HB artus C.-trachomatis-TM-PCR-Kit-CE-0703-CS

Leden 2015
artus® C. trachomatis TM PCR Kit
Manuál
24 (Katalogové čís. 4552163)
96 (Katalogové čís. 4552165)
In vitro diagnostikum pro kvantitativní stanovení Pro
použití s
ABI PRISM® 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems
Verze 1
4552163, 4552165
1046950CS
QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, NĚMECKO
R3
1046950CS
Sample & Assay Technologies
QIAGEN Sample and Assay Technologies
QIAGEN je vedoucím poskytovatelem inovativních technologií přípravy
vzorků a analýz, které umožňují izolaci a detekci obsahu jakéhokoliv
biologického vzorku. Naše pokročilé, vysoce kvalitní produkty a služby Vám
zajistí spolehlivý výsledek.
QIAGEN určuje standardy:

v purifikaci DNA, RNA a proteinů

v analýzách nukleových kyselin a proteinů

ve výzkumu microRNA a RNAi

v automatizaci technologií pro přípravu vzorků a jejich analýz.
Naší misí je umožnit Vám dosáhnout vynikajících výsledků a technických úspěchů. Více informací
naleznete na www.qiagen.com.
Obsah
1. Obsah................................................................................. 5
2. Skladování ........................................................................... 5
3. Další potřebné vybavení ........................................................ 6
4. Všeobecná preventivní opatření .............................................. 7
5. Informace o původcích .......................................................... 7
6. Princip PCR s hodnocením v reálném čase ............................... 8
7. Popis produktu ..................................................................... 8
8. Protokol ............................................................................... 9
8.1 Preanalytika: Odběr, skladování a přeprava vzorků ................................... 9
8.2 Izolace DNA ........................................................................................... 13
8.3 Interní kontrola....................................................................................... 20
8.4 Kvantifikace ............................................................................................ 21
8.5 Příprava PCR .......................................................................................... 22
8.6 Programování ABI PRISM SDS ................................................................. 27
9. Vyhodnocení ...................................................................... 45
10. Řešení problémů .............................................................. 50
11. Specifikace....................................................................... 52
11.1 Analytická senzitivita ............................................................................. 52
11.2 Specificita ............................................................................................. 53
11.3 Přesnost .............................................................................................. 55
11.4 Robustnost ............................................................................................ 57
11.5 Reprodukovatelnost............................................................................... 57
11.6 Diagnostické hodnocení ........................................................................ 58
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
3
12. Zvláštní pokyny pro použití produktu ................................... 59
13. Bezpečnostní informace ..................................................... 59
14. Kontrola kvality................................................................. 59
15. Literatura ......................................................................... 59
16. Vysvětlení symbolů............................................................ 60
4
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
artus C. trachomatis TM PCR Kit
Pro použití s ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems.
Upozornění: artus C. trachomatis TM PCR Kit nelze použít ani ve spojení s
GeneAmp® 5700 SDS, ani s 384 formátem destiček systému ABI PRISM
7900HT SDS.
1. Obsah
Označení
Kat. čís. 4552163
Kat. čís. 4552165
a obsah
24 reakcí
96 reakcí
Modrá
C. trachomatis TM Master
2 x 12 rxns
8 x 12 rxns
¤
červená
C. trachomatis TM QS 1
4
1 x 10 cop/µl
1 x 200 µl
1 x 200 µl
¤
červená
C. trachomatis TM QS 2
3
1 x 10 cop/µl
1 x 200 µl
1 x 200 µl
¤
červená
C. trachomatis TM QS 3
2
1 x 10 cop/µl
1 x 200 µl
1 x 200 µl
¤
červená
C. trachomatis TM QS 4
1
1 x 10 cop/µl
1 x 200 µl
1 x 200 µl
Zelená
C. trachomatis TM IC
1 x 1 000 µl
2 x 1 000 µl
Bílá
Water (PCR grade)
1 x 1 000 µl
1 x 1 000 µl
¤
QS
IC
¤
= Kvantifikační standard
= Interní kontrola
2. Skladování
Komponenty artus C. trachomatis TM PCR Kit se skladují při –30 °C až –15 °C
a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabraňte opakovanému
rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. Při nepravidelném
používání by proto měly být reagencie alikvotovány. V případě, že je nutné
komponenty skladovat při teplotě +4°C, skladujte je takto maximálně po dobu
pěti hodin.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
5
3. Další potřebné vybavení
•
Laboratorní rukavice bez pudru
•
DNA-izolační souprava (viz 8.2 Izolace DNA)
•
Pipety (nastavitelné)
•
Sterilní pipetovací špičky s filtrem
•
Vortex mixer
•
Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml zkumavky
•
Centrifuga s rotorem pro mikrotitrační destičky (volitelné)
•
96-ti jamková reakční destička/zkumavky pro optická měření s
odpovídajícími optickými uzavíracími prostředky* (viz 8.5 Příprava
PCR)
96-ti jamkové dvojdílné přídržné rámy k použití optických zkumavek
•
(96-Well Tray/Retainer Set, kat. č. 403 081, Applied Biosystems), viz
8.5 Příprava PCR
Kompresní podložka pro použití s optickými lepicími foliemi (Optical
•
Cover Compression Pads, kat. č. 4 312 639, Applied Biosystems), viz
8.5 Příprava PCR
Aplikátor k uzavření reakčních destiček při použití optických lepicích
•
folií (Adhesive Seal Applicator Kit, kat. č. 4 333 183, Applied
Biosystems)
ABI PRISM 7000, 7700 nebo 7900HT SDS
•
Upozornění: Při uvedení přístrojů do provozu je bezpodmínečně nutná jsoucí
platná kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background
Component File).
Použití zkumavek k optickým měřením s vypouklými víčky je přípustné pouze pro
®
ABI PRISM 7700 SDS a vyžaduje změnu nastavení doby osvitu (viz
®
8.6.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS, 8.6.2.5 Důležitá přídavná nastavení).
*
6
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
4. Všeobecná preventivní opatření
Uživatel by měl dbát na následující:
•
Používejte sterilní pipetovací špičky s filtrem.
•
Skladujte, izolujte a přidávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly,
amplifikáty) do reakce na jiném místě než ostatní reagencie.
•
Všechny komponenty před počátkem testu úplně rozmrazte při
pokojové teplotě.
•
Následně komponenty řádně promíchejte a krátce centrifugujte.
•
Pracujte plynule na ledu nebo v chladicím bloku.
5. Informace o původcích
Bakterie rodu Chlamydia mají celosvětově velký epidemiologický význam.
Chlamydia trachomatis (sérovary D – L) patří na celém světě k nejčastějším
původcům pohlavně přenosných chorob (STD – sexually
transmitted
diseases). Šestnáct sérovarů C. trachomatis vyvolává různá onemocnění:
Sérovary A, B, Ba a C způsobují trachom, chronicky recidivující onemocnění
spojivek a rohovky rozšířené v tropech. Sérovary D – K způsobují pohlavně
přenosné urogenitální infekce a oční infekce, dále také po perinatálním
přenosu
novorozenecké
infekce.
Sérovary
LGV
I
-
III
způsobují
lymphogranuloma venereum, pohlavně přenosnou chorobu vyskytující se
převážně v tropech.
Trachom se vyskytuje téměř výhradně v tropických zemích, v podmínkách s
nedostatečnou hygienou. Představuje nejčastější oční chorobu ve světě a je po
šedém zákalu druhou nejčastější příčinou oslepnutí. Předpokládá se, že je
infikováno přibližně 150 miliónů lidí. Přibližně u šesti miliónů došlo k oslepnutí.
V průmyslově vyspělých zemích jsou chlamydie nejčastějšími bakteriálními
původci urogenitálních infekcí. V Německu se počet nových genitálních
infekcí odhaduje na 300 000 ročně. Incidence lymphogranuloma venereum
(Lymphogranuloma inguinale, Durand-Nicolas-Favreova choroba) celosvětově
klesá. Tato pohlavně přenosná choroba je však v Asii, Africe, Jižní Americe a v
částech Karibské oblasti stále ještě endemická.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
7
6. Princip PCR s hodnocením v reálném čase
Při
diagnostikování
pomocí
polymerázové
řetězové
reakce
(PCR)
se
amplifikují specifické oblasti genomu původce. Detekce probíhá při PCR v
reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na
oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát.
Detekce intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase umožňuje
průkaz a kvantifikaci produktů, aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat
testovací zkumavky (Mackay, 2004).
7. Popis produktu
artus C. trachomatis TM PCR Kit je systém k přímému použití pro průkaz
C. trachomatis DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v ABI PRISM
7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection System.
C. trachomatis TM Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou
amplifikaci 100 bp dlouhého úseku genomu C. trachomatis. Detekce
amplifikátu se provádí měřením fluorescence FAM v ABI PRISM SDS. Kromě
toho obsahuje artus C. trachomatis TM PCR Kit druhý heterologní amplifikační
systém pro průkaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako
Interní kontrola (IC) měřením fluorescence VIC. Limit detekce analytické
C. trachomatis PCR (viz 11.1 Analytická senzitivita) přitom není negativně
ovlivněn. Spolu s produktem se dodávají externí pozitivní kontroly (C.
trachomatis TM QS 1 - 4), s jejichž pomocí lze určit množství původce ve
vzorku. Prostudujte si prosím oddíl 8.4 Kvantifikace.
8
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
8. Protokol
8.1 Preanalytika: Odběr, skladování a přeprava vzorků
Upozornění: Se všemi vzorky se musí zacházet jako s potenciálně infekčními.
Přípustné jsou pouze následující vzorky, u kterých se musí bezpodmínečně
dodržovat následující pravidla a předpisy pro odběr, skladování a přepravu:
1.
Moč (ženy a muži).
2.
Endocervikální a uretrální výtěry a oční stěry.
3.
Sperma.
Aby byla zaručena vysoká kvalita vzorku, měl by transport vzorku do
výzkumné laboratoře proběhnout co nejrychleji. Vzorky musí být přepravovány
za uvedených teplotních podmínek.
8.1.1 Odběr vzorků
1. Vzorky moči
Pacient(ka) nesmí v předcházejících dvou hodinách močit.
