní pulzy
Obrázek 2: Modulace TRPA1 receptoru napìtím. (A) Membránové
proudy vyvolané depolarizaèními pulzy (nahoøe), pøi nichž je klidový
membránový potenciál -70 mV vystøídán na 100 ms jiným membránovým potenciálem (postupnì z -80 mV na +200 mV). HEK293T buòka
byla transfekována lidským ortologem TRPA1 receptoru. Symbol nad
záznamem oznaèuje místo, kde byla mìøena maximální proudová odpovìï. (B) Proudovì-napìśová závislost TRPA1 receptoru, v níž je zobrazena maximální vyvolaná odpovìï (prùmìr proudových hustot získaných ze sedmi rùzných bunìk) pøi daném membránovém potenciálu.
(< -70 mV) nevyvolávají žádný membránový proud, výrazný
proud je vyvolán až na pozitivních membránových potenciálech. Proudovì-napìśová závislost (obr. 2B) ukazuje strmost
usmìrnìní membránového proudu neseného kationty, smìøujícího ven z buòky na pozitivních potenciálech. Proudy vyvolané depolarizaèními pulzy jsou následovány dovnitø smìøujícím proudem, který vzniká v dùsledku pøetrvávajícího otevøení kanálu v okamžiku zmìny membránového potenciálu
na negativní hodnotu (-70 mV). Tyto proudy (tail currents)
mají exponenciální charakter a jejich èasová konstanta odráží
prùmìrné trvání otevøení kanálu vyvolaného depolarizaèním
pulzem. Tato vlastnost TRPA1 receptoru, která je charakteristická i pro jiné iontové kanály TRP skupiny receptorù, se
mùže výraznì uplatòovat ve fyziologickém kontextu, kdy aktivace receptorù je usnadnìna pøi depolarizaci jakéhokoliv pùvodu, aniž by receptor byl aktivován pøímo tj. chemicky nebo
chladem. Modulace TRPA1 napìtím je zvlášś výrazná, je-li
pøítomen ještì jiný aktivaèní podnìt, protože nastává výrazná synergie, tj. vyšší než aditivní úèinek obou podnìtù. Všude, kde se v periferním nervovém systému dynamicky mìní
membránový potenciál, mùže být tímto zpùsobem variabilnì
a významnì uplatòován vliv TRPA1 receptorù.
Strukturální vlastnosti TRPA1 receptoru
Molekulární strukturu lidského TRPA1 receptoru tvoøí 1119 aminokyselin uspoøádaných v šesti transmembránových doménách (S1–S6) a cytoplazmaticky orientovaném
karboxylovém a aminovém konci (obr. 3A). Iontové kanály
jsou vytváøeny symetrickým uspoøádáním ètyø identických
TRPA1 podjednotek v plazmatické membránì (Ramsey et
al., 2006). Podobnì, jako je tomu u jiných TRP kanálù, hydrofobní klièky mezi transmembránovými segmenty S5 a S6
BOLEST  ROÈNÍK 13  2010  ÈÍSLO 3
Pøehledné èlánky
Obrázek 3: Molekulární struktura podjednotky TRPA1 receptoru. Struktura je tvoøena šesti transmembránovými segmenty (S1–S6), jednou
kratší hydrofobní klièkou mezi S5 a S6 a cytoplazmaticky orientovaným aminovým a karboxylovým koncem. Dominantní èást aminového konce receptoru je tvoøena opakujícím se sekvenèním motivem ankyrinových domén. N konec obsahuje vazebnou doménu (EF-hand), která zodpovídá za modulaci TRPA1 vápenatými ionty [Zurborg et al., Nat Neurosci. 2007;10:277-9. a Doerner et al., J Biol Chem. 2007;282:13180-9.]. Cysteiny interagující s cystein-reaktivními látkami typu allylisothiokyanát jsou vyznaèeny písmenem „C“. Iontové kanály TRPA1 jsou tvoøeny symetrickým uspoøádáním ètyø stejných podjednotek, pøièemž hydrofobní klièky mezi segmenty 5 a 6 se podílejí na vytvoøení centrálního póru (pohled shora na iontový kanál a uspoøádání ètyø podjednotek je vyznaèen na menším obrázku). Sekundární struktura C-konce je pravdìpodobnì z 50 % helikální (predikováno podle serveru Jpred 3, [Cole C, Barber JD & Barton GJ. Nucleic Acids Res. 2008]). (B) Fylogenetický strom
pøíbuznosti C-konce TRPA1 receptoru pro rùzné živoèišné druhy. Pro porovnání sekvencí je použita ClustalW metoda (mìøítko oznaèuje jednotku genetické vzdálenosti).
se podílejí na vytvoøení centrálního póru iontového kanálu.
