Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz

1052.
Regular Article
Biol. Pharm. Bull. 36(7) 1052-1059 (2013)
Vol. 36, No. 7
Antiobézní účinek ionizované zásadité vody u myší s obezitou
vyvolanou vysokotučnou dietou
Rosa Mistica Coles Ignacio1), Tae-Young Kang2), Cheol-Su Kim3), Soo-Ki Kim3), Young-Chul Yang4),
Joon-Hyung Sohn5), Kyu-Jae Lee1) 6)
Není jasné, zda ionizovaná zásaditá voda (IZV) má či nemá příznivý účinek proti obezitě. Tato studie si
klade za cíl prokázat pozitivní vliv IZV na obezitu vyvolanou vysokotučnou (HF) stravou (DIO) u myší typu
C57BL/6. Za tímto účelem byla obezita vyvolána podáváním vysokotučného krmiva (w/w 45% tuku)
samcům myší typu C57BL/6 po dobu 12 týdnů. Poté byla zvířatům podávána buď ionizovaná zásaditá voda
(IZV), nebo obyčejná kohoutková voda. Dále byla hodnocena míra adipozity a určeny parametry obezity
vyvolané vysokotučnou stravou: klinicko-patologické parametry, biochemická měření, histopatologická
analýza jater, exprese cholesterolu metabolických genů v játrech a hladiny adipokinu a cytokinu v krevním
séru. Zjistili jsme, že u myší krmených ionizovanou zásaditou vodou se adipozita výrazně zlepšila: byl
upraven přírůstek tělesné váhy, bylo dosaženo sníženého hromadění tuků v nadvarleti a tuky v játrech ve
srovnání s kontrolní skupinou. Podobně, IZV způsobila úpravu hladiny adiponektinu a leptinu. Navíc
nastala upregulace exprese mediátorové RNA (mRNA) u cytochromu P450 (CYP)7A1. Stručně řečeno, naše
data ukazují, že podávání IZV omezuje vývoj obezity vyvolané vysokotučnou stravou (HF-DIO) u myší.
Toto je první písemná zpráva o antiobézním účinku IZV, což klinicky znamená bezpečnější kapalný lék pro
kontrolu obezity.
Klíčová slova Ionizovaná zásaditá voda; adiponektin;
cytokin;
Obezita dosáhla globálního stavu epidemie. V rozvinutých
a rozvojových zemí je obezita uváděna jako šestý
nejvýznamnější rizikový faktor, který přispívá k celkové
zátěži chronických onemocnění.1) Čtyřicet tři milionů dětí, z
nichž 82% pochází z rozvojových zemí, je postiženo
obezitou.2) Světová zdravotnická organizace nedávno uvedla,
že na světě žije více než 1 miliarda lidí s nadváhou, z nichž
500 milionů trpí obezitou.3) Obezita představuje významný
problém veřejného zdraví, protože je známo, že je rozhodně
spojena se zvýšeným rizikem některých chronických
onemocnění, jako jsou kardiovaskulární choroby, hypertenze,
diabetes druhého typu a steatóza jater.3-5) Nadměrný příjem
tuků v potravě ovlivňuje rozvoj obezity6), která je
charakterizována akumulací tělesných tuků vyznačující se
abnormálním zvýšením tukové tkáně a hmotnosti jaterních
tuků (adipozita), dysregulovanou úrovní adipokinů, a
nerovnováhou mezi prozánětlivými a protizánětlivými
cytokiny.7-9) Složitost těchto patogenetických mechanismů
obezity představuje výzvu k rozvoji účinné terapie. V této
souvislosti došlo k rostoucímu zájmu o potřebu nových
léčebných postupů, které se přímo zabývají těmito mechanismy.
Z několika takových léčebných postupů jsme poprvé představili
ionizovanou zásaditou vodu (IZV) pro kontrolu obezity, a to u
obezity vyvolané vysokotučnou (HF) stravou (DIO) u myší
populace.
IZV se týká elektrolyzované vody vyrobené z minerálních
látek, jako je hořčík a vápník, která je charakterizována
přesyceným vodíkem o vysoké hodnotě pH, a záporným
oxidačně-redukčním potenciálem. Tato užitková voda
bohatá na vodík byla představena jako proveditelná léčebná
strategie pro podporu zdraví a pro prevenci nemocí.10-12)
Naše předchozí studie prokázaly, že příjem IZV snižuje
hladiny triglyceridů v krevním séru, jakož i hladiny
celkového cholesterolu a glukózy v krvi u myší populace
typu OLETF. 13,14) Důkazy získané při chovných
experimentech ukazují, že voda s vysokým obsahem vodíku
působí jako zachycovač aktivních forem kyslíku, chrání
DNA před oxidačním poškozením,10), a podporuje
adipozita;
tuk nadvarlete;
cholesterol 7α-hydroxyláza
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
1) Department of Environmental Medical Biology, Wonju College of Medicine, Yonsei University 2)
Department of Rheumatology, Wonju College of Medicine, Yonsei University 3) Department of
Microbiology, Wonju College of Medicine, Yonsei University 4) Department of Anatomy, Wonju College
of Medicine, Yonsei University 5) Institute of Lifestyle Medicine, Wonju College of Medicine, Yonsei
University 6) Institute for Poverty Alleviation and International Development, Yonsei University Wonju
Campus
metabolismus.15) Dále se ukázalo, že voda s vysokým
obsahem vodíku má prospěšné účinky při prevenci
civilizačních chorob, jako je diabetes 2. typu a při odolnosti
proti inzulínu , 16) a zánětu jater.17) Vzhledem k tomu, že
voda bohatá na vodík je generována reakcí kovového
hořčíku s vodou, došli jsme k závěru, že IZV s vysokým
obsahem vodíku produkovaná při stejné reakci by byla
účinné proti obezitě. Za účelem vyřešení této otázky jsme
přizpůsobili model obezity myší vyvolané vysokotučnou
stravou (HF DIO) napodobením patogeneze lidské obezity
18)
, výsledkem čehož byl průzkum antiobézního účinku IZV
pomocí klinicko-patologických parametrů, biochemických
měření, histopatologického vyšetření jater, exprese
cholesterolu metabolických genů v játrech, a hladiny
adipokinu a cytokinu.