Odeberte 10 - 30 ml první porce moči do čisté polypropylenové nádobky bez
konzervačních činidel. Nepoužívejte vzorky moči, které byly odebrány do
nádobek s konzervačními činidly. Nádobky uzavřete a nadepište. Postupujte
podle předpisů pro skladování a transport.
2. Výtěrové vzorky
Pro odběr endocervikálních a uretrálních výtěrových vzorků a očních stěrů
používejte prosím následující materiály:
•
Používejte pouze výtěrové tampony se špičkami z Dacronu®, Rayonu nebo
z
kalciumalginátu
na
násadách
z
plastu.
Nepoužívejte
výtěrové
tampony s dřevěnými nebo hliníkovými násadami.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
9
Endocervikální a uretrální výtěrové vzorky a oční stěry mohou být
•
odebrány a přepraveny v 1 - 3 ml následujících médií :
� AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.)
� Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation)
� Cervical Sampler (Digene Corporation)
� STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.)
� Venturi
Transystem
(vhodné
pro aeroby
a anaeroby),
sterilní
transportní nádobky pro výtěry (SARSTEDT AG & Co.)
� SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.)
� M4 CTM (MicroTest, Inc.)
� 2SP CTM (Bartels, Inc.)
� Bartels ClamTrans™ CTM (Bartels, Inc.)
� Chlamydia-tampon (MAST DIAGNOSTICA)
� IDEIA™ Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation)
Tampon ponechte v transportním médiu. Nádobky uzavřete a nadepište.
•
Dbejte předpisů pro přepravu a skladování*.
Dodržujte
•
doporučený
postup
pro odběr cylindrických
a plochých
epitelových buňek po odstranění cervikálního hlenu.
3.
Vzorky spermatu†
Odběr vzorku by měl proběhnout nejdříve dva až čtyři dny po poslední
ejakulaci.
•
Vzorek spermatu musí být odebrán v ten samý den, kdy je zaslán do
laboratoře.
•
Za použití běžného laboratorního postupu může být vzorek spermatu
odebrán jedním z následujících způsobů:
� masturbací přímo do sterilní, čisté a suché nádobky na vzorek. Ujistěte
se, že se do nádobky dostal celý vzorek. Došlo-li k úniku části vzorku,
musí to být zaznamenáno do protokolu o odběru vzorku.
Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W.
eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
†
Reference:
1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine
(http://uuhsc.utah.edu/andrology/)
2) Andrology Institute of America (http://www.aia-zavos.com/).
*
10
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
� masturbací za použití prezervativu. Po ejakulaci kondom sejměte. Je
důležité, aby byl nahoře uzavřen gumičkou kvůli udržení vzorku
spermatu uvnitř prezervativu. Kondom následně vložte do transportní
nádobky.
Důležité: Používejte pouze nádobky bez konzervačních činidel resp. kondomy bez
spermicidů a umělých přídavných látek (např. barviv).
•
Vzorek spermatu postavte na 30 až 45 minut do temna (např. do zásuvky
nebo do skříně), dokud nezkapalní.
•
Vzorek ihned po zkapalnění zmrazte v kryozkumavce při -20°C nebo nižší
teplotě.
8.1.2 Skladování vzorků
Výkonnost testu může být pravidelným zmrazováním nebo delším skladováním
vzorků narušena.
1. Vzorky moči
•
Bude-li rozbor moči proveden do 24 hodin, mohou být vzorky uloženy při
pokojové teplotě (19 - 23°C). Pokud bude rozbor proveden do sedmi dnů
od odběru, musí být vzorky uchovávány v lednici při 2 - 8°C. Vzorky moči,
které nebudou zpracovány během sedmi dnů, mohou být skladovány po
dobu 30-ti dnů při -20°C nebo méně.
2. Výtěrové vzorky
•
Vzorky se skladují při 2 - 8°C. (Pokud musí být výtěrové vzorky do
výzkumné laboratoře zaslány, musí být odeslány co nejdříve po odběru v
souladu s laboratorními předpisy pro přepravu vzorků chlamydií).
•
Výtěrové vzorky, které nebudou testovány bezprostředně po doručení do
laboratoře, musí být uskladněny při 2 - 8°C a během sedmi
dní
zpracovány. Výtěrové vzorky, které nemohou být zpracovány do sedmi dní
po odběru, musí být uskladněny při -20°C a méně a testovány do 30-ti
dnů po odběru.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
11
3. Vzorky spermatu
•
Vzorky se skladují při -20°C nebo nižší teplotě.
•
Vzorky spermatu, které nebudou testovány ihned po doručení do
laboratoře, musí být skladovány při -20°C nebo nižší teplotě a testovány
během 30-ti dnů po odběru.
8.1.3 Přeprava vzorků
1. Vzorky moči
Vzorky moči, které jsou určeny k zaslání, musí být až do odeslání uloženy v
•
lednici při 2 - 8°C. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a
státních předpisů pro přepravu látek vyvolávajících nákazu*.
2. Výtěrové vzorky
•
Výtěrové vzorky musí být přepravovány v chladu.
•
Musí-li být výtěrové vzorky do laboratoře zaslány, je nutné je odeslat co
nejdříve po odběru v souladu s laboratorními předpisy pro přepravu v
chladu. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních
předpisů pro přepravu látek vyvolávajících nákazu*.
3. Vzorky spermatu
Musí-li být výtěrové vzorky do laboratoře zaslány, je nutné je odeslat ve
•
stejný den, kdy byly odebrány, v souladu s laboratorními předpisy pro
přepravu vzorků chlamydií.
Kromě toho je nutné dbát na to, aby byly vzorky spermatu zasílány v
•
chladu. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních
předpisů pro přepravu látek vyvolávajících nákazu*.
*
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition,
2000.704.
12
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
8.2 Izolace DNA
DNA-izolační soupravy nabízejí různí výrobci. V závislosti na protokolu
zvoleného výrobce použijte dané množství vzorku a proveďte izolaci DNA
podle návodu. Doporučujeme následující izolační soupravy:
Vzorek
•
Izolační souprava
®
moč, výtěry
QIAamp Viral RNA
Mini Kit (50)
sperma, výtěry
QIAamp
DNA Mini
Kit (50)
Katalogové
číslo
Výrobce
52 904
QIAGEN
51 304
QIAGEN
Nosič RNA
®
obsažen
neobsažen
Užití nosiče RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro
výtěžek DNA/RNA. Pokud použitá izolační souprava neobsahuje žádný
nosič RNA, povšimněte si prosím, že je při izolaci nukleových kyselin z
nebuněčných tělesných tekutin resp. materiálů s malým
obsahem
DNA/RNA (např. likvor) důrazně doporučeno přidat nosič RNA (RNA
homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat. čís. 27-4110-01).
Prosím postupujte následujícím způsobem:
a) Resuspendujte lyofilizovaný nosič RNA v elučním pufru (nepoužívejte
lyzační pufr) izolační soupravy (např. AE pufr soupravy QIAamp DNA
Mini Kit) a ředěním vytvořte roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozdělte
tento roztok nosiče RNA na počet alikvotů odpovídající Vaším
požadavkům a skladujte je při -20°C. Zabraňte
opakovanému
rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosiče RNA.
b) Používejte 1 µg nosiče RNA na 100 µl lyzačního pufru. Je-li extrakčním
protokolem stanoveno 200 µl lyzačního pufru na jeden vzorek, vložte 2
µl nosiče RNA (1 µg/µl) přímo do lyzačního pufru. Před začátkem každé
izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu čerstvě
vytvořena směs lyzačního pufru a nosiče RNA (popř. i Interní kontroly,
viz 8.3 Interní kontrola):
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
13
Počet vzorků
1
Lyzační pufr
12
např. 200 µl
např. 2 400 µl
2 µl
24 µl
Celkový objem
202 µl
2 424 µl
Objem pro izolaci
200 µl
po 200 µl
Nosič RNA (1 µg/µl)
c) Tuto čerstvě vytvořenou směs lyzačního pufru a nosiče RNA vložte
ihned do izolace. Skladování směsi není možné.
•
Užití nosiče RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro
výtěžek DNA/RNA. Aby bylo dosaženo vyšší stability nosiče
RNA
dodávaného s QIAamp Viral RNA Mini Kit, doporučujeme následující
postup lišící se od údajů uvedených v příručce izolační soupravy:
a.
Resuspendujte lyofilizovaný nosič RNA před prvním použitím izolační
soupravy v 310 µl elučního pufru obsaženého v soupravě (konečná
koncentrace 1 µg/µl, nepoužívejte lyzační pufr). Rozdělte tento roztok
nosiče RNA na počet alikvotů odpovídající Vaším požadavkům a
skladujte je při -20°C. Zabraňte opakovanému rozmrazení (> 2 x)
alikvotu nosiče RNA.
b.
Před
začátkem
každé
izolace
musí
být
podle
následujícího
pipetovacího schématu čerstvě vytvořena směs lyzačního pufru a
nosiče RNA (popř. i Interní kontroly, viz 8.3 Interní kontrola):
Počet vzorků
12
Lyzační pufr AVL
560 µl
6 720 µl
Nosič RNA (1 µg/µl)
5,6 µl
67,2 µl
565,6 µl
6 787,2 µl
560 µl
po 560 µl
Celkový objem
Objem pro izolaci
c.
1
Tuto čerstvě vytvořenou směs lyzačního pufru a nosiče RNA vložte
ihned do izolace. Skladování směsi není možné.
14
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Z oblasti automatizovaných izolací se doporučuje následující systém:
•
Vzorek
Izolační systém
moč, výtěry
ABI PRISM
6100 Nucleic
Acid PrepStation
Izolační souprava
Pro obdržení seznamu potřebných
doplňků a validovaného protokolu
izolace kontaktujte prosím naší
technickou podporu.
Výrobce
Applied
Biosystems,
Foster City,
U.S.A.
Při izolaci využívající promývací pufr s obsahem etanolu bezpodmínečně
zajistěte, aby byl před elucí proveden ještě jeden centrifugační krok (tři
minuty, 13 000 ot/min) a tím se odstranily zbytky etanolu. Předejdete tak
možným inhibicím PCR.