Souèástí horní (vnì orientované) èásti póru je selektivní filtr, jenž reguluje propustnost kanálu pro jednomocné a dvojmocné kationty, zøejmì ale také pro organické kationty vìtšího prùmìru (Banke et al., 2010; Chen et al., 2009). Modul
póru iontového kanálu patøí mezi nejvíce konzervované oblasti napøíè rodinou TRP kanálù, což nasvìdèuje tomu, že
pro tyto iontové kanály existuje nìkolik spoleèných principù selektivity, propustnosti a blokujících úèinkù nìkterých
nekompetitivních inhibitorù (rutheniové èervenì nebo lanthanidù). Naproti tomu hydrofilní N- a C-koncové èásti jsou
u všech TRP receptorù nejménì konzervované, a proto se
pøedpokládá, že obsahují funkèní domény, jež urèují specifické vlastnosti jednotlivých podtypù receptorù. Dominantní
èástí (716 aminokyselin) TRPA1 receptoru je cytoplazmatický
N-konec obsahující repetice ankyrinových domén. Na C-konci receptoru není zatím predikována žádná konzervovaná doména, ale vzhledem k tomu, že tato èást proteinu obsahuje
znaèné množství kladnì nabitých aminokyselinových zbytkù
(27 u lidského ortologu), lze se domnívat, že nìkteré z nich
se budou podílet na modulaci receptoru, nebo na interakci
s negativnì nabitými molekulami nebo rezidui ve svém okolí.
Zatím ne pøíliš èetné strukturálnì-funkèní studie postupnì ukazují, že homologie, která existuje mezi nejblíže pøíbuznými TRP kanály, nemusí nutnì znamenat analogii v mechanizmech pøevodu jednotlivých aktivaèních signálù nebo v mechanizmech otevírání/zavírání (vrátkování neboli gating) iontového kanálu (Latorre, 2009). Zatímco ve vrátkování TRPV1
kanálu hrají hlavní úlohu dva hydrofobní aminokyselinové
BOLEST  ROÈNÍK 13  2010  ÈÍSLO 3
zbytky v intracelulární èásti pórové domény (Salazar et al.,
2009; Sušánková et al., 2007), rozhodující úlohu v procesu
otevírání a zavírání póru TRPA1 iontového kanálu má lokální flexibilita prolinového zbytku uprostøed 6. transmembránové domény (Benedikt et al., 2009).
Modulace úèinnosti transdukèního pøevodu TRPA1
kanálem pøi zánìtu
Za souèasného stavu poznání je obtížné pøedvídat, do
jaké míry se TRPA1 iontový kanál podílí na nocicepci a na
vzniku chronické bolesti. Lze však nespornì konstatovat, že
TRPA1 receptory, jež jsou souèástí plazmatických membrán
primárních polymodálních nociceptorù, jsou specificky aktivovány podnìty rùzných modalit, které u lidí vyvolávají bolest. Vyøazení jejich funkèního genu u experimentálních zvíøat snižuje vnímání tepelných, mechanických a chemických
podnìtù (Bautista et al., 2006; Kwan et al., 2006).