MATERIÁLY A METODY
Zvířata a jejich péče Pět týdnů staří samci myší typu
C57BL/6 (n=30) o hmotnosti 20±2 g byly zakoupeny u Orient
Bio Inc. (Seongnam, South Korea) a byly chováni při teplotě
22±2°C, vlhkosti 40–60% a při fotoperiodě světlo/tma 12 : 12 h.
Myši byly krmeny laboratorní stravou po dobu jednoho týdne
k zajištění stabilních podmínek pro metabolismus a byly
náhodně přiřazeny do jedné ze tří dietních skupin: normální
skupina (NC+TW) krmená stravou s normální hladinou tuků
(10% tučnost; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, U.S.A.)
a kohoutkovou vodou, kontrolní skupina (HFD+TW) krmená
vysokotučnou stravou (45% tučnost; Research Diets Inc., New
Brunswick, NJ, U.S.A.) a kohoutkovou vodou, a experimentální
skupina (HFD+IZV) krmená vysokotučnou stravou a
ionizovanou zásaditou vodu IZV po dobu 12 týdnů. Kohoutková
i ionizovaná zásaditá voda byla poskytována denně. Vitamínové
i minerální složky těchto dvou druhů stravy byly srovnatelné.
Příjem stravy a tekutin byly měřeny denně a tělesná hmotnost
byla monitorována týdně po dobu experimentu. Na konci
experimentální doby byl měřen tuk v nadvarleti. Smlouva o užití
Obr. 1.
Ronkonkoma, NY, U.S.A.) ve 100 mL 100%
propylenglykolu. K podbarvení preparátu bylo použit
roztok Harris hematoxylin po dobu 2–3 s, s následným
propláchnutím kohoutkovou vodou. Zabarvené tkáně byly
namáčeny 2–3 krát do 1% roztoku HCl a propláchnuty
destilovanou vodou, poté umístěny do glycerinového želé.
Řezy byly zobrazeny pod světelným mikroskopem Motic
BA 3000 (Motic Incorporation Ltd., China) při
400-násobném zvětšení, přičemž bylo nastaveno 10
polí/myš při stanovení počtu kapek. Řezy zabarvené
barvivem Oil Red O byly kvantifikovány a analyzovány
s použitím počítačového obrazového analyzátoru (Soft
Imaging System 4; Soft Imaging System Corp., Munster,
Germany). Pro měření velikosti tukových kapek bylo
náhodně vybráno 30 kapek z 10 různých polí každé jaterní
tkáně myši, což dohromady představovalo 300 tukových
kapek pro každou skupinu (n=10).
PCR - Analýza pomocí polymerázové řetězové reakce
Úplná RNA byla izolována z jater pomocí zařízení RNeasy
Plus Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, U.S.A.), podle pokynů
výrobce. Komplementární DNA (cDNA) byla vyrobena
pomocí zařízení QuantiTect reverse transcription kit (Qiagen,
Valencia, CA, U.S.A.) reverzní transkripcí celkově získané
RNA. Analýza PCR byla provedena v reálném čase s
použitím systému 7900HT Fast Real-Time PCR System
s použitím činidla SYBR Green PCR Master Mix podle
pokynů výrobce (Applied Biosystem Inc., Forest City, CA,
U.S.A.). Byly použity následující sekvence primerů:
Účinek IZV na tělesnou hmotnost (A) a na hmotnost tuku v nadvarleti (B)
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
zvířat a o jejich péči byla schválena organizací Institutional
Animal Care and Use Committee (IACUC) of Wonju College of
Medicine, Yonsei University.
Produkce a chemické vlastnosti ionizované zásadité
vody IZV byla vyráběna zařízením pro kontinuální elektrolýzu
(HDr Co., Ltd., Korea), u které je jako hlavní zdroj použita
kohoutková voda. IZV byla připravena fyzikální filtrací
s následnou elektrolýzou a shromážděna v článcích vybavených
katodovými titanovými elektrodami potaženými platinou
(0.9±0.1 A při 2.5±0.3 kilogram-síla/minuta (kgf/min)). IZV
byla udržována při hodnotě pH 9.5±0.3 a oxidačně-redukčním
potenciálu −325.0±20.5 mV. Elektrická vodivost IZV byla
223±5.5 µS, hodnota rozpuštěného vodíku 0.1 ppm a hodnota
rozpuštěného kyslíku 4.82±0.11 mg/L. Pro krmení tekutinou
byly použity skleněné láhve. IZV byla vyměňována dvakrát
denně za účelem udržení jejích konstantních vlastností.
Kapková analýza obsahu tuku pomocí hydrofobního
barviva Oil Red O Jaterní tkáň byla nasekaná při
optimální teplotě do 10 µm plátků, řezy byly poté
umístěny do kryostatických průhledných podložních
sklíček. Tkáně byly ponechány sušení po dobu 1h a
namočeny do destilované vody po dobu 5 min, poté
ponořeny do neředěného roztoku propylenglykolu po dobu
2 min. Tkáně byly poté mořeny za použití barviva Oil Red
O v pracovním roztoku po dobu 1 h, namočeny v 85%
roztoku propylenglykolu během 1 min a propláchnuty
destilovanou vodou. Roztok barviva Oil Red O byl
připraven rozpuštěním 500 mg prášku Oil Red O (Sigma,
Skupinám s vysokotučnou dietou (HFD) byla podávána buď kohoutková voda (TW) nebo ionizovaná zásaditá voda (ARW), přičemž byla měřena spotřeba vody (C) a potravy
(D) po dobu 12 týdnů. Skupině s normální dietou a kohoutkovou vodou (NC+TW) byla podávána normální strava a kohoutková voda. Data jsou vyjádřena jako průměr
±směrodatná odchylka, n=10. † p<0.01 ve srovnání se skupinou s vysokotučnou dietou a kohoutkovou vodou (HFD+TW) (analýza ANOVA s opakovanými měřeními
následována Tukeyho testem), a * p<0.05, ** p<0.01, a *** p<0.001 indikují významné rozdíly při použití analýzy ANOVA s Tukeyho testem.