•
artus C. trachomatis TM PCR Kit není vhodný pro izolace na základě
fenolu.
Důležité: Interní kontrolu soupravy artus C. trachomatis TM PCR Kit lze vložit
přímo do izolace (viz 8.3 Interní kontrola).
8.2.1 Doporučení pro izolaci ze vzorků moči a výtěrů pomocí
QIAamp Viral RNA Mini Kit
•
AVL pufr obsažený v QIAamp Viral RNA Mini Kit byl vyvinut
speciálně pro inaktivaci četných inhibitorů vyskytujících se v moči.
Proto se výslovně doporučuje používat protokol QIAamp Viral
RNA Mini Kit pro extrakci buněčné, bakteriální a virové DNA z
moči.
•
Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19 - 23°C).
•
Protože je ve vzorcích moči obsaženo často jen velmi malé
množství bakterií, měl by být zkoumaný materiál koncentrován. Za
tímto účelem centrifugujte zkoumané vzorky moči (10 - 30 ml) po
dobu 15 - 20 minut při 10 000 x g (alternativně 30 minut při 3
000 x g). Supernatant odlijte a proveďte úplnou resuspenzi
peletu pomocí vortexování s intervaly (15 - 30 sekund) v 300 - 900
µl 1 x PBS. Objem resuspenze závisí na vkládaném množství
vzorku.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
15
•
Při používání suchých tamponů je prosím třepejte nejméně hodinu
při pokojové teplotě v 500 µl 1 x PBS.
•
Výtěrové vzorky, které jsou uchovávány v transportním médiu,
musí být důkladně promíchány vortexováním.
•
Sundejte ze zkumavek opatrně víčka a dbejte na to, aby nebyly
rukavice kontaminovány. Kontaminované rukavice musí být před
zpracováním dalšího vzorku vyměněny za nové.
Přitiskněte
tampon na stěnu zkumavky, aby odtekla tekutina. Případné zbytky
hlenu ve vzorku sejměte tamponem. Zbylou tekutinu hlenu v
tamponu
odstraňte
výše
uvedeným
způsobem.
Tampon
s
případnými zbytky hlenu odstraňte a zlikvidujte.
•
Pro izolaci DNA by mělo být použito 140 µl takto předupraveného
vzorku.
•
Postupujte podle pokynů protokolu QIAamp Viral RNA Mini Spin
(QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) od kroku 1.
•
Bezpodmínečně
se
ujistěte,
aby
byl
proveden
volitelný
centrifugační krok 9a protokolu (13 000 ot/min, tři minuty) k
odstranění zbytků etanolu.
•
Doporučuje se eluční objem o 60 µl.
8.2.2 Doporučení pro izolaci z výtěrových vzorků a vzorků
spermatu pomocí QIAamp DNA Mini Kit
•
Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19 – 23°C).
•
Výtěrové vzorky, které jsou uchovávány v transportním médiu,
musí být důkladně promíchány vortexováním.
•
Sundejte ze zkumavek opatrně víčka a dbejte na to, aby nebyly
rukavice kontaminovány. Kontaminované rukavice musí být před
zpracováním dalšího vzorku vyměněny za nové.
Přitiskněte
tampon na stěnu zkumavky, aby odtekla tekutina. Případné zbytky
hlenu ve vzorku sejměte tamponem. Zbylou tekutinu hlenu v
tamponu
odstraňte
výše
uvedeným
způsobem.
Tampon
s
případnými zbytky hlenu odstraňte a zlikvidujte.
16
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
•
Bakterie peletujte centrifugací po dobu 10 minut při 5 000 x g
(7 500 ot/min).
•
Bakteriální pelet resuspendujte v 180 µl ATL pufru (QIAamp DNA
Mini
Kit).
Suché
tampony
převeďte
přímo
do
1,5
ml
mikrocentrifugační zkumavky a vortexujte je spolu s 180 µl ATL
pufru po dobu 15 sekund.
•
Pro extrakci DNA ze vzorků spermatu rozřeďte prosím 60 µlvzorku
s 80 µl 1 x PBS v 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavce. Po
důkladném vortexování pipetujte prosím 100 µl zředěného roztoku
k 180 µl ATL pufru. Směs míchejte 15 - 30 sekund vortexováním s
intervaly.
•
Ke
vzorku
přidejte
20
µl
proteinázy
K.
Promíchejte
jej
vortexováním a inkubujte směs při 56°C po dobu 1 – 12 hodin.
Pro promíchání vzorku jej během inkubace příležitostně vortexujte
nebo jej vložte do termomixeru. Prosím všimněte si, že musí být
použita proteináza K. QIAGEN proteáza má za přítomnosti ATL
pufru redukovanou aktivitu.
•
Při používání suchých tamponu dbejte prosím na to, aby byla
tekutina z tamponu vymačkána na stěně zkumavky. Tampon
následně odstraňte a zlikvidujte.
•
Postupujte podle „Tissue Protocol“ (QIAamp DNA Mini Kit a
QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, strana 34) od
kroku 3.
•
Bezpodmínečně se ujistěte, aby byl proveden volitelný
centrifugační krok 7a (13 000 ot/min, tři minuty) protokolu k
odstranění zbytků etanolu.
•
Doporučuje se eluční objem o 50 µl AE pufru.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
17
8.2.3 Doporučení pro izolaci z lyofilizovaných vzorků pomocí
QIAamp DNA Mini Kit
•
Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19 – 23°C).
•
Lyofilizovaný vzorek pečlivě resuspendujte v 500 µl 1 x PBS opatrným
pootáčením ruky. Vzorek následně třepejte nejméně 30 minut při
pokojové teplotě, aby se úplně rozpustil.
•
Pipetujte 200 µl rozpuštěného vzorku k 360 µl ATL pufru do 1,5 ml
mikrocentrifugační zkumavky a důkladně promíchejte pomocí
vortexování.
•
Ke vzorku přidejte 20 µl proteinázy K. Směs
promíchejte
vortexováním a inkubujte ji při 56°C po dobu 1 – 12 hodin. Pro
promíchání vzorku jej během inkubace příležitostně vortexujte
nebo jej vložte do termomixeru. Prosím všimněte si, že musí být
použita proteináza K. QIAGEN proteáza má za přítomnosti ATL
pufru redukovanou aktivitu.
•
Centrifugujte krátce 1,5 ml zkumavky, aby se zabránilo křížovým
kontaminacím způsobeným vystříknutím tekutiny vzorku ve vnitřní
části víčka při otevření nádobky.
•
Ke vzorku přidejte 400 µl AL pufru, rázně jej 15
sekund
promíchejte na vortexu a inkubujte po dobu 10 minut při 70°C.
•
Ke vzorku přidejte 400 µl etanolu (96 – 100 %), a opět jej
promíchejte 15 sekund na vortexu.
•
Směs (včetně precipitátu) opatrně vložte – bez pokropení horního
okraje – na QIAamp kolonku. Uzavřete víčko a centrifugujte jednu
minutu při 6 000 x g (8 000 ot/min). Následně vložte QIAamp
kolonku do čisté 2 ml Collection Tube (obsaženo v diagnostické
soupravě) a použitou Collection Tube spolu s filtrátem vyhoďte.
Tento krok opakujte vložením zbylého roztoku na kolonku.
•
Postupujte podle „Tissue Protocol“ (QIAamp DNA Mini Kit a
QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, strana 35) od
kroku 6.
18
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
•
Bezpodmínečně
se
ujistěte,
aby
byl
proveden
volitelný
centrifugační krok 7a (13 000 ot/min, tři minuty) protokolu k
odstranění zbytků etanolu.
•
Doporučuje se eluční objem o 50 µl AE pufru.
8.3 Interní kontrola
Spolu s produktem se dodává Interní kontrola (C. trachomatis TM IC). Máte
tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR (viz
Obr. 1). Pro tuto aplikaci přidejte k izolaci Interní kontrolu v poměru 0,1 µl
na
1 µl elučního objemu. Jestliže například používáte QIAamp DNA Mini Kit a
eluujete DNA v 200 µl AE pufru, vložte 20 µl Interní kontroly. Jestliže např.
eluujete ve 100 µl, vložte 10 µl. Množství vkládané Interní kontroly závisí pouze
na elučním objemu. Interní kontrola a nosič RNA (viz 8.2 Izolace DNA) by měly
být přidávány pouze k
•
směsi lyzačního pufru a vzorku nebo
•
přímo k lyzačnímu pufru.
Interní kontrola nesmí být přidána přímo ke vzorku. Při přidání k lyzačnímu
pufru se musí dbát na to, aby byla směs Interní kontroly, lyzačního pufru a
nosiče RNA čerstvě připravena a ihned použita (skladování směsi při
pokojové teplotě nebo v lednici může již po několika hodinách vest k
vynechání Interní kontroly a ke snížení efektivity izolace). Interní kontrolu a
nosič RNA nepipetujte přímo do vzorku.
Aby byla izolace hodnocena jako úspěšná, musí Ct hodnota Interní kontroly
na ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT SDS ležet u Ct = 22 ± 3
(threshold: 0,05). Uvedená variabilita maximálně tří Ct hodnot je podmíněná
přístrojovou variabilitou a variabilitou izolace. Větší odchylka poukazuje na
problémy s izolací. V tomto případě musí být izolace přezkoušena a
popřípadě nově validována. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy,
kontaktujte prosím naší technickou podporu. Volitelně lze Interní kontrolu použít
výhradně ke kontrole možné inhibice PCR (viz Obr. 2). V tomto případě přidejte 0,5
µl Interní kontroly na jednu
20
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
testovací směs přímo do 15 µl C. trachomatis TM Master. Pro každou PCR
reakci použijte 15 µl takto vytvořeného Master Mixu* a přidejte následně 10 µl
izolátu. Jestliže připravujete jeden běh pro více vzorků, zvyšte potřebná
množství C. trachomatis TM Master a Interní kontroly podle počtu vzorků (viz
8.5 Příprava PCR).
8.4 Kvantifikace
S Kvantifikačními standardy (C. trachomatis TM QS 1 - 4) dodávanými spolu
s produktem se zachází stejně jako s již izolovanými vzorky a přidávají se ve
stejném objemu (10 µl). Standardní křivku v ABI PRISM Sequence Detection
System vytvoříte tak, že vložíte všechny čtyři Kvantifikační standardy dodávané
s produktem a definujete je jako standardy při zadání odpovídajících
koncentrací (viz 8.6 Programování ABI PRISM SDS). Import standardních křivek
z předchozích běhů není se softwarem ABI PRISM 7000,
7700 a 7900HT SDS možný.