Bradykinin se váže na receptor typu B2, metabotropní receptor spojený s G proteiny. Tím se aktivuje enzym fosfolipáza C (PLC), která z vnitøního listu plazmatické membrány hydrolyzuje fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfát (PIP2), èímž se
spouští jedna z významných intracelulárních kaskád dùležitých pro modulaci aktivity (nejen) TRPA1 receptoru. Je zajímavé, že TRPA1 receptor pro svou funkci vyžaduje bazální
aktivitu PLC, což by mohlo znamenat, že pro jeho aktivitu
je nezbytná pøesnì definovaná hladina fosfoinozitidù. Tyto
membránové lipidy tvoøí pouze 1–5 % lipidù vnitøní strany
plazmatické membrány, pøesto jsou významné pro svoji signální a modulaèní úlohu (Rohacs, 2009). Pøedpokládá se,
83
Pøehledné èlánky
Obrázek 4: Možné mechanizmy modulace TRPA1 kanálu fosfatidylinozitol 4,5-bisfosfátem (PIP2), vápenatými ionty a kalmodulinem. (A) Schematické znázornìní modulace kationtového kanálu interagujícího s membránovým PIP2. Procházející ionty vápníku aktivují enzym PLC, který hydrolyzuje PIP2 (èervenì oznaèené záporné náboje). Snížení koncentrace PIP2 oslabuje interakci s kladnì nabitými místy (modøe oznaèené kladné náboje) na receptoru a uzavírá iontový kanál. V dolní èásti panelu je zobrazena molekula kalmodulinu s vyznaèenými ètyømi vazebnými místy pro ionty vápníku, jejichž vazba zmìní konformaci kalmodulinu. Ca2+ kalmodulinový komplex kompetuje o vazebné místo pro
PIP2, což zpùsobí uzavírání iontového kanálu. (B) Membránové proudy snímané z buòky HEK293T exprimující lidský TRPA1 receptor souèasnì s draslíkovým iontovým kanálem (Kir 2.1), jehož aktivita závisí na koncentraci membránového PIP2. Draslíkové kanály jsou na negativním membránovém potenciálu trvale otevøené, aplikace vysoké koncentrace draselných iontù (doba aplikace vyznaèena nad záznamem èernou èarou) vyvolá dovnitø buòky smìøující kationtový proud, jehož amplituda slouží jako marker (znaèka) hladiny [PIP2]. Po aplikaci allylisothiokyanátu (AITC) je amplituda proudových odpovìdí nesených draslíkem mnohem nižší, což svìdèí o vyèerpání membránového [PIP2].
(C) Membránové proudy snímané v podobném uspoøádání jako v (B). Odpovìdi byly opakovanì vyvolány syntetickým aktivátorem TRPA1 receptoru URB597 za souèasného monitorování hladiny [PIP2] opakovanými aplikacemi zvýšené koncentrace draselných iontù. Poté byla pøidána látka fenylarsinoxid (PAO), která inhibuje všechny izoformy fosfatidylinozitol 4-kinázy, enzymu, jenž katalyzuje první krok syntézy PIP2
z fosfatidylinozitolu. Pøestože cílem bylo zjistit úèinek vyèerpání [PIP2], v záznamu je patrné, že sama látka PAO aktivuje TRPA1 kanály, což
brání jednoznaèné interpretaci úèinku. Záznamy B a C upraveny podle [Samad A et al., Sixth Conference of the Czech Neuroscience Society.
Prague, Czech Republic; 2007].
že PIP2 mùže interagovat s bazickými èástmi proteinù (lysin,
arginin) elektrostaticky díky svým tøem fosfátovým skupinám,
které pøi pH = 7 udìlují PIP2 celkový náboj -4. Nepøímá regulace pomocí PIP2 se také mùže uplatòovat u TRP receptorù
v souvislosti s kalmodulinem, negativnì nabitým cytozolickým proteinem, který je v hojné míøe pøítomný ve všech eukaryotických buòkách (obr. 4A).
Zatím nevíme, s jakou mìrou specifiènosti ovlivòují lipidy plazmatické membrány aktivitu TRPA1 receptoru a jakou úlohu v jeho modulaci sehrává membránový PIP2. Studium vlivu membránových fosfoinozitidù je obtížné pøedevším proto, že látky bìžnì používané k modifikaci koncentrace PIP2 v plazmatické membránì navíc samy o sobì ovlivòují aktivitu TRPA1 (obr. 4B a C). Prokazatelná distribuce
TRPA1 proteinu nejen v periferních zakonèeních senzorických neuronù, ale také v keratinocytech, však svìdèí o velmi pravdìpodobné bezprostøední roli TRPA1 kanálu v mechano- a termotransdukèních systémech, ve kterých zcela jis84
tì budou deformace nebo teplotní zmìny pøímo pùsobit na
biofyzikální vlastnosti plazmatické membrány.