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
Obr. 2. Počet (A) a velikost (B) tukových kapek ve tkáních jater u myší s obezitou vyvolanou vysokotučnou dietou napájených ionizovanou zásaditou vodou
(ARW) a kohoutkovou vodou (TW) po dobu 12 týdnů
NC, normální strava; HFD, vysokotučná dieta. Data jsou vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka, n=10. ** p<0.01 vs. HFD+TW testovány analýzou ANOVA. Tukeyho test
proveden v rámci post-hoc testů. (C) Světelné mikrosnímky jater zabarvených barvivem Oil red O, 400násobné zvětšení. U skupiny HFD+TW byla detekována velká tuková vakuola
vyplňující cytoplazmu hepatocytu vytlačující jádro; u skupiny HFD+IZV s obsahem malých tukových kapek v cytoplazmě hepatocytu s centrálním umístěním jádra. Měřítko
představuje rozměr 100 µm.
cytochrome
P450
(CYP)7A1,
dopředná
5′-AGA GCT TGA AGC ACA AGA AC-3′
a
zpětná
5′-ATG TCA TCA AAG GTG GAG AG-3′
a
3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reduktáza (HMG-CoA
reduktáza),
dopředná
5′-GGA GCC TCT TAG TGA TTG TG-3′
a
zpětná
5′-GGT ACT GGC TGA AAA GTC AC-3′. Tyto primery
vedly na výsledné velikosti 101 a 100 bázových párů
reduktázy CYP7A1, resp. HMG-CoA. Koncentrace každé
mediátorové RNA (mRNA) byla normalizována za použití
provozního genu (tzv. house-keeping gen) β-actin, dopředné
sekvence 5′-ACG TTG ACA TCC GTA AAG AC-3′ a zpětné
5′-GCA GTA ATC TCC TTC TGC AT-3′ se 100 bázovými
páry coby vnitřní standard. Všechny tkáně byly zpracovány ve
384-jamkových titračních destičkách a všechny reakce byly
provedeny ve 3 provedeních. Relativní mRNA exprese byly
vypočteny jako průměrná exprese u myší v normální skupině,
s použitím metody 2−ΔΔCT a referenčního genu β-actin.
Analýza krevních vzorků
Za použití automatizovaného krevního analyzátoru
(HEMAVET HV950 FS, Drew Scientific Inc., Dallas, Texas,
U.S.A.) byly určeny následující parametry: celkový počet
bílých krvinek (WBC) včetně určení počtu jejich derivátů jako
jsou neutrofilní granulocyty, lymfocyty, monocyty, eozinofilní
a bazofilní granulocyty.
Adipokiny a cytokiny v krevním séru Byly zkoumány
adipokiny a cytokiny vylučovány do krve. Za použití přístroje
Multiplex kit (Bio-Rad, San Diego, CA, U.S.A.) byly podle
pokynů výrobce určeny následující parametry v krevním séru:
adiponektin, leptin, interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-10 a Tumor
nekrotizující faktor alfa (TNF)-α. Standardní křivky pro
všechny adipokiny a cytokiny byly generovány pomocí
referenčních koncentrací obsažených v kitu použitého zařízení.
Mikrotitrační destička byla vložena do zařízení Luminex 200
Bio-Plex Instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.). Surová
data získaná fluorescencí byla softwarově zpracována
s použitím 5-parametrového logistického modelu.
Statistická analýza Datové hodnoty byly vyjádřeny jako
průměr ± směrodatná odchylka. Průměrné hodnoty ve
skupinách byly analyzovány a porovnávány pomocí
jednofaktorové analýzy rozptylu (ANOVA) a navazující
metodou mnohonásobného porovnávání (Tukeyho test) s
použitím sw prostředků nástroje GraphPad Prism verze 5.0
(GraphPad Software, La Jolla, CA, U.S.A.). ANOVA
s opakovanými měřeními a návazným Tukeyho testem byly
nasazeny pro testování účinků ionizované zásadité vody na
tělesnou hmotnost. Hladiny významnosti byly uvažovány při
hodnotách p<0.05, p<0.01, a p<0.001.
VÝSLEDKY
Tělesná hmotnost a hmotnost tuku v nadvarleti Obrázky
Obr. 1A, B ukazují změny tělesné hmotnosti a hmotnosti tuku
v nadvarleti mezi skupinami. Po 7 týdnech přijímání
ionizované zásadité vody (IZV) vykazovala skupina
s vysokotučnou dietou s příjmem IZV (HFD+IZV) významné
snížení tělesné hmotnosti v porovnání s kontrolní skupinou
(p<0.01), viz Obr. 1A. Zároveň se v této experimentální
skupině (HFD+IZV) významně snížila hmotnost tuku
v nadvarleti v porovnání s kontrolní skupinou s vysokotučnou
dietou a kohoutkovou vodou (HFD+TW) (p<0.05), viz Obr.
1B. Skupiny s vysokotučnou dietou (HFD) vykazovaly
podobný trend ve spotřebě potravy a vody, viz Obr. 1C, D.
Kapková tuková analýza ve tkáních jater Zabarvení jater
barvivem Oil red O vykázalo značný procentuální pokles
(p<0.01) při usazování tukových kapek, a statisticky menší
velikost (p<0.01) kapek u myší napájených IZV ve srovnání
s kontrolní skupinou (HFD+TW), viz Obr. 2A. Experimentální
skupina (HFD+TW) vykázala makrovezikulární steatózu
s velkou tukovou vakuolou vyplňující cytoplazmu hepatocytu
odtlačující jádro na okraj, viz Obr. 2B. Naproti tomu, u
experimentální skupiny HFD+IZV měla jaterní tkáň pouze
Hladiny adipokinů a cytokinů Byly analyzovány
koncentrace adipokinů v krevním séru vylučovanými hlavně
tukovou tkání, jako je adiponektin a leptin. Zjistili jsme, že
hladina adiponektinu u skupiny krmené IZV byla významně
nižší (p<0.05) než u kontrolní skupiny (HFD+TW), viz Obr.