Upozornění: Kvantifikační standardy jsou definovány jako kopie/µl. Pro
přepočet hodnot získaných pomocí standardní křivky na kopie/ml vzorku se
používá následující vzorec:
výsledek (kopie/µl) x eluční objem (µl)
výsledek (kopie/ml)
=
objem vzorku (ml)
Prosím povšimněte si, že se do výše uvedeného vzorce dosazuje zásadně
původní objem vzorku. Toto se musí zohlednit, byl-li objem vzorku před izolací
nukleových kyselin pozměněn (např. redukce objemu centrifugací nebo jeho
zvýšení naplněním na objem požadovaný pro izolaci).
Důležité: Na www.qiagen.com/Products/ByLabFocus/MDX je k dispozici
příručka pro zjednodušení kvantitativního vyhodnocení systémů artus na ABI
PRISM 7000 SDS (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS).
*
Zvýšení objemu podmíněné přidáním Interní kontroly je při přípravě PCR reakce
opominuto. Senzitivita není omezena.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
21
8.5 Příprava PCR
Připravte pro plánované reakce potřebný počet zkumavek resp.
96-ti
jamkovou reakční destičku. Doporučené prostředky jsou uvedeny v následující
tabulce:
Označení
Katalogové
číslo
Výrobce
Přídržné
*
rámy
96-Well
Optical
Reaction Plate
4 306 737
Applied
Biosystems
ne
-
4 311 971
Applied
Biosystems
-
ano
4 316 567
Applied
Biosystems
ano
-
N8010933
Applied
Biosystems
ano
-
4 323 032
Applied
Biosystems
-
ne
Položka
96-ti
jamkov
á
optická
reakční
destička
Optické
lepicí folie
Optické
zkumavky
Optické
zkumavky
Optická
víčka
(plochá)
Optical
Adhesive
Covers
ABI PRISM
Optical Tubes,
8 Tubes/Strip
®
MicroAmp
Optical Tubes
ABI PRISM
Optical
Caps, 8
Caps/Strip
Kompresní
podložka
Upozornění: Použití zkumavek k optickým měřením s vypouklými víčky je
přípustné pouze pro přístroj ABI PRISM 7700 SDS a vyžaduje změnu nastavení
doby osvitu (viz 8.6.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS,
8.6.2.5 Důležitá přídavná nastavení).
Při přípravě PCR dbejte na to, aby byl společně s každým během PCR
proveden alespoň jeden Kvantifikační standard a jedna negativní kontrola
(Water, PCR grade). Standardní křivku vytvoříte u každého běhu PCR pomocí
všech spolu s produktem dodávaných Kvantifikačních standardů (C.
trachomatis TM QS 1 - 4). Všechny reagencie se musí před začátkem testu
zcela rozmrazit při pokojové teplotě, musí být dobře promíchány (opakovaný
náběr pipetou a vypuštění pipety nebo krátký vortex) a následně
centrifugovány.
*
Při použití dvojdílných přídržných rámů je nutné zkumavky při vkládání a při vyjímání
otevřít. K zamezení tím zapříčiněných kontaminací používejte výhradně dolní díl
přídržného rámu.
22
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Chcete-li Interní kontrolou kontrolovat jak izolaci DNA, tak možnou inhibici
PCR, musí být napřed Interní kontrola přidána k izolaci (viz 8.3 Interní
kontrola). V tomto případě používejte následující schéma pipetování (viz také
schématický přehled na Obr. 1):
1. Příprava
Master Mixu
2. Příprava PCR
reakce
Počet vzorků
1
C. trachomatis TM Master
15 µl
C. trachomatis TM IC
12
180 µl
0 µl
0 µl
celkový objem
15 µl
180 µl
Master Mix
15 µl
po 15 µl
vzorek
10 µl
po 10 µl
celkový objem
25 µl
po 25 µl
Jestliže chcete Interní kontrolu použít výhradně ke kontrole PCR inhibice, je
třeba ji přidat přímo do C. trachomatis TM Master. V tomto případě používejte
následující schéma pipetování (viz také schématický přehled na Obr. 2):
1. Příprava
Master Mixu
2. Příprava PCR
reakce
Počet vzorků
1
C. trachomatis TM Master
15 µl
C. trachomatis TM IC
12
180 µl
0,5 µl
*
15,5 µl
celkový objem
*
6 µl
*
186 µl
*
Master Mix
15 µl
po 15 µl
vzorek
10 µl
po 10 µl
celkový objem
25 µl
po 25 µl
Pipetujte do každé zkumavky nebo do každé potřebné jamky 96-ti jamkové
reakční destičky 15 µl Master Mixu. Následně přidejte 10 µl eluátu z izolace
DNA. Dbejte na to, aby byly oba roztoky dobře promíchány opakovaným
náběrem pipetou a jejím vypuštěním. Uzavřete zkumavky příslušnými víčky.
96-ti jamkovou reakční destičku můžete alternativně uzavřít pomocí optických
lepicích folií (Optical Adhesive Covers). Pro shromáždění vkládaného objemu
na dně zkumavek nebo destiček centrifugujte zkumavky (v držáku určeném
pro zkumavky PCR) popř. 96-ti jamkovou reakční destičku v centrifuze
vybavené rotorem pro mikrotitrační desky po dobu 30 sekund při 1 780 x g
*
Zvýšení objemu podmíněné přidáním Interní kontroly je při přípravě PCR reakce
opominuto. Senzitivita detekčního systému není omezena.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
23
(4 000 ot/min). Pokud takovou centrifugu nemáte k dispozici, dbejte při
přípravě reakcí PCR na to, aby byly Master Mix a objem vzorku pipetovány na
dno zkumavek popř. reakčních jednotek (well). Reakční směsi skladujte při
teplotě +4°C, dokud nebude přístroj ABI PRISM SDS naprogramován (viz
8.6 Programování ABI PRISM SDS) a pak je převeďte do přístroje.
Upozornění:
•
Při použití optických zkumavek v kombinaci s optickými víčky vkládejte do
přístroje (ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT SDS) vždy přídržný rám
(96-Well Tray/Retainer Set). Při použití dvojdílného přídržného rámu je
nutné zkumavky při vkládání a při vyjímání otevřít. K zamezení tím
zapříčiněných kontaminací používejte výhradně dolní díl přídržného rámu.
•
Použití 96-ti jamkových optických reakčních destiček v kombinaci s
optickými lepicími foliemi vyžaduje vložení kompresní podložky (Optical
Cover Compression Pads).
24
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Přidání Interní kontroly k izolaci
Izolace
směs lyzačního pufru
a vzorku
+ O,1 µl IC* na 1
µl elučního objemu
1O µl izolátu*
15 µl artus Master*
Optická reakční
destička/
optické zkumavky
ABI PRISM® SDS
Obr. 1: Schéma pracovního postupu pro kontrolu izolace a inhibice
PCR.
*
Při každém pipetovacím kroku je třeba bezpodmínečně dbát
na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, řádně
promíchané a krátce centrifugované.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
25
Přidání Interní kontroly k artus Master
Obr. 2: Schéma pracovního postupu pro kontrolu inhibice PCR.
*
Při každém pipetovacím kroku je třeba bezpodmínečně dbát
na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, řádně
promíchané a krátce centrifugované.
26
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
8.6 Programování ABI PRISM SDS
Software ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems (SDS)
potřebuje před spuštěním běhu PCR dodatečné informace. Postupy při
programování přístrojů se od sebe významně odlišují, proto jsou v
následujícím textu uvedeny v samostatných kapitolách.
8.6.1 Programování ABI PRISM 7000 SDS
K detekci C. trachomatis DNA vytvořte na přístroji ABI PRISM 7000 SDS profil
podle následujících šesti pracovních kroků (8.6.1.1 - 8.6.1.6). Veškeré údaje
se vztahují na ABI PRISM 7000 SDS software verzi 1.0.1. Podrobnosti o
programování ABI PRISM 7000 SDS si prosím prostudujte v příručce ABI PRISM
7000 SDS User Guide. Pro lepší přehled jsou potřebná nastavení na obrázcích
zvýrazněna černými rámečky.
8.6.1.1 Předvolená nastavení při vytváření nového běhu PCR
Na přístroji ABI PRISM 7000 SDS vyberte pod File položku New a nastavte pro
nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 3). Dříve uložená
šablona (SDS Template [*.sdt]) je k dispozici v seznamu Template nebo
volbou funkce Browse (viz 8.6.1.5 Uložení běhu PCR). Svá zadání potvrďte
(OK).
Obr. 3: Předvolená nastavení při vytváření nového běhu PCR (New Document).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
27
8.6.1.2 Vytvoření/volba detektorů
V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, přiřaďte dokumentu
odpovídající barviva detektoru. K průkazu C. trachomatis DNA a Interní
Kontroly pomocí artus C. trachomatis TM PCR Kit je nutné definovat
reporter/quencher uvedené v následující tabulce:
Průkaz
Reporter
Quencher
C. trachomatis DNA
FAM
TAMRA
Interní kontrola
(C. trachomatis TM IC)
VIC
none
Tyto detektory vytvoříte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo
dole lokalizovanou volbu File a následně volbu New.
Obr. 4: Vytvoření detektoru specifického
pro C. trachomatis (Detector
Manager).
Obr. 5: Vytvoření detektoru specifického
pro Interní kontrolu (Detector
Manager).
V okně, které se zobrazí, definujte (podle Obr. 4 a Obr. 5) kombinaci
reporter/quencher FAM/TAMRA pro průkaz C. trachomatis DNA, pro průkaz
Interní kontroly zvolte kombinaci VIC/none. Potvrzením údajů (OK) se vrátíte
zpět do Detector Manager. Označte právě vytvořené detektory a každý výběr
přeneste klepnutím na volbu Add to Plate Document do Well Inspector (viz
Obr. 6). Zavřete okno (Done).