Souèasné smìry výzkumu receptorù se specifickou
úlohou ve fyziologii bolesti
TRPA1 hraje u savcù úlohu polymodálního receptoru
úèastnícího se pøevodu podnìtù ohrožujících integritu organizmu na impulzní aktivitu, která vyvolává bolest. Studie publikované v posledních deseti letech prokazují, že odstranìní genu pro expresi jednotlivých transdukèních TRP proteinù odstraòuje u celého organizmu vždy jen malou èást nocicepèní reakce. Je tedy zøejmé, že pro pøevod bolestivých
podnìtù musí být zapojena celá soustava specifických receptorù, jejichž aktivita pøispívá k detekci bolestivých podnìtù
rùzných modalit a rùzných intenzit a které se vzájemnì významnì ovlivòují. TRPA1 receptor je pøevážnì exprimován
v buòkách ganglií zadních koøenù míšních a v trigeminálních
gangliích, v malé míøe však byl funkèní receptor nalezen také
BOLEST  ROÈNÍK 13  2010  ÈÍSLO 3
Podìkování: Práce byla podpoøena granty MŠMT (1M0517,
LC 554 a Výzkumným zámìrem MSM 0021620835), grantem GAUK (43-259 052), Grantovou agenturou Èeské republiky (305/09/0081) a Výzkumným projektem AV ÈR (AV0Z
50110509).
Literatura:
1. Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A. Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron. 2004;41:849-57.
2. Banke TG, Chaplan SR, Wickenden AD. Dynamic changes in the TRPA1
selectivity filter lead to progressive but reversible pore dilation. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;298:C1457-68.
3. Baraldi PG, Preti D, Materazzi S, Geppetti P. Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) Channel as Emerging Target for Novel Analgesics
and Anti-Inflammatory Agents. J Med Chem. 2010;53:5085-107.
13. Karashima Y, Talavera K, Everaerts W, Janssens A, Kwan KY, Vennekens R, Nilius B, Voets T. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:1273-8.
14. Kwan KY, Allchorne AJ, Vollrath MA, Christensen AP, Zhang DS, Woolf
CJ, Corey DP. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 2006;50:277-89.
15. Kwan KY, Glazer JM, Corey DP, Rice FL, Stucky CL. TRPA1 modulates mechanotransduction in cutaneous sensory neurons. J Neurosci.
2009;29:4808-19.
16. Latorre R. Perspectives on TRP channel structure and the TRPA1 puzzle. J Gen Physiol. 2009;133:227-9.
17. Macpherson LJ, Hwang SW, Miyamoto T, Dubin AE, Patapoutian A,
Story GM. More than cool: promiscuous relationships of menthol and other
sensory compounds. Mol Cell Neurosci .2006;32:335-43.
18. Nagata K, Duggan A, Kumar G, Garcia-Anoveros J. Nociceptor and
hair cell transducer properties of TRPA1, a channel for pain and hearing. J
Neurosci. 2005;25:4052-61.
19. Nilius B, Owsianik G, Voets T, Peters JA. Transient receptor potential
cation channels in disease. Physiol Rev. 2007;87:165-217.
20. Ramsey IS, Delling M, Clapham DE. An introduction to TRP channels.
Annu Rev Physiol. 2006;68:619-47.
21. Rohacs T. Phosphoinositide regulation of non-canonical transient receptor potential channels. Cell Calcium. 2009;45:554-65.
22. Salazar H, Jara-Oseguera A, Hernandez-Garcia E, Llorente I, Arias O,
II, Soriano-Garcia M, Islas LD, Rosenbaum T. Structural determinants of
gating in the TRPV1 channel. Nat Struct Mol Biol. 2009;16:704-10.
23. Sawada Y, Hosokawa H, Hori A, Matsumura K, Kobayashi S. Cold
sensitivity of recombinant TRPA1 channels. Brain Res. 2007;1160:39-46.
4. Bautista DM, Jordt SE, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, Poblete J, Yamoah EN, Basbaum AI, Julius D. TRPA1 mediates the inflammatory actions
of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 2006;124:1269-82.