4A. U skupiny HFD+TW nastalo významné zvýšení
koncentrace leptinu (p<0.01), stejně jako u skupiny
HFD+IZV (p<0.05) ve srovnání se skupinou s normální
stravou (NC+TW).
Souběžně jsme
zkontrolovali
prozánětlivé a protizánětlivé cytokiny (IL-1β, IL-6, IL-10 a
TNF-α). Celkem došlo ke zvýšení koncentrace u IL-1β, IL-6,
IL-10 a TNF-α ve skupině krmené normální stravou ve
srovaní se skupinami s vysokotučnou dietou (HF). U Skupiny
HFD+TW došlo ke zřetelnému snížení koncentrace IL-10 a
TNF-α (p<0.01) ve srovnání se skupinou HFD+IZV
(p<0.05), viz Obr. 4C–F.
DISKUSE
Obr. 3. Účinek zásadité redukované vody (ARW) na Cytochrome P450
(CYP)7A1 a 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reduktázu (HMG-CoA
reduktázu) u mRNA exprese v jaterní tkáni
Exprese CYP7A1 (A) a HMG-CoA reduktázy (B) byly měřeny polymerázovou
řetězovou reakcí (PCR) v reálném čase, jak je popsáno v odstavci Materiály a
metody. Poměrové ukazatele byly vypočteny porovnáním se střední hodnotou
exprese u skupiny s normální dietou (NC+TW). Všechny geny byly normalizovány
vzhledem k endogennímu kontrolnímu genu β-actin. Data jsou vyjádřena jako
průměr ± směrodatná odchylka, n=10. ** p<0.01 při porovnání se skupinou
s vysokotučnou stravou a kohoutkovou vodou (HFD+TW) testovanou pomocí
analýzy ANOVA. Tukeyho test byl použit pro post-hoc testy.
Bílé krvinky a jejich deriváty Celková koncentrace
bílých krvinek (WBC) u skupiny HFD+IZV byla
významně vyšší, než u skupiny HFD+TW (p<0.05) jak je
zřejmé ze zvýšených hodnot neutrofilů a lymfocytů, viz
Tabulka 1.
Tabulka 1.
Naše výsledky ukazují, že příjem IZV tlumí progresi
obezity vyvolané vysokotučnou dietou prostřednictvím
zmírnění adipozity, úpravou hladinu adipokinů a zánětlivých
cytokinů, a ovlivněním homeostázy cholesterolu v játrech.
Naše hypotéza je taková, že IZV může regulovat obezitu
vyvolanou stravou, hromadění tuku, napravuje cytokinovou
nerovnováhu a zlepšuje katabolismus cholesterolu.
Za účelem ověření jsme nejprve zkontrolovali
klinicko-patologické důkazy vztahující se k adipozitě.
Neočekávaně jsme zjistili, že ionizovaná zásaditá voda by
mohla snížit abnormálně zvýšenou tělesnou hmotnost a
hmotnost tuku nadvarlete, viz Obr. 1. Následně jsme
vyšetřovali hepatickou adipozitu pomocí barviva Oil Red O.
Při barvení pomocí Oil Red O vyšší procento a větší velikost
kapiček tuku ukazuje, že více tuků je přítomno u buněk
vyživovaných při vysokotučné dietě. Toto zvýšené procento
tukových kapiček by mohlo signalizovat zvýšené vypuzování
lipidů, tzv. efflux.19) V souladu se snížením tělesné hmotnosti a
hmotnosti tuku v nadvarleti, u myší napájených IZV se
významně snížil podíl a velikost kapiček tuku v játrech. Tento
dekrementační efekt silně naznačuje jedinečnou vlastnost IZV
působit proti hromadění tuku v játrech. Kromě toho, krevní
tlak u myší krmených IZV byl v blízkosti hodnot normální
skupiny (data nejsou ukázána). Toto pozitivum IZV může být
částečně podporováno předchozími výsledky, že u léčby
vodou bohatou na vodík s nízkým oxidačně-redukčním
potenciálem a vysokou hodnotou pH je prokázána významná
regulace tělesných tuků a tělesné hmotnosti, stejně jako
klesající hodnoty glukózy, inzulínu a triglyceridů u
diabetických zvířat . 20)
Celkové počty bílých krvinek (WBC) a jejich derivátů
Počty bílých krvinek a derivátů
NC+TW
HFD+TW
9
Celkový počet, ×10 /L
8.22±2.18
5.25±1.45
8.02±2.71*
Neutrofily, ×109/L
2.15±0.82
0.97±0.29
1.80±0.63**
Lymfocyty, ×109/L
5.82±1.87
4.11±1.15
5.89±2.19*
Monocyty, ×10 /L
0.19±0.07
0.14±0.05
0.24±0.14
Eosinofily, ×109/L
0.04±0.04
0.03±0.02
0.03±0.02
0.01±0.01
0.01±0.01
0.02±0.02
9
9
Bazofily, ×10 /L
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
malé tukové kapky s neporušeným jádrem uprostřed
hepatocytu, viz Obr. 2B.
mRNA exprese hepatické reduktázy CYP7A1 a
HMG-CoA Pro identifikaci vlivu IZV na cholesterolový
metabolismus v játrech jsme měřili mRNA expresi hepatických
reduktáz CYP7A1 a HMG-CoA zodpovědných za homeostázu
cholesterolu u metabolismu lipidů. Skupina HFD+IZV
vykázala značné zvýšení genové exprese cholesterol
7α-hydroxylázy (CYP7A1) v játrech (p<0.01) v porovnání se
skupinou HFD+TW, viz Obr. 3A. Dále u obou skupin
s vysokotučnou dietou (HF) nebyly prokázány žádné
významné rozdíly v expresi reduktázy HMG-CoA Obr. 3B.
HFD+IZV
Zkratky: NC, normální strava; HFD, vysokotučná dieta; TW, kohoutková voda; IZV, ionizovaná zásaditá voda. Data vyjádřena jako průměry±směrodatné odchylky, n=10.
*p<0.05, **p<0.01 vs. HFD+TW testovanou s použitím analýzy ANOVA a následným Tukeyho testem.