28
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Obr. 6: Výběr detektorů (Detector Manager).
8.6.1.3 Přiřazení potřebných informací k pozicím destiček
Pokud nyní v nabídce View otevřete položku Well Inspector, naleznete tam
Vámi v kapitole 8.6.1.2 zvolené detektory znovu (viz Obr. 7).
Obr. 7: Přiřazení potřebných informací k pozicím destiček (Well Inspector).
Označte pozice destičky, které jsou obsazené pro průkaz C. trachomatis DNA.
Aktivujte volbu Use u obou detektorů, čímž vybrané detektory přiřadíte k
označeným pozicím. Objeví se zatržítko. Pro pojmenování
jednotlivých
reakčních směsí vyberte odpovídající pozici na destičce a zadejte název do
položky Sample Name. Přitom pamatujte na to, že směsi se stejným Sample
Name a stejným přiřazením detektorů bude software považovat za replikáty a
zprůměruje je s ohledem na jejich kvantifikované množství původce.
30
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Pak vyberte
pro každý typ vzorku odpovídající funkci
(Task) podle
následující tabulky:
Typ vzorku
vzorek
Funkce
(Task)
Unknown
Koncentrace
(Quantity)
-
Reporter
Quencher
FAM
TAMRA
negativní
kontrola
NTC
-
FAM
TAMRA
standard
Standard
viz 1. Obsah
FAM
TAMRA
Standardní křivku vytvořte u každého běhu PCR pomocí všech spolu s
produktem dodávaných Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity) uveďte příslušné koncentrace
(viz 1. Obsah). Dbejte na to, že pro běh PCR s
artus C. trachomatis TM PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní
reference (Passive Reference). Rovnoměrné rozložení barviva ROX na všechny
směsi PCR jedné šarže pomocí promíchání
C. trachomatis TM Master zaručuje rozpoznání a přepočítání tube-to-tube
variací (fluorescenční rozdíly mezi různými směsmi PCR) pomocí Sequence
Detection Software (normalizace).
8.6.1.4 Vytvoření teplotního profilu
K zadání teplotního profilu přepněte software z režimu Setup do režimu
Instrument. Podle Obr. 8 zadejte platný teplotní profil pro detekci
C. trachomatis DNA. Krok 50°C uložený v předvoleném nastavení odstraníte
tak, že jej označíte levým tlačítkem myši, přičemž přidržíte stisknuté tlačítko
Shift, a následně jej vymažete tlačítkem Backspace. Zkontrolujte, zda je objem
reakce nastaven na 25 µl. Volba 9600 Emulation by měla být aktivována.
Předvolená nastavení Auto Incrementu zůstávají nezměněná
(Auto Increment: 0.0°C, 0.0 Seconds).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
31
Obr. 8: Vytvoření teplotního profilu.
8.6.1.5 Uložení běhu PCR
Na tomto místě můžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je
později mohli použít ve změněném nebo nezměněném stavu. Uložíte-li
nastavení jako SDS Template (*.sdt) v adresáři Template Directory (místní disk
[C:]\Program
Files\ABI
PRISM
7000\Templates,
zavedeného
Applied
Biosystems), můžete tento soubor zvolit přímo z Template drop-down
seznamu v okně New Document. Předlohy uložené v jiných adresářích musí
být otevřeny pomocí funkce Browse. Před spuštěním běhu PCR dbejte prosím na
to, abyste jej znovu uložili jako SDS Document (*.sds). Tím zajistíte ukládání
dat nahromaděných v průběhu PCR.
8.6.1.6 Spuštění běhu PCR
Běh PCR spusťte volbou Start v položce nabídky Instrument nebo polem Start
v režimu Instrument.
32
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
8.6.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS
K detekci C. trachomatis DNA vytvořte na přístroji ABI PRISM 7700 SDS profil
podle následujících sedmi pracovních kroků (8.6.2.1 - 8.6.2.7). Veškeré údaje
se vztahují na ABI PRISM 7700 SDS software verzi 1.9.1. Podrobnosti o
programování ABI PRISM 7700 SDS si prosím prostudujte v příručce ABI PRISM
7700 SDS User`s Manual. Pro lepší přehled jsou potřebná nastavení na
obrázcích zvýrazněna černými rámečky.
8.6.2.1 Předvolená nastavení při vytváření nového běhu PCR
Na přístroji ABI PRISM 7700 SDS vyberte pod File položku New Plate a
nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 9). Svá
zadání potvrďte (OK).
Obr. 9: Předvolená nastavení při vytváření nového běhu PCR (New Plate).
8.6.2.2 Volba fluorescenčního barviva a přiřazení typu vzorku
Pomocí položky Sample Type Setup (režim Setup: Sample Type/Sample Type
Setup) přiřaďte dokumentu odpovídající barviva detektoru a odpovídající typ
vzorku. K průkazu C. trachomatis DNA a Interní kontroly pomocí
artus C. trachomatis TM PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher
uvedené v následující tabulce:
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
33
Průkaz
Reporter
Quencher
C. trachomatis DNA
FAM
TAMRA
Interní kontrola
(C. trachomatis TM IC)
VIC
TAMRA
Pro měření C. trachomatis DNA pomocí artus C. trachomatis TM PCR Kit
vyberte podle tabulky barvivo reporteru FAM. To platí pro standardy (STND),
vzorky (UNKN) a pro negativní kontroly (UNKN). K měření Interní kontroly
(IPC+) definujte VIC jako reporter. Jako quencher nastavte TAMRA. Přiřazení
barviv a typů vzorků v okně Sample Type Setup je zobrazeno na Obr. 10.
Obr. 10: Volba fluorescenčních barviv a přiřazení typu vzorku (Sample Type Setup).
Přiřazení typu vzorku k odpovídající funkci (Acronym) se provádí podle
následující tabulky:
Typ vzorku
vzorek
Funkce
Koncentrace
Quencher (Acronym)
(Quantity)
UNKN
-
Reporter
FAM
TAMRA
negativní
kontrola
UNKN
-
FAM
TAMRA
standard
STND
viz 1. Obsah
FAM
TAMRA
34
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
8.6.2.3 Přiřazení potřebných informací k pozicím destiček
Pro přiřazení detektorů a typů vzorků k jednotlivým pozicím destiček zvolte
odpovídající pole. Pak otevřete v režimu Setup dialogové okno Dye Layer a
přiřaďte příslušný reporter. Aktivujete-li pop-up menu Sample Type, tak v
zobrazeném seznamu znovu naleznete typy vzorků přiřazené reporteru v
Sample Type Setup (viz Obr. 11). Vyberte vhodný typ vzorku (viz tabulka v
8.6.2.2) a určete pomocí Dye Layer a nabídky Sample Type přiřazení ke
zbývajícím pozicím destičky. V poli Sample Name lze každému vzorku přiřadit
jméno. Pole definovaná jako Replicate (zadání názvu kontrolního vzorku do
kolonky Replicate) zprůměruje software vzhledem k jejich kvantifikovanému
množství původce a vypočítá jejich standardní odchylku.
Obr. 11/12: Přiřazení potřebných informací k pozicím destiček.
Standardní křivku vytvořte u každého běhu PCR pomocí všech s produktem
dodávaných Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 - 4) a pro
každý jednotlivý standard (Quantity, viz Obr. 12) uveďte příslušné koncentrace
(viz 1. Obsah). To je však možné pouze tehdy, jestliže pozice obsazené
standardy byly předem jako takové definovány pomocí nabídky Sample Type.
8.6.2.4 Vytvoření teplotního profilu
K zadání teplotního profilu přepněte na nabídku Thermal Cycler Conditions na
ploše Setup. Podle Obr. 13 zadejte pro detekci C. trachomatis DNA platný
teplotní profil. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 25 µl.
Předvolená nastavení časů Ramp a Auto Increment zůstávají nezměněná
(Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0°C, 0.0 Seconds).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
35
Obr. 13: Vytvoření teplotního profilu.
Kromě toho se v nabídce Thermal Cycler Conditions nachází volba Show
Data Collection. Zvolením této volby se dostanete do okna zobrazeného na
Obr. 14. Každá Ramp a Plateau teplota je opatřena symbolem sběru dat
(Data Collection Icon), který znázorňuje přijetí dat v tomto určitém okamžiku
běhu. Klepnutím odstraňte všechny symboly až na ten ve chvíli kroku
Annealing-Extension (Stage2/Step2), čímž ušetříte zbytečná fluorescenční
měření. Tak udržíte celkovou dobu běhu a množství dat co nejnižší.
36
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Obr. 14: Sběr dat (Data Collection).
8.6.2.5 Důležitá přídavná nastavení
K nastavení doby osvitu (vybuzení fluorescenčního barviva) a také pro volbu
souborů Pure Spectra a Background přejděte z režimu Setup na režim
Analysis. V nabídce Instrument, v podnabídce Diagnostics, zvolte nyní
aktivovanou položku Advanced Options. Proveďte nastavení podle Obr. 15.
Deaktivací funkce výběru Spectra Components (Analysis) se při novém
vyhodnocování již analyzovaných běhů automaticky použijí aktuální kalibrační
data, která byla do složky Spectra Components uložena ve chvíli vytváření
dat. Pro analýzu starších běhů za použití nově načtených Spectra Components
aktivujte prosím obě tato pole. Dbejte na to, že pro běh PCR s artus C.
trachomatis TM PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference
(Reference). Rovnoměrné rozložení barviva ROX na všechny reakční směsi
PCR jedné šarže pomocí promíchání C. trachomatis TM Master
zaručuje rozpoznání a přepočítání tube-to-tube variací (fluorescenční rozdíly
mezi různými reakčními směsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software
(normalizace).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
37
Upozornění: Doba osvitu (Exposure Time) při použití 96-ti
jamkových
reakčních destiček pro optická měření ve spojení s optickými lepicími foliemi
(Optical Adhesive Covers) nebo optickými zkumavkami s plochými víčky je
deset milisekund. Používáte-li optické zkumavky s vypouklými víčky, nastavte
tento časový údaj na 25 milisekund.
