Spektrální a další charakterizační metody

Transkript

Vznik tohoto výukového materiálu byl podpořen projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253.
Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením
na spektrální metody
Materiál je určen studentům k předmětu Úvod do spektrálních metod pro analýzu léčiv
bakalářského studia oboru Analýza léčiv
Zpracoval a editoval kolektiv autorů pod vedením prof. Dr. RNDr. Pavla Matějky
Obsah
Charakterizace farmaceutických látek a jejich systémů se zaměřením na spektrální metody ............... 1
1.
Opticko spektroskopická charakterizace farmaceutických systémů ............................................... 7
1.1.
Úvod – charakterizace pevných farmaceutických látek a léčiv ............................................... 7
1.2.
Elektromagnetické záření a jeho základní charakteristiky ...................................................... 8
1.3.
Vibrační spektroskopie .......................................................................................................... 10
1.3.1.
Základní uspořádání spektrometru ................................................................................... 11
1.3.2.
Infračervená spektroskopie v blízké a střední infračervené oblasti .................................. 12
1.3.3.
Instrumentace pro střední infračervenou oblast .............................................................. 13
1.3.4.
Technika zeslabeného úplného odrazu - ATR.................................................................... 15
1.3.5.
Aplikace vibrační spektroskopie ........................................................................................ 15
1.3.6.
Příklady farmaceutického využití ATR-FT-IR spektroskopie .............................................. 16
1.4.
Spektroskopie v blízké infračervené oblasti .......................................................................... 17
1.4.1.
Teorie absorpce v blízké infračervené oblasti ................................................................... 17
1.4.2.
Instrumentace pro blízkou infračervenou oblast .............................................................. 18
1.4.3.
Kvalitativní a kvantitativní analýza NIR dat ....................................................................... 21
1.4.4.
Farmaceutické aplikace NIR spektroskopie ....................................................................... 23
1.4.5.
NIR spektroskopie a polymorfismus .................................................................................. 26
1.4.6.
Pseudopolymorfismus, hydráty a solváty ......................................................................... 27
1.4.7.
Ověřování léčiv a odhalování padělaných a klonovaných verzí ........................................ 28
1.4.8.
Příklady dalšího farmaceutického použití NIR spektrometrie ........................................... 29
1.5.
Ramanova spektroskopie ...................................................................................................... 31
Tento materiál vychází z překladu dvou anglických knih a některých dale uvedených podkladů.
1) Solid State Characterization of Pharmaceuticals, First Edition. Edited by Richard A. Storey
and Ingvar Ymen. © 2011 Blackwell Publishing Ltd. Published 2011 by Blackwell Publishing
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
2) Process Analytical Technology: Spectroscopic Tools and Implementation Strategies for the
Chemical and Pharmaceutical Industries, Second Edition, Edited by Katherine A. Bakeev. ©
2010 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 978-0-470-72207-7
1
1.5.1.
Teorie Ramanova rozptylu ................................................................................................ 31
1.5.2.
Instrumentace Ramanovy spektroskopie .......................................................................... 34
1.5.3.
Farmaceutické aplikace Ramanovy spektroskopie............................................................ 35
1.5.4.
Ramanova spektrometrie jako technika pro proces monitorování, degradace, stability a
krystalizace ........................................................................................................................................ 36
1.5.5.
Polymorfismus a použití Ramanovy spektroskopie ........................................................... 40
1.5.6.
Pseudopolymorfismus a Ramanova spektroskopie........................................................... 42
1.5.7.
Využití Ramanovy spektroskmopie jako procesní analytické techniky v rámci PAT ......... 44
1.5.8.
Ramanova spektroskopie – další příklady farmaceutických aplikací................................. 46
1.6.
Chemické zobrazování a mapovací mikrospektroskopické techniky .................................... 48
1.6.1.
Principy spektrálního zobrazování a mapování ................................................................. 48
2. Spektroskopie nukleární magnetické resonance jako nástroj pro studium farmaceutických
systémů ................................................................................................................................................. 51
2.1.
Principy spektroskopie nukleární magnetické resonance ......................................................... 51
2.2.
Farmaceutické aplikace NMR spektroskopie ............................................................................ 53
2.3.
Využití NMR spektroskopie těžších jader ve farmacii ............................................................... 53
2.4.
NMR spektroskopie a polymorfismus ....................................................................................... 54
2.5.
Analýza léčivé látky a lékové formy pomocí NMR..................................................................... 56
2.5.1.
3.
Konformace, stereochemie a interakce vodíkových vazeb ................................................... 56
Terahertzová pulzní spektroskopie ............................................................................................... 57
3.1.
Teoretický úvod k THz spektroskopii ......................................................................................... 57
3.2.
Instrumentace THz spektroskopie ............................................................................................. 57
3.3.
Příprava vzorku a manipulace s ním .......................................................................................... 59
3.4.
Nedávný rozvoj THz instrumentace .......................................................................................... 60
3.5.
Farmaceutické aplikace THz spektroskopie............................................................................... 60
4.
Termická analýza – konvenční techniky ........................................................................................ 74
4.1.
Úvod do termické analýzy ......................................................................................................... 74
4.2.
Diferenční skenovací kalorimetrie ............................................................................................. 74
4.2.1.
Měření tepelného toku ......................................................................................................... 75
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
2
4.2.2.
Derivační křivky při DSC ......................................................................................................... 76
4.2.3.
Praktické pokyny pro DSC experiment .................................................................................. 77
4.2.4.
Enkapsulace pro DSC měření ................................................................................................. 77
4.2.5.
Teplotní rozsah běžných DSC měření .................................................................................... 79
4.2.6.
Rychlost skenování při DSC experimentu .............................................................................. 80
4.2.7.
Ustavení rovnováhy v DSC přístroji ....................................................................................... 81
4.2.8.
Kalibrace DSC ......................................................................................................................... 82
4.2.9.
Faktory ovlivňující DSC kalibraci ............................................................................................ 82
4.2.10.
Systém DSC s dvojitou pecí.................................................................................................... 83
4.2.11.
Systém DSC s jednoduchou pecí............................................................................................ 84
4.3.
4.3.1.
Diferenční termická analýza (DTA) ............................................................................................ 85
Modulovaný profil teploty..................................................................................................... 86
4.4.
Postupné/krokové metody termické analýzy............................................................................ 87
4.5.
Termogravimetrická analýza (TGA) ........................................................................................... 88
4.5.1.
Design přístroje pro TGA ....................................................................................................... 88
4.5.2.
TGA kalibrace – základní pokyny ........................................................................................... 89
4.5.3.
Praktická upozornění pro TGA experiment ........................................................................... 89
4.5.4.
Interpretace TGA záznamu vzorku ........................................................................................ 92
4.6.
Dynamická mechanická analýza (DMA) .................................................................................... 93
4.6.1.
Definice dynamické mechanické analýzy .............................................................................. 93
4.6.2.
Principy dynamické mechanické analýzy .............................................................................. 94
4.7.
Zjištění chování pevných krystalických látek v průběhu tání .................................................... 97
4.7.1.
Vyhodnocení přechodu bodu tání ......................................................................................... 98
4.7.2.
Určení bodu tání pro identifikaci vzorků ............................................................................... 99
4.8.
Polymorfismus a termická analýza .......................................................................................... 100
4.8.1.
Význam polymorfismu ve farmaceutických aplikacích........................................................ 101
4.8.2.
Termodynamické a kinetické aspekty polymorfismu: enantiotropie a monotropie........... 102
4.8.3.
Charakterizace polymorfů pomocí diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) ...................... 105
4.8.4.
Zjišťování polymorfní čistoty pomocí diferenční skenovací kalorimetrie ........................... 108
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
3
4.8.5.
Interpretace naměřených DSC termogramů vzorků vykazujících polymorfismus .............. 113
4.8.5.1.
Křivky typu 1: Přechod pevná látka-pevná látka ............................................................. 113
4.8.5.2.
Křivky typu 2: Rekrystalizace kapalina-tavenina ............................................................. 114
4.8.5.3.
Křivky typu 3: Zjišťování bodu tání .................................................................................. 114
4.9.
Solváty a hydráty (pseudopolymorfismus) a termická analýza ............................................... 115
4.9.1.
Faktory ovlivňující experimentální DSC křivky hydrátů a solvátů ....................................... 115
4.9.2.
Typy desolvatace/dehydratace v termické analýze ............................................................ 117
4.9.2.1.
Křivky typu 1: Dehydratace/desolvatace bez rekrystalizace ........................................... 117
4.9.2.2.
Křivky typu 2: Dehydratace/desolvatace provázená rekrystalizací ................................ 119
4.10.
Spřažená emisní termogravimetrická analýza (EGA) a simultánní měření ......................... 120
4.11.
Složení amorfních látek a jejich význam ve farmacii ........................................................... 122
4.11.1.
Úvod k amorfním látkám ..................................................................................................... 122
4.11.2.
Charakterizace amorfní pevné látky pomocí termických metod: teplota skelného přechodu
123
4.11.3.
Kvantifikace amorfních látek použitím diferenční skenovací kalorimetrie ......................... 126
4.12.
Stanovení čistoty preparátů použitím diferenční skenovací kalorimetrie .......................... 129
4.12.1.
Typy nečistot ve farmacii..................................................................................................... 129
4.12.2.
Diferenční skenovací kalorimetrie jako metoda pro stanovení čistoty ve farmacii ............ 130
4.12.3.
Praktické provedení termické analýzy a potenciální interference ...................................... 132
4.13.
Kompatibilita pomocných látek........................................................................................... 135
4.13.1.
Screening kompatibility pomocné látky pomocí diferenční skenovací kalorimetrie .......... 136
5.
Mikroskopie ................................................................................................................................. 142
5.1.
Úvod k mikroskopickým technikám ........................................................................................ 142
5.2.
Mikroskop jako analytický přístroj .......................................................................................... 143
5.3.
Jaký mikroskop použít? ........................................................................................................... 144
5.4.
Optická mikroskopie ................................................................................................................ 145
5.4.1.
Polarizační optický mikroskop pro studium vlastností látek v pevné fázi ........................... 147
5.4.2.
Příprava vzorku pro optickou mikroskopii........................................................................... 150
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
4
5.4.3.
Charakterizace krystalických a amorfních materiálů s využitím polarizační optické
mikroskopie ......................................................................................................................................... 152
5.4.4.
Určování optických vlastností krystalů ................................................................................ 153
5.4.5.
Měření indexu lomu pevných látek ..................................................................................... 161
5.4.6.
Určení mikrorozpustnosti pevných látek............................................................................. 162
5.5.
Tvar krystalů ............................................................................................................................ 164
5.6.
Velikost částic .......................................................................................................................... 166
5.7.
Optická mikroskopie za nestandardních podmínek ................................................................ 168
5.7.1.
Termomikroskopie .............................................................................................................. 169
5.7.2.
Stupeň vlhkosti .................................................................................................................... 178
5.7.3.
Stolek pro mrazové sušení .................................................................................................. 179
5.7.4.
Výzkum tekutých krystalů s využitím optické mikroskopie za nestandardních podmínek . 180
5.8.
Skenovací elektronová mikroskopie ........................................................................................ 182
5.8.1.
Princip řádkovací elektronové mikroskopie (SEM).............................................................. 185
5.8.2.
Příprava vzorku pro řádkovací elektronovou mikroskopii .................................................. 187
5.8.3.
Interakce elektronového paprsku se vzorkem .................................................................... 190
5.8.3.1.
Sekundární elektrony ...................................................................................................... 191
5.8.3.2.
Zpětně rozptýlené elektrony ........................................................................................... 193
5.8.3.3.
Rentgenové záření v elektronové mikroskopii ................................................................ 195
5.8.3.4.
Katodoluminiscence ........................................................................................................ 195
5.8.3.5.
Environmentální SEM a VP SEM (mód s proměnným tlakem - „variable pressure“ mód)
196
5.8.4.
5.9.
Kvantitativní analýza SEM obrazů ....................................................................................... 198
Prvková rentgenová mikroanalýza .......................................................................................... 200
5.9.1.
Detekce rentgenového záření ............................................................................................. 201
5.9.2.
Rentgenové emisní spektrum.............................................................................................. 202
5.9.3.
Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza jednotlivých částic a mapování prvků ....... 203
5.10.
Mikroskopie atomárních sil ................................................................................................. 205
5.10.1.
Princip jednotlivých technik mikroskopie atomárních sil .................................................... 207
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
5
5.10.1.1.
Zobrazování ..................................................................................................................... 207
5.10.1.2.
Příprava vzorku ................................................................................................................ 210
5.10.2.
Aplikace AFM ve farmaceutické analýze ............................................................................. 211
5.10.2.1.
Morfologická analýza....................................................................................................... 211
5.10.2.2.
Analýza lokálních interakcí mezi sondou a vzorkem ....................................................... 217
5.10.3.
Vyhlídky do budoucnosti ..................................................................................................... 220
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
6
1. Opticko spektroskopická charakterizace farmaceutických systémů
1.1.Úvod – charakterizace pevných farmaceutických látek a léčiv
Fyzikální a fyzikálně chemická charakterizace pevných farmaceutických látek a pevných léčiv je
nedílnou součástí procesu vývoje léčiv, a dále je také nezbytnou součástí kontroly výroby
farmaceutických látek i léčiv v konkrétních formulacích. Charakterizace farmaceutických látek i léčiv
v jednotlivých formulacích hraje důležitou roli i z hlediska patentových práv a také z hlediska kontroly
léčiv dozorovými autoritami.
Již dlouho je známo, že farmakav pevné fázi mohou existovat ve více než jedné pevné formě
(např. polymorfní krystaly a podchlazené amorfní kapaliny – viz Haleblian a McCrone 1969).
Jednotlivé pevné formy léčiv mohou vykazovat výrazně odlišné fyzikální a chemické vlastnosti, včetně
barvy, morfologie, stability, rozpustnosti, sypkosti, tableting behaviour a biologické dostupnosti
(Holzgrabe a kol. 1999) {poznámka překladatele: Biologická dostupnost je údaj, který vyjadřuje
procento podané dávky, které je organismem využito}. Běžně se pro vývoj finálního produktu volí
termodynamicky nejstabilnější forma, ale v posledních letech se začínají uplatňovat metastabilní
formy, z důvodu vyšší rozpustnosti nebo profilu biologické dostupnosti. Ve všech případech je úplná
charakterizace aktivní farmaceutické složky nezbytná pro pochopení chemických a fyzikálních
vlastností materiálu. Při rozšíření uvedeného konceptu musí kvalitativní analýza zahrnovat aktivní
farmaceutickou složku ve dvou úrovních: jako samotnou léčivou látku a stejně tak ve finálním léčivu.
V návaznosti na tento krok je nezbytná rovněž kvantitativní analýza obou forem.
V minulosti byla charakterizace aktivní farmaceutické složky založena na optické mikroskopii,
rentgenové difrakci a termálních technikách, včetně diferenciální skenovací kalorimetrie a
termogravimetrické analýzy. V roce 1940 se další využívanou technikou v multidisciplinárním postupu
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
7
charakterizace pevných farmaceutických látek stala infračervená spektroskopie. Nedávno byly do
arzenálu používaných technik přidány spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR), Ramanova
spektroskopie, nukleární magnetická rezonance pevné fáze a terahertzová spektroskopie.
Výběr a správná aplikace těchto analytických technik pro charakterizaci pevných farmak závisí na
požadované analytické informaci a fyzikální a chemické povaze vzorku. Všechny tyto techniky
zahrnují měření interakce elektromagnetického záření externího zdroje se vzorkem a schopnost
vzorku podstoupit další energetické změny. Energie tohoto elektromagnetického záření určuje
fyzikálně-chemické vlastnosti vzorku, které mají být zkoumány. Je proto vhodné důkladně zopakovat
vlastnosti samotného elektromagnetického záření.
1.2. Elektromagnetické záření a jeho základní charakteristiky
Elektromagnetické spektrum pokrývá oblast vibračních energií a vlnových délek od několika metrů
do 10-2 nanometru (kosmické záření). Bylo demonstrováno, že elektromagnetické záření se chová
jednak jako vlnění a jednak jako proud částic. Vlnění můžeme popsat pomocí klasického
sinusoidálního vlnového modelu. Elektromagnetické záření můžeme proto charakterizovat jeho
vlnovou délkou, λ, frekvencí, v, rychlostí šíření, c, a amplitudou (obr. 3.1). Vlnová délka je vzdálenost
dvou následujících bodů s odpovídající fází vlny a je rovna podílu rychlosti záření jeho frekvencí
(jednotka: metr). V molekulové spektroskopii je vlnová délka často z pohodlnosti vyjádřena
v nanometrech (nm) nebo mikrometrech (µm) (nanometr je 10-9 m; mikrometr, někdy též hovorově
mikron, je 10-6 m). Frekvence, ν, značí počet kompletních vlnových cyklů, které proběhnou za
sekundu
(jednotka:
Hz/s-1)
(Murray
and
Williams
1987).
Rychlost elektromagnetického záření, c, je konstanta nazývaná rychlost světla (ve vakuu c =
2.997925. 108 ms−1). Vzájemný vztah vlnové délky, frekvence a rychlosti ve vakuu je popsán
následující rovnicí:
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
8
Energie fotonu (jakožto kvanta) elektromagnetického záření je přímo úměrná jeho frekvenci a
tedy nepřímo úměrná vlnové délce. Převrácená hodnota vlnové délky je známa jako vlnočet, ̃
(jednotka: cm-1):
λ
λ
̃
⁄
Obr.: Schématické znázornění elektromagnetické vlny: rovinně polarizovaný vektor elektrického pole
Energie elektromagnetického záření, E, je přenášena v diskrétních svazcích či kvantech,
nazývaných fotony a je vztažena k frekvenci (nebo vlnočtu) přes Plankovu rovnici
̃
kde
h
je
Plankova
konstanta
(h
=
6.626
196
10−34
J
s).
Elektromagnetické záření je příčné vlnění a nevyžaduje pro svůj přenos „hmotné“ či podpůrné
prostředí, tj. je schopné šiřit se vakuuem. Sinusoidálně vlnový model popisu elektromagnetického
záření není schopen odpovídajícím způsobem popsat absorpci a emisi zářivé energie. Tyto jevy lépe
popisuje částicový (kvantový) model elektromagnetického záření. V tomto modelu je záření
představováno proudem oddělených (diskrétních) částic (vlnových balíků), které nazýváme fotony.
Oba uvedené modely se vzájemně doplňují v popisu vlastností EM záření, a proto obvykle mluvíme o
vlnově-částicovém chování EM záření. Energie EM záření je přímo úměrná jeho frekvenci (Murray a
Williams 1987).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
9
Vlnový model EM záření rozlišuje elektrickou a magnetickou složku, které jsou navzájem kolmé,
jsou kolmé ke směru šíření, a jejich sinusoidální oscilace jsou ve fázi. V případě lineárně
polarizovaného záření je elektrická složka omezena jednou rovinou – rovinou vibrace. Magnetický
vektor osciluje rovněž v jediné rovině, kolmé k rovině vibrace, kterou nazýváme rovinou polarizace
(obr. 3.2). Je to právě elektrická složka EM záření, která se uplatní při spektroskopických jevech:
absorpce, průchod, reflexe a refrakce při interakci s materiálem. Při každém z těchto procesů
molekula absorbuje energetický foton a dojde k přechodu molekuly ze základního na vzbuzený
rotační, vibrační nebo elektronový energetický stav. Tento přechod provází absorpce odpovídajícího
množství energie, ΔE, a molekula tak může absorbovat pouze takový foton, jehož energie odpovídá
frekvenci charakteristické vibrace molekuly. Oblast elektromagnetického záření může být rozdělena
na několik podoblastí, které nám pomohou vhodně zvolit analytickou techniku (obr. 3.3).
1.3. Vibrační spektroskopie
Infračervená oblast elektromagnetického spektra leží v oblasti 800 až 1000000 nm (0,8 až 1000
µm). Spektra se nejčastěji měří s linearizovanou stupnicí, která je inverzní k vlnové délce a nazývá se
vlnočet ( ̃, jednotka: reciproký centimetr), protože vlnočet je přímo úměrný k energii a frekvenci
absorpčního přechodu a nabývá smysluplnější číselné hodnoty vůči kterým je spektrum vynášeno. IR
oblast můžeme rozdělit na tři podoblasti: rozsah 12500 až 4000 cm -1 (0,8 – 2,5 µm) je známa jako
blízká infračervená oblast; střední infračervenou oblastí nazýváme rozsah 4000 až 400 cm-1 (2,5 – 25
µm) a rozsah 400 až 10 cm-1 (25 – 1000 µm) je nazýván dalekou infračervenou oblastí (někdy též
terahertzová oblast) (Murray and Williams 1987). Při farmaceutické analýze se využívá oblast střední
nebo blízká infračervená. Blízkou infračervenou oblast můžeme dále dělit na rozsahy 780 až 1100 nm
(Herschlova oblast) a 1100 až 2500 nm. Tato oblast se při farmaceutické analýze využívá častěji.
Ramanova spektroskopie se zabývá měřením neelastického rozptylu monochromatického záření
koherentního zdroje na zkoumaném vzorku. Frekvenční posun odpovídající jednotlivým vazebným
vibračním módům je stejný jako odpovídající vlnočet absorpčního pásu ve střední infračervené
oblasti. Ramanova spektroskopie a spektroskopie ve střední infračervené oblasti jsou proto
komplementárními technikami.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
10
1.3.1.