Vol. 36, No. 7
Obr. 4. Účinek IZV na adiponektin (A), leptin (B) a vybrané cytokiny jako IL-1β (C), IL-6 (D), IL-10 (E) a TNF-α (F) Koncentrace v krevním
séru, samci myší typu C57BL/6 s aplikovanými různými dietami po dobu 12 týdnů (NC+TW, normální strava+kohoutková voda; HFD+TW,
vysokotučná dieta+kohoutková voda; HFD+ARW, vysokotučná dieta+ionizovaná zásaditá voda)
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
1056
Byl použit systém Bio-Plex luminex s tzv. kuličkovými mikročipy, jak je popsáno v odstavci Materiály a Metody. Data jsou vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka,
n=10. * p<0.05, ** p<0.01 indikují významné rozdíly při testovaní analýzou ANOVA. Tukeyho test byl použit pro post-hoc testy.
Nakonec, za účelem určení vlivu IZV na metabolizmus
cholesterolu v játrech, jsme vybrali dva klíčové enzymy
CYP7A1 a HMG - CoA reduktázu; a porovnali jsme jejich
úrovně u myší v kontrolní skupině. Hodnota CYP7A1 byla
výrazně vyšší neuž u obézních myší napájených IZV, což
naznačuje, že IZV vyvolává vyšší rychlost katabolické reakce
u cholesterolu. Bylo dobře dokumentováno, že žlučová
kyselina syntetizována v lidských játrech je vysoce
korelována se signálními molekulami, které regulují
metabolismus lipidů a glukózy mající vliv na obezitu a jaterní
onemocnění.21,22) Konverze cholesterolu na žlučové kyseliny
je jednou z hlavních cest při odstraňování přebytku
cholesterolu v těle, k čemuž dochází výhradně v játrech.23)
Dále, gen CYP7A1 je klíčový regulační gen při biosyntéze
žlučové kyseliny, který kóduje enzym omezující rychlost
reakční cesty.24) V této souvislosti jsme zvláště prověřovali
jaterní genovou expresi CYP7A1 coby subjektu s hlavní
úlohou při biosyntéze žlučových kyselin. Předchozí studie
ukazuje, že zvýšená exprese CYP7A1 zlepšuje metabolické
syndromy, steatózu a odolnost proti inzulínu u myší.25)
Prostřednictvím inhibice glukoneogeneze a syntézy
triglyceridů, regulace produkce žlučových kyselin může
zmírnit nepříznivý vliv komplikací, které mohou vzniknout
kvůli
neregulované
glukóze
a
neregulovaným
triglyceridům.26) Naše data jsou silně podporovány
nedávnými studiemi, které ukazují, jak vyvolání genové
exprese u CYP7A1 zabraňuje obezitě vyvolané vysokotučnou
stravou, ztučnění jater a odolnosti proti inzulínu.25,27) Příjem
IZV zvýšil, i když nepodstatně, expresi HMG-CoA reduktázy,
o čemž si myslíme, že je v souladu s předchozími zjištěními,
že exprese hepatické HMG-CoA reduktázy je významně
down-regulována u myší s vysokotučnou dietou.28,29) Obecně
vzato tvrdíme, že příjem IZV může ovlivnit homeostázu
cholesterolu v játrech prostřednictvím regulace činnosti
CYP7A1.
Tuk hraje významnou roli u endokrinních a imunitních funkcí
prostřednictvím uvolňování adipokinů, jako je například
adiponektin a leptin, stejně jako zánětlivých cytokinů, jako je
TNF - α , IL - 1β a IL - 6. 30) Konkrétně jsou tyto cytokiny
hluboce spojeny s chronickými záněty související
s metabolickými poruchami. Jako taková je obezita
charakterizována nerovnováhou mezi adipokiny a cytokiny.
Naše předchozí studie ukazuje, že IZV zlepšuje poškození
pokožky způsobené zářením UVB prostřednictvím ovlivňování
rovnováhy mezi prozánětlivými a protizánětlivými cytokiny u
modelu poškození pokožky u zvířat.31) Pro další objasnění
účinků IZV na nerovnováhu mezi adipokiny a cytokiny u
myší s vysokotučnou dietou jsme nejdříve v krevním séru
vyšetřovali adipokiny (adiponektin a leptin) a cytokiny ( IL 1β , TNF - α , IL - 6 a IL - 10 ) implikované při obezitě.
Adipokiny jsou bioaktivní peptidy nebo proteiny vylučované
převážně tukovou tkání a jejich exprese jsou u obezity
oslabeny, jako v případě adiponektinu a leptinu.32) Zjistili jsme,
že obě úrovně adipokinů byly tak vysoké jako u ostatních
čtyřech úrovních cytokinů, což naznačuje typický profil
obezity doprovázené imunologickými poruchami.
Navíc, příjem IZV u myší s vysokotučnou dietou obnovil
úroveň adiponektinu zpět na základní úroveň u normální
skupiny (NC + TW). Adiponektin je hojně přítomný v plazmě,
a je známo, že moduluje metabolické procesy a zvyšuje
citlivost na inzulin prostřednictvím regulace metabolismu
glukózy, vyvolání oxidace mastných kyselin, a down-regulaci
a buněk s mírou dostatečnou pro narušení buněčných procesů.
Naše hypotéza je, že zmírnění účinku IZV u modelu obézních
myší lze alespoň částečně přičíst existenci rozpuštěného vodíku
v IZV. Za účelem odhalení hlubšího mechanismu na
imunologickou homeostázu by musely být provedeny další
studie zaměřené na zánětlivé signální dráhy a na produkci
reaktivních kyslíkových radikálů, protože obezita typově
souvisí s oxidačním stresem zapojeným do chronických zánětů.
Stručně řečeno, naše výsledky ukazují, že příjem IZV
utlumuje postup obezity vyvolané vysokotučnou dietou
prostřednictvím zmírnění adipozity, úpravy hladin adipokinů a
zánětlivých hladin cytokinů, a ovlivňováním homeostázy
cholesterolu v játrech. To je první písemná zpráva o
antiobézních účincích ionizované zásadité vody, která otevírá
příležitost pro rozvoj nových, bezpečných klinických léků pro
regulaci obezity.