Obr. 15: Důležitá přídavná nastavení (Advanced Options).
8.6.2.6 Uložení běhu PCR
Na tomto místě můžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je
mohli později použít ve změněném nebo nezměněném stavu. Proto uložte
tento
soubor
ve
Stationary
File
Format.
Před
spuštěním
aktuálně
programovaného běhu PCR pamatujte na to, že jej musíte znovu uložit ve
Normal File Format. Tím zajistíte uložení dat nahromaděných v průběhu PCR.
38
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
8.6.2.7 Spuštění běhu PCR
Běh PCR spusťte volbou Run v položce nabídky Instrument nebo polem Run
v režimu Analysis.
8.6.3 Programování ABI PRISM 7900HT SDS
K detekci C. trachomatis DNA vytvořte na přístroji ABI PRISM 7900HT SDS
profil podle následujících šesti pracovních kroků (8.6.3.1 - 8.6.3.6). Veškeré
údaje se vztahují na ABI PRISM 7900HT SDS software verzi 2.1. Podrobnosti o
programování ABI PRISM 7900HT SDS si prosím prostudujte v příručce ABI
PRISM 7900HT SDS User Guide. Pro lepší přehled jsou potřebná nastavení
na obrázcích zvýrazněna černými rámečky.
8.6.3.1 Předvolená nastavení při vytváření nového běhu PCR
Na přístroji ABI PRISM 7900HT SDS vyberte pod File položku New a nastavte
pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 16). Dříve
uložená šablona (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) je k dispozici v
seznamu Template nebo volbou funkce Browse (viz
8.6.3.5 Uložení běhu PCR). Svá zadání potvrďte (OK).
Upozornění: artus C. trachomatis TM PCR Kit nelze použít ve spojení s 384
formátem destiček ABI PRISM 7900HT SDS.
Obr. 16: Předvolená nastavení při vytváření nového běhu PCR (New Document).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
39
8.6.3.2 Vytvoření/volba detektorů
V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, (alternativně zvolte režim
Setup/funkci
Add
Detector)
přiřaďte
dokumentu
odpovídající
barviva
detektorů. K průkazu C. trachomatis DNA a Interní kontroly pomocí
artus C. trachomatis TM PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher
uvedené v následující tabulce:
Průkaz
Reporter
Quencher
C. trachomatis DNA
FAM
TAMRA
Interní kontrola
(C. trachomatis TM IC)
VIC
Non Fluorescent
Tyto detektory vytvoříte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo
dole lokalizovanou volbu New.
Obr. 17: Vytvoření detektoru specifického
pro C. trachomatis (Detector
Manager).
Obr. 18: Vytvoření detektoru specifického
pro Interní kontrolu (Detector
Manager).
V okně, které se zobrazí, definujte (podle Obr. 17 a Obr. 18) kombinaci
reporter/quencher FAM/TAMRA pro průkaz C. trachomatis DNA, pro průkaz
Interní kontroly vyberte kombinaci VIC/Non Fluorescent. Potvrzením údajů
(OK) se vrátíte zpět do Detector Manager. Označte právě vytvořené detektory a
každý výběr přeneste klepnutím na volbu Copy to Plate Document do režimu
Setup (viz Obr. 19). Zavřete okno (Done).
40
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Obr. 19: Výběr detektorů (Detector Manager).
8.6.3.3 Přiřazení potřebných informací k pozicím destiček
Vámi v kapitole 8.6.3.2 zvolené detektory naleznete znovu po uzavření
Detector Manager (Done) seřazené v tabulce v režimu Setup (Well Inspector)
(viz Obr. 20).
Obr. 20: Přiřazení potřebných informací k pozicím destiček.
Označte pozice destičky, které jsou obsazené pro průkaz C. trachomatis DNA.
Aktivujte volbu Use u obou detektorů, čímž vybrané detektory přiřadíte k
označeným pozicím. Objeví se křížek. Pro pojmenování
jednotlivých
reakčních směsí zvolte odpovídající pozici na destičce a zadejte název do
položky Sample Name. Přitom pamatujte na to, že směsi se stejným Sample
Name a stejným přiřazením detektorů bude software považovat za replikáty a
zprůměruje je s ohledem na jejich kvantifikované množství původce. Pak
vyberte pro každý typ vzorku odpovídající funkci (Task) podle následující
tabulky:
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
41
Funkce
(Task)
Unknown
Typ vzorku
vzorek
Koncentrace
(Quantity)
-
Reporter
Quencher
FAM
TAMRA
negativní
kontrola
NTC
-
FAM
TAMRA
standard
Standard
viz 1. Obsah
FAM
TAMRA
Standardní křivku vytvořte u každého běhu PCR pomocí všech s produktem
dodávaných Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 - 4) a pro
každý jednotlivý standard (Quantity) uveďte příslušné koncentrace (viz
1. Obsah). Dbejte na to, že pro běh PCR s artus C. trachomatis TM PCR Kit
musí
být
ROX
nastaven
jako pasivní
reference
(Passive
Reference).
Rovnoměrné rozložení barviva ROX na všechny směsi PCR jedné šarže
pomocí promíchání C. trachomatis TM Master zaručuje rozpoznání a
přepočítání tube-to-tube variací (fluorescenční rozdíly mezi různými směsmi
PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace).
8.6.3.4 Vytvoření teplotního profilu
K zadání teplotního profilu přepněte software z režimu Setup do režimu
Instrument. Podle Obr. 21 zadejte pro detekci C. trachomatis DNA platný
teplotní profil. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 25 µl. Volba
9600 Emulation by měla být aktivována, předvolená nastavení času Ramp a
Auto Increment zůstávají nezměněna (Ramp Time: 0:00,
Auto Increment: 0.0°C, 0.0 Seconds).
42
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Obr. 21: Vytvoření teplotního profilu.
Kromě toho se v režimu Instrument nachází volba Data Collection. Zvolením
této volby se dostanete do okna zobrazeného na Obr. 22. Každá Ramp a
Plateau teplota je opatřena jedním symbolem sběru dat (Data Collection Icon),
který znázorňuje přijetí dat v tomto určitém okamžiku běhu. Odstraňte
všechny
symboly
až
na
ten
ve
chvíli
kroku
Annealing-Extension
(Stage2/Step2), čímž ušetříte zbytečná fluorescenční měření. Tak udržíte
celkovou dobu běhu a množství dat co nejnižší.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
43
Obr. 22: Sběr dat (Data Collection).
8.6.3.5 Uložení běhu PCR
Na tomto místě můžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je
mohli později použít ve změněném nebo nezměněném stavu. Uložíte-li
nastavení jako ABI PRISM SDS Template Document (*.sdt) v adresáři Template
Directory
([D:]\Program
Files\Applied
Biosystems\
SDS
2.1\Templates,
zavedeném Applied Biosystems), můžete tento soubor zvolit přímo z Template
seznamu v okně New Document. Předlohy uložené v jiných adresářích musí být
otevřeny pomocí funkce Browse. Před spuštěním aktuálního běhu PCR dbejte
prosím na to, abyste jej znovu uložili jako ABI PRISM SDS Document (*.sds).
Tím zajistíte ukládání dat nahromaděných v průběhu PCR.
8.6.3.6 Spuštění běhu PCR
Běh PCR spusťte volbou Start v položce nabídky Instrument.
44
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
9. Vyhodnocení
Při uvedení přístroje do provozu je bezpodmínečně nutná jsoucí platná
kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background
Component File). Tyto kalibrační soubory slouží následujícím způsobem pro
přesný výpočet výsledků:
Veškeré přístrojem podmíněné rušivé signály, které ovlivňují měření, jsou
eliminovány programem Sequence Detection Software přístrojů ABI PRISM
Sequence Detection Systems za pomoci Background Component File.
Navíc se u vícebarevných analýz vyskytují mezi emisními spektry jednotlivých
fluorescenčních barviv interference. Software ABI PRISM SDS kompenzuje tyto
interference přepočítáním pomocí spektrálních dat jednotlivých
barviv
uložených v Pure Spectra Component File. Přiřazení fluorescenčních dat
shromážděných
v
průběhu
PCR
v
celém
měřitelném
spektru
k
naprogramovaným detektorům provádí software také pomocí souboru Pure
Spectra Component. Následně se zjištěná fluorescenční data jednotlivých
barviv rozdělí pro přepočítání tube-to-tube variací (fluorescenční rozdíly mezi
různými reakčními směsmi PCR) pomocí signálu pasivní reference (ROX).
Tímto způsobem normalizované signály lze vyhodnotit pomocí Amplification
Plot.
Kalibrační soubory použité při vyhodnocení běhu PCR jsou automaticky
zajištěny při ukládání dat. Pokud nejsou instalovány žádné kalibrační
soubory, vytvořte tyto soubory podle pokynů v ABI PRISM SDS
User
Guide/Manual.
Pokud do běhu PCR integrujete více než jeden systém artus TM PCR (dbejte na
teplotní profil), analyzujte prosím tyto testovací systémy odděleně. Vzorky s
totožným označením (Sample Name) a přiřazením detektoru identifikuje
ABI PRISM 7000 a 7900HT SDS Software automaticky jako replikáty a
zprůměruje je s ohledem na kvantifikované množství původce.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
45
Může dojít k následujícím výsledkům:
1. Je detekován fluorescenční signál FAM.
Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje C. trachomatis DNA.
V tomto případě je detekce fluorescenčního signálu VIC (Interní kontrola) podružná,
protože vysoké výchozí koncentrace C. trachomatis DNA (pozitivní fluorescenční
signál FAM) mohou vést k redukovanému až chybějícímu fluorescenčnímu signálu
Interní kontroly (kompetice).
Pokud se po cyklu 40 objeví pozitivní signál, doporučuje se PCR zopakovat. Při
opakovaně pozitivním výsledku se vzorek považuje za pozitivní. Při negativním
výsledku nelze učinit žádný jednoznačný závěr. V tomto případě se doporučuje nová
izolace.
2. Není detekován žádný fluorescenční signal FAM, nýbrž pouze fluorescenční
signál VIC (signál Interní kontroly).
Ve vzorku není prokazatelná žádná C. trachomatis DNA. Lze jej proto
považovat za negativní.