24. Staruschenko A, Jeske NA, Akopian AN. Contribution of TRPV1-TRPA1 interaction to the single channel properties of the TRPA1 channel. J
Biol Chem. 2010;285:15167-77.
5. Benedikt J, Samad A, Ettrich R, Teisinger J, Vlachova V. Essential role for
the putative S6 inner pore region in the activation gating of the human TRPA1
channel. Biochim Biophys Acta Mol Cell Research. 2009;1793:1279-88.
25. Stokes A, Wakano C, Koblan-Huberson M, Adra CN, Fleig A, Turner H.
TRPA1 is a substrate for de-ubiquitination by the tumor suppressor CYLD.
Cell Signal. 2006;18:1584-94.
6. Boukalova S, Vlachova V. TRP receptory jako transdukèní molekuly nociceptivních podnìtù. Bolest. 2008;4:194-206.
26. Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, Hricik TR, Earley TJ, Hergarden AC, Andersson DA, Hwang SW, McIntyre P, Jegla T,
Bevan S, Patapoutian A. ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell. 2003;112:819-29.
7. Clapham DE, Nilius B, Owsianik G. David E. Clapham, Bernd Nilius,
Grzegorz Owsianik. Transient Receptor Potential Channels. Last modified
on 2010-04-07. Accessed on 2010-07-20. IUPHAR database (IUPHAR-DB),
http://www.iuphar-db.org/DATABASE/FamilyMenuForward?familyId=78.
8. Corey DP, Garcia-Anoveros J, Holt JR, Kwan KY, Lin SY, Vollrath MA,
Amalfitano A, Cheung EL, Derfler BH, Duggan A, Geleoc GS, Gray PA,
Hoffman MP, Rehm HL, Tamasauskas D, Zhang DS. TRPA1 is a candidate for the mechanosensitive transduction channel of vertebrate hair cells.
Nature 2004;432:723-730.
9. Gaudet R. A primer on ankyrin repeat function in TRP channels and beyond. Mol Biosyst. 2008;4:372-9.
10. Chen J, Kim D, Bianchi BR, Cavanaugh EJ, Faltynek CR, Kym PR,
Reilly RM. Pore dilation occurs in TRPA1 but not in TRPM8 channels.
Mol Pain. 2009;5:3.
11. Jaquemar D, Schenker T, Trueb B. An ankyrin-like protein with transmembrane domains is specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts. J Biol Chem. 1999;274:7325-33.
12. Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Hogestatt ED, Meng ID, Julius D. Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature. 2004;427:260-5.
BOLEST  ROÈNÍK 13  2010  ÈÍSLO 3
27. Susankova K, Ettrich R, Vyklicky L, Teisinger J, Vlachova V. Contribution of the putative inner-pore region to the gating of the transient receptor
potential vanilloid subtype 1 channel (TRPV1). J Neurosci. 2007;27:7578-85.
28. Wang YY, Chang RB, Waters HN, McKemy DD, Liman ER. The nociceptor ion channel TRPA1 is potentiated and inactivated by permeating
calcium ions. J Biol Chem. 2008;283:32691-703.
RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc.
Oddìlení bunìèné neurofyziologie
Fyziologický ústav AV ÈR, v.v.i.
Vídeòská 1083
142 20 Praha 4
E-mail: [email protected]
Do redakce pøišlo: 17. 6. 2010
K publikaci pøijato: 10. 8. 2010
85
Pøehledné èlánky
v tenkém a tlustém støevì, kosterním svalstvu, srdci, mozku, plicích a nìkterých èástech imunitního systému (Stokes
et al., 2006). Zùstává prozatím nezodpovìzenou otázkou,
zda TRPA1 zodpovídá za pøevod bolestivých mechanických
a chladových podnìtù in vivo, nebo zda se uplatòuje pøi vzniku mechanické hyperalgezie èi alodynie, tj. bolesti vyvolané
dotykem nebo nepatrným tlakem v podmínkách zánìtu nebo
‘bolestivého‘ chladu. Urèitým pøehodnocením procházejí i dosud zažité pøedstavy o mechanizmech pùsobení látek s analgetickým pùsobením, o jejichž úèincích jsou pøesvìdèivé klinické èi empirické zkušenosti, ale dosud chybí experimentální dùkazy o molekulární podstatì jejich pùsobení.