Acknowledgment Tento výzkum byl podpořen
grantem uděleným národní výzkumnou nadací National
Research Foundation financovanou Korejskou vládou
(NRF-2010-413-B00024).
REFERENCES
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
triglyceridů.33,34) Adiponektin, který je produkován především
adipózní tkání, je down-regulován u subjektů s diabetem.35, 36)
Naopak, skupina HFD + TW vykazovala zvýšenou hladinu
adiponektinu ve srovnání s normální skupinou. To je v souladu
se skutečností, že abnormální zvýšení hladiny adiponektinu
vysoce koreluje s nástupem diabetu 1. typu u člověka, 37,38) a u
obezity u myší s vysokotučnou dietou. Dále jsme měřili hladiny
leptinu, tj. adipokinu fungujícího jako regulátor metabolismu.
Leptin je hluboce zapojen do regulace příjmu potravy,
energetického výdeje a metabolismu glukózy a lipidů.39, 40)
Vzhledem k tomu, koncentrace leptinu v krevním séru je
zvýšená u obézních jedinců v poměru ke hmotnosti tuku a
stupni adipozity, 41), vysoká úroveň leptinu v našem modelu u
myší s vysokotučnou stravou (HFD) potvrzuje proveditelnost
našeho modelu myší. To je jedním z indikátorů, že jsme
úspěšně vyvolali obezitu v našem modelu u myší. Kromě toho,
ve skupině HFD + TW se vyskytuje zvýšená hodnota leptinu ve
srovnání s mírným zvýšením ve skupině HFD + IZV. V tomto
ohledu je rozdíl v úrovních leptinu v myší napájených IZV
v souladu se sníženou adipozitou u tělesné hmotnosti a
hmotnosti tuku v nadvarleti.
Chcete-li dále vymezit potenciální účinek IZV na
imunologickou nerovnováhu vyvolanou obezitou, provedli jsme
profilaci prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů v krevním
séru pomocí systému Luminex s kuličkovými mikročipy,
známého pro svou vysokou citlivost a přesnost. Nižší úroveň
prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů v normální skupině
může být přičtena k regulačnímu zásahu adiponektinu, což
naznačuje, že vysokotučná dieta vyvolává imunitní dysregulaci.
Nicméně, skupina s IZV vykázala zvýšené hodnoty IL - 6 , IL 10 a TNF - α, stejně jako sníženou hladinu IL - 1β , i když
nevýrazně, viz Obr. 4C - F. Kumulativní výsledky ukazují, že
markery zánětu , jako jsou prozánětlivé cytokiny, jsou zvýšeny u
exprese nastávající při vysokotučné dietě.42) IL - 10 je důležitý
imunoregulační cytokin s více biologickými účinky, včetně
down-regulace zánětlivých projevů a normalizace imunitních
buněk jako jsou T-lymfocyty a B-lymfocyty, NK buňky a
granulocyty.31) IL-6 může fungovat jako protizánětlivý element,
vyznačující se tím, že inhibuje TNF – α vyvolanou
lipopolysacharidy a IL - 1 , 43) a snižuje expresi zánětlivých
signálních kaskád, které regulují oxidaci mastných kyselin v
podmínkách obezity /diabetes.44) Kromě toho, zvýšená sekrece
IL - 6 je u obezity spojena s korekcí nadměrného nabírání
tělesné hmotnosti.45) Obecně vzato tvrdíme, že příjem IZV
obnovil nerovnováhu mezi prozánětlivými a protizánětlivými
cytokiny způsobenou vysokotučnou dietou. V souladu s těmito
výsledky se zvýšil celkový počet bílých krvinek, které slouží
jako zdroj IL-6, u skupiny napájených IZV ve srovnání s
kontrolní skupinou. Co se týče vztahu mezi úrovní bílých
krvinek a obezitou,46), důkazy získané při chovných
experimentech ukázaly, že zvýšená hladina bílých krvinek a
jejich derivátů může chránit před nepříznivými účinky obezity.
Tato regulace leukocytů může přispět k dosažení rovnováhy
prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů při adipozitě . Tyto
cytokinové a hematologické vyrovnávacími účinky mohou být
dále podporovány našimi předchozími výsledky, kde bylo u
elektrolyzované vody prokázáno, že obnovuje buněčnou
nerovnováhu u modelu myší s vyvolaným poškozením
pokožky způsobeným UV zářením.47) Kombinací těchto závěrů
lze na základě našich dat celkově konstatovat, že příjem IZV je
účinný při udržení homeostázy imunity pomocí adipokin cytokinové sítě.
Navzdory těmto pozitivním důkazům IZV u obezity je
činnost IZV na molekulární úrovni stále otázkou čekající na
odpověď. Bylo důkladně prokázáno, že voda bohatá na vodík
má příznivé účinky na modely různých onemocnění a je
většinou závislá na svých protizánětlivých, 48), a antioxidačních
vlastnostech.49) Molekuly vodíku také rychle difundují do tkání
1) Haslam DW, James WP. Obesity. Lancet, 366, 1197–1209
(2005).
2) de Onis M, Blössner M, Borghi E. Global prevalence and
trends of overweight and obesity among preschool
children. Am. J. Clin. Nutr., 92, 1257–1264 (2010).
3) World Health Organization. “Obesity and overweight.”:
‹http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/in
dex.htm›, cited 10 May, 2012.
4) James PT, Leach R, Kalamara E, Shayeghi M. The
worldwide obesity epidemic. Obes. Res., 9 (Suppl. 4),
228S–233S (2001).
5) Wolf AM, Busch B, Kuhlmann HW, Beisiegel U.
Histological changes in the liver of morbidly obese
patients: correlation with metabolic parameters. Obes.
Surg., 15, 228–237 (2005).
6) Harris RB. Factors influencing energy intake of rats fed
either a high-fat or a fat mimetic diet. Int. J. Obes. Relat.
Metab. Disord., 18, 632–640 (1994).
7) Altunkaynak Z. Effects of high fat diet induced obesity on
female rat livers (A histochemical study). Eur. J. Gen.