Při negativní C. trachomatis PCR vylučuje detekovaný signál Interní kontroly
možnost inhibice PCR.
3. Není detekován ani fluorescenční signál FAM, ani fluorescenční signál
VIC.
Není možné učinit diagnostický závěr.
Pokyny týkající se zdrojů chyb a jejich odstranění jsou uvedeny v kapitole
10. Řešení problémů.
Příklady pozitivních a negativních reakcí PCR jsou uvedeny na obrázcích
23/24 (ABI PRISM 7000 SDS), 25/26 (ABI PRISM 7700 SDS) a 27/28 (ABI
PRISM 7900HT SDS).
46
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Obr. 23: Průkaz Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 4) detekcí fluorescenčního signálu FAM (ABI PRISM 7000
SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola).
Obr. 24: Průkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenčního signálu
VIC (ABI PRISM 7000 SDS) při současné amplifikaci
Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 - 4). NTC:
non-template control (negativní kontrola).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
47
Obr. 25: Průkaz Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 4) detekcí fluorescenčního signálu FAM (ABI PRISM 7700
SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola).
Obr. 26: Průkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenčního signálu
VIC (ABI PRISM 7700 SDS) při současné amplifikaci
Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 - 4). NTC:
non-template control (negativní kontrola).
48
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Obr. 27: Průkaz Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 4) detekcí fluorescenčního signálu FAM (ABI PRISM 7900HT
SDS). NTC: non-template control (negativní
kontrola).
Obr. 28: Průkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenčního signálu
VIC (ABI PRISM 7900HT SDS) při současné amplifikaci
Kvantifikačních standardů (C. trachomatis TM QS 1 - 4). NTC:
non-template control (negativní kontrola).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
49
10. Řešení problémů
Žádný
fluorescenční
signál
FAM
při
pozitivních
kontrolách
(C. trachomatis TM QS 1 - 4):
•
Volba barviva detektoru při analýze dat PCR neodpovídá protokolu.
�K
analýze
dat zvolte
barvivo
detektoru
FAM
pro analytickou
C. trachomatis PCR a barvivo detektoru VIC pro PCR Interní kontroly.
•
Nastavení uvedená v položce Options k vyhodnocení získaných dat
(Extension Phase Data Extraction) se neshodují s nastaveními Data
Collection (pro ABI PRISM 7700 SDS viz 8.6.2.4 Vytvoření teplotního
profilu, pro ABI PRISM 7900HT SDS viz 8.6.3.4 Vytvoření teplotního
profilu).
� Analyzujte běh PCR s opraveným nastavení a zopakujte vyhodnocení
(Analysis).
•
Naprogramování teplotního profilu ABI PRISM Sequence Detection
Systems je chybné.
� Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz
8.6 Programování ABI PRISM SDS).
•
PCR reakce byla chybně sestavena.
� Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (viz
8.5 Příprava PCR) a popř. PCR zopakujte.
•
Podmínky
skladování
jednoho
nebo
více
komponentů
soupravy
neodpovídají předpisům uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla
překročena doba použitelnosti soupravy artus C. trachomatis TM PCR Kit.
� Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti
reagencií (viz štítek soupravy) a použijte popř. novou soupravu.
Slabý nebo chybějící signál Interní kontroly (fluorescenční signál
VIC;
odchylka větší než Ct = 22 ± 3; threshold: 0,05) při současné nepřítomnosti
fluorescenčního signálu FAM specifické C. trachomatis PCR:
•
Podmínky PCR neodpovídají protokolu.
� Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a popř. PCR zopakujte s
opraveným nastavením.
50
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
•
PCR byla inhibována.
� Ujistěte se, že používáte námi doporučený postup izolace (viz
8.2 Izolace DNA) a držte se přesně předpisů výrobce.
� Přesvědčte se, že byl při izolaci DNA před elucí proveden dodatečný
doporučený centrifugační krok k úplnému odstranění zbytků etanolu
(viz 8.2 Izolace DNA).
•
Během izolace dochází k úbytku DNA.
� Byla-li k izolaci přidána Interní kontrola, může nepřítomnost signálu
Interní kontroly znamenat úbytek DNA během izolace. Ujistěte se, že
používáte námi doporučený postup izolace (viz 8.2 Izolace DNA) a
držte se přesně předpisů výrobce.
•
Podmínky
skladování
jednoho
nebo
více
komponentů
soupravy
neodpovídají předpisům uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla
překročena doba použitelnosti soupravy artus C. trachomatis TM PCR Kit.
� Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti
reagencií (viz štítek soupravy) a použijte popř. novou soupravu.
Fluorescenční signál FAM analytické PCR při negativních kontrolách.
•
Během přípravy PCR došlo ke kontaminaci.
� Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi.
� Uzavřete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení
zkoumaného vzorku.
� Pipetujte pozitivní kontroly zásadně jako poslední.
�
Ujistěte
se,
že
jsou
pracovní
plochy
a
přístroje
pravidelně
dekontaminovány.
•
Během izolace dochází ke kontaminaci.
� Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzorků za užití nových reagencií.
�
Ujistěte
se,
že
jsou
pracovní
plochy
a
přístroje
pravidelně
dekontaminovány.
Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší
technickou podporu.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
51
11. Specifikace
11.1 Analytická senzitivita
Pro zjištění analytické senzitivity artus C. trachomatis TM PCR Kit byla
vytvořena řada ředění standardů od 100 do nominálně 0,0625 C.
*
trachomatis- ekvivalentů kopie /µl. Ta byla následně analyzována za použití
artus C. trachomatis TM PCR Kit s ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence
Detection Systems. Experimenty byly pro každý přístroj provedeny ve třech
různých
dnech
formou
osminásobných určení. Výsledky byly zjištěny
probitovou analýzou. Jejich grafické vyhodnocení (ABI PRISM 7000 SDS) je
zobrazeno na Obr. 29.
Limit detekce (p = 0,05)
ABI PRISM 7000 SDS
0,3 kopií/µl
ABI PRISM 7700 SDS
0,2 kopií/µl
ABI PRISM 7900HT SDS
0,2 kopií/µl
To znamená, že je s 95 % pravděpodobností detekováno 0,3 kopií/µl (ABI PRISM
7000 SDS), 0,2 kopií/µl (ABI PRISM 7700 SDS) resp. 0,2 kopií/µl (ABI PRISM
7900HT SDS).
*
U zde použitého standardu se jedná o klonovaný PCR produkt, jehož koncentrace byla zjištěna
spektrální a fluorescenční fotometrií.
52
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Probitová analýza: Chlamydia trachomatis (ABI PRISM 7000 SDS)
Obr. 29: Analytická
senzitivita
(ABI PRISM 7000 SDS).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
11.2 Specificita
Specificita artus C. trachomatis TM PCR Kit je v první řadě zaručena výběrem
primerů a sond, jakož i volbou přísných reakčních podmínek. Primery a sondy
byly na základě sekvenční analýzy přezkoušeny na eventuální homologie se
všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Detekovatelnost všech
sérovarů byla zajištěna jak pomocí alignmentu databáze, tak pomocí
PCR na ABI PRISM 7000 SDS s následujícími sérovary (viz Tabulka 1):
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
53
Tabulka 1: Testování specificity sérovarů.
¤
+
Interní
kontrola
(VIC)
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
¤
+
+
C. trachomatis
(FAM)
Chlamydia
Sérovary
Zdroj
C. trachomatis
A
ATCC VR-571B
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
C. trachomatis
¤
B
Ba
C
D
E
F
G
H
I
J
K
LGV I
LGV II
LGV II
LGV III
ATCC VR-573
ATCC VR-347 (prep 1)
ATCC VR-872
ATCC VR-885
ATCC VR-348B
ATCC VR-346
ATCC VR-878
ATCC VR-879B
ATCC VR-880
ATCC VR-886
ATCC VR-887
ATCC VR-901B
ATCC VR-902B
ATCC VR-577
ATCC VR-903
ATCC: American Type Culture Collection
Validace specificity byla provedena na 100 různých C. trachomatis
negativních vzorcích moči a 30 negativních výtěrových vzorcích, které spolu s
C. trachomatis specifickými primery a sondami obsaženými v C. trachomatis
TM Master negenerovaly žádný signál.
K určení specificity artus C. trachomatis TM PCR Kit byla kontrolní skupina
uvedená v Tabulce 2 testována na křížovou reaktivitu. Žádný z testovaných
původců nebyl reaktivní.
54
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Tabulka 2: Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciálně křížově
reaktivních původců.
C. trachomatis
(FAM)
Interní kontrola
(VIC)
Salmonella typhimurium
-
+
Staphylococcus aureus
-
+
Peptostreptococcus productus
-
+
Neisseria gonorrhoeae
-
+
Acinetobacter spp.
-
+
Escherichia coli
-
+
Klebsiella pneumoniae
-
+
Gardnerella vaginalis
-
+
Streptococcus agalactiae
-
+
Streptococcus pyogenes
-
+
Proteus mirabilis
-
+
Haemophilus influenzae
-
+
Herpes simplex virus 1 a 2
-
+
Candida albicans
-
+
Candida glabrata
-
+
Chlamydia psittaci
-
+
Chlamydia pneumoniae
-
+
Kontrolní skupina
11.3 Přesnost
Údaje o přesnosti pro artus C. trachomatis TM PCR Kit umožňují stanovení
celkové variability testovacího systému. Tato celková variabilita se skládá z
Intra-Assay variability (variabilita vzorků stejné koncentrace v rámci jednoho
pokusu),
z
Inter-Assay
variability
(variabilita
způsobená
provedením
experimentu různými osobami v jedné laboratoři a užitím různých přístrojů
stejného typu) a z Inter-Batch variability (variabilita způsobená použitím
různých šarží). Přitom byla vždy vypočítána standardní odchylka, variance a
koeficient variace jak pro specifickou PCR původce, tak i pro PCR Interní
kontroly.
Tyto údaje byly pro artus C. trachomatis TM PCR Kit stanoveny na základě
Kvantifikačního standardu s nejnižší koncentrací (QS 4; 10 kopií/µl).