Základní uspořádání spektrometru
Molekulární spektroskopie využívá pro analýzu nejčastěji jedno ze dvou základních uspořádání:
transmisní a reflexní měření. V prvním případě záření s žádanou vlnovou délkou nebo s určitým
rozsahem délek prochází kolmo přes kyvetu, s fixní optickou dráhou, obsahující měřený analyt.
Intenzita záření vystupujícího z kyvety je porovnávána s intenzitou záření vystupujícího z referenční
kyvety (obvykle obsahuje stejné prostředí, ve kterém se nachází měřený analyt; tímto prostředím
může být vzduch, sintrované PTFE, rozpouštědlo aj. – obr. 3.4) Reflexní spektroskopie využívá
dopadajícího záření dané vlnové délky, resp. rozsahu vlnových délek, a měří intenzitu záření
reflektovaného (odraženého) vzorkem. Dopadající a odražený paprsek se měří v úhlu 45° k rovině
neprůhledného difusně reflexního vzorku (obr. 3.4). Intenzita reflektovaného záření je porovnávána
s intenzitou záření reflektovaného neabsorbujícím standardem (např. sintrované PTFE – Spectralon
v NIR spektroskopii nebo lisovaný práškový síran barnatý). Oba typy instrumentací pracují s mírou
absorpce záření o dané vlnové délce (resp. vlnových délkách při měření celého spektra). Označme
intenzitu vstupujícího záření (záření prošlé slepým vzorkem nebo reflektované standardem) při
jednotlivých vlnových délkách jako I0 a záření prošlé či reflektované vzorkem při stejné vlnové délce
jako I.
Obr. 3.4 Základní konfigurace spektrometru v reflexním a transmisním uspořádání (převzato
z Practical NIR spectroscopy with applications in food & beverage analysis).
Transmitance, T, je pak dána poměrem:
běžně vyjadřované jako procenta transmitance, %T, dané vztahem:
Reflektance, R, je obdobně dána poměrem
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
11
Reflektance i transmitance jsou definovány jako poměr a jsou tedy bezrozměrné, hodnoty
nabývají v rozsahu 0 až 1. Pro každou vlnovou délku je při měření vzorku v transmisním uspořádání
absorbance, A, definována jako:
( )
( )
Při měření v reflexním uspořádání je absorbance, A, definována obdobně jako:
( )
( )
Absorbance je rovněž bezrozměrnou veličinou. V reflexním uspořádání nabývá hodnot od 0 do 2
(například v NIR oblasti s využítím 99% PTFE reflexního standardu), v transmisním módu, v závislosti
na zvoleném rozsahu a citlivosti detektoru může absorbance nabýt hodnot od 0 do 6. Výjimečně
může být hodnota absorbance i vyšší (intenzita záření prošlého na detektor je nižší nebo rovna
miliontině intenzity záření dopadajícího na vzorek).
1.3.2.
Infračervená spektroskopie v blízké a střední
infračervené oblasti
Spektroskopie v blízké i střední infračervené oblasti se zabývá studiem rozptylu, reflexe, absorpce
nebo propustnosti infračerveného záření. Spektra vznikají na základě absorpce infračerveného záření
odpovídající vibračním modům molekuly. Z hlediska vibračních módů rozlišujeme dva druhy
valenčních vibrací (změna v délce vazby) a čtyři módy deformačních vibrací (změna vazebného úhlu).
U infračerveného spektra nás zajímá několik charakteristik: počet vibračních pásů a jejich vlnočet,
intenzita a šířka vibračního pásu. Každá molekula léčiva bude mít (3N-6) vibračních módů, kde N značí
počet atomů v molekule. Tyto módy označujeme jako fundamentální a vyžadují pro svou excitaci
energii ve střední infračervené oblasti spektra. Avšak pouze nejintenzivnější vibrace budou
detekovány s přesným přiřazením vlnočtu. Tyto vlastnosti závisí jak na síle vazby, tak na hmotnosti
vázaných atomů. Obecně, při pokojové teplotě, většina vazeb bude v základním energetickém stavu.
Přechod ze základního stavu, v=0, na vzbuzený fundamentální stav (v=1) se projeví absorpcí dodané
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
12
infračervené energie s fundamentální frekvencí. Tyto fundamentální frekvence jsou charakteristické
pro danou vazbu a umožňují tak identifikovat jednotlivé funkční skupiny. Běžné vibrace jsou uvedeny
v tabulce 3.1.
Infračervená spektra jsou ale mnohdy složitější, především v oblasti 1800 až 400 cm-1. Tato „oblast
otisku palce“ je bohatá na úzké absorpční pásy (malá pološířka linií), z nichž většina je nepřiřaditelná
k dané funkční skupině. Přesto navzdory komplexnosti dané oblasti, zůstávají použitelné jako
charakteristické absorpce celé molekuly,
Tabulka: Charakteristické infračervené přechody
a umožňují tak identifikaci (například s využitím počítačových vyhledávacích databází
nejintenzivnějších absorpčních pásů nebo porovnáním s tabelovanými a knihovnovými spektry.
Přístroje s Fourierovou transformací (FT) mají excelentní poměr signál-šum, přesnou frekvenci a
stabilitu. Spektroskopie ve střední IR oblasti je nejstarší ze všech tří vibračně-spektroskopických
technik a s využitím tradiční instrumentace trpí několika nevýhodami. Záření MIR neprochází přes
většinu obvyklých optických materiálů a omezuje tak vzorkovací možnosti (není například možné
analyzovat pevný vzorek ve skleněné vialce). Mnoho materiálů má vysokou molární absorptivitu ve
střední IR oblasti. Z tohoto důvodu musí být pevné vzorky často připravovány v tabletách alkalických
halogenidů nebo jako tenké filmy v tekutém parafinu (Nujol) mezi okénky z alkalických halogenidů
(např. NaCl, KBr). Hydratované vzorky musí být ve formě velmi tenkých filmů, protože páry vody jsou
rovněž interferentem.
1.3.3.
Instrumentace pro střední infračervenou oblast
Většina MIR spektrometrů využívaných při farmaceutické analýze je buď dispersní povahy či
mnohokanálového
multiplexního
typu
(využívájící
Fourierovu
transformaci).
Multiplexní
spektrometry využívají obvykle Michelsonův interferometr a jsou jednopaprskové. Tento typ využívá
pohyblivé zrcadlo, které se posouvá plynulým pohybem o konstantní rychlosti úsekem vlnových délek
(rozsah 50 – 1000 µm). V případě spektrometrů ve střední a blízké IR oblasti je toto zrcadlo obvykle
přiděláno na plovoucím, vzduchovém polštáři voně mezi přesnými nerezovými objímkami. Zrcadlo je
poháněno pomocí lineárního motoru, který zvyšováním napětí v elektromagnetické cívce umožňuje
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
13
zrcadlu pohyb konstantní rychlostí. Dráha pohybu zrcadla v interferometru se pohybuje od 1 do 20
cm s obvyklou skenovací rychlostí 0,01 až 10 cm/s (Skoog a kol.). Spektrometry s Fourierovou
transformací dosahují ve střední IR oblasti více jak o řád lepší poměr signálu k šumu v porovnání
s vysoce výkonným dispersním spektrometrem. Díky tomu umožňují rychlé měření (doba měření:
několik sekund) akceptovatelných spekter, s malým počtem kompletních skenů. Kromě toho
umožňují přístroje s Fourierovou transformací vysoké rozlišení (<0,1 cm-1), přesnost a
reprodukovatelnost
frekvenční škály.
Většina dispersních MIR spektrometrů je
naopak
dvoupaprskových, a to z důvodu relativně malé intenzity infračervených zdrojů záření, nízké citlivosti
detektorů a především kvůli absorpci MIR záření atmosférickou vodní parou a oxidem uhličitým
(může vyvolat interference). Referenční paprsek kompenzuje tyto atmosférické absorpce a fluktuace
výkonu zdroje záření, což se projeví stabilní základní linií na hodnotě 100%T. Záření zdroje je
rozděleno do dvou paprsků, přičemž polovina záření prochází vzorkovým prostorem a polovina slouží
jako srovnávací (referentní). Intenzita srovnávacího paprsku je zeslabena pohybem hřebenu,
procházejícím příčně skrz paprsek. Pro dělení referenčního a měřícího paprsku se využívá
nízkofrekvenční dělič (5 až 13 rotací za sekundu). Tento motorem řízený disk střídavě propouští
měřící paprsek a odráží paprsek srovnávací. Oba paprsky následně prochází přes monochromátor
(hranol nebo mřížka) a rozdělují se podle vlnových délek, které jsou detegovány, převedeny na napětí
a zaznamenány (Skoog a kol.). Při měření pevných vzorků zahrnuje příprava vzorku buď tvorbu
lisovaných diskových tablet vzorku v halogenidu alkalického kovu (např. KBr) nebo suspenze vzorku
v uhlovodíku s dlouhým řetězcem (např. Nujol), která je umístěna mezi dvě okénka halogenidu. První
je měřeno srovnávací
spektrum/interferogram pozadí a až následně je do paprsku umístěn
analyzovaný vzorek. Žádané spektrum je pak dáno poměrem spektrálního záznamu vzorku a spektra
referentního. Ve střední infračervené oblasti se obvykle akumuluje více jednotlivých skenů pro každé
měření. V případě fourierovských přístrojů jsou jednotlivé interferogramy sčítány, u přístrojů
dispersních se jednotlivá měření průměrují (obvykle 16 nebo 32 kompletních skenů pro oba typy
spektrometrů).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
14
1.3.4.
Technika zeslabeného úplného odrazu - ATR
Spektroskopie totální vnitřní reflexe, označovaná častěji jako technika zeslabeného úplného
odrazu (attenuated total reflection (ATR)) je technika umožňující měřit infračervená spektra vzorků, u
nichž by standardní techniky nešly použít (Skoog a kol.). Z farmaceutického hlediska může být
takovým materiálem například obtížně rozpustitelné léčivo a pomocné látky, tenké filmy, práškové
vzorky a pasty. Příklad ATR modulu je uveden na obrázku 3.5. Spektrometrie zeslabeného úplného
odrazu je založena na jevu reflexe záření při průchodu záření z opticky hustšího prostředí do
prostředí opticky řidšího. Během tohoto procesu část energie dopadajícího paprsku projde do velmi
tenké vrstvy opticky řidšího prostředí (obr. 3.5). Hloubka průniku záření je závislá na vlnové délce,
úhlu dopadu optického paprsku a indexu lomu obou optických materiálů.
Obr.: Schématické znázornění přístroje pro měření zeslabeného úplného odrazu: (a) vzorek umístěný
na vnitřně reflexní vrstvě; (b) internal reflection adapter
Běžně se hloubka průniku pohybuje od zlomků vlnové délky záření až po několik jednotek vlnové
délky. Pronikající záření je známo jako evanescentní vlna. Spektroskopie zeslabeného úplného odrazu
je běžně dostupná jako přídavný nástavec většiny moderních infračervených spektrometrů (obr. 3.5).
Vzorek se pouze přiloží na vnější stranu transparentního krystalu o vysokém indexu lomu (např.
bromid thalný/jodid thalný, germaniová destička nebo selenid zinečnatý). Úhel dopadu záření je
nastaven tak, aby nastalo několik vnitřních reflexí na rozhraní krystalu a vzorku předtím, než záření
dorazí na detektor. {pozn. překladatele: uvedené platí pro případ víceodrazového ATR,
jednoodrazové ATR využívá právě jednu reflexi} Při každé této reflexi nastane absorpce záření
vzorkem a tedy zeslabení intenzity záření. Spektra zeslabeného úplného odrazu jsou velmi podobná
běžným absorpčním spektrům, včetně polohy jednotlivých vibračních pásů. Relativní intenzity
jednotlivých pásů se liší od tradičnítransmitanční MIR spektrometrie. Běžně záření proniká do
hloubky několika mikrometrů vzorku.
1.3.5.
Aplikace vibrační spektroskopie
FT-IR s využitím zeslabeného úplného odrazu se široce využívá pro charakterizaci farmaceutických
látek v pevném stavu. Metoda se využívá i pro studium interakcí mezi jednotlivými složkami léku,
míry rozpustnosti (dissolution rate) a uvolnění léčiva z polymerní matrice (polymer-drug formulation)
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
15
(Park a kol. 1999). ATR FT-IR využili Kazarian a Matirosyan (Kazarian a Matirosyan 2002) při in situ
studiu vysokotlaké superkritické impregnace (impregnation) PVP ibuprofenem v superkritickém CO2.
Autoři ve své práci ukázali, že je tato technika vhodná pro studium impregnace široké skupiny
polymerů molekulami léčiva v prostředí superkritické kapaliny. Dále bylo ukázáno, že superkritická
kapalinová impregnace léčiva do polymerní matrice vede k molekulárně rozptýlenému léčivu
v polymerní matrici, bez krystalizace léčiva. Další zkoumání bylo provedeno analýzou pomocí
Ramanovy spektroskopie. Autoři popsali využitelnost tohoto postupu pro optimalizaci (tailor)
rychlosti uvolňování léčiva s řízeným uvolňováním, snadněji kontrolovatelnému díky absenci
krystalické fáze. Spektra ATR FT-IR prokázala interakci mezi léčivem a polymerní matricí, specifickou
vodíkovou vazbou mezi hydroxy- skupinou ibuprofenu a karbonylovou skupinou PVP; tato interakce
tedy potlačuje asociaci molekul ibuprofenu. Interakce ibuprofenu s karbonylovou skupinou PVP
potlačuje pohlcování vody. Závěrem lze říct, že bylo prokázáno, že metoda je použitelná pro přípravu
impregnovaných polymerních filmů; CO2 změkčuje PVP film, usnadňuje difundování léčiva do filmu, a
jako rozpouštědlo se snadno odstraňuje. Metoda soupeří s tradiční metodou přípravy pevných
disperzí, zejména s použitím ve vodě špatně rozpustného léčiva.
1.3.6.
Příklady farmaceutického využití ATR-FT-IR
spektroskopie
Použití ATR-FT-IR spektroskopie pro charakterizaci pevné fáze zahrnuje identifikaci látky, její
kvantifikaci a určení krystalové formy. V porovnání s tradiční MIR spektrometrií je nutná jen mírná
předúprava a drobné množství vzorku (řádově miligramy) může být rychle analyzováno, přičemž
získáme ostré intenzivní spektrální pásy s vysokým poměrem signálu k šumu. Tabulka 3.2 uvádí deset
nejintenzivnějších pásů vyskytujících se u práškových léčivých a pomocných látek (řazeno podle
klesající intenzity) při analýze ATR technikou. Tato tabulka zdůrazňuje použitelnost metody pro
rychlou nedestruktivní identifikaci a roztřídění práškových, krystalických materiálů. Vybrané ukázky
ATR FT-IR spekter α-laktózy (monohydrát a bezvodá forma) jsou uvedeny na obrázku 3.6 a 3.7.
Obrázky 3.8 a 3.9 ukazují spektra naměřená pro kofein a paracetamol a na obrázku 3.10 je ukázka
spektra stearátu hořečnatého (lubrikant). Technika je rovněž schopna odlišit jednotlivé polymorfní
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
16
formy materiálu. Ukázka identifikace a odlišení dvou polymorfních forem Salmeterol xinafoate_u je
popsána v tabulce 3.3 a na obrázcích 3.11 a 3.12.
Tabulka 3.2 Pozice ATR FT-IR absorpčních pásů běžných farmaceutických a pomocných látek (řazeno
podle klesající intenzity, lineárně interpolováno ze záznamu prvních derivací spekter, rozsah vlnočtů:
4000,4 – 648,08 cm-1).
Obr.: ATR spektrum monohydrátu α-laktózy
Obr.: ATR spektrum bezvodé α-laktózy
1.4.Spektroskopie v blízké infračervené oblasti
Spektroskopie v blízké infračervené oblasti z velké míry spadá do vibrační spektroskopie, ale
vzhledem k jejím specifickým aspektům se často probírá samostatně.
1.4.1.
Teorie absorpce v blízké infračervené oblasti
Absorpce v blízké infračervené oblasti (NIR) odpovídá svrchním tónům (overtonům), kombinačním
a rozdílovým přechodům odpovídajících fundamentálních vibračních přechodů (obr. 3.13), ale také
některým nízkoenergetickým elektronovým přechodům. NIR
absoprce
projevuje se v rozsahu
vlnových délek cca 700 – 2500 nm (14300 – 4000 cm-1). Jelikož jsou tyto přechody z hlediska
kvantové mechaniky pro případ harmonického oscilátoru zakázané, mají tendenci být oproti MIR
pásům slabší. Ačkoliv se při NIR absorpci uplatňují fotony s vyšší energií, jsou propouštěny běžnými
optickými materiály i sklem. Molární absorptivita těchto materiálů je v NIR oblasti o dva až tři řády
slabší než v MIR oblasti a tyto materiály tak propouštějí NIR záření do větší hloubky. Při NIR analýze
tak není nutná tak důkladná příprava vzorku, nebo použití tenkých filmů. Je naopak možná
neinvazivní analýza pomocí vláknové optiky nebo přes skleněnou nádobu. Z tohoto důvodu je tato
technika široce užívána farmaceutickými firmami při výrobě k identifikaci pomocných látek.
Obr. ATR spektrum paracetamolu
Obr. ATR spektrum bezvodého kofeinu
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
17
Dokonce i po smíšení práškových látek, tvorbě tablety nebo kapsle můžou být tyto kompaktní
formy nebo kapsle analyzovány pomocí difusní reflexe nebo transmisního měření. Kubelka-Munkova
teorie difusní reflexe se běžně využívá při popisu interakce NIR záření s pevnou látkou (Kortüm 1969).
Všechny práškové farmaceutické látky rozptylují dopadající NIR záření. Tento rozptyl je závislý na
vlnové délce velikosti částic a jejich tvaru. Při průchodu záření přes vzorek zpět na detektor dojde
k opoakovanému rozptylu na jednotlivých částicích látky. Kromě toho mohou částice v průběhu
rozptylu část záření rovněž absorbovat. Důsledkem toho je, že spektra pevných látek obsahují kromě
absorpčních pásů prohnutou či posunutou základní linii. Surová reflektanční spektra mohou být
převedena pomocí matematické Kubelka-Munkovi funkce, která vztáhne reflektanci k teoretickým
absorpčním (přímá úměra (direct relationship)) a rozptylovým koeficientům (nepřímá úměra).
Obr. ATR spektrum stearátu hořečnatého
Tabulka 3.3 Pozice deseti nejintenzivnějších absorpčních pásů ATR spekter práškových polymorfních
forem Salmeterol xinafoate_u (forma I a II), získané pomocí zero-crossing point první derivace
spektrálního záznamu (sedmibodový filtr typu Savitzky-Golay, kubický polynom)
Obr. ATR infračervené spektrum Salmaterol xinafoatu (polymorfní forma I)
Obr. ATR infračervené spektrum Salmaterol xinafoatu (polymorfní forma II)
Obr. Hladiny vibrační energie v diatomické molekule. Fundamentální přechod (ν=0 ν=1); první
svrchní tón (ν=0 ν=2); druhý svrchní tón (ν=0 ν=3)
Mnoho literárně publikovaných aplikací pak využívá buď další matematické předzpracování
surových dat (např. převod na absorbanci,
( ⁄ )) nebo samotná surová data (reflektanci, R,
nebo transmitanci, T). Základním požadavkem teorie difusní reflexe je nekonečná tloušťka vrstvy
práškového materiálu. V praxi bylo zjištěno, že práškový vzorek by měl být ve vrstvě alespoň 1 cm,
aby bylo dosaženo reprodukovatelných spekter s vysokým poměrem signál/šum (Yoon a kol. 1998); u
tablet většinou postačí několik milimetrů.
1.4.2.