Med., 2, 100–109 (2005).
8) Lee IS, Shin G, Choue R. Shifts in diet from high fat to
high carbohydrate improved levels of adipokines and
pro-inflammatory cytokines in mice fed a high-fat diet.
Endocr. J., 57, 39–50 (2010).
9) Lee SE, Jang IS, Park JS, Lee J-H, Lee S-Y, Back SY, Lee
SH, Lee H. Systemic immunity of obese-diabetes model
(db/db) mice. Mol. Cell. Toxicol., 6, 143–149 (2010).
10) Shirahata S, Kabayama S, Nakano M, Miura T,
Kusumoto K, Gotoh M, Hayashi H, Otsubo K, Morisawa
S, Katakura Y. Electrolyzed-reduced water scavenges
active oxygen species and protects DNA from oxidative
damage. Biochem. Biophys. Res. Commun., 234, 269–
274 (1997).
11) Huang KC, Yang CC, Lee KT, Chien CT. Reduced
hemodialysis-induced oxidative stress in end-stage renal
disease patients by electrolyzed reduced water. Kidney
Int., 64, 704–714 (2003).
12) Zong C, Song G, Yao S, Li L, Yu Y, Feng L, Guo S, Luo
T, Qin S. Administration of hydrogen-saturated saline
decreases plasma low-density lipoprotein cholesterol
levels and improves high-density lipoprotein function in
high-fat diet-fed hamsters. Metabolism, 61, 794–800
(2012).
13) Jin D, Ryu SH, Kim HW, Yang EJ, Lim SJ, Ryang YS,
Chung CH, Park SK, Lee KJ. Anti-diabetic effect of
alkaline-reduced water on OLETF rats. Biosci.
32)
33)
34)
35)
36)
37)
38)
39)
40)
41)
42)
43)
44)
45)
Chang BS, Kim DH, Lee KJ. Histological study on the
effect of electrolyzed reduced water-bathing on UVB
radiation-induced skin injury in hairless mice. Biol.
Pharm. Bull., 34, 1671–1677 (2011).
Maury E, Brichard SM. Adipokine dysregulation,
adipose tissue inflammation and metabolic syndrome.
Mol. Cell. Endocrinol., 314, 1–16 (2010).
Trayhurn P. Adipose tissue in obesity—an inflammatory
issue. Endocrinology, 146, 1003–1005 (2005).
Ahn M-S, Koh S-B, Kim J-Y, Yoon JH, Sung JK, Youn
YJ, Yoo B-S, Lee S-H, Yoon J, Eom A, Park J-K, Choe
K-H. The association between serum adiponectin and
carotid intima media thickness in community based
cohort in Korea: The ARIRANG study. Mol. Cell.
Toxicol., 7, 33–38 (2011).
Yamauchi T, Kamon J, Waki H, Terauchi Y, Kubota N,
Hara K, Mori Y, Ide T, Murakami K,
Tsuboyama-Kasaoka N, Ezaki O, Akanuma Y, Gavrilova
O, Vinson C, Reitman ML, Kagechika H, Shudo K, Yoda
M, Nakano Y, Tobe K, Nagai R, Kimura S, Tomita M,
Froguel P, Kadowaki T. The fat-derived hormone
adiponectin reverses insulin resistance associated with
both lipoatrophy and obesity. Nat. Med., 7, 941–946
(2001).
Iwabu M, Yamauchi T, Okada-Iwabu M, Sato K,
Nakagawa T, Funata M, Yamaguchi M, Namiki S,
Nakayama R, Tabata M, Ogata H, Kubota N, Takamoto I,
Hayashi YK, Yamauchi N, Waki H, Fukayama M,
Nishino I, Tokuyama K, Ueki K, Oike Y, Ishii S, Hirose
K, Shimizu T, Touhara K, Kadowaki T. Adiponectin and
AdipoR1 regulate PGC-1alpha and mitochondria by
Ca(2+) and AMPK/SIRT1. Nature, 464, 1313–1319
(2010).
Saraheimo M, Forsblom C, Fagerudd J, Teppo AM,
Pettersson-Fernholm K, Frystyk J, Flyvbjerg A, Groop
PH, FinnDiane Study Group. Serum adiponectin is
increased in type 1 diabetic patients with nephropathy.
Diabetes Care, 28, 1410–1414 (2005).
Imagawa A, Funahashi T, Nakamura T, Moriwaki M,
Tanaka S, Nishizawa H, Sayama K, Uno S, Iwahashi H,
Yamagata K, Miyagawa J, Matsuzawa Y. Elevated serum
concentration of adipose-derived factor, adiponectin, in
patients with type 1 diabetes. Diabetes Care, 25, 1665–
1666 (2002).
Begriche K, Lettéron P, Abbey-Toby A, Vadrot N, Robin
MA, Bado A, Pessayre D, Fromenty B. Partial leptin
deficiency favors diet-induced obesity and related
metabolic disorders in mice. Am. J. Physiol. Endocrinol.
Metab., 294, E939–E951 (2008).
Wong CK, Cheung PF, Lam CW. Leptin-mediated
cytokine release and migration of eosinophils:
implications for immunopathophysiology of allergic
inflammation. Eur. J. Immunol., 37, 2337–2348 (2007).
Farooqi IS, Keogh JM, Kamath S, Jones S, Gibson WT,
Trussell R, Jebb SA, Lip GY, O’Rahilly S. Partial leptin
deficiency and human adiposity. Nature, 414, 34–35
(2001).
Chang HP, Wang ML, Chan MH, Chiu YS, Chen YH.
Antiobesity activities of indole-3-carbinol in
high-fat-diet-induced obese mice. Nutrition, 27, 463–470
(2011).
Wunderlich FT, Ströhle P, Könner AC, Gruber S, Tovar
S, Brönneke HS, Juntti-Berggren L, Li LS, van Rooijen
N, Libert C, Berggren PO, Brüning JC. Interleukin-6
signaling in liver-parenchymal cells suppresses hepatic
inflammation and improves systemic insulin action. Cell
Metab., 12, 237–249 (2010).