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
55
Experimenty byly provedeny formou osminásobných určení. Vyhodnocení
výsledků bylo provedeno na základě Ct hodnot amplifikačních křivek (Ct:
threshold cycle, viz Tabulka 3) a z toho určených kvantitativních hodnot v
kopiích/µl (viz Tabulka 4). Celková variabilita libovolného vzorku uvedené
koncentrace činí tedy 2,80 % (Ct) resp. 13,41 % (konc.), pro průkaz Interní
kontroly 2,46 % (Ct). Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech dílčích
hodnot zjištěných variabilit.
Tabulka 3: Údaje o přesnosti na základě Ct hodnot.
Standardní
odchylka
Intra-Assay variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Intra-Assay variabilita:
Interní kontrola
Inter-Assay variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Inter-Assay variabilita:
Interní kontrola
Inter-Batch variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Inter-Batch variabilita:
Interní kontrola
Celková variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Celková variabilita:
Interní kontrola
56
Variance
Koeficient
variace [%]
0,36
0,13
1,20
0,22
0,05
1,01
0,37
0,13
1,22
0,23
0,05
1,08
0,76
0,58
2,44
0,68
0,46
3,13
0,86
0,74
2,80
0,53
0,28
2,46
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Tabulka 4: Údaje o přesnosti na základě kvantitativních hodnot (v kopiích/µl).
Standardní
odchylka
Intra-Assay variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Inter-Assay variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Inter-Batch variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Celková variabilita:
C. trachomatis TM QS 4
Variance
Koeficient
variace [%]
0,89
0,79
8,86
1,64
2,68
16,19
1,26
1,58
12,46
1,35
1,83
13,41
11.4 Robustnost
Přezkoušení robustnosti slouží k stanovení celkové četnosti chyb artus C.
trachomatis TM PCR Kit. Za tímto účelem bylo 100 C. trachomatis
negativních vzorků moči smíseno s 1 kopií/µl elučního objemu kontrolní
C. trachomatis DNA (cca třínásobná koncentrace analytické
hranice
senzitivity), stejně jako 30 výtěrů s 1 kopií/µl. Všechny výtěrové vzorky a
vzorky moči byly pomocí QIAamp Viral RNA Mini Kit izolovány (viz
8.2 Izolace DNA) a pomocí artus C. trachomatis TM PCR Kit analyzovány.
četnost chyb pro C. trachomatis činila u všech vzorků 0 %. Robustnost Interní
kontroly byla dodatečně přezkoušena izolací a analýzou 100 C. trachomatis
negativních vzorků moči a 60 negativních výtěrů. Celková četnost chyb činila
0 %. Inhibice nebyly pozorovány. Robustnost artus C. trachomatis TM PCR Kit
činí tedy ≥ 99 %.
11.5 Reprodukovatelnost
Údaje o reprodukovatelnosti jsou pořizovány za účelem pravidelného
hodnocení výkonnosti artus C. trachomatis TM PCR Kit a výkonnostního
srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základě účastí na
mezilaboratorních pokusech.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
57
11.6 Diagnostické hodnocení
artus C. trachomatis TM PCR Kit byl v kombinaci s ABI PRISM 7000 SDS
podroben v jedné studii srovnání s LCx® C. trachomatis Assay* a s APTIMA®
Combo 2™ C. trachomatis Assay*. Zkoumáno bylo 150 retrospektivních
výtěrových vzorků (50 uretrálních výtěrů, 50 výtěrů z cervixu a 50 z vulvy) a
100 retrospektivních vzorků moči (50 mužských a 50 ženských).
Všechny vzorky byly předtím v rámci rutinní diagnostiky testovány pomocí
LCx a APTIMA Combo 2™ Assay. Vzorky byly pro tyto analýzy zpracovány
podle návodu výrobce. Následně byly vzorky až do analýzy pomocí artus C.
trachomatis TM PCR Kit skladovány při -20°C. Před touto analýzou proběhla
izolace DNA za použití QIAamp Viral RNA Mini Kit.
Pro retrospektivní vzorky moči a výtěrů činí diagnostická senzitivita artus C.
trachomatis TM PCR Kit 99,2 % a specificita 98,4 %. Poměr inhibicí ležel u 0
%. Výsledky jsou znázorněny v Tabulce 5.
Tabulka 5: Výsledky srovnávací validační studie.
Počet
vzorků
*
Podíl
pozitivních
vzorků
(určeno pomocí
LCx/APTIMA Combo
2 Assay)
Srovnání s LCx
(artus/LCx)
Srovnání s Aptima
Combo 2 (artus/Aptima
Combo
2™)
Senzitivita
Specificita
Senzitivita
Specificita
Uretrální výtěry
50
50 %
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
Výtěry z cervixu
50
50 %
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
Výtěry z vulvy
50
50 %
96 %
(24/25)
100 %
(25/25)
96 %
(24/25)
100 %
(25/25)
Moč ženy
50
50 %
100 %
(25/25)
92 %
(23/25)
100 %
(25/25)
92 %
(23/25)
Moč muži
50
50 %
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
100 %
(25/25)
Celkově
250
50 %
99,2 %
(124/125)
98,4 %
(123/125)
99,2 %
(124/125)
98,4 %
(123/125)
LCx C. trachomatis Assay se zakládá na technologii ligázové řetězové reakce (LCR), APTIMA
Combo 2™ Assay na transcription mediated amplification (TMA).
58
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
12. Zvláštní pokyny pro použití produktu
•
Všechny reagencie se smí používat výhradně pro diagnostiku in vitro.
•
Prostředek by měli používat pouze pracovníci, kteří jsou speciálně
poučeni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro.
•
Přesné dodržování protokolu je bezpodmínečně nutné k dosažení
optimálních výsledků PCR.
•
Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích
jednotlivých
komponentů.
Nepoužívejte
reagencie
s
prošlou
trvanlivostí.
13. Bezpečnostní informace
Bezpečnostní informace k soupravě artus C. trachomatis TM PCR Kit naleznete
v odpovídajících bezpečnostních listech (safety data sheets, SDS). Tyto listy
jsou k dispozici v podobě kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na
www.qiagen.com/safety.
14. Kontrola kvality
V
souladu
se
systémem
managementu
jakosti
společnosti
QIAGEN
certifikovaným podle norem ISO 9001 a ISO 13485 byla každá šarže artus
C. trachomatis TM PCR Kit testována podle předem stanovených specifikací,
aby byla zaručena jednotná kvalita produktu.
15. Literatura
(1) Eickhoff M, Laue T, Ruckes T, Cramer SO, Krupp G, Tiemann C. UltraRapid Detection of Chlamydia trachomatis by Real-Time PCR in the
LightCycler® using SYBR Green Technology or 5’-Nuclease Probes.
Clin. Lab. 2003; 49: 217 - 225.
(2) Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol.
Infect. 2004; 10 (3): 190 - 212.
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
59
16. Vysvětlení symbolů
Použijte do
Číslo šarže
Výrobce
Katalogové číslo
Číslo materiálu
Manuál
Prostředky zdravotnické techniky pro in vitro diagnostiku
Mezinárodní číslo obchodní položky GTIN
Obsahuje reagencie pro <N> reakcí
<N>
Teplotní rozmezí
Kvantifikační standard
Interní kontrola
60
artus C. trachomatis TM PCR Kit
01/2015
Poznámka
1046950CS 151012836
Sample & Assay Technologies
Poznámka
Poznámka
1046950CS 151012836
Sample & Assay Technologies
artus C. trachomatis TM PCR Kit
Ochranné známky a vyloučení odpovědnosti
QIAGEN®, QIAamp®, artus® (QIAGEN Group); ABI PRISM® (Applera Corporation); MicroAmp®, GeneAmp®
(Applied Biosystems); IDEIA™ (DakoCytomation); ClamTrans™ (Bartels, Inc.); LCx® (Abbott Laboratories); Aptima®
,Combo 2™ (Gen-Probe, Inc.); Dacron® (Invista, Inc.); LightCycler® (Roche Diagnostics).
Registrované názvy, ochranné známky etc. použité v tomto manuálu nelze považovat za nechráněné zákonem,
ani když nejsou jako takové označeny.
artus C. trachomatis TM PCR Kit je diagnostická souprava označená značkou CE v souladu s evropskou směrnicí
98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro. Souprava není dostupná ve všech zemích.
Soupravy QIAamp Kit jsou určeny pro obecné laboratorní použití. Údaje produktu nebo jeho prezentace
nejsou určeny k tomu, aby podávaly informace o diagnóze, prevenci nebo léčení nemoci.
Koupě souprav artus PCR Kit zahrnuje limitovanou licenci pro jejich použití v procesu polymerázové řetězové
reakce (PCR) v rámci humánní a veterinární in vitro diagnostiky, ve spojení s termocyklerem, jehož použití při
automatizovaném provedení PCR je kryto předem splatným licenčním poplatkem, který se odvádí buď
platbou společnosti Applied Biosystems nebo koupí autorizovaného termocykleru. Technologie PCR je chráněna
národními patentními právy ekvivalentními k USA patentům čís. 5.219.727 a 5.322.770 a 5.210.015 a
5.176.995 a 6.040.166 a 6.197.563 a 5.994.056 a 6.171.785 a 5.487.972 a 5.804.375 a 5.407.800 a
5.310.652 a
5.994.56 ; vlastněno firmou F. Hoffmann-La Roche Ltd.
© 2007-2015 QIAGEN, všechna práva vyhrazena.
www.qiagen.com
Australia  [email protected]
Austria  [email protected]
Belgium  [email protected]
Brazil  [email protected]
Canada  [email protected]
China  [email protected]
Denmark  [email protected]
Finland  [email protected]
France  [email protected]
Germany  [email protected]
Hong Kong  [email protected]
India  [email protected]
Ireland  [email protected]
Italy  [email protected]
Japan  [email protected]
Korea (South)  [email protected]
Luxembourg  [email protected]
Mexico  [email protected]
The Netherlands  [email protected]
Norway  [email protected]
Singapore  [email protected]
Sweden  [email protected]
Switzerland  [email protected]
UK  [email protected]
USA  [email protected]
Sample & Assay Technologies
USA  Orders 800-426-8157  Fax 800-718-2056  Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)
1046950CS 151012836