Instrumentace pro blízkou infračervenou oblast
Spektrometry pro blízkou infračervenou oblast jsou svým designem velmi podobné UV-Vis
spektrometrům a můžeme je dělit na tři základní typy podle způsobu spektrálního výběru: disperzní,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
18
interferometrické a netermální. První dva typy využívají širokospektrální tepelný zdroj záření,
nejčastěji žhavené vlákno (např. halogenovou výbojku – quartz tungsten). Netermální design
obsahuje studený zdroj záření a výběr vlnových délek je inherentně dán díky širokému spektrálnímu
rozsahu emitovaného záření (Osborne a kol. 1993). Disperzní přístroje rozdělují širokopásmové záření
zdroje prostorově (úhlově) použitím hranolu nebo mřížky. Hranol se stává neefektivním a trpí slabou
nelineární, anomální disperzí (především rozptyluje spektrální oblast ve které absorbují –OH vazby a
to i v případě záření z IR čistého křemene). Z tohoto důvodu se v těchto přístrojích více používají
difrakční mřížky. Vesměs se jedná o holografické reflexní mřížky z vysoce leštěného kovu (např.
hliník) s laserově nebo photo-etched ekvidistantními drážkami. Alternativní dispersní systém využívá
akusticko-optický laditelný filtr (AOTF). Tento typ využívá anisotropického krystalu (např. TeO2) jako
disperzního prvku. Tento krystal is formed into aligned, cut a leštěného krystalu s rovinnou akustické
vlny procházející transverzálně skrz krystal. Blízké infračervené záření dopadá na krystal kolmo
k akustické rovině a interaguje s periodicitami v indexu lomu materiálu (periodicity je rovna vlnové
délce akustického vlnění). Krystal tak pracuje jako podélná difrakční mřížka. Změnou frekvence
akustického signálu se změní vlnová délka, při které jsou oba signály ve fázi. S využitím
širokopásmového rovině polarizovaného zdroje je tedy možné, aby krystal fungoval jako laditelný
úzce pásmově propustný filtr. Akustický signál je generován jedním nebo více piezo-elektrickými
převodníky (transducers), které jsou vakuově přivařené ke straně krystalu. Pro NIR oblast záření
pracují převodníky s frekvencemi 20 – 150 MHz a spotřebovávají jen několik watů. Využívané
radiofrekvenční zdroje produkují vysoce stabilní frekvenční pásmo s rychlou změnou frekvence
(několik mikrosekund). Vysokofrekvenční stabilita obvykle znamená kratší kalibraci než v případě
mřížkového difrakčního systému (Osborne a kol. 1993). Interferometrické systémy využívají
k spektrálnímu výběru optickou interferenci. Klasickým interferometrem je ten vytvořený
Michelsonem v roce 1891 a nesoucí název Michelsonův interferometr (obr. 3.14). Základním
principem, na kterém je systém postaven je rozdělení vstupního záření na dva samostatné paprsky,
prodloužení optické dráhy jednoho z paprsků a jejich opětovné spojení. Základní sestava
interferometru obsahuje dvě kolmá zrcadla, jedno pevné a druhé pohyblivé umístěné souběžně se
vstupujícím zářením. Mezi oběma zrcadly je v úhlu 45 stupňů umístěn dělič paprsků, který rozděluje
vstupující záření na dva paprsky a po odrazu na příslušném ze dvou zrcadel oba paprsky opět
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
19
kombinuje. Pokud je pohyblivé zrcadlo v základní poloze, jsou obě zrcadla, fixní i pohyblivé, ve stejné
vzdálenosti od děliče paprsků. Optická dráha odraženého a znovu složeného paprsku je tak
dvojnásobkem vzdálenosti zrcadel od děliče. Pokud je tedy pohyblivé zrcadlo v základní poloze,
neexistuje žádný dráhový rozdíl (zpoždění (retardation)) mezi oběma rozdělenými paprsky a při jejich
kombinaci dochází ke konstruktivní interferenci. V případě monochromatického záření dochází při
posunu zrcadla o λ/4 k dráhovému rozdílu λ/2 a tedy k destruktivní interferenci obou paprsků, která
vyústí v nulový detekovaný signál.
Obr. Schéma Michelsonova interferometru (převzato z Osborne, Fearn & Hindle (1993), Practical NIR
Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis)
Zrcadlo interferometru se pohybuje konstantní lineární rychlostí a vytváří sinusoidální změny
v intenzitě detekovaného signálu. Signál je zaznamenáván ve formě interferogramu, který je
závislostí variability signálu na čase, resp. zpoždění (retardation). Protože používané zdroje jsou
širokopásmové, je výsledný interferogram součtem jednotlivých sinusoidálních signálů odpovídajících
každé vlnové délce. K rekonstrukci spektra z interferogramu je potřeba počítač, který využívá
algoritmus inverzní Fourierovi transformace (iFFT) a výpočet probíhá téměř okamžitě.
Interferometrické přístroje jsou mnohokanálové (multiplexní), protože všechny části spektra jsou
měřeny současně. Existuje rovněž několik modifikací Michelsonova interferometru. Příkladem může
být interferometr na obr. 3.15, využívající místo zrcadel refrakční hranoly (Buhler NIRVIS, Buhler
ANATEC AG, Uzwil, Švýcarsko). Zdroje záření pro NIR oblast jsou obecně širokopásmové a emitují
záření od viditelné oblasti až po vlnovou délku 3 µm. Záření emitované zdrojem nemusí mít v celém
rozsahu stejnou intenzitu, ale musí být stabilní v čase. Většina spektrometrů využívá žhavené objekty,
emitující záření černého tělesa, kterým je typicky křemeno-wolframová halogenová žárovka
s maximem okolo 1 µm a běžnou provozní teplotou 2400 K. Pro dosažení delší životnosti, obvykle
několik tisíc hodin, není používána maximální teplota a výkon (až 3200 K), ale teplota nižší, která
nevyvolává takové ztráty wolframu ve vlákně a prodlužuje životnost výbojky (Osborne a kol.
1993:69). Detektory, používané v NIR spektroskopii se liší svou citlivostí pro tuto oblast. Fotodiody
z křemíku a germánia jsou citlivé v oblasti Vis-NIR. Křemíkové diody jsou nejcitlivější v oblasti
vlnových délek od uv-A (0,38 µm) nebo viditelné (0,4 µm) až po 1 µm, s maximem u ca. 0,85 µm.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
20
Germániové detektory mají maximum okolo 1,3 µm. Častěji jsou používané detektory z olověných
solí (sulfidu, PbS, a selenidu, PbSe), využívající fotoelektrický jev.
Obr. Schématické znázornění FT-NIR spektrometru (Buhler FT-NIR Universal Spectrometer, System
NIRVIS, převzato z Buhler NIRVIS manual, Buhler Anatec, Uzwil, Švýcarsko)
Detektory ze sulfidu olovnatého jsou nejcitlivější v rozsahu 1 – 2,5 µm, zatímco selenidové jsou
celkově méně citlivé, s použitelnou citlivostí v rozsahu vlnových délek 2,5 – 3 µm. Nejnovějším
detektorem pro NIR oblast jsou detektory z indium-galium arzenidu (InGaAs), pracující v rozsahu 1 –
1,8 µm, s maximem odezvy u 1,7 µm. Citlivost tohoto detektoru je o několik řádů vyšší než u
detektoru z PbS, kratší je rovněž doba odezvy (<1 µs versus 100 – 200 µs)(Osborne a kol. 1993).
Optické součásti používané pro NIR spektroskopii jsou stále častěji z křemíku (oblast: viditelná –
2,5 µm) nebo z bezvodého IR-čistého (IR-grade) křemene (VIS – 3,5 µm). Stále častější je ve
farmaceutické analýze, především při řízení a kontrole procesů, použití optických vláken. Jejich
použití umožňuje umístit spektrometr mimo nebezpečné či nevhodné prostředí (s nebezpečím
požáru, exploze, mechanických vibrací či s expozicí rozpouštědel aj.) a dokonce při užití více optických
vláken umožňuje měření a kontrolu na více místech výrobního procesu, tedy odstraňuje potřebu
použití více spektrometrů a s tím spojených investic.
1.4.3.
Kvalitativní a kvantitativní analýza NIR dat
Surová NIR spektra často obsahují široké a překrývající se absorpční pásy, které dělají interpretaci
složitější než v případě MIR spekter. NIR spektra pevných látek kromě toho často obsahují efekty
vícenásobného rozptylu, které jsou funkcí vlnové délky, distribuce velikosti částic, kompaktnosti
vzorku a jeho vlhkosti (O’Neil a kol. 1998).
Rozptyl interagujícího NIR záření nastává na částicích, které jsou mnohem větší než vlnová délka
záření (0,78 – 2,5 µm, Tyndall, 1869) a tento jev tak nastává u práškových farmaceutických materiálů,
které mají velikosti částic v rozsahu několika mikrometrů až po 1 mm. Na soustředěné vrstvě částic
nastává několikanásobný rozptyl a produkuje neostrý difusní odraz. Malá část interagujícího záření
může být absorbována i z jediné vrstvy částic, tento jev je výrazně zesílen při mnohonásobném
rozptylu, který nastane uvnitř silnější vrstvy částic (protože celková optická dráha interagujícího
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
21
fotonu může být až 80-krát síla vrstvy (Butler a Norris, 1960)). Kubelka-Munkův matematický popis
difusní reflexe vedl k vývoji fenomenologické teorie difusní reflexe (Kubelka a Munk, 1931). Jejich
teorie uvádí, že pro neprůsvitnou nekonečně silnou (v praxi 1 cm a více) vrstvu difusně reflektujících
částic může být intenzita difusně reflektovaného záření, R, vztažena k stupni rozptylu (ratio of a
scatter), s, a absorpčnímu koeficientu, k. Tento vztah je označován jako Kubelka-Munkova funkce,
F(R∞), a je dán následující rovnicí:
(
(
)
)
Analogicky k Lambert-Beerovu zákonu můžeme uvažovat, že absorpční koeficient, k, je součinem
koncentrace, c, a absorptivity, a (Kortüm 1969). Uvedenou rovnici pak můžeme přepsat:
(
)
(
)
Efekt difusní reflexe se projeví v surových NIR spektrech pevných látek, prášků nebo kompaktních
vzorků obvykle prohnutou či posunutou základní linii. NIR spektra pevných látek tak obsahují
informace o chemické i fyzikální podstatě vzorku. Přítomnost obou typů informace může být
přínosem pro kvalitativní aplikace, kde jsou velikost částic a obsah vody důležitými parametry. Pro
ostatní aplikace, například pouhou identifikaci, způsobuje kolineární povaha spektra (díky nelineární
základní linii) potíže při užití surových spekter. Tyto aplikace vyžadují předzpracování spekter, za
účelem odstranění rozptylových efektů. Pro odstranění těchto jevů lze použít například digitální
polynomický vyhlazovací algoritmus (například Savitzky-Golay, druhé derivace spektra), tvořící
derivované spektrum ve kterém jsou chemické pásy rozlišené. Spektra druhé derivace jsou podobná
MIR oblasti otisku palce a jsou tedy často používána při identifikaci. Kromě výpočtu spektrálních
derivací můžeme minimalizovat efekt vícenásobného rozptylu použitím metody SNV (standard
normal variate) a multiplikativní korekce rozptylu (MSC). MSC vyžaduje znalost průměrného spektra
materiálu pro výpočet alfa a beta koeficientů pro opravu posunu základní linie a efektu
vícenásobného rozptylu v jednotlivých spektrech materiálu. SNV i MSC předzpracování dat může být
užito samostatně nebo v kombinaci s derivacemi.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
22
Typické aplikace, v případě pevných látek, jsou identifikace velkého množství farmaceutických
pomocných látek, srovnání šarží multikomponentních tabletových (dosage) forem nebo kontrola
meziproduktu oproti uloženému průměrnému spektru. Kvalitativní a kvantitativní aplikace NIR
spektroskopie jsou založeny na použití vícerozměrných statistických metod analýzy "celého spektra".
Pro identifikaci jsou využívány metody jako například Analýza hlavních komponent (Principal
Component Analysis, PCA) a příbuzná technika SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy).
Kvantitativní stanovení je obecně založeno na vícerozměrných regresních metodách, například
regrese hlavních komponent (Principal components regression, PCR) nebo regrese částečných
nejmenších čtverců (Partial least squares, PLS). Pro získání žádaných informací (například obsah
aktivní složky, velikost částic, obsah vlhkosti) z NIR dat jsou vytvářeny regresní modely. Tyto modely
umožňují předpověď hodnot žádaných proměnných z následných NIR měření. Pro dosažení optimální
správnosti a přesnosti modelu jsou většinou aplikovány některé techniky předzpracování dat (např.
korekce rozptylu). Rovněž je nutné sestavit kalibrační a testovací soubory dat. Sestavení
kvalitativního či kvantitativního NIR modelu je proto časově náročný proces vyžadující odborné
znalosti chemometriky. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti není technikou stopové analýzy a
v případě multikomponentního pevného vzorku vyžaduje pro detekci přítomnost alespoň 1% obsahu
analytu. Technika se nejlépe hodí pro kvantifikaci složek s obsahem mezi 10 a 90 %hm. Pro
kompaktní pevné materiály se při stanovení obvykle dosahuje větší přesnosti a správnosti u
transmisního měření než u techniky reflexní, protože toto měření je méně citlivé na nehomogenitu.
1.4.4.
Farmaceutické aplikace NIR spektroskopie
V poslední době je NIR spektroskopie široce využívanou analytickou technikou ve farmaceutickém
průmyslu. Na tuto skutečnost upozornili v roce 1998 ve své přehledové práci Blanco a kol. (Blanco a
kol., 1998). V roce 1999 akceptovala tuto techniku (spolu s dalšími) pro kontrolu farmaceutického
výrobního procesu, od kontroly vstupních materiálů po zpracování meziproduktů (např. kontrola
práškových směsí) do konečných lékových forem, americká agentura pro kontrolu léčiv (U.S. Federal
Drug Agency’s Process Analytical Technology (PAT) initiative (www.fda.gov/cder/OPS/PAT.htm)).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
23
Cílem této instituce je podporovat lepší pochopení farmaceutických výrob a provádět jejich
kontrolu v souladu s aktuálním systémem kvality. Kvalita tedy nemůže být testována v konečném
produktu, ale musí být implementována v celém procesu. FDA původně definovala PAT jako systém
pro návrh, analýzu a řízení výroby pomocí měření kritických kvalitativních a výkonnostních parametrů
surových materiálů a meziproduktů v reálném čase za účelem zajištění kvality finálního produktu.
Procesní analytická technologie (PAT), jako celek, zahrnuje širokou paletu nástrojů pro zajištění
výroby s "řízeným rizikem". NIR spektrometrie, jako moderní procesní analytická technika, je
důležitým nástrojem většiny farmaceutických procesů. Další nástroje zahrnuté v PAT jsou techniky
vícerozměrného sběru dat a vícerozměrné analytické nástroje (např. pro interpretaci vícerozměrných
NIR dat); nástroje k monitorování a určení konce procesu (jako například sondy s vláknovou optikou a
stroje se softwarovou zpětnou vazbou) a nástroje pro kontinuální vylepšení a management znalostí
(například lepší pochopení výrobního procesu a jeho kritických parametrů). Již dříve popsali
zajímavou aplikaci NIR spektroskopie pro zjištění shody fyzikálních a chemických vlastností
farmaceutických přísad s předpisem Plugge a van der Vlies (1993). S použitím trihydrátu ampicilinu
jako modelového léčiva demonstrovali autoři schopnost určit konec uvolňování na základě NIR
měření, čímž nahradili předepsané testování (compendial identification), určení obsahu vody a assay
tests a vytvořili tak nový parametr pro určení přijatelnosti, známý jako index shody. Později autoři
implementovali novou metodu kontroly kvality, založenou na NIR spektroskopii. Tato metoda
zahrnuje transformaci souboru spekter do polárních souřadnic a pro každé transformované spektrum
vypočítává těžiště. Tato jsou následně zobrazena do kartézkých souřadnic a umožňují rozlišení
podobných materiálů, pomocí klastrové analýzy, (např. formy laktózy) mírně se lišících fyzikálními a
chemickými vlastnostmi (např. amorfní, bezvodé, monohydrát, odlišné velikosti částic). Metoda byla
rozšířena, aby ukázala potenciál NIR spekter pro kontrolu homogenity směsí s použitím analýzy
rozptylu. Hailey a kol. v roce 1996 a Sekulic a kol v roce 1998 popsali automatický systém pro on-line
monitoring a kontrolu míchání práškových vzorků za pomoci NIR spekter. V těchto pracích je míchací
zařízení řízeno v reálném čase pomocí vláknové optiky a softwarové zpětné vazby. Studie zkoumá
skupinu technik pro předzpracování spektrálních dat a jejich kombinace – např. metodu SNV,
polynomický rozklad metodou kvadrátů nejmenších čtverců či druhé derivace spektra – a úspěšně
demonstruje vztah mezi změnami ve spektrální variabilitě a homogenitou směsi. Dále zde byly
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
24
použity k zajištění on-line procesní kontroly metody SIMCA a blokově prováděný výpočet směrodatné
odchylky. Jinou on-line aplikaci vícekanálové NIR techniky zavedli k monitorování obsahu směsi
v granulátoru s fluidační lože Rantanen a kol. (Rantanen et al., 1998). Metoda zkoumala tři
granulovací postupy a jeden peletovací (vytvářené vytlačováním přes předlohu - extrusionspheronization). Při porovnání s referenční metodou úbytku hmotnosti při sušení (loss-on-drying)
bylo dosaženo nejistoty směrodatné odchylky (standard error on prediction) 0,2 % pro granulovací
postup. Byl studován efekt různých průtoků kapaliny (liquid flow rates) a koncového sušení a bylo
zjištěno, že technika je vhodná ke stanovení konce a řízení farmaceutických procesů. Aplikace pro
monitorování a kontrolu procesu potahování tablet byla popsána Anderssonem (Andersson et al.,
1999). Tloušťka potahu tablety dvou granulovaných jader může být monitorována s využitím metody
vícenásobné korekce rozptylu, PCA a PLS. Maximální tloušťka potahu, která umožňuje stanovit
základní chemické složení, byla stanovena v rozmezí 0,1 – 0,2 mm. Využití NIR měření pro předpověď
tvrdosti tablety popsali Kirsch a Drennen (1999). Autoři použili dvě metody kalibrace – PCR a fitovací
algoritmus. Byly vytvořeny modely pro tablety Cimetdine s obsahem 1-20 %hm a tvrdostí tablet mezi
1-7 kp. Směrodatná odchylka kalibrace pro PCR a fitovací model byla O,42 a 0,46 kp. Charakteristické
rysy chemických složek pozorované v NIR spektrech je činí použitelnými pro identifikační a
kvantifikační účely. Identifikační metody obvykle vyžadují databázi referenčních spekter vzorku.
Jednoduché metody identifikace pevných látek zahrnují například vhodnou transformaci do druhé
derivace (např. Savitzky-Golay) a porovnání šesti nebo deseti nejintenzivnějších pásů oproti těm
z databáze (Jee 2004). Pro účely pozitivní identifikace je obvykle dostatečná tolerance několika
desítek nanometrů na obě strany od referenční hodnoty. NIR spektra farmaceutických pevných látek
obyčejně poskytují více než 20 spektrálních pásů. Uživatel tak musí pečlivě volit pásy reprezentující
jedinečné chemické absorpce (Jee, 2004). Alternativní metodou diskriminační analýzy, která využívá
celé spektrum, je metoda SIMCA. Tato metoda využívá konstrukci separátního PCA modelu z NIR
spekter pro každý materiál. Metoda křížové validace (Cross-validation) je využívána pro určení
použitého počtu hlavních komponent v každém modelu (například použitím PRESS statistiky
(Predicted residual error sum of squares) Následně měřená spektra jsou vždy přiřazena ke třídě, se
kterou dosahují minima PRESS statistiky (Jackson, 1991). Využití této metody pro identifikaci
pomocných látek popsali Candolfi a kol. (Candolfi et al., 1999). Autoři využili hlavní komponenty,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
25
které popisovaly více než 1% spektrální variability. Ačkoliv bylo při použití omezeného datového
souboru 15 % spekter každé třídy neidentifikováno při využití 95 a 99% intervalu spolehlivosti,
nedošlo k žádné chybné identifikaci (pokud bylo spektrum identifikováno, bylo přiřazeno správně).
Bylo zjištěno, že korekce rozptylu identifikaci neovlivňuje. V roce 2003 byla popsána NIR metoda
kvantifikace Kofeinu v neporušených jednotlivých tabletách (Laasonen et al., 2003). Tablety obsahují
58,82 %hm Kofeinu. Předzpracování spektrálních dat zahrnovalo druhou derivaci algoritmu SavitzkyGolay s následnou aplikací SNV a centrováním spektrálních dat na průměr. K předpovědi koncentrace
kofeinu byl vyvinut jednofaktorový PLS model. Přesnost metody byla validována (relativní
směrodatná odchylka opakovatelnosti a tzv. střední přesnost byly nižší než 0,75 %hm). Správnost se
významně nelišila od HPLC stanovení. Limit stanovení pro NIR experiment byl stanoven na 13,7 %hm
a rutinní NIR analýza se tak stala flexibilnější a rychlejší metodou než tradiční HPLC.
Jak je již dlouho známo, fyzikální vlivy na průběh NIR spekter pevných farmaceutických látek jsou
díky rozptylu velmi významné Rozptylový jev je závislý na vlnové délce i velikosti částic a tak celkově
velikost částic a jejich distribuce, tvar a kompaktnost ovlivňují průběh NIR spekter práškových
farmaceutických látek. O’Neil, Jee a Moffat (1998, 1999) ukázali, že medián a rozpětí distribuce
velikosti částic práškových léčivých a pomocných látek může být modelován pomocí opakované
lineární regrese (MLR) a regrese hlavních komponent (PCR). Pozdější práce ukázala, že kompletní
procentuální četnost zrnitosti mikrokrystalické celulózy může být předpovězena z NIR spekter pomocí
regrese částečných nejmenších čtverců. Metoda byla necitlivá pro směsi s obsahem analytu od 0,9 do
4,8 %hm. Navíc u všech metod bylo dosaženo lepší kalibrace s použitím surových reflektančních dat.
1.4.5.
NIR spektroskopie a polymorfismus
Je známo, že spektra v blízké infračervené oblasti jsou ovlivněna morfologií krystalu (polymorph).
Aaltonen a kol. (2003) popsali screeningovou metodu polymorfního typu Sulfathiazolu jako modelové
látky. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti byla potvrzena jako rychlá screeningová metoda pro
určení polymorfní konfigurace a monitorování procesu indukované transformace. Surová data byla
převedena na druhou derivaci a podrobena analýze PCA. Graf hodnot SCORE analýzy PCA byl využit
pro určení klastrů odlišných polymorfů.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
26
Vliv vnitřní konverze polymorfních forem, ke kterému může dojít při granulaci na mokré cestě,
může mít významný vliv na fyzikálně-chemické vlastnosti krystalických léčiv. Wong a Mitchell
například zjistili, že chlorpromazin hydrochlorid přechází z formy II na formu I při sušení z přechodně
hydratované fáze (směsné rozpouštědlo ethanol:voda, 80:20 %) při 70°C (Wong and Mitchell, 1992).
Polymorfní transformace, která nastává při sušení vlhkého granulátu, byla monitorována také pomocí
NIR spektroskopie (Davis et al., 2004). Autoři vytvořili polymorfní formy glycinu (α a γ formy)
rekrystalizací ze zahřátého roztoku (redestilovaná voda a 15% ledová kyselina octová). První roztok
byl za konstantního míchání zchlazen na pokojovou teplotu, druhý roztok byl zchlazen bez míchání.
K identifikaci fází a polymorfní čistoty výsledných krystalů byla použita rentgenová difrakční analýza.
Stejné krystaly byly analyzovány i NIR spektrometrií. Spektra byla transformována pomocí SNV a
převedena na druhou derivaci. Jednorozměrné kalibrační modely byly vytvořeny ze zpracovaných
spekter krystalických vzorků a vzorků zředěných na 50% koncentraci mikrokrystalickou celulózou.
Roztokem iniciovaná přeměna polymorfní formy byla také sledována v rámci nasyceného roztoku
kalů/suspenzí. Odebrané vzorky byly vakuově filtrovány, analyzovány pomocí NIR spektroskopie a
koncentrace každého polymorfu byla stanovena pomocí kalibrační metody nejmenších čtverců.
Studie vlhkého granulátu byly provedeny s 50% směsí γ-glycinu v mikrokrystalické celulóze s použitím
vody jako pojiva. Granulát byl sušen buď fluidačně při 60 nebo 80 °C nebo vsádkově (tray dried) při
21°C v kontrolované atmosféře s nízkou vlhkostí (26-32% relativní vlhkost).
U stabilního γ-glycinu byl pozorován kinetický záchyt metastabilního α-glycinu při rychlém
fluidním sušení (sušení při 80 °C přineslo 9,2% α-glycinu, sušení při teplotě 60 °C poskytlo 6,9% αglycinu). Při pomalém vsádkovém sušení při nižší teplotě byla pozorována nižší vnitřní konverze (0,9
% α-glycinu). Kvantitativní NIR modely se ukázaly jako schopné analyzovat nízké úrovně obsahu
polymorfních forem (až 0,9 %), což bylo prokázáno srovnáním s rentgenovou difrakcí.
1.4.6.
Pseudopolymorfismus, hydráty a solváty
Pro studium tvorby hydrátů i on-line monitorování mokrých granulačních procesů dvou strukturně
blízkých bezvodých látek – kofeinu a theophyllinu byly využity Ramanova a NIR spektrometrie
(Jorgensen et al. 2002). Na základě druhé derivace NIR spekter bylo možno odlišit hydratovanou a
bezvodou formu přes absorpční pás u ca 1690 nm, odpovídající vlhkosti (tento pás u bezvodé formy
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
27
chybí). Bylo zjištěno, že při nízké vlhkosti hydratuje lépe theophyllin než kofein (druhý uvedený
vyžaduje 0,9 mol vody na jeden mol látky, aby byl ve spektru pozorován pás vlhkosti). Během
postupného přidávání vody a vlhnutí byla postupně snímána NIR spektra a následně byl vyvinut tříkomponentní PCA model, postihující 99,9 % spektrální variability. Interpretace křivky zátěží prokázala
silnou vazbu k O-H kombinačním pásům (první PC, tj. hydrát) a svrchním tónům (overtonům) C-H (1.
PC); C-H overtonům (druhá PC) a O-H kombinačním pásům (třetí PC, volná voda). První komponenta
tak vystihuje tvorbu hydrátu. Křivka zátěží pro první a druhou hlavní komponentu rovněž dokázala, že
tvorba hydrátu vede k postupné změně absorpčních C-H pásů mezi 1600 – 1700 nm. Křivka zátěží
třetí komponenty ukazuje, že tato komponenta popisuje absorpci volné vody. Třídimenzionální
zobrazení hodnot SCORE odhalilo celkový časový trend: počáteční vzestup hodnot score (1. a 2. PC)
s rostoucím obsahem vlhkosti (a tedy tvorbu hydrátu) až do 1,4 molů vody na mol bezvodé formy,
následované prudkým poklesem hodnot score podél třetí hlavní komponenty při tvorbě granulí
(reprezentující výskyt volné vody). Model tak zřetelně popsal tvorbu hydrátu a granulí a učinil tak
z vícerozměrné analýzy vizuální prostředek. NIR analýza byla považována za účinnější při
charakterizaci hydrátů a obsahu volné vody než Ramanova spektrometrie.
1.4.7.
Ověřování léčiv a odhalování padělaných a klonovaných
verzí
Padělání léčiv je závažný a globální problém. Falšování farmaceutických látek bylo objeveno i
v rámci legitimních dodavatelských řetězců (Deisingh, 2005). Neoficiální nákup léku spotřebitelem
přes internet je spojen s vysokým rizikem získání padělků (Deisingh 2005). Tato situace představuje
výzvu pro analytické oddělení regulačních agentur: vysoké množství léků, podezřelých z padělání,
nebo které by mohly být cílem padělatelů, musí být plošně testováno. Vysoké náklady a dlouhá doba
analýzy spojené s tradičními chemickými testy na mokré cestě, jako je vysoce účinná kapalinová
chromatografie, vyvolaly velký zájem o využití rychlých, nedestruktivních metod molekulární
spektrometrické analýzy vzorku. NIR spektrometrie byla testována pro ověřování léčiv a odhalování
padělaných (Scafi et al., 2001). Makroskopická NIR reflexní analýza vzorků, např. celých
neporušených jednotlivých dávek, poskytuje spektra, která jsou reprezentativní i pro vícesložkové
matrice a jsou tak reprodukovatelné. Nedávná práce se zabývala vývojem přenosného
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
28
transmitančního NIR spektrometru pro použití v terénu (O’Neil et al., 2008). Tato práce ukázala
užitečnost oblasti třetího overtonu pro ověřování léčiv. Kvalitativní analýza s použitím PCA a metody
modelování tříd na základě nerovnoměrné variability (UNEQ) aplikované na hodnoty SCORES byla
schopna identifikovat originální léčivo (tablety Viagry a Cialis) a detekovat falešné napodobeniny
s vysokou mírou správného přiřazení. Kohonenova samoorganizující se mapa (SOM) s učením „bez
učitele“ – neuronová síť – byla použita k modelování NIR transmitančních dat dvou tablet originální a
padělané verze léků a dále transmitančních spekter suchých tablet čistých pomocných látek a aktivní
složky. Výsledky ukazují, že spektra padělků jsou v některých oblastech mapována do sousedních
neuronů a naznačují tak několik zdrojů původu. Kromě toho, zařazení spekter některých padělků na
neurony sousedící se špatnou aktivní či pomocnou látkou ukazuje na rozdíly v matrici padělaných
tablet v porovnání s originály. Dosažené výsledky byly u některých padělaných tablet ověřeny pomocí
referenční analytické metody (HPLC) – tato prokázala přítomnost špatné aktivní složky (přestože se
jednalo o stejnou terapeutickou třídu) v těchto tabletách a to na úrovni vyšší než je nominální
hodnota.
1.4.8.
Příklady dalšího farmaceutického použití NIR
spektrometrie
Blízké infračervené spektroskopie se běžně používá jako metody pro identifikaci surovin. Ačkoli
spektra vykazují široké, překrývající se absorpční pásy, pocházející z overtonů a kombinací
fundamentálních vibrací, a nerovnoměrnou základní linii vyplývající z vícenásobného rozptylu,
využitím matematických postupů, zejména druhé spektrální derivace (metoda Savitzky-Golay)
můžeme eliminovat offset základní linie a zakřivení a tím rozlišit většinu absorpci. Pozice rozlišeného
absorpčního pásu je obvykle počítána s použitím algoritmu těžiště (centre-of-gravity). Tabulka 3.4
ukazuje deset nejintenzivnějších absorpčních pásů pro 13 obvyklých léčivých a pomocných látek. Pro
správnou identifikaci většinou dostačuje šest až deset pozic pásů, údaje ukazují, že na základě NIR
spekter může být identifikován každý materiál. Výběr materiálů obsahoval polymorfní formy
(laktóza), hydráty i bezvodé látky. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti může být použita i
k identifikaci odlišných polymorfních forem, solvátů a amorfních materiálů. Absorpce okolo 1934 nm
odpovídá kombinaci O-H valenční a O-H deformační vibrace (Osborne et al., 1993).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
29
Tabulka 3.4 Pozice deseti nejintenzivnějších absorpčních pásů (seřazeny podle intenzity druhé
derivace absorbance, blízká infračervená oblast: 1340.6-2488.2 nm) FT-NIR spekter práškových
vzorků farmaceutických pomocných látek získaných prostřednictvím těžiště negativních pásů druhé
derivace spekter (11 bodový vyhlazovací algoritmus Savitzky- Golay, kubický polynom).
Tato absorpce je intenzivní ve spektru monohydrátu α-laktózy (druhý nejintenzivnější pás) a
mnohem méně intenzivní ve spektru bezvodé α- a β-laktózy a ve spektru bezvodého kofeinu (Tab.
3.4). Tato absorpce byla zjištěna ve sprejově sušené laktóze. Dihydrát askorbátu vápenatého vykazuje
intenzivní absorpci při 1455.8 nm, která je spojena s prvním overtonem O-H valencni vibrace.
Absorpce při 1943.2 nm, pro tento materiál spojená s kombinací O-H valenční a O-H deformační
vibrací nastane u delší vlnové délky než u spektra monohydrátu a sprejově sušené laktózy. Rozdíl v
pozici tohoto pásu je pravděpodobně důsledkem intenzivnější absorpce dihydrátu a asymetrické
povahy píku. Druhá derivace spekter různých vzorků laktózy, po vyhlazení algoritmem Savitzky-Golay,
je uvedena na obrázcích 3.16-3.19. Průběhy derivace bezvodého kofeinu (Obr. 3.20) a dihydrátu
askorbátu vápenatého (obr. 3.21), jsou také uvedeny. Odlišení různých druhů laktózy může být
dosaženo pomocí vícerozměrné analýzy. Analýza hlavních komponent druhé derivace absorbančních
spekter ukazuje přesně definované shluky spekter jednotlivých druhů laktózy (obr. 3.22). Oblast
hodnot SCORE do které se při PCA promítnou spektra každé formy laktózy lze definovat pomocí 95 %
pravděpodobností elipsy. Alternativní vícerozměrná klasifikační metoda, která je běžně využívána pro
třídění a identifikaci, je metoda SIMCA. Tato metoda vyžaduje vývoj samostatných SIMCA modelů pro
každý materiál, který chceme identifikovat a představuje tak nesouvislé modelování tříd (termed
disjoint class modeling). To je dosaženo použitím dále používané hlavní komponenty a pro každé
spektrum je vypočtena residuální vzdálenost k modelu, která by pro přiřazení spektra k dané třídě
měla být nižší než empirická nebo statisticky významná prahová hodnota. Příklad použití SIMCA pro
třídění spekter monohydrátu α-laktózy je na obr. Spektra dalších forem laktózy mají výraznější
reziduální vzdálenost a jsou tak označeny jako nepříslušející k dané třídě.
Obr.
Obr.
Obr.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
30
Obr.
Obr.
Obr.
Obr.
Obr.
Absorpční NIR spektra (druhá derivace) polymorfních forem léku salmeterolu Xinafoate (formy I a
II) jsou uvedeny na obr. 3.24 a 3.25. Hlavní absorpční pásy řazené podle sestupné intenzity (Tabulka
3.5), jsou výrazně odlišné, s rozdíly v relativní intenzitě a pozici pásů (například u formy I je
nejintenzivnější pás při 2258,2 nm, u formy II je tento pás při 2263,6 nm - slabší intenzita, druhý
nejsilnější pás). Analýza hlavních komponent spekter obou dvou forem rovněž vykazuje zřetelné
seskupování příslušných hodnot spektrálního skóre (obr. 3.26).
1.5.
Ramanova spektroskopie
Ramanova spektroskopie je molekulárně spektroskopická metoda založená na jevu Ramanova
rozptylu, předpovězeného v roce 1923 A.G.S. Smekalem a pozorovaného v roce 1928 C.V. Ramanem.
1.5.1.
Teorie Ramanova rozptylu
Ramanova spektroskopie studuje neelastický rozptyl monochromatického záření vzorkem.
Obrázek Figure 3.27 znázorňuje přechody, které mohou probíhat během tohoto procesu. Pokud je
vzorek ozařován monochromatickým zářením o dostatečné energii, probíhá elektronový přechod
stejně jako v UV-Vis spektroskopii. Při využití méně energetického zdroje dojde k porušení
rovnoměrnosti elektronového oblaku doprovázejícího s kovalentní vazbou. Lze to považovat za
přechod do virtuálního stavu. Když se molekula vrací zpět do základního stavu, uvolní během tohoto
procesu foton o stejné frekvenci, jakou má foton ze zdroje. Tento proces se označuje jako Rayleighův
neboli elastický rozptyl. Nicméně, v některých případech se molekula okamžitě nevrací do základního
stavu, ale na vyšší vibrační stav, než je základní. Během tohoto procesu se emituje foton o nižší
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
31
frekvenci než je frekvence dopadajícího fotonu (o delší vlnové délce). Tento neelastický rozptyl je
označován jako Stokesův Ramanův rozptyl.
Obrázek Druhá derivace NIR absorpčního spektra polymorfu I salmeterol xinofoatu (Savitzky –Golay
digitální polynomický vyhlazovací filtr, kvadratický polynom, velikost filtru 7 datových bodů)
Obrázek Druhá derivace NIR absorpčního spektra polymorfu II salmeterol xinofoatu (Savitzky –Golay
digitální polynomický vyhlazovací filtr, kvadratický polynom, velikost filtru 7 datových bodů)
Tabulka Polohy pásů 10 nejintenzivnějších absorpčních pásů (seřazené podle druhé derivace
absorbance, blízká infračervená oblast:1340,6 – 2493,0 nm) v FT-NIR spektrech práškových vzorků
dvou polymorfů Salmeterol Xinofoatu (formy I a II) získané pomocí těžiště negativních pásů ve
spektrech druhé derivace (Savitzky-Golay, velikost filtru 7, kubický polynom)
Obrázek Graf skóre analýzy hlavních komponent spekter polymorfních forem I a II salmeterol
xinofoatu ukazující elipsoidy Hotelling’s T2 95% spolehlivosti ohraničující skóre pro každý polymorf.
Model odvozený od NIR absorpčního spektra druhé derivace (Savitzky – Golay digitální polynomický
vyhlazovací filtr, kvadratický polynom, velikost filtru 7 datových bodů) polymorfů I a II Salmeterol
Xinofoatu. Převzato z Bharati, M. H. and MacGregor, J. F., Multivariate Image Analysis for Real-Time
Process Monitoring and Control, Ind. Eng. Chem. Res. 37: 4715–4724. Copyright (1998) with
permission from American Chemical Society
V menším procentu přechodů, proběhne excitace do vyššího virtuálního stavu z energetické
hladiny vyšší, než je základní stav. V tomto případě, návrat do základního stavu povede k uvolnění
fotonu o vyšší frekvenci (kratší vlnové délce) než u dopadajícího záření. Tento proces se nazývá antiStokesův Ramanův rozptyl. Protože v excitovaném stavu je zpočátku méně molekul, tato forma
rozptylu je méně intenzivní než Stokesův Ramanův rozptyl a Stokesova část spektra je proto většinou
ta, která se měří. Spektra se zaznamenávají ve tvaru intenzity jako funkce Stokesova Ramanova
frekvenčního posunu (cm-1). Jelikož se jedná o posun ve frekvenci od monochromatického zdroje,
který se měří, je proto tento jev nezávislý na vlnové délce použité excitace. Jak je zřejmé z Obr. 3.27,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
32
Stokesův Ramanův frekvenční posun doprovázený s kovalentní vazbou odpovídá fundamentální
frekvenci ve střední infračervené oblasti. Obě techniky jsou navzájem komplementární. Ramanova
spektroskopie proto nepřímo zkoumá vibrační přechody a pozorované posuny mají stejný rozsah
energií jako u FT-IR absorpce. Hlavní rozdíl mezi Ramanovou a FT-IR spektroskopií je
pravděpodobnost pozorování spektrálních linií. FT-IR absorpce jsou většinou pozorovatelné s daleko
větší pravděpodobností než Ramanovy posuny. Ramanův jev je slabý s rozptylem zhruba 10-10 krát
nižší než odpovídající IR absorpce ve střední oblasti. Další nevýhodou v Ramanově spektroskopii je
konkurenční jev fluorescence, zvláště v případech, kde zdroj excitace je viditelné záření (například
514,5 nm). Signál fluorescence, který může být vyvolán buď analytem, nebo nečistotami ve vzorku,
může přesáhnout a překrýt signál Ramanova rozptylu. Nedávný vývoj a využití NIR zdrojů (například
1064 nm lasery), zvláště ve spojení s Michelsonovým interferometrem, do značné míry vyřešilo
problém fluorescence, protože NIR excitace je energeticky podstatně nižší než většina elektronových
přechodů zodpovědných za fluorescenci.
Obrázek Diagram energetických hladin (Jablonskiho) ukazující možné přechody: A) Elektronový
přechod s nezářivým přechodem; B) Rayleighův rozptyl; C) Stokesův Ramanův rozptyl; D) AntiStokesův Ramanův rozptyl. S0 je základní stav singletu, S1 je nejnižší excitovaný stav singletu a ν
představuje energetické vibrační hladiny uvnitř každého elektronového stavu
Navzdory skutečnosti, že Ramanův rozptyl je slabší při delších vlnových délkách, je pozorován
vyšší poměr Ramanova rozptylu k signálu fluorescence, což umožňuje analýzu širší škály vzorků. FT
Ramanova spektroskopie, podobně jako FT-IR spektroskopie, vykazuje další výhodu, co se týče
frekvenční přesnosti a vysokého spektrálního rozlišení. Společnou vlastností Ramanovy a NIR
spektroskopie je možnost rychlých a neinvazivních analýz vzorků. V závislosti na instrumentaci, není
potřeba ani drobná nebo jiná příprava pevných vzorků. Zařízení spojené s mikroskopy nevyžadují
většinou žádnou úpravu vzorku, zatímco u FT spektrometrů, které lze považovat za třídu I, co se týče
laserových zařízení s uzavřenými kyvetovými prostory, je zpravidla vyžadováno malé množství vzorku
umístěného do vzorkovacího kalíšku. Kalíšek má uprostřed vyvrtaný malý otvor s průměrem větším
než fokusovaný laserový paprsek – přibližně 100 mikrometrů. Ramanovy přístroje se liší v intenzitě
svých laserů od několika miliwattů až do 1500 mW. Je třeba být opatrní při výběru intenzity laseru
využitého během zaznamenávání spektra. Studie podle Johanssona a kol, 2002 využila přímé tepelné
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
33
zobrazování ke studiu míry ohřevu škály práškových pomocných látek a léčiv během analýzy
Ramanovou spektroskopií. Některé materiály byly během analýzy citlivější na ohřev s teplotami
pohybujícími se mezi 38 a 60°C. Cílem této práce bylo testování využití rotace vzorku jako prevence
proti přechodu z pevného stavu do tepelně citlivých sloučenin (theophylline monohydrát) a zároveň
aplikace kinetických modelů ke zjištění rychlosti otáčení, která by mohla snižovat ohřev vzorku na
požadovanou hodnotu. Předpoklady byly experimentálně potvrzeny, a proto se jedná o využitelnou
metodu, kterou mohou být analyzovány tepelně citlivé materiály.
1.5.2.
Instrumentace Ramanovy spektroskopie
Ramanovy spektrometry lze rozdělit buď na dispersní, nebo nedispersní (s Fourierovou
transformací). Dispersní přístroje rozdělují rozptýlený Ramanův signál prostorově do jednotlivých
vlnových délek. Intenzitu spektrálních složek lze měřit jednokanálovým detektorem, s využitím
skenovací mřížky nebo lze měřit paralelně s využitím plošných detektorů.
Nedisperzní, spektrometry s Fourierovou transformací nevytváří prostorovou separaci vlnových
délek; jsou modulovány pro každou vlnovou délku nesoucí charakteristickou modulační frekvenci.
Všechny Ramanovy spektrální prvky se měří najednou (multiplex) jako interferogram, ze kterého se
inverzní Fourierouvou transformací (jejíž algoritmus je prováděn prakticky okamžitě s měřením
s využitím připojené počítačové jednotky) vypočítá spektrum.
Použitá vlnová délka je klíčový faktor pro úspěšnou analýzu Ramanovou spektroskopií (navzdory
tomu, že teoreticky nemá použitá vlnová délka žádný vliv na pozorovaný Ramanův posun). Kratší
vlnové délky většinou vykazují větší průřez, a proto umožňují detekci s vysokým kvantovým výtěžkem
a menší hladinou šumu a zdokonalit tak citlivost. Nicméně, s kratší vlnovou délkou (např. 406, 515
nm) se stává fluorescence pravděpodobnější, aby byla pozorována ve spektru, protože v ultrafialové
a viditelné oblasti dochází k elektronovým přechodům. Aby neměl tento efekt vliv na naměřené
spektrum, mohou se využít excitace laseru s delší vlnovou délkou, jako např. NIR lasery (například
1064 nm). Kratší průřez laseru znamená, že poměr signál/šum je nižší a z toho důvodu je potřeba
zvýšit intenzitu laseru nebo počet akumulovaných skenů. Excitační vlnové délky při 850 nm nebo
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
34
vyšší (1064 nm) obvykle vyžadují, aby byl spektrometr nedispersní s Fourierovou transformací z
důvodu nízké použitelnosti vhodných multikanálových detektorů pro posuny o vlnových délkách
vyšších než 100 nm a tím se lze vyhnout obvyklým problémům při měření s viditelnými excitačními
vlnovými délkami. Lasery využívané pro analýzy farmaceutik a většinu analytických aplikací obvykle
pracují nepřetržitě a nemají bezpečnostní rizika spojená s pulsními lasery o vyšší intenzitě a obvykle
lepší frekvenční stabilitě (<1 cm-1).
Snímání rozptýleného Ramanova signálu může být v 90° uspořádání nebo v 180°uspořádání,
pokud měření zpětně rozptýleného signálu je od vzorku nebo objektivu mikroskopu. Výběr detektoru
závisí na excitační vlnové délce laseru, citlivosti a typu spektrometru. Detektor bude také ovlivněn
rychlostí měření a požadovaným spektrálním rozsahem.
Dispersní, multikanálové spektrometry využívají většinou lasery o excitační vlnové délce menší než
900 nm a jsou tak schopny využívat křemíkové detektory se zařízením s vázaným nábojem (chargecoupled device CCD), které jsou limitovány do přibližně 1100 nm. Křemíkové CCD poskytují tomuto
spektrometru vysoký poměr signál/šum.
1.5.3.
Farmaceutické aplikace Ramanovy spektroskopie
V poslední době existuje několik výukových materiálů zahrnující charakterizaci farmaceutik
v pevné fázi řadou spektroskopických technik jako je Ramanova spektroskopie (Bugay 2001;
Wartewig a Neubert 2005). Aplikace Ramanovy spektroskopie pro charakterizaci farmaceutik v pevné
fázi lze rozdělit do studií polymorfismu (identifikace a kvantifikace), proces monitorování a kontroly
(například, hydrolytická degradace, vysoce účinná polymorfní krystalizace, stanovení počátku
krystalizace, krystalické stability, účinků na tvorbu krystalů během zpracování, organická syntéza);
chemického zobrazování a mapování (například, ke stanovení krystalické formy); charakterizace a
sledování tvorby hydrátů a adsorpce vodní páry; kvantitativní stanovení účinných složek farmaceutik
ve vícesložkovém složení a stanovení stupně krystalinity.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
35
1.5.4.
Ramanova spektrometrie jako technika pro proces
monitorování, degradace, stability a krystalizace
Dřívější farmaceutické aplikace NIR FT-Raman spektroskopie popisuje výhody FT-Raman
spektroskopie pro charakterizaci farmaceutik (Tudor a kol. 1990). Tři specifické farmaceutické
systémy byly odzkoušeny: práškové, krystalické sympatomimetické aminy (arterenol, fenylefrin a
efedrin), biomedicinské polymery citlivé na hydrolýzu (poly(sebacic) anhydrid) a profilování
koncentrace léčiva (Diclofenac, koncentrační rozsah: 0,01 – 60 %) kromě polymerní matrice. Aby se
demonstrovala použitelnost této techniky pro identifikaci strukturně podobných (příbuzných)
sloučenin, byly vybrány tři aminy: ty, které byly jednoduše rozlišitelné od spektrální oblasti „otisku
prstu“ ukazující výrazné vibrační pásy substituovaných skupin (např. skupinu meta-disubstituovaného
benzenu v fenylefrinu u 996 cm-1 díky dýchací vibraci trigonálního kruhu) umožňující jejich
identifikaci. Ukázalo se, že obecně mohou fenylové skupiny výborně rozptylovat Ramanův signál.
Degradace poly(anhydridů), které jsou používány během reakcí ke kontrole rychlosti uvolňování
léčiva z polymerní matrice přes chemickou modifikaci uhlíkového řetězce, byla studována pomocí
dvou charakteristických karbonylových vibrací anhydridů (které byly odděleny 50 – 70 cm-1). Tyto
páry absorpcí se lišily pro každý anhydrid, umožňující jejich identifikaci. Byla také zjištěna možnost
studovat a sledovat degradaci těchto polymerů v pevném stavu pomocí dvojice pásů anhydridu (1803
a 1739 cm-1), u kterých klesá intenzita s degradací a současně se sleduje vznik a nárůst intenzity
komplementárního pásu karbonylové skupiny (1640 cm-1). Autoři spekulují, že by tato technika mohla
být vhodná pro kvantifikování kinetiky degradace v polymerech. Uvolňování léčiva (Diclofenac)
z matrice alginátu polymeru se také posuzovalo pomocí FT-Ramanovy spektroskopie. Dva silné
aromatické pásy díky Diclofenacu byly pozorovány u 1578 a 1603 cm -1 s alginátem, který vykazuje
slabý Ramanův rozptyl. Tato studie prokázala hodnoty FT-Ramanovy spektroskopie pro in-situ
charakterizaci pevných látek (jak kvantitativní tak kvalitativní) takového systému dodání léku.
Disociace vysoce krystalického hydrochloridu nějakého léčiva do amorfní formy, volné báze byla
studována s využitím FT Ramanovy spektroskopie (Williams a kol. 2004). Zkoumaným procesem byla
výroba tablet pomocí granulace mokrou cestou a bylo zjištěno, že transformace krystalické formy do
amorfní volné báze měla za následek změny vlastností tablet, zejména nárůst tvrdosti tablet. Faktory
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
36
upravující konverzi/přeměnu byly stanoveny výrobou tablet z vodných a nevodných granulačních
tekutin, vystavením granulí ve vlhkém prostředí po určité období předcházející sušení a skladování a
vystavení tablet při 40°C/75% relativní vlhkosti. Bylo zjištěno, že vystavení API do vlhkého prostředí
po delší dobu urychlilo disociaci léčiva; tento jev byl minimalizován při použití bezvodé (absolutní
etanol) granulovací kapaliny a vyvarování se zpoždění díky výrobě a skladování produktu
v uzavřeném prostředí. Bylo zjištěno, že metoda Ramanovy spektroskopie je vynikající pro sledování
disociace a byla také spolehlivě schopna detegovat přítomnost obou forem léčiva, krystalické a
amorfní, amorfní až na hladinu nižší než 1 % a umožnila vývoj vhodného procesu a stabilní tvorby.
Rozsáhlý přehledový článek (Morissette a kol. 2004) o „high throughput“ krystalizaci,
polymorfech, solích, ko-krystalech, solvátech farmaceutických pevných látek konstatuje, že taková
HT-technologie využívá, při jeho konečné analýze krystalických pevných látek, Ramanovu
spektrometrii, buď samotnou nebo v kombinaci s práškovou Roentgenovou difrakcí, k charakterizaci
a rozlišení mezi různými pevno-látkovými formami (polymorfy, formy solí, solvatované formy a
hydráty) s podílem rychlosti přeměny vzorků pro analýzy, které jsou závislé na faktoru upravujícího
volbu techniky. Ramanova spektrometrie se také hodí k rychlé analýze vzorků a je často primárním
prostředkem „high-throughput“ vytvářených charakterizací krystalů. Autoři upozorňují, nicméně na
problém fluorescence a potřebu v určitých případech použít delší vlnové délky NIR laserů aby se snížil
vliv fluorescence. Interpretace Ramanových spekter HT krystalických vzorků může být dosaženo
pomocí klastrovacích technik s použitím spočítané míry podpobnosti jako je Tanimotův koeficient.
Tato statistika je odvozena ze spekter s filtrovaným pozadím a z přiřazených poloh pásů a intenzit.
Analytik je schopen nastavit toleranci polohy pásu a filtrované intenzity pásů, aby provedl spektrální
třídění a interpretace.
FT-Ramanova spektrometrie se využila k posouzení konformačních změn ve struktuře proteinu
lysozomu (Elkordy a kol. 2004). Surové, sprejově-sušené a krystalické přípravy enzymu byly
podrobeny extrémním podmínkám za různých teplot a relativní vlhkosti (4 – 60°C, 2 – 75% relativní
vlhkosti). Sekundární struktury těchto vzorků byly analyzovány při různých Ramanových posunech:
amide I (1660 cm-1) pro α-helix; amide II (1250 – 1350 cm−1) – charakteristický u proteinů. Pás u 1255
cm-1 byl použit k označení amidu III. Spektrum enzymu ve vodném roztoku bylo použito jako
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
37
referenční spektrum, ukazující charakteristické rysy pro strukturu α-helix. Toto spektrum se použilo
k porovnání spekter pevných látek, uchovaných při různých teplotách a vlhkosti. Nebyla pozorována
žádná degradace pevných vzorků (surové, sprejově-sušené a krystalické) uchovaných při 4°C a 2%
relativní vlhkosti po dobu 20 týdnů. Uchování při 20°C a 65% vlhkosti nebo 30°C a 65% vlhkosti po
dobu 20 týdnů vedlo ke vzniku nového absorpčního pásu u sprejově-sušeného vzorku, připisovaného
k agregaci a současně změně v Ramanovém posunu amidu I o 9 cm-1. U vzorků uchovávaných při 40°C
a 75% vlhkosti po dobu 20 týdnů, oba nezpracované a sušené lysozomy ukázaly štěpení a posun pásu
amidu I; ve spektru surového vzorku se objevil nový pás u 1788 cm-1 a ve spektru sušeného vzorku
nový pás u 1715 cm-1.Druhý pás byl připsán agregaci a nestabilitě proteinu. V případě krystalického
vzorku byla pozorována malá změna, kromě nepatrné změny v posunu pásu amidu I o několik málo
cm-1, což naznačuje, že tento vzorek je docela stabilní, což bylo také potvrzeno měřením. Analýza
rozpuštěných vzorků a samotná jejich měření odhalila, že teplota ovlivňovala stabilitu sušeného
vzorku, zvláště co se týče změny posunu: u amidu I o 4 cm-1, a amidu II o 8 cm-1. Spektra pevných
vzorků, uchovávaných při různých teplotách a různých hodnotách relativní vlhkosti odhalila, že
nezpracované a krystalické vzorky byly stabilní více než 20 týdnů. Zpracování superkritické tekutiny
lysozomu a jeho vysrážení z roztoku bylo také studováno Ramanovou spektrometrií (Moshashaee a
kol. 2003). Analýza pevných vzorků FT-Ramanovou spektrometrií, s 1064-nm excitací a výkonem
laseru 200 mW superkriticky vysráželo lysozom pomocí (vodným) roztokem zesílenou disperzí
nadkritickou kapalinou (SEDS). Malé změny byly pozorovány ve spektrech lysozomů tvořených
následujícím SED procesy. Oblast spektra amidu I, která je charakteristická pro α-helix (1660 cm-1)
vykazovala změnu plus 4 cm-1 následující SED vysrážení, v souladu se snížením počtu vodíkových
vazeb a úpravou sekundární struktury. Další důkaz změny v sekundární struktuře byl poskytnut
negativním přemístěním oblasti absorpčního pásu amidu III na 1250 cm-1. Celkově, bylo zjištěno, že
změny v Ramanových spektrech pevných vzorků, viz změny v Ramanových posunech absorpčních
pásů, dobře odpovídají s biologickou aktivitou v rozpuštěném stavu.
Strukturální změny v léčebné protilátce (therapeutic antibody), vyvolané sušením, se
přezkoumávaly Ramanovou spektrometrií (Sane a kol. 2003). Výsledky ukázaly, že bylo možné
kvantifikovat barvivem indukované sekundární strukturální změny pomocí sledování pásu amidu I a
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
38
autoři spekulují, že by to mělo poskytnout větší porozumění procesu denaturace proteinu se sušením
a metody rozvinuté k překonání a minimalizaci takových změn. Dlouhotrvající stabilitu sprejem
sušených a lyofilizovaných forem by mohlo jít předpovědět ze strukturního stavu protilátky okamžitě
po každém sušícím procesu. Bylo také ukázáno, že Ramanova spektrometrie umožňuje rychlejší
způsob výběru vhodných pomocných látek a jejich koncentraci během studií pro vývoj formy než
složitější studie stability (několik hodin s první jmenovanou metodou versus několik měsíců s druhou
jmenovanou metodou).
Absorpce tetracainu z bioadhezivní gelové náplasti byla posuzována Ramanovou spektrometrií.
Tato analytická technika se ukázala jako použitelná z několika důvodů. Zaprvé, umožnila posouzení
fyzikálních interakcí mezi léčivou látkou a složkami gelu. Žádné interakce nebyly pozorovány, což také
bylo podpořeno klinickými údaji o účinnosti. Sledováním zavádění následující aplikace gelu na
pokožku ukázalo rozšíření absorpčních pásů u 774, 848 a 907 cm-1. Bylo to v souladu se změnou fáze
léčivé látky po aplikaci na pokožku. Pokles intenzity pásu tetracainu u 1600 cm-1 v gelu dokazoval
absorpci léčiva přes pokožku a kompletní absorpce léčiva byla pozorována 40 minut po podání,
s malým množstvím dalších změn ve spektrech. Bylo to v souladu s nasycením stratum corneum
(vrstvy pokožky) se zásobou tetracainu. Autoři z toho vyvodili závěry, že Ramanova spektrometrie
byla vhodná k charakterizaci takových farmaceutických přípravků na bázi gelu, jednoduchá, rychlá a
prakticky neinvazivní technika.
Monitorovací proces syntézy Metoprololu pomocí Ramanovy spektrometrie, s excitací laseru 785
nm a optickými vlákny, byl v poslední době studován (Svensson a kol. 2000). Metoda využila
chemometrickou analýzu dat, hlavně PCA a PLS. Žádná kvantifikovaná data nebyla potřeba ke
kalibrování statistického modelu pomocí multivariační analýzy, nebylo nutné řešit vlivy překryvu pásů
v meziproduktech a konečném produktu. Multivariační regulační diagramy Euklidovské vzdálenosti
PCA nebo PLS skóre byly použity ke stanovení koncového bodu (výsledný ukazatel); autoři
demonstrovali, jak aplikace PAT umožňuje redukci během dávkovacího cyklu.
Ramanova mikro-spektrometrie ke stanovení polymorfní formy se využila ke zjištění začátku
krystalizace Sulfathiazolu (Anderson a kol. 2001). Ramanova mikro-spektrometrie jednoduchých
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
39
krystalů 5 polymorfních forem podala více informativní a ucelené výsledky než IR analýza ve střední
oblasti spektra. Děje se tak pravděpodobně díky kolísání v přítomnosti vzorku a mid-IR spektroskopie
analyzuje více než jeden krystal, a tak se spíš podobá analýze velkoobjemové.
1.5.5.
Polymorfismus a použití Ramanovy spektroskopie
Obě základní metody vibrační spektroskopie, a to FT-IR (za využití reflexní techniky DRIFTS) a FTRamanova spektrometrie, byly použity současně ke studiu 13 velkoobjemových farmaceutických
příprav Spironolactonu (Neville a kol. 1992). Tyto techniky byly také použity k detekci zbytků
rozpouštědel, hydrolytického vedlejšího produktu, thiooctové kyseliny, enolických tautomerizačních
forem a polymorfních forem. Benzen byl detekován v jednom vzorku. Enolické tautomery nebyly
nalezeny. Čtyři různé polymorfy byly detekovány oběma metodami (DRIFTS: 3600 – 3200 cm-1;
Raman 1800 – 400 cm-1). Bylo zjištěno, že je možné přiřadit všechny valenční vibrace C=O a C=C vazeb
od 3600 – 3200 cm-1 overtone a oblasti kombinačního pásu. Navíc, Ramanovy linie 637 a 655 cm-1
byly přiřazeny přítomnosti dvou C-S valenčních módů kyseliny thiooctové.
V později publikované studii byla také využita IR a Ramanova spektrometrii pro studium
polymorfů acetazolamidu (Griesser a kol. (1997). Ze dvou polymorfních forem, které charakteristicky
krystalizují z vody buď jako jehličky nebo rovinné krystaly, žádná neprokázala konformační
polymorfismus. Obě formy vykazují asociační typ polymorfismu – pro nějž jsou charakteristické
rozdíly ve tří-dimenzionálních vodíkových strukturách. Obě IR i Ramanova spektroskopie ukázaly
rozdíly ve spektrech forem I a II. Bylo zjištěno, že N(4)-H· · ·O(1) ve formě II vede k posunu valenční
frekvence vazby C=O k nižším frekvencím (IR: 1679 cm-1 s formou II cf. 1701 cm-1 a formou I; Raman
1675 cm-1 s formou II cf. 1704 cm-1 s formou I). Navíc, symetrické a antisymetrické N-H valenční
vibrace formy II ((3301, 3182, 3094 cm−1) se vyskytly u nižších vlnočtů než ve formě I (3337, 3228,
3152 cm−1), což vypovídá o silnějších intermolekulárních vazebných silách. Ramanova spektroskopie
také ukázala zřetelné rozdíly v oblasti vibrací krystalické mřížky, pod 200 cm-1.
Byla vyvíjena semi-kvantitativní metoda pro stanovení dvou polymorfů, A a B, ve vlastní
sloučenině. Tato metoda byla vyvíjena použitím připravených směsí dvou polymorfů s formou A a B
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
40
přítomných ve směsi (koncentrační rozsah formy A: 1.8 – 15.4% m/m). Bylo zjištěno, že relativní
intenzita dvou charakteristických pásů, 1716 a 1724 cm-1 je lineárně úměrná relativnímu množství
každé formy. Přehledná studie Findlay a Bugay (1998) demonstrovala široké využití Ramanovy a IR
spektroskopie pro identifikaci rozpouštědla (cyklohexanu), odlišeného od polymorfní formy. Výhodou
Ramanovy spektroskopie oproti IR spektroskopie byl širší spektrální rozsah, pokrývající oblast 500 –
25 cm-1 – tento rozsah je použitelný pro studium mřížkových vibrací. Vliv teploty na krystalizaci byl
sledován pomocí přesycených roztoků mentolu v etanolu.
Léčiva v pevné fázi přítomná v tabletách a kapslích různých léků: enalapril maleate, prednisolone
(formy I and II), bezvodá forma theophyllinu a monohydrát theophyllinu a warfarin sodium clathrate
byly vyhodnocovány Ramanovou spektrometrií (Taylor a Langkilde 2000). Přítomnost léčiva by mohla
být detegována na úrovni nižší než 1 % hmotnostních dávkovacích jednotek (dosage unit’s mass) a
v některých případech jako krystalická forma. Bylo zjištěno, že pro studium o přítomnosti léčiva jsou
použitelné pásy odpovídající aromatickým C-C a karbonylovým skupinám (například, pásy mezi 1750
– 1500 cm-1 odpovídají vibracím prednisilonu, dominantní vibraci karbonylu v prednisolonu spřažené
s vibracemi nenasycených uhlíků v sousedním kruhu u 1653 cm-1) jako malé interference nastalé od
vibrací pomocné látky. Screening metoda pro stanovení a získání nejstabilnějšího a žádoucího
polymorfu léčiva během tvorby byla popsána Millerem a kol. (2005). Použitím sady různých
rozpouštědel o různé polaritě, byla studována konverze zprostředkovaná rozpouštědlem Ritonaviru
z formy I na formu II technikou XRPD a Ramanovou spektrometrií. Obě formy byly připraveny
rekrystalizací ze směsi rozpouštědel (2:1 ethylacetate : heptan a aceton, resp.) a jejich formy
stanoveny technikou XRPD. Další léčivo, uvedené jako sloučenina A bylo studováno obdobným
způsobem. Ramanova spektrometrie byla využita ke studiu konverze in-situ nasycené suspenze
rozpouštědlo/krystal léčiva v různých testovaných systémech rozpouštědel. Aplikace PCA na spektra
mezi 1145 – 1200 cm-1 umožnila stanovení míry polymorfní konverze a kinetiky procesu. Celková in
situ metoda Ramanovy spektrometrie usnadnila výběr vhodného rozpouštědla o relativně nízké
rozpustnosti pro navýšení, které poskytlo vysokou výtěžnost krystalizace.
Použití Ramanovy spektroskopie pro odlišení polymorfní formy od 14 léčiv bylo hodnoceno
statisticky (Mehrens a kol. 2005). Variační analýza (ANOVA) byla použita na pásy forem každého
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
41
léčiva. Srovnáním rozdílů v pozici pásu uvnitř a mezi polymorfy byli autoři schopni nastavit limitní
posun v pozici píku o 1.6 cm-1 pro správnou identifikaci alternativní polymorfní formy léčiva.
Důkladná studie charakterizace falicaine hydrochloridu a isomorphic dyclonine hydrochloridu
v pevném stavu byla provedena pomocí několika technik FT-IR a FT-Ramanovy analýzy. Obě techniky
byly zjištěny jako komplementární a ukázaly reprodukovatelné rozdíly ve spektrech polymorfních
forem každého léčiva, s posunem polymorfních pásů mezi 3 a 6 cm-1. Nejvíc patrné rozdíly ve
spektrech kteréhokoli polymorfu léčiva byly pozorovány mezi 2980–2960 cm−1 (FT Raman), v oblasti
odpovídající valenčním C-H vibracím alkylového řetězce; 1700–1600 cm−1 (FT-IR), valenční vibrace
karbonylu a amino skupiny, 1500–1000 cm−1 (FT-IR), molekulové vibrace a 200–50 cm−1 (FT-Raman),
vibrace krystalické mřížky. Tyto mřížkové vibrace jasně ukázaly rozdílné krystalické mřížky
polymorfních forem. Byla studována krystalizace z metanolu (Anquetil a kol. 2002) in-situ a
Ramanovou analýzou v reálném čase polymorfní formy carbamazepinu (formy I a III). V této studii se
testovaly mikrolitrové objemy a bylo zde možné stanovit rozpustnost a krystalizační formu léčiva a
také se ukázala schopnost reprodukovatelně studovat polymorfní formu z teplotně-řízených
podmínek a to s minimem vzorků.
1.5.6.
Pseudopolymorfismus a Ramanova spektroskopie
Účinek tvorby solvátu a následující dehydratace na krystalovou strukturu carbamazepinu byla
zkoumána FT Ramanovou spektrometrií (McMahon a kol. 1996). S využitím polymorfních forem I a III
(forma III připravená z formy I zahřátím při 170°C a struktura potvrzena diferenční skenovací
kalorimetrií, dihydrát každé formy byl tvořen pozastavením tvorby anhydridu každé formy
v destilované vodě a mícháním po dobu 24 hodin. Tvorba dihydrátu byla potvrzena Karl Fischerem a
termogravimetrickou analýzou (TGA) za vlhka. Hydratované formy byly uchovávány při
laboratorní/pokojové teplotě a 55-60% relativní vlhkosti, aby se udržela celistvost hydrátu. Za
podmínek, kde vlhkost může být snadno odstraněna, analýza Ramanovou spektroskopií odhalila, že
při dehydrataci dihydrát přešel zpět do polymorfní formy I, bez ohledu na začínající tvorbu krystalu;
spektra dehydratovaného materiálu byla v souladu se spektry formy I. Ramanovou spektroskopií bylo
zjištěno, že vzorky dihydrátu zahřívané a dehydratované v DSC misce při 110°C také přecházejí zpět
k jejich příslušným výchozím polymorfním formám (I a III, resp.). Strukturní rozdíly mezi dihydráty
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
42
byly studovány oběma technikami, Ramanovou spektroskopií (oblast mřížkových vibrací: 50–200
cm−1) a difuzně reflexní infračervenou spektrometrií s Fourierovou transformací (DRIFTS). Ramanova
spektrometrie byla preferována pro odlišení začínající bezvodé konformace dihydrátu od vody,
vykazující slabý signál Ramanovy rozptylu, což nevedlo k vibracím, které by zakryly signály z léčiva
samotného. Dihydrát tvořený z formy III byl nejjednodušeji identifikován solvát pomocí analýza
Ramanovou spektrometrií. Za podmínek blízkých podmínkám uskladnění, ve kterých vlhkosti nebylo
dovoleno uniknout, zahřívání dihydrátů vytvářených z obou bezvodých forem vedlo také k vytvoření
jejich příslušných bezvodých forem. A tak autoři usoudili, že patrnou „paměť“ v krystalech dihydrátu
lze vysvětlit formou dihydrátu (produkované z kterékoli bezvodé formy), která není zřetelná.
Interakce vodní páry s amorfními polymery (PVP: K90 & K12; PVP/Va a PVAc) přes vodíkové
můstky byla studována Ramanovou spektrometrií (Taylor a kol. 2001). Tato studie se prováděla,
protože fyzikální absorpce vody hydrofilními polymery má tendenci pozměnit fyzikální a chemické
vlastnosti, zahrnující chemickou stabilitu, sypkost a stlačitelnost, plasticitu, volný objem a teplotu
skelného přechodu. Vztah mezi obsahem vody a teplotou skelného přechodu byl zkoumán s cílem
stanovit
optimálního
obsahu
vody,
který
by
snížil
teplotu
skelného
přechodu,
na
odpovídající životnímu prostředí a tím umožnit konverzi polymeru z viskózního skelného stavu do
méně viskózního pružného stavu. Tyto polymery nejsou schopny tvořit inter- nebo intramolekulární
vodíkové vazby, protože nejsou přítomny žádné kyselé protony, terciární amidová funkční skupina
v PVP je hydrofilní a tak schopna tvořit vodíkové vazby s molekulami vody. Použitím dobře sušených
vzorků, Ramanova spektra každého polymeru byla získána a použita k reprezentaci spektra bez
vodíkových vazeb, čistého vzorku. Vzorky pak byly vystaveny vzdušné vlhkosti a byla sledována oblast
karbonylu v Ramanově spektru. S rostoucím obsahem vlhkosti byl sledován pozorovatelný posun
pozice pásu k nižšímu vlnočtu, dokazující tvorbu vodíkových vazeb. Stejný trend posunu pozice pásu
karbonylu byl pozorován pro další tři polymery po vystavení vlhkosti. Analýza hlavních komponent
(PCA) spekter (oblast 1550–600 cm−1) každého polymeru, uchovaných při různých hodnotách relativní
vlhkosti, byla provedena. Ve všech případech skóre první hlavní komponenty viditelně dobře
korelovalo s relativní vlhkostí. Narušení linearity v těchto grafech skóre versus relativní vlhkost se
ukázalo tak, že odpovídalo obsahům vody, při kterých se polymery transformovaly ze skleného do
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
43
pružného stavu pro PVP K 12 a PVP/VA, a přibližně také pro PVP K90; ne příliš jasné trendy byly
pozorovány pro PVAc.
Tvorba hydrátů a sledování granulace vlhkou cestou během procesu byly studovány oběma
Ramanovou a NIR spektrometrií pro dvě strukturně příbuzná bezvodá léčiva: kofein a theophylline
(Jorgensen a kol. 2002). S Ramanovou spektrometrií, tvorba hydrátu theophyllinu byla
charakterizována ztrátou dvou absorpčních pásů u 1699 a 159 cm-1 (valenční C=O vibrace) se
současným výskytem pásu u 1680 cm-1. Byl zjištěn posun obou pásů pro oba hydráty k nižším
vlnočtům na tvorbu hydrátu theophyllinu. Spektra theophyllinu vlhkých vzorků s 1,3 moly vody na 1
mol bezvodé formy neukázala pozorovatelné rozdíly od spekter monohydrátu. Spektrum vlhkého
vzorku s 0,3 moly vody na mol bezvodé formy se podobalo spektrům bezvodé formy, jejíž vzorek
s 0,7 moly vody na mol bezvodé formy ukázalo charakteristické rysy meziproduktů obou bezvodé i
monohydratované formy. S kofeinem, hydratovaná forma byla charakterizovaná výskytem nového
pásu u 1650 cm-1 a současně posunem dalšího pásu směrem k vyšším vlnočtům. Ramanova spektra
vlhkých vzorků kofeinu s vlhkostí mezi 0,3 a 0,9 moly na mol bezvodé formy se podobalo spíše
bezvodé formě. Z toho důvodu tvorba hydrátu vypadala, že nastává s theophyllinem při mnohem
vyšší vlhkosti vzorku než v případě kofeinu. Navíc, protože Ramanova spektra kofeinu a jeho hydrátu
byla méně variabilní než theophyllinu a jeho hydrátu, autoři usuzují, že větší přeuspořádání ve
struktuře theophyllinu probíhá při tvorbě hydratované formy.
1.5.7.
Využití Ramanovy spektroskmopie jako procesní
analytické techniky v rámci PAT
Možnost aplikace Ramanovy spektroskopie jako procesní analytické techniky PAT bylo nedávno
studováno Islamem a kol. 2004. Studovaly se procesy výroby lokálních/povrchových forem léků – gel
a emulze. Při nastavení přístroje se využilo vláknové optické sondy připojené ke spektrometru.
Spektra surových materiálů a šarží vyrobených gelů byla získána, aby se ověřily charakteristické
vibrace. Pomocí této informace bylo zjištěno, že je možné monitorovat a detegovat rozdílné výrobní
stupně procesu, které zahrnovaly přidávání zahušťovadla a emulgátorů. Autoři na závěr shrnuli, že
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
44
Ramanova spektroskopie má potenciál, aby byla využitelná jako PAT technika pro kontrolu jakosti
lokálního/povrchového gelů a krémů.
Další příklad in-line sledování procesu mísení peletů Diltiazem HCL a kuliček parafinového vosku
s využitím přístroje s vláknovou optickou sondou bylo poskytnuto Vergotem a kol. 2004. Po procesu
výroby následovalo přezkoumání odchylky mezi po sobě následujícími měřeními Ramanovou
spektrometrií, získanými v reálném čase. Velká spektrální odchylka byla pozorována během
počátečních stádií mísení a bylo to přiřazeno nehomogenitě vzorku. Jak pokračovalo mísení,
spektrální odchylka se zmenšovala v souladu dosažení homogenity. Validace Ramanovy
spektroskopie pro sledování procesu a detekci konce procesu byla potvrzena HPLC analýzou vzorků
odebraných vzorkovačem.
Nedávný přehled o studii procesů krystalizace pomocí analytických technologických metod
poznamenává, že čidla v takovýchto procesech zahrnují molekulové spektroskopické metody
Ramanovy, NIR a ATR FT-IR spektroskopie (Yu a kol. 2004). Několik příkladových studií je uvedeno,
zdůrazňování kontroly kritických PAT aspektů pro stanovení kvality výrobku: velikost, tvar, polymorfní
forma a to vše pomocí uvedených analytických metod. Kombinace Ramanovy spektrometrie
s chemometrickou analýzou dat, byla použita k identifikování a kvantifikaci množství několika
polymorfních forem přítomných v tabletách Ranitidine hydrochloridu. Chemometrická analýza
zahrnující třísložkovou analýzu hlavních komponent se ukázala jako nutná pro rozlišení různých
forem, které byly spektrálně podobné a ne příliš jednoduše rozlišitelné od jejich surových spekter.
Skóre hlavních komponent byla použita k vývoji kvantitativního modelu pro stanovení relativního
obsahu každé přítomné formy. Studie detailně popisuje použití Ramanovy a NIR metody pro in situ
sledování a sledování v reálném čase procesů krystalizace, zvláště pro vývoj robustních procesů
k minimalizaci nespecifikovaných šarží, kvantifikaci úrovně přítomnosti polymorfu a kontroly léčivého
účinku procesu. Polymorfy progesteronu byly rozsáhle studovány Ramanovou spektrometrií. Toto
farmaceutikum má minimálně pět definovaných polymorfů, ačkoli jen u forem I a II bylo zjištěno, že
jsou důležité pro studium během krystalizace. Bylo zjištěno, že vibrační pás karbonylu se mezi těmito
dvěma formami liší (forma I: 1662 cm−1 a forma II: 1667 cm−1) a pozice tohoto pásu byla tak použita
ke kvantifikaci každé formy in situ. Studováním polymorfních přechodů v široké oblasti podmínek a
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
45
teplot, kinetiky procesu byly pak stanoveny z těchto dat, umožňující pracovníkovi soustavně vyrábět
jednu ze dvou polymorfních forem – v souladu s charakterem PAT. Dodatečný krystalizační proces,
produkce sloučeniny „MK-A“, byl studován in situ pomocí Ramanovy spektrometrie. Meziprodukt
„semi-pure“ procesu se skládal z několika forem krystalu: bezvodé formy A a C, hemihydrát a
dihydrát. Ramanova spektra těchto odlišných forem byla získána a pak použita k sestavení
kvantitativního modelu pro předpověď jejich hladiny zastoupení z následujících procesních spekter.
Kinetika transformace dvou polymorfních způsobů (cest) byla úspěšně objasněna: hemihydrát na
formu C a forma C na formu A. Tato metody umožnila vývoj nového robustního procesu pro stejný
produkt MK-A v požadované polymorfní formě.
1.5.8.
Ramanova spektroskopie – další příklady
farmaceutických aplikací
Použitelnost Ramanovy spektroskopie pro charakterizaci farmaceutik v pevné fázi bude nyní
předvedena na nějakých farmaceutických příkladech.
Analogicky k ATR FT-IR spektroskopii, Ramanova spektrometrie může být také použita pro
identifikaci farmaceutických materiálů v pevném stavu. Pozice Ramanových pásů vibrací 13 běžně
dostupných práškových léčiv a pomocných látek jsou uvedeny v Table 3.6. Protože Ramanovy pásy
mají tendenci být symetrické, pozice pásů mohou být vypočítány z první derivace vibračních spekter
(například pomocí Savitzky-Golay digitálního polynomického vyhlazovacího algoritmu). Pozice pásů
lze vypočítat první derivací spektra pomocí lineární interpolace – jako poloha Ramanova posunu, při
které je derivace rovná 0 (metoda hledání průsečíku s nulou the 0 -point crossing method).
Paracetamol (Acetaminophenol v US) velmi dobře rozptyluje Ramanův signál, s 24 dobře
definovatelnými vibračními pásy. ASTM jej doporučuje jako kalibrační standard pro Ramanův posun
(ASTM 2002). Ramanovo spektrum paracetamolu je ukázáno na obrázku Figure 3.28. První derivace
tohoto vibračního spektra paracetamolu, ukazující „0-point crossing“ pozici každé vibrace, je uvedena
na obrázku Figure3.29.
Ramanova spektrometrie je hodnotná technika pro studium krystalických forem farmaceutických
materiálu v pevném stavu. Jako příklad, pomocná látka laktózy má dva dobře definované polymorfy,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
46
α- a β-, a také se vyskytuje ve formě hydrátů, pseudo-polymorfní formě. Navíc sprejově sušená
laktóza může často existovat i v amorfním stavu. Ramanova spektroskopie je použitelná technika pro
charakterizaci takových forem pomocných látek a léčiv, protože tyto látky vykazují odlišnosti
v intenzitách pásů (a relativních intenzitách) a posuny v polohách pásů. Tabulka Table 3.7 ukazuje
polohy 6 nejintenzivnějších Ramanových pásů pro různé formy laktózy: sprejově sušená (částečně
amorfní), α-bezvodá, α-monohydrát, β-bezvodá. Tato tabulka ukazuje, že rozdíly ve spektrech mezi
odlišnými formami laktózy jsou rozpoznatelné podle jejich prvních 6 nejintenzivnějších vibrací a tuto
informaci lze využít k odlišení a identifikaci těchto forem. Další využitelná informace pro jejich
charakterizaci může být studována přezkoumáním rozdílů v polohách pásů a intenzitách všech pásů.
Roztříděním těchto forem laktózy na: α-polymorfní (bezvodá, monohydrát), bezvodá (α- a β-formy) a
amorfní (sprejově sušená versus α-monohydrát) je možné identifikovat rozdíly ve spektrech uvnitř
každé třídy pro charakterizaci solvátu, polymorfní a amorfní formy, resp. Tabulka Table 3.8 ukazuje
řádově rozdíly v intenzitách (100% do 0% libovolné intenzity) pásů forem laktózy (třetí a čtvrtý
sloupec napravo tabulky), ignorující ty pásy, které jsou v běžném a v řádově odpovídajícím
intensitním-pořadí podle pořadí vzorků. Graf překrývajících se spekter těchto forem také ukazuje
spektrální rozdíly (Figure 3.30).
Dalším klasickým příkladem schopnosti Ramanovy spektrometrie rozlišit polymorfní formy látek
v pevném stavu je u léčiva Sulfathiazol. Toto léčivo má 5 popsaných polymorfních forem. Standardní
normální variabilitou transformovaná Ramanova spektra forem I, II, III a V jsou ukázána na obrázku
Figure 3.31. Tato spektra ukazují zjevné rozdíly v intenzitách pásů a jejich polohách. PCA analýza
spekter vyžaduje právě dvě komponenty k odlišení spekter každé polymorfní formy (Figure 3.32).
Grafy PC zátěží (hlavních komponent) první komponenty (Figure 3.33) a druhé komponenty (Figure
3.34) odhalují Ramanovy posuny, s velmi negativními a pozitivními hodnotami zátěží, spojené se
spektrální odchylkou a tedy schopnosti diskriminace.
Tabulka Pozice absorpčních pásů běžných farmaceutik a pomocných látek, lineárně interpolované ze
spekter první derivace (rozsah Ramanova posunu: 200 – 1971 cm-1)
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
47
Obrázek Ramanovo spektrum práškového paracetamolu (získané s excitací laseru 1064 nm)
Obrázek Ramanovo spektrum první derivace práškového paracetamolu (Savitzky-Golay digitální
kubický polynomický vyhlazovací algoritmus, velikost filtru 7 datových bodů, získáno s excitací laseru
1064 nm)
Tabulka Ramanovy posuny 6 nejintenzivnějších pásů pro různé formy práškové krystalické laktózy
1.6.Chemické zobrazování a mapovací mikrospektroskopické
techniky
Pro získání chemických informací v kombinaci s mikroskopickými technikami se využívají dva
základní přístupy záznamu dat, které označujeme jako zobrazování (imaging) a mapování (mapping).
1.6.1.
Principy spektrálního zobrazování a mapování
Spřažení optických mikroskopů s NIR a Ramanovými spektrometry umožňuje detailní analýzu
malých ploch pevných farmaceutik. Zpravidla, je vzorek analyzován v režimu buď jednobodovém, bod
po bodu nebo mapování v přímce, nebo případně jako celý vzorek, analyzovaný mapováním v přímce
nebo bodovým mapováním tvořícím mřížku. Tento postup pak vytváří trojrozměrné (3D) údaje
obsahující jak spektrální, tak prostorovou (x, y, z) informaci a označuje se pak jako hyperspektrální
zobrazení. Schematická reprezentace multivariačního 3D zobrazení je ukázána na obrázku Figure
3.36. Mapování bod po bodu a v přímce je u farmaceutik často zdlouhavý proces vyžadující několik
hodin až dnů dlouhou dobu snímání. V případě NIR zobrazování, nicméně, nedávná kombinace
ohniskových plošných detektorů, jako jsou ty založené na indium antimonide, s laditelnými filtry
tekutých krystalů (LCTF) výrazně urychlila proces zobrazování, neboť všechna zobrazovaná 3D spektra
jsou získávána paralelně s dobou analýzy obvykle řádově několika minut. Jako s NIR a Ramanovou
spektroskopií, je vyžadována malá příprava vzorku a vzorek může být často analyzován neporušený a
neinvazivně. Příklad schématického diagramu typického NIR zobrazovacího spektrometru je uveden
na obrázku Figure 3.35.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
48
Chemické zobrazování a mapování je využito při odstraňování problémů a při vytvářejícím se
vývoji. Clarke, a kol. (2001) skombinoval Ramanovu a NIR mikroskopii, aby studoval příčiny špatného
tabletování pomocí měření plochy pásu. Jelikož tento typ analýzy často generuje rozsáhlé sady
multivariačních zobrazovacích dat, metody multivariační zobrazovací analýzy (MIA) jsou často
využívány k dosažení správné interpretace. Tyto metody jsou obvykle založené na technikách
multivariátních latentních proměnných: PCA a PLSR.
Vícecestný PCA rozklad surových nebo předem upravených
hyperspektrálních 3D dat lze
vypočítat pomocí rozvinuté metody PCA. S touto metodou, 3D data, kde X je závislá linie po vektoru
v zobrazené rovině, k vytvoření dlouhého tenkého 2D
matice (pole) spekter. Analýza hlavních
komponent se pak provádí na odvíjené (rozložené) matici, například pomocí algoritmu NIPALS postupný výpočet jednotlivých hlavních komponent. Výsledná PC skóre jsou zpětně skládané
k vytvoření 3D zobrazení skóre, které má menší počet skóre než je počet zobrazovaných vlnových
délek (Figure3.26). Modely vícecestné PCA vyžadují interaktivní interpretaci grafů skóre, čímž uživatel
rýsuje polygon známý jako maska oblasti zájmu (region-of-interest ROI) okolo shluku skóre spekter, o
diskrétní oblasti intenzit (obvykle 8-bit, tj. 256 diskrétních hodnot), které jsou zobrazeny na
obrazovce počítače jako barevně kódovaný 3D frekvenční histogram. Počítačový program se používá
k identifikaci prostorových umístění pixelů v oddělených ROI třídách masek. Proces se opakuje pro
různé ROI masky. Tímto způsobem, prostorová umístění v zobrazované scéně jednotlivých složek
lékové formy mohou být určena a proto metoda může být považována za semi-kvantitativní
(navzdory dvou-cestné PCA jako metody kvalitativní analýzy).
Alternativní metodou pro kvantitativní analýzu multivariačních zobrazení je vícecestná PLSR. Tato
metoda potřebuje ke stanovení sadu zkušebních dat zobrazení materiálů. Každá ze všech chemických
tříd složek materiálu musí být známa. Například lze zobrazit čisté složky. Pro účely modelování, tyto
odezvy (X) čistých složek jsou kombinovány do jednoho 3D zobrazení rozsáhlých dat. 3D graf
předpovězených (predictor) dat (Y) je syntetické pole (falešné proměnné, kde jeden bod označuje
pixel čistého materiálu anebo nepřítomnost tohoto materiálu). A tak může být tato metoda
považována za formu diskriminační analýzy (Lied a kol. 2000).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
49
Tabulka Účinky hydratace, krystalinity a typu polymorfu laktózy na pozice hlavního pásu v Ramanově
spektru a relativní intenzity pásu – kromě porovnání mezi pomocnými látkami laktózy (n=38
Ramanovy pásy celkem na jeden případ, rozsah Ramanova posunu: 200 – 1971 cm-1)
Tabulka Seznam různých pulzních sekvencí NMR pevné fáze používané pro charakterizaci pevné fáze
Obrázek Ramanova spektra různých pevných forem laktózy jako pomocné látky
Obrázek SNV transformovaná Ramanova spektra 4 polymorfů Sulfathiazolu: I, II, III a V
Obrázek Graf PCA skóre (první a druhá komponenta) skóre SNV transformovaných absorpčních
spekter polymorfů Sulfathiazolu: I, II, III a V (ukazující elipsy 95% spolehlivosti)
Obrázek Graf zátěží PC 1 modelu PCA SNV transformovaných absorpčních spekter polymorfů
Sulfathiazolu: I, II, III a V
Obrázek Graf zátěží PC 2 modelu PCA SNV transformovaných absorpčních spekter polymorfů
Sulfathiazolu: I, II, III a V
Hlavní výhodou multivariační zobrazovací analýzy je, že interpretovaná sada dat může být
zobrazena graficky a není potřeba prozkoumávat velké tabulky dat.
Bharati a MacGregor (1998) použili příklad LANDSAT satelitního zobrazení, aby demonstrovali
využitelný potenciál analýzy tohoto typu dat pro řízení a monitoring průmyslových procesů v reálném
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
50
čase. Příklad aplikace je kontrola procesu krystalizace k výrobě 1 nebo 2 polymorfních forem léčiva
Salmeterol (Figures 3.37–3.39). Vícecestná PCA prováděna na výsledných zobrazeních umožnila
rozlišování polymorfní formy pomocí první a čtvrté hlavní komponenty (PCs).
2. Spektroskopie nukleární magnetické resonance jako nástroj pro
studium farmaceutických systémů
2.1.Principy spektroskopie nukleární magnetické resonance
Spektroskopie nukleární magnetické resonance (NMR) prozkoumává atomové prostředí založené
na různých resonančních frekvencích vyvolanými jádrem v silném magnetickém poli. Spousta
odlišných jader je pozorovatelná NMR, ale nejčastěji jsou studovány vodíkové a uhlíkové atomy
(Haleblian a McCrone 1969). Nukleární magnetická resonanční spektra nemohou být měřena
v pevném stavu stejným způsobem, kterým jsou běžně získávána v roztocích, protože NMR linie
z pevných látek jsou obvykle příliš široké (Holzgrabe a kol. 1999). V roztoku všechny interakce kromě
chemického posunu a nepřímých propojení jsou průměrovány až na nulovou úroveň tepelnými
pohyby molekul; kapalný roztok se chová jako isotropní prostředí. Spektroskopie nukleární
magnetické resonance roztoků se běžně využívá pro určení struktury; nicméně, techniky NMR
spektroskopie pevných látek jsou mimořádně významné pro charakterizaci krystalických forem
pevných farmaceutik (Newman a Byrn 2003).
NMR pevných látek má poměrně málo problémů se vzorkováním při provádění studií kvalitativní
fyzikální charakterizace. Nespornou výhodou této techniky je, že analýza celého objemu je dosažena
s velmi malým, pokud vůbec nějakým, vlivem od jednotlivých částic materiálu.
NMR spektroskopie pevných látek poskytuje účinnou metodu pro porovnání fyzické formy léčivé
látky po zpracování a výrobě. Mimoto NMR spektroskopie pevných látek poskytuje metodu pro
analýzu směsí pevných forem v čistých léčivech i v lékových formách (Tishmack a kol. 2003).
Přesto studie o léčivém produktu ukazují další komplikaci pro charakterizaci. Hlavní problémy
souvisí s citlivostí a specifitou. Typicky, složka, na kterou je kladen zájem v léčivém produktu, je
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
51
aktivní farmaceutikum, které se může nacházet v docela nízké koncentraci (∼< 10% w/w). Protože
NMR pevných látek je ze své podstaty necitlivé, klesající koncentrace zájmové složky může způsobit
problémy při experimentování (delší průměrování signálu, je nutná pro analýzu léčivého produktu).
Navíc, může být kompromitována specifita. Diagnostická resonance zájmu může být překročena
resonancí přiřazené pomocné látce. V tomto případě vyšší spektrální rozlišení může být potřeba
(vyšší intenzita magnetického pole) nebo využití technik spektrální dekonvoluce, jako je fitování
křivky. Navíc, vyvažování rotoru, jenž obsahuje vzorek, je klíčové, aby se získala potřebná frekvence
rotace (spin rates) k odstranění anisotropie chemického posunu, ale toto lze překonat jednoduše
se správnými experimentálními technikami (Bugay, 2001).
Četné pulsní sekvence se se vyvíjely pro NMR pevné fáze a mnoho z nich je aplikovatelných pro
charakterizaci pevných farmaceutik; Tabulka 3.1 dává dohromady počet těchto pulsních sekvencí
zahrnující stručný popis a citace vhodné literatury.
Použití spektroskopie NMR pevné fáze pro výzkum polymorfismu lze pochopit na základě
následujícího modelu. Jestli existuje sloučenina ve dvou, skutečných polymorfních formách
označených jako A a B, každá formy se liší ve své krystalografické struktuře. A proto, jádra uhlíku ve
formě A mohou být umístěna v mírně odlišném molekulovém prostředí než stejná jádra ve formě B.
Ačkoli kovalentní chemická vazba specifických jader uhlíku je stejná v každé formě, lokální
prostředí se může lišit z důvodu omezeného pohybu v pevné fázi. Tyto omezené pohyby způsobují
rozdíly v lokálním prostředí okolo jednoho nebo více uhlíků v každé polymorfní formě, protože jejich
prostorové uspořádání se liší s ohledem na další jádra v molekule. NMR spektra pevné fáze ukazují
tento rozdíl jako změnu v izotropním chemickém posunu odpovídajícího uhlíku v každé polymorfní
formě. Pokud lze získat čistý materiál pro obě formy, analýza a přiřazení NMR spekter pevné fáze
takových dvou forem může vést k původu krystalografických rozdílů v těchto dvou polymorfních
formách (Tishmack a kol. 2003).
Existuje počet podstatných výhod při použití NMR spektroskopie pevné fáze pro studium
polymorfismu. V porovnání s DRIFT, Ramanovou spektroskopií a Roentgenovou práškovou difrakcí,
NMR pevné fáze je technika měření celého objemu, ve které vlivy velikosti částic mají malý dopad na
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
52
intenzitu měřeného signálu. Navíc, v případě dodržení správné procedury měření lze NMR pevné fáze
využít i jako kvantitativní techniku. Proto, intenzita signálu bude přímo úměrná počtu jader, která na
ni působí. V některých výzkumech polymorfních forem, dostatečně kvalitní jednotlivý krystal nemůže
být dostatečný pro stanovení struktury X-ray krystalografií. Nicméně, vhodným resonančním
přiřazením NMR spektra, může být původ polymorfu odvozen z rozdílů chemického posunu pro
identická jádra v každé polymorfní formě (Tishmack a kol. 2003).
2.2.Farmaceutické aplikace NMR spektroskopie
Jsou různé aplikace spektroskopie NMR pevné fáze, které jsou důležité pro farmaceutický výzkum.
Některé z nich zahrnují analýzu pevných fází (polymorfy, solváty), vodíkové vazby a krystalové
uspořádání, amorfní pevné látky, stereochemie a interakce pevná fáze-pevná fáze (přeměny pevné
fáze, aktivační energie pohybu molekul a reakce v pevné fázi). Některé z těchto obecných použití
spektroskopie NMR v pevné fázi pro farmaceutický výzkum byly popisovány detailně jinde (AboulEnein 1990; Bugay 1993, 2001, 2002: 467–499; Aliev a Law 2001; Tishmack a kol. 2003; Offerdahl a
Munson 2004).
2.3.Využití NMR spektroskopie těžších jader ve farmacii
Experimenty založené/známé
31
P-NMR pevné fáze a novodobé
19
F-NMR byly použity
v komplementárním přístupu k popisu chování fluorovaných léčiv, flufenamová kyselina,
v modelových membránách fosfolipidů (Grage a kol. 2000). Dehydratace klodronátu sodného byla
studována
jen jedna
31
P CP/MAS nmR. Rychlý teplotní nárůst odhalil, že klodronát sodný ztrácí vodu z mřížky a
31
P resonance se měří, zatímco pomalý pokles teploty převádí krystalickou formu na
bezvodou formu, která zobrazuje ne-ekvivalentní atomy fosforu (dvě oddělené resonance) (Timonen
a kol. 1998).
Některé studie NMR pevné fáze farmaceutických sloučenin zahrnulo popisování struktury a
hygroskopické povahy dehydrátu erythromycinu A (Stephenson a kol. 1997a) a stanovení fyzikální
formy BHA (2-tert.butyl-4-methoxy-phenol) na běžných farmaceutických pomocných látkách
(Remenar a kol. 2004).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
53
Z důvodu specifity spektroskopie NMR pevné fáze, je tak ideální technikou ke studiu inkluzních
komplexů a membránových interakcí s léčivem. Studie o inkluzních komplexech zahrnují
indomethacin-α-, β-, γ - cyclodextrinové komplexy v PEG 6000 nosiči (Wulff et al. 2002), inkluzní
sloučenina S-ibuprofenu v β-cyclodextrinu (Braga a kol. 2003), bropirimine s β-cyclodextrinem
(Ahmed a kol. 1991), flurbiprofen s β-cyclodextrinem a heptakis (2, 3, 6, -tri-O- methyl) - βcyclodextrin (Imai a kol. 1988), amorfní pevné komplexy tlbutamidu s 2-hydroxypropyl- α- a βcyclodextrinem (Kimura a kol. 1999) a inkluzní komplexaci prostaglandinu F2 alfa s γ - cyclodextrin
(Uekama a kol. 1984).
Spektroskopie NMR pevné fáze se použila pro zkoumání interakce membrána-léčivo s použitím
14
N a
31
P NMR pevné fáze ke studiu léčivých interakcí cholesterolu a antidepresiva s fosfolipidy
(Santos a kol. 2002). Interakce Chlorpromazinu s fosfatidylserinem byla studována
pevné fáze (Underhang a kol. 2004), a rotací pod magickým úhlem
13
C a
31
P NMR
13
C-NMR pevné fáze a
diferenciální skenovací kalorimetrií (Nerdal a kol. 2000).
Další interakce studované NMR spektroskopií pevné fáze zahrnují poly (etylen oxid)
s ketoprofenem (Schachter a kol. 2004) a použití
13
Ca
113
Cd CP/MAS nmR v chemických a in vivo
studiích interakce mezi kadmiem a vitaminem B6 (Couce a kol. 1992).
2.4.NMR spektroskopie a polymorfismus
Studie polymorfismu je jedna z nejběžnějších aplikací NMR spektroskopie pevné fáze pro
farmaceutické sloučeniny. Pevná farmaceutika mohou existovat v několika pevných formách, kdy
každá forma má odlišné vlastnosti farmaceutického významu, zahrnující stabilitu a biodostupnost.
Počet těchto forem a jejich vlastnosti jsou velmi nepředvídatelné a případ od případu se značně liší.
Pevná farmaceutika lze rozdělit na krystalické a amorfní pevné látky založené na Roentgenové
práškové difrakci a/nebo na mikroskopickém zkoumání. Krystalické pevné látky se mohou dále třídit
na polymorfní formy, formy mající stejné chemické složení, ale různé krystalické struktury a proto
odlišné hustoty, body tání, rozpustnosti a další vlastnosti; a solváty, formy obsahující molekuly
rozpouštědla uvnitř krystalické struktury, vedoucí ke vzniku unikátních rozdílů v rozpustnosti, odezva
na vzdušnou vlhkost, ztráta rozpouštědla a další vlastnosti. Někdy může být léčivá látka
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
54
desolvatovaný solvát, který se vytvoří, když je rozpouštědlo odstraněno ze specifického krystalického
solvátu, za zachování krystalické struktury. Mnoho důležitých vlastností je jedinečných pro takovou
formu.
Odlišné fyzikální formy léčivé látky mohou vykazovat radikálně odlišné rozpustnosti, které
ovlivňují rozpouštěcí a biodostupnost charakteristiky dané sloučeniny. Navíc, chemická stabilita jedné
formy, ve srovnání s jinou, může kolísat. Klíčová je také fyzikální stabilita polymorfů. Během různých
kroků procesu (mletí, mísení, tvorba tablet atd.) fyzikální forma léčivé látky může být narušena, což
následně vede k problémům s rozpuštěním. Z těchto důvodů, úplná charakterizace polymorfních
systémů
je
rozhodující
pro
četné
skupiny
ve
vývoji
komerčních
léčiv;
jmenovitě
preformulační/fyzikální farmacie, vývoj chemických procesů, regulační záležitosti, duševní vlastnictví,
a analytický rozvoj.
Jsou publikovány CP/MAS
13
C NMR studie v pevné fázi zaměřena na polymorfismus steralin
hydrochloridu, antidepresiva (Novoselsky a Glaser 2002) a na polymorfní formy benoxaprofenu,
nabilonu a cefazolinu (Byrn a kol. 1985).
NMR a Rentgenova krystalografie v pevné fázi jsou doplňkové techniky pro studie charakteristiky
pevné fáze. U dvou polymorfních forem acetohexamidu, antidiabetika bylo pomocí
13
C v pevném
stavu a Roentgenové krystalografie (Stephenson a kol. 1997b) zjištěno, že se nachází v ketotautomerní formě.
Polymorfní formy vitaminu B12 se analyzovaly s 13C, 15N, 31P, and 59Co NMR spektroskopií. 13C NMR
data poskytla nejvíc informací, protože krystalický materiál produkoval ostré resonance většiny
uhlíků v této poměrně složité organické molekule (Medek a Frydman 2000).
Většina aplikací NMR spektroskopie pevné fáze, které byly použity ve výzkumu polymorfních
forem farmaceutik, jsou prováděny ve spojení s dalšími analytickými technikami. Je to případ
roxifibanu, metylester proléčivo potenciální nepeptidické protilátky glykoprotein IIb/IIIa receptoru,
dochází tak k inhibici agregaci krevních destiček a k zajištění mechanismu pro antitrombotickou
terapii, u kterých bylo zjištěno, že existují ve dvou polymorfních formách. Tyto polymorfy byly
detegovány RTG práškovou difrakcí a NMR v pevné fázi. Nepatrný rozdíl mezi dvěma polymorfy byl
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
55
také detegován izotermální mikrokalorimetrií; avšak žádné rozdíly nebyly pozorovány diferenční
skenovací kalorimetrií, infračervenou nebo Ramanovou spektroskopií (Maurin a kol. 2002). Další
významné případy zahrnují fosinopril sodný (Brittain a kol. 1993), rifampicin (Agrawal a kol. 2004) a
CNS aktivní sloučeninu (org 13011) (Van Hoof a kol. 2002).
Použití NMR pevné fáze a vibrační spektroskopie pro studium polymorfů léčiva a solvátů se
diskutovalo (Brittain 1997).
2.5.Analýza léčivé látky a lékové formy pomocí NMR
Několik kvantitativních analýz farmaceutických sloučenin pomocí NMR v pevné fázi bylo
publikováno (Gao 1996; Lefort a kol. 2004).
13
C nmR spektra pevné fáze mofebutazonu,
phenylbutazonu a monohydrátu a bezvodého oxyphenbutazonu byla publikována (Stoltz a kol. 1991).
Spektroskopie nukleární magnetické resonance je obecně docela použitelná technika pro analýzu
směsí sloučenin v roztoku nebo pevné fázi. Může tak být použitá pro analýzu formulovaných léčivých
přípravků pro přeměny a interakce. NMR pevné fáze v kombinaci s 13C značení může, ve vhodných
případech, být použitá jako strategie ke studiu účinku formulace na polymorfismus nízké dávky léků
jako ve zkoumání účinku tabletování na polymorfismus Org OD14 (steroidní lék) (Booy a kol. 2005).
Charakterizace ústně podávaných lékových forem CP/MAS NMR byla publikována (Reutzel-Edens a
Bush 2002). 3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamine (MDMA) byl analyzován
13
C NMR
spektroskopií pevné fáze v tabletách „extáze“ (Lee a kol. 1999).
13
C NMR spektra pevné fáze tablet nebo kapslí prednisolonu, enalapril maleatu, lovastatinu,
simvastatin, ibuprofenu, fluorpiprofenu, kyseliny mefenamic, indomethacinu, diflunisalu, sulindacu a
piroxicamu byla získána v CP/MAS režimu při 50MHz (Saindon a kol. 1993). Aspirin a tablety
rozpustného aspirinu byly studovány 13C NMR v pevné fázi (Chang a kol. 1986 a Diaz a kol. 1987).
2.5.1. Konformace, stereochemie a interakce vodíkových vazeb
Diastereomery vykazují odlišná NMR spektra. Pevná forma troglitazonu, je nové ústní
antidiabetikum, které zdokonaluje citlivost a reakční schopnost inzulinu, léčivá látka a její
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
56
diastereomery byly charakterizovány NMR v pevné fázi, která by mohla rozlišit hydratované a
nehydratované RR/SS formy lépe než RTG difrakce. NMR pevné fáze ve výsledku podpořila názor, že
léčivá látka troglitazone obsahuje diastereomery jako jednoduchou fyzikální směs (Suzuki a Kawasaki
2005). 13C NMR měření vzdálenosti a úhlu byla využita ke studiu konformací cimetidinu, protilátky
histamin H2 receptoru (Middleton a kol. 2000). Symetrie a interakce vodíkových vazeb olanzapinu,
nového činidla benzodiazepinu použitého při léčbě schizofrenie a obdobných psychóz, byly
charakterizovány 13C a 15N CP/MAS spektroskopií (Reutzel-Edens a kol. 2003).
Tato sekce pokrývá některé metody poslední doby a aplikace NMR spektroskopie pevné fáze,
která by se, doufejme, mohla stát více používanou pro studium pevných farmaceutických látek.
3. Terahertzová pulzní spektroskopie
3.1. Teoretický úvod k THz spektroskopii
Terahertzová oblast elektromagnetického spektra zasahuje mimo střední infračervenou oblast do
daleké infračervené oblasti a až do mikrovlnné oblasti (Figure 3.3). Frekvenční rozsah je: 60 GHz–6
THz (2–200 cm−1).
Záření v této oblasti má podstatně nižší energii, než je energie spojená s většinou molekulových
vibrací, ale shoduje se s energiemi spojenými s intermolekulovými vibracemi (Taday 2004). Absorpce
THz záření takovým materiálem, jako jsou pevná krystalická farmaceutika, je tak charakteristická pro
daný materiál a jeho strukturu a umožňuje přímé sledování fononových mřížkových módů materiálu
a popis vlastností krystalu (Zeitler a kol. 2007). Příklad terahertzových spekter polymorfních forem
karbamazepinu je uveden na obrázku Figure 3.40.
3.2.Instrumentace THz spektroskopie
Terahertzové spektrometry (Figure 3.41) využívají kryogenního chlazení (tzn. chlazení kapalným
dusíkem), tepelné detektory známé jako bolometry. Detektor je polovodičový materiál vyrobený
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
57
z arsenidu galia (GaAs) o přibližné tloušťce 500 μm a působí jako fotoelektrický spínač. Fotoelektrický
emitor/vysílač, který je upevněn sendvičově na substrátu, se skládá ze dvou tenkých kovových
proužků. DC potenciálový rozdíl je aplikován napříč tyto dva kovové proužky.
Využívá se schopnost laseru produkovat femtosekundové pulsy. Typickým příkladem je
titan:safírový NIR laser (800 nm). Intenzita těchto laserů je přibližně 1 μW až 300mW (Taday a kol.
2003]; Zeitler a kol. 2007).
Terahertzové pulsy o 75 fs jsou generovány laserem při opakovací frekvenci přibližně 800 MHz.
Paprsek je rozdělen na dva děliče paprsků. Jeden z paprsků je zeslaben (obvykle 25%) a je fokusován
a veden přímo na polovodičový materiál s otevřeným spínačem. Fotony pulsu mají dostatečně velkou
energii, aby překonaly zakázané pásmo a produkovaly páry elektron-díra v polovodičovém substrátu.
Elektrony, jako nosiče náboje, jsou pak urychleny aplikovaným elektrickým polem skrz substrát,
generující, během procesu, krátké záblesky koherentního, širokopásmového terahertzového záření.
Fotoelektrický spínač se tak chová jako anténa. Mimoosé parabolické zrcadlo (OAP) kolimuje THz
záření a další zrcadlo je použito k odrazu fokusovaného paprsku záření skrz testovaný materiál
s paprskem o průměru přibližně 1 mm. Další sada zrcadel zaměřuje/cílí a odráží přeměněný paprsek
na detektor (jako je Telurid zinečnatý (ZnTe)). Druhý laserový paprsek, odražený od děliče paprsku
(zeslabený 75%) se kombinuje s přeměněným THz paprskem a fokusuje na ZnTe krystal. THz záření
modifikuje polarizaci vzorkovacího paprsku a Wollastonův hranol je použit pro rozdělení polarizačně
modifikovaného vzorkovacího -paprsku do jeho jednotlivých složek. Rovnovážný pár fotodiod
deteguje a monitoruje změny ve vzorkovacím paprsku.
Jejich výstupní signál je zesílen a změna v elektrickém poli jako funkce časového zpoždění se
zaznamenává
jako
interferogram.
Inverzní
Fourierovou
transformací
časově
rozlišeného
interferogramu se vypočítá spektrum analytu ve frekvenční oblasti.
Spektra lze získat buď v režimu step-scan, s vysokým rozlišením (například 1 cm-1), nebo v režimu
rychlý sken (s nižším spektrálním rozlišením, několik cm-1). Získávání celého spektra trvá obvykle
méně než 1 minutu a to s rozlišením 1 cm-1 v režimu step-scan. Rychlejší analýza v režimu rychlý sken
umožňuje získání celého spektra během 100 ms; tento režim je nejvhodnější pro aplikace vyžadující
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
58
rychlá, nepřetržitá měření v reálném čase, jako je řízení procesu a monitoring. Např. graf ukazující
změnu v terahertzovém spektrálním profilu v čase (5-minutový interval získávání spektra) pro
fázovou přeměnu krystalického karbazepinu, z polymorfní formy III na I během izotermálního
procesu při 165°C je znázorněn na obrázku Figure 3.42.
Jelikož Terahertzová spektroskopie využívá laserové pulsy k vytvoření širokopásmového
koherentního terahertzového pulsu, označuje se obvykle jako terahertzová pulsní spektroskopie
(TPS). Spektrometry vyžadují nenáročnou údržbu a nízký výkon laseru (ve srovnání s Ramanovými
spektrometry), což znamená, že tepelně indukované změny ve struktuře pevných vzorků jsou
podstatně méně pravděpodobné.
3.3.Příprava vzorku a manipulace s ním
Spektra terahertzové pulsní spektroskopie se během studie získávala v režimu transmitance
z lisovaných tablet pevného materiálu. Pokud tento materiál není snadno stlačitelný a schopen
vytvořit fyzikálně stabilní kompaktní formu, musí se nejprve zředit a smísit s neabsorbujícím
stlačitelným práškovým materiálem (buď polyetylen nebo poly)tetrafluoretylen, PTFE, přibližně 5 –
40 mg analytu) a poté se musí lisovat do tablety. Rozměry tablety jsou obvykle 5 – 30 mm v průměru
a tloušťka tablety 0,5 – 3 mm. Rovněž je důležitá distribuce velikosti částic a většinou by měla být 100
μm nebo méně, aby se minimalizoval rozptyl.
Obrázek TPS spektra přechodu pevného karbamezapinu z formy III (černá) na formu I (světle šedá) při
konstantní teplotě 165°C. Spektra se zaznamenávala v 5-minutových intervalech. Převzato z Zeitler, J.
A., a kol., J. Pharm. Pharmacol., 59: 209–223. Copyright (2007) se souhlasem American Association of
Pharmaceutical Scientists
Vodní pára vykazuje velmi intenzivní rotační spektra a úzké absorpční linie v THz oblasti. Aby se
minimalizovaly interference absorpce vodní páry s testovaným analytem, je kyvetový prostor buď
očištěn vysušeným dusíkem, nebo evakuován a uchováván v čistém nebo vakuovém prostředí po
celou dobu spektroskopické analýzy.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
59
3.4.Nedávný rozvoj THz instrumentace
Poslední rozvoj v instrumentaci pro THz spektroskopii umožňuje, aby byla možná ATR měření
(s využitím křemenného krystalu) prášků a kapalin, s kratší dobou měření (několik sekund), a tak
nebylo třeba připravovat vzorek.
Terahertzové pulsní zobrazování (TPI) je v poslední době dalším předmětem vývoje, který
umožňuje prostorově řešenou chemickou analýzu vzorku v x, y, z souřadnicích (v rovině a z obou povrchu i pod povrchem). Většinou se vyžadují snímky v reflexním režimu (i když snímky
v transmisním režimu jsou také možné). Aplikace zahrnují chemické zobrazování vícesložkových
farmaceutických materiálů a lékových forem. Hloubka průniku záření je mezi 1 a 3 mm pod
povrchem. 4D zobrazení (x, y, z fyzikální rozměry a intenzita při daném vlnočtu) získané v TPI se
provádělo v rámci jednoho skenu během mapování.
3.5.Farmaceutické aplikace THz spektroskopie
Aplikace TPS pro rozlišení polymorfních forem Ranitidin hydrochloridu bylo popsáno v dřívějším
článku (Taday a kol. 2003). Toto zvláštní léčivo má dva dobře charakterizované polymorfy, formy I a
II. Analýzou těchto dvou polymorfů pomocí TPS se získala spektra, která byla na první pohled odlišná
s evidentními rozdíly v absorpční oblasti okolo 1.1 THz, charakteristické pro každou polymorfní formu
a použitelné tak pro jejich identifikaci. Forma I vykazovala v THz spektru absorpční ekvi-distanční pásy
(vykazující téměř harmonický charakter) v intervalu přibližně 250 GHz, od 0,95 do 2,04 THz. Autoři se
domnívali, že tyto absorpce mohou pocházet z torzních pohybů v jedné z molekulových funkčních
skupin. Tyto absorpční pásy naopak chyběly ve spektru formy II, autoři předpokládali, že je to
způsobeno sterickým bráněním ve stejné funkční skupině. THz spektra dvou odlišných forem se
porovnávala s THz spektry získanými ze dvou tablet Ranitidin hydrochloridu (obě přibližně 54% m/m
Ranitidin hydrochloridu). Spektra se viditelně lišila a spektrum jedné tablety se jevilo jako spektrum
formy I. Ačkoli autoři předpokládají, že další forma byla forma II, bylo mnohem těžší rozeznat toto
spektrum od spektra čisté formy II (která vykazovala mnohem méně absorpčních pásů).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
60
Dřívější studie zkoumající potenciál terahertzové spektroskopie pro kvantitativní analýzu účinné
látky ve farmakologickém přípravku popsal Taday (2004). Tato práce se zaměřila na dvě léčiva –
aspirin a paracetamol – které byly smíchány s celulózou a práškovou laktózou. Procentuální obsah
paracetamolu a laktózy se lišil (od 0 do 67% m/m) a obsah celulózy byl konstantní (přibližně 33%
m/m). Ačkoli autor potvrdil, že spektrální pásy ve spektru daného materiálu zůstávají z velké části
nepřiřazené, je možné provést dobré kvantitativní kalibrace pomocí regrese nejmenších čtverců první
derivace absorpčního spektra. Z testovaných vzorků o 9 různých koncentracích se vytvořily čtyři
vzorky. Pomocí metody PLS s využitím 6 hlavních komponent, směrodatná odchylka křížové validace
byla 2,85 % m/m pro paracetamol a 3,65% m/m pro laktózu. Nezávislá kalibrační a validační sada
nebyla nicméně testována. V novější studii se zkoumalo použití terahertzové spektroskopie pro
kvantitativní stanovení obsahu polymorfu mefenamové kyseliny (Otsuka a kol. 2010). Použilo se toto
modelové léčivo, protože má dvě dobře popsané polymorfní formy I a II. Tyto formy se připravily
rekrystalizací. Krystaly formy I byly produkovány z ledem chlazeného přesyceného roztoku acetonu.
Krystaly formy II se připravily z roztoku N,N-dimethylformamidu, obsahujícího léčivo (0.6 g ml−1),
chlazeného na -40°C. Dvě krystalické formy byly použity k přípravě 11 práškových směsí o různém
obsahu formy I (obsah formy I: 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) pomocí
achátového vibračního mlýnku. Terahertzová spektra dvou krystalických forem a jejich směsí se
zaznamenávala v režimu transmitance v rozsahu 0,60 – 6,05 THz. Každá prášková směs byla
analyzována terahertzovou spektroskopií v režimu transmitance a ve 4 různých místech pro každý
testovaný vzorek, celkem bylo získáno 44 spekter. Multivariační regresní modely pomocí regresní
metody částečných nejmenších čtverců spektrálních a koncentračních dat byly použity ke kalibraci
spekter pro obsah polymorfu. Vliv vyhlazení, plošné normalizace, korekce základní linie, derivatizace
a korekce rozptylu (SNV) správnost a přesnost kalibračního modelu byl vyhodnocen pomocí leaveone-out křížové validace plné/s vynecháním jednoho bodu. Vyhlazení a normalizace všech spekter
odhalilo izobestický bod u 3.70 THz. Oblast terahertzového spektra byla vyhlazena, plošně
normalizována spektra ukázala v rozsahu 0,5 – 3,70 THz dobrou korelaci transmitance a obsahu
formy I. Spektrální data byla rozdělena do pěti oblastí a byl zkoumán vliv spektrální oblasti na
správnost a přesnost kalibračního modelu. Nejlepší shoda dat byla od oblasti 0,46 – 6,05 THz, se
standardní odchylkou kalibrace 8,60 % a korelačním koeficientem r=0,9692. Vektor regrese každého
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
61
modelu byl vykreslen, aby se zjistily frekvence (a pásy) se schopností předvídat formu I. S modelem
derivovaným z vyhlazených a plošně normalizovaných dat a pomocí spektrální oblasti: 0,46 – 8,05
THz, vektor regrese ukázal pás pozitivně korelovaný s formou I u 1,45 THz a pás negativně korelovaný
s formou I (a proto pozitivně korelovaný s formou II) u 2,25 THz. Podobný průběh byl pozorován
s modely vyrobenými z transformovaných dat druhé derivace. Tato práce jasně prokázala schopnost
THz spektroskopie, spřažené s vhodnou úpravou dat, kvantifikovat obsah polymorfu v krystalických
prášcích. Charakterizace polymorfů v lyofilizovaném manitolu se také prováděla terahertzovou
spektroskopií (Chakkittakandy a kol. 2009). Terahertzová spektroskopie v pseudo-blízkém poli skrz
frekvenční rozsah 0,5 – 7,5 THz byla využita ke studiu, kdy různé podmínky vymrazování mají vliv na
polymorfní formu výsledného krystalizovaného manitolu. Tři jednotlivé polymorfy pomocných látek
byly připraveny Walter-Leviho metodou, čímž byly připraveny 0,4, 0,8, a 1,2 M roztoky a 10 ml
každého roztoku se nechalo odpařit na samostatných hodinových sklíčkách při laboratorní teplotě,
poskytující vždy směsi třech polymorfů. Bylo možné vizuálně identifikovat krystaly odpovídající
každému polymorfu: krystaly α-polymorfu byly neprůhledné, svislé a lišejnikovité, krystaly βpolymorfu byly průsvitné zkosené hranoly a krystaly δ-polymorfu byly získány jako průsvitné,
jehličkovité struktury ve sferulitové morfologii. Lyofilizovaný koláč Manitolu a lyofilizované vzorky
vyrobené z obojího - jemných i velkých kapiček byly studovány Roentgenovou práškovou difrakcí,
spolu s práškovým Manitolem. Vymrazování/lyofilizace z kapky byla studována, protože by se mohla
zvětšit sublimační plocha a rychlost a šlo by tak ovlivnit vytvářený polymorf. Manitolový prášek jako
počáteční materiál byl ukázán Roentgenovou práškovou difrakcí, že se skládá z β-polymorfu. U
Manitolu, lyofilizovaného z jemných kapiček, se ukázalo, že se jedná o δ-polymorf; u manitolu
lyofilizovaného z větších kapek se ukázalo, že se jedná převážně o β-polymorf se stopami krystalů δformy. Obvyklý koláč manitolu byl směs β- a δ-forem. A tak Roentgenová difrakce ukázala, že
podmínky při vymrazování mají výrazný vliv na vyrobenou polymorfní formu nebo směs forem.
Terahertzová spektroskopie připravených β- a δ-forem ukázala zřetelné rozdíly. β-forma ukázala
absorpční pásy u 1,12, 2,26, 2,88, 3,28, 4,22, 4,77 a 5,66 THz. δ-forma ukázala absorpční pásy u 1,9,
2,19, 2,3, 3,74, 3,98 a 5,36 THz. Bylo tak možné jednoduše rozlišit tyto dva polymorfy. Terahertzová
spektra vzorků koláče lyofilizovaného manitolu vykazovala pásy odpovídající oběma β- a δ-formě (βpolymorf absorpční frekvence: 2,88 and 3,28 THz; δ-polymorf absorpční frekvence: 3,74, 3,98 a 5,36
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
62
THz). Z výsledků plyne, že β-polymorf byla nejhojnější forma, v souladu s výsledky Roentgenové
práškové difrakce. Manitol lyofilizovaný z jemných kapek vykazoval absorpční pásy u 3,74, 3,98, a
5,36 THz a jednalo se tedy pouze o δ-formu. Terahertzové analýzy roztoku Manitolu lyofilizovaného
z větších kapek ukázaly pásy obou β- a δ-forem. Práce jasně ukázala (demonstrovala), že
charakterizace polymorfní formy manitolu pomocí terahertzové spektroskopie byla v souladu
s výsledky z Roentgenovy práškové difrakce a umožnilo se stanovení podmínek účinků vymrazování
na polymorfní formu.
Tloušťka potahu a povrchová morfologie potažených tablet se nedávno studovaly terahertzovým
pulzním zobrazováním (TPI) (Ho a kol. 2009). Osm dávek tabletek se vyrobilo ke studiu účinků
různých tlouštěk vrstvy, rovnoměrnosti vrstvy léčivé látky a jejich vliv na rychlost uvolňování pro
tablety s postupným uvolňováním. Deset tablet z každé dávky bylo vybráno náhodným vzorkováním a
zobrazeno pomocí TPI. To pak bylo schopno odhalit tloušťku vrstvy jader, které se podstatně lišily
mezi jednotlivými dávkami. Dávka s 8,2% w/w přírůstkem hmotnosti potahu ukázala průměrnou
tloušťku vrstvy 66 μm; další dávka, s 12,5% w/w přírůstkem hmotnosti potahu ukázala průměrnou
tloušťku vrstvy 102 μm. Technika také detegovala velkou rozmanitost v tloušťce vrstvy v tabletách
v každé dávce. Terahertz electric field peak strength (TEFPS), parametr související s fyzikálně
chemickými vlastnostmi potahu nebo dávkovací formy, byl také měřen a studován pro theophylinem
potažené cukerné jádro. Čtyři dávky potažených sugar cores se připravily: dvě s PVAc/PVA-PEG
filmem a u dvou dávek jádra byla provedena úprava materiálu tablet k docílení správného tvaru a
fyzikálních vlastností (spheronization) výsledných tablet před provedením povrchové úpravy – za
účelem výroby hladšího povrchu léků. Hodnoty TEFPS získané z TPI map tablet odhalily podstatné
rozdíly v povrchových morfologiích dávek vyrobených ze sferonozivaných jader s hladkou vrstvou
léku a s hrubší lékovou vrstvou. Obecně, bylo zjištěno, že nižší hodnoty TEFPS svědčí o vyšší
povrchové drsnosti potahu. TEFPS dvourozměrné TPI mapy tablet (peletů) byly schopny ukázat
variabilitu v tloušťce potahové vrstvy s rovnoměrností léčivé vrstvy. Tablety (pelety) vyrobené
z hladkých drug layered cores měly vyšší tloušťku potahové vrstvy než ty vyrobené z hrubě
vrstvenými jádry. Účinky léčby na profily rozpustnosti byly méně jisté. Další práce (Ho a kol. 2009)
zkoumala použití TPI pro hodnocení/posouzení účinnosti povlaku tabletových jader a detekce
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
63
nedostatečně potažených oblastí jader. S pozvolným uvolňováním, byla použita oboustranně
vypouklá tabletová jádra. Bylo zjištěno, že TPI je schopno identifikovat odlišnosti jako kolísání
v tloušťce potahové vrstvy a povrchové drsnosti pomocí podobných TPI parametrů jako v předchozí
práci. Central band region oboustranně vypouklých tablet byla identifikována jako plocha nejvíce
náchylná k nerovnoměrnostem v pokrytí povrchu.
Snahy zesílit teoretické porozumění a interpretaci terahertzových spekter krystalických
farmaceutických materiálů byly zkoumány Kingem a kol. (2010). Teoretická metoda výpočtu
funkcionálu hustoty (DFT) pevných látek byla použita k simulaci krystalické struktury a terahertzových
spekter obou (S)-(+)-ibuprofenu a racemického (RS)-ibuprofenu a přiřazení experimentálně
stanovených terahertzových absorpčních pásů enantiomeru a racemátu k vibračním módům.
Prováděné strukturní a spektrální simulace byly schopny přiřadit všechny spektrální rysy k jednomu
nebo více vypočítaným vibračním módům.
References
Aaltonen, J., Rantanen, J., Siiria, S., Karjalainen, M., Jorgensen, A., Laitinen, N., Savolainen, M.,
Seitavuopio, P., Luohi-Kultanen, M. and Yliruusi, J. (2003) Anal. Chem. 75: 5267–5273.
Aboul-Enein, Y. (1990) Spectroscopy 5: 32–40.
Agrawal, S., Ashokraj, Y., Bharatam, V., Pillai, O., Panchagnula, R. (2004) European J. Pharm. Sci. 22
(2–3): 127–144.
Ahmed, M., Naggi, A., Guerrini, M., Focher, B., Int. J. Pharm. (1991) 77(2–3): 247–254.
Aliev, E., Law, V., Nuclear Mag. Reson. (2001) 30: 214–310.
Al-Zoubi, N., Koundourellis, J. E. and Malamataris, S. (2002) J. Pharm. Biomed. Anal. 29: 459–467.
Anderson, J. E., Moore, S., Tarczynski, F. and Walker, D. (2001) Spectrochimica Acta Part A. 57: 1793–
1808.
Andersson, M., Josefson, M., Langkilde, F. W. and Wahlund, K. -G. (1999) J. Pharm. Biomed. Anal. 20:
27–37.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
64
Anquetil, P. A., Brenan, C. J. H., Marcoll, C. and Hunter, I. W. J. (2002) Pharm. Sci. 92: 149–160.
ASTM Standard E1840–96 (2002), Standard Guide for Raman Shift Standards for Spectrometer
Calibration ASTM International, PA, USA.
Beer, de, T. R. M., Vergote, G. J., Baeyens, W. R. G., Remon, J. P., Vervaet and Verpoort, F. (2004) Eur.
J. Pharm. Sci. 23: 355–362.
Bharati, M. H. and MacGregor, J. F. (1998) Ind. Eng. Chem. Res. 37: 4715–4724.
Blanco, M., Coello, H., Iturriaga, S., Maspoch, S and Pezuela, de la, C. (1998) Analyst. 123: 135R–150R.
Booy, J., Wiegerinck, P., Vader, J., Kaspersen, F., Lambregats, D., Vormans, H., Kellenbach, E. (2005) J.
Pharm. Sci. 94(2): 458–463.
Braga, S., Goncalves, S., Herdtweck, E., Teixeira, D., Jose, C. (2003) New Journal of Chemistry 27(3):
597–601.
Breitenbach, J., Schrof, W. and Neumann, J. (1999) Pharm. Res. 16: 1109–1113.
Brittain, G. (1997) J. Pharm. Sci. 86(4): 405–412.
Brittain, G., Morris, R., Bugay, D., Thakur, B., Serajuddin, M. (1993) J. Pharm. Biom. Anal. 11(11–12):
1063–1069.
Bugay, D. E. (1993) Pharm. Res. 10(3): 317–327.
Bugay, D. E. (2001) Advanced Drug Delivery Reviews 48: 43–65.
Bugay, D. E. (2002) Handbook of Pharmaceutical Analysis. Marcel Dekker, Inc., New York.
Butler, W. L. and Norris, K. H. (1960) The spectroscopy of dense light scattered material. Arch.
Biochem. Biophys. 87: 31–40.
Byrn, R., Gray, G., Pfeiffer, R., Frye, J. (1985) J. Pharm. Sci. 74(5): 565–569.
Campbell-Roberts, S. N., Williams, A. C., Grimsey, I. M. and Booth, S. W. 2002. J. Pharm. Biomed.
Anal. 28: 1135–1147.
Candolfi, A., Maesschalck, de, R., Massart, D. L., Hailey, P. A. and Harrington, A. C. E. (1999) J. Pharm.
Biomed. Anal. 19: 923–935.
Chakkittakandy, R., Corver, J. A. W. M. and Planken, P. C. M. (2009) J. Pharm. Sci., 99: 932–940.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
65
Chang, J., Diaz, E., Morin, F., Grant, M. (1986) Mag. Reson. in Chem. 24(9): 768–771.
Clarke, C., Jamieson, M. J., Clark, D. A., Hammond, S. V., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (2001) Anal.
Chem. 73: 2213–2220.
Cory, D. (1988) Che. Phys. Lett. 152: 431–434.
Couce, D., Valera, M., Sanchez, A., Casas, S., Sordo, J., Lobez-Rivadulla, M. (1992) J. of Inorg. Biochem.
46(1): 17–22.
Davis, T. D., Peck, G. E., Stowell, J. G., Morris, K. R. and Byrn, S. R. (2004) Pharm. Res. 21: 860–866.
Deisingh, A. K. (2005) Analyst. 130: 271–279.
Delacroix, S., Titman, J., Hagemeyer, A., Spiess, H. (1992) J. Magn. Reson. 97: 435–443.
Dennis, A. C., McGarvey, J. J., Woolfson, A. D., McCafferty, D. F. and Moss, G. P. (2004