Bruce CR, Dyck DJ. Cytokine regulation of skeletal
muscle fatty acid metabolism: effect of interleukin-6 and
tumor necrosis factor-alpha. Am. J. Physiol. Endocrinol.
Metab., 287, E616–E621 (2004).
Wallenius V, Wallenius K, Ahrén B, Rudling M,
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
Biotechnol. Biochem., 70, 31–37 (2006).
14) Kim MJ, Kim HK. Anti-diabetic effects of electrolyzed
reduced water in streptozotocin-induced and genetic
diabetic mice. Life Sci., 79, 2288–2292 (2006).
15) Watanabe T. Effect of alkaline ionized water on
reproduction in gestational and lactational rats. J. Toxicol.
Sci., 20, 135–142 (1995).
16) Kajiyama S, Hasegawa G, Asano M, Hosoda H, Fukui M,
Nakamura N, Kitawaki J, Imai S, Nakano K, Ohta M,
Adachi T, Obayashi H, Yoshikawa T. Supplementation of
hydrogen-rich water improves lipid and glucose
metabolism in patients with type 2 diabetes or impaired
glucose tolerance. Nutr. Res., 28, 137–143 (2008).
17) Gharib B, Hanna S, Abdallahi OM, Lepidi H, Gardette B,
De Reggi M. Anti-inflammatory properties of molecular
hydrogen: investigation on parasite-induced liver
inflammation. C. R. Acad. Sci. III, 324, 719–724 (2001).
18) Ghibaudi L, Cook J, Farley C, van Heek M, Hwa JJ. Fat
intake affects adiposity, comorbidity factors, and energy
metabolism of Sprague-Dawley rats. Obes. Res., 10, 956–
963 (2002).
19) Stringer DM, Zahradka P, Declercq VC, Ryz NR, Diakiw
R, Burr LL, Xie X, Taylor CG. Modulation of lipid
droplet size and lipid droplet proteins by trans-10, cis-12
conjugated linoleic acid parallels improvements in
hepatic steatosis in obese, insulin-resistant rats. Biochim.
Biophys. Acta, 1801, 1375–1385 (2010).
20) Ohta S. Recent progress toward hydrogen medicine:
potential of molecular hydrogen for preventive and
therapeutic applications. Curr. Pharm. Des., 17, 2241–
2252 (2011).
21) Thomas C, Pellicciari R, Pruzanski M, Auwerx J,
Schoonjans K. Targeting bile-acid signalling for
metabolic diseases. Nat. Rev. Drug Discov., 7, 678–693
(2008).
22) Lefebvre P, Cariou B, Lien F, Kuipers F, Staels B. Role
of bile acids and bile acid receptors in metabolic
regulation. Physiol. Rev., 89, 147–191 (2009).
23) Chiang JYL. Bile acid regulation of gene expression:
roles of nuclear hormone receptors. Endocr. Rev., 23,
443–463 (2002).
24) Li T, Chanda D, Zhang Y, Choi HS, Chiang JY. Glucose
stimulates
cholesterol
7alpha-hydroxylase
gene
transcription in human hepatocytes. J. Lipid Res., 51,
832–842 (2010).
25) Li T, Owsley E, Matozel M, Hsu P, Novak CM, Chiang
JY.
Transgenic
expression
of
cholesterol
7alpha-hydroxylase in the liver prevents high-fat
diet-induced obesity and insulin resistance in mice.
Hepatology, 52, 678–690 (2010).
26) Kobayashi M, Ikegami H, Fujisawa T, Nojima K,
Kawabata Y, Noso S, Babaya N, Itoi-Babaya M, Yamaji
K, Hiromine Y, Shibata M, Ogihara T. Prevention and
treatment of obesity, insulin resistance, and diabetes by
bile acid-binding resin. Diabetes, 56, 239–247 (2007).
27) Li T, Matozel M, Boehme S, Kong B, Nilsson LM, Guo
G, Ellis E, Chiang JY. Overexpression of cholesterol
7α-hydroxylase promotes hepatic bile acid synthesis and
secretion and maintains cholesterol homeostasis.
Hepatology, 53, 996–1006 (2011).
28) Ness GC, Gertz KR. Hepatic HMG-CoA reductase
expression and resistance to dietary cholesterol. Exp.
Biol. Med. (Maywood), 229, 412–416 (2004).
29) Oh HT, Chung MJ, Kim SH, Choi HJ, Ham SS. Masou
salmon (Oncorhynchus masou) ethanol extract decreases
3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase
expression in diet-induced obese mice. Nutr. Res., 29,
123–129 (2009).
30) AggIZVal BB. Targeting inflammation-induced obesity
and metabolic diseases by curcumin and other
nutraceuticals. Annu. Rev. Nutr., 30, 173–199 (2010).
31) Yoon KS, Huang XZ, Yoon YS, Kim SK, Song SB,
47)
48)
49)
Zveřejnění českého překladu: www.ionaqua.cz
46)
Carlsten H, Dickson SL, Ohlsson C, Jansson JO.
Interleukin-6-deficient mice develop mature-onset
obesity. Nat. Med., 8, 75–79 (2002).
Charles LE, Fekedulegn D, McCall T, Burchfiel CM,
Andrew ME, Violanti JM. Obesity, white blood cell
counts, and platelet counts among police officers. Obesity
(Silver Spring), 15, 2846–2854 (2007).
Yoon YS, Kim DH, Kim SK, Song SB, Uh Y, Jin D, Qi
XF, Teng YC, Lee KJ. The melamine excretion effect of
the electrolyzed reduced water in melamine-fed mice.
Food Chem. Toxicol., 49, 1814–1819 (2011).
Nakao A, Toyoda Y, Sharma P, Evans M, Guthrie N.
Effectiveness of hydrogen rich water on antioxidant
status of subjects with potential metabolic syndrome-an
open label pilot study. J. Clin. Biochem. Nutr., 46, 140–
149 (2010).
Fujita R, Tanaka Y, Saihara Y, Yamakita M, Ando D,
Koyama K. Effect of molecular hydrogen saturated
alkaline electrolyzed water on disuse muscle atrophy in
gastrocnemius muscle. J. Physiol. Anthropol., 30, 195–
201 (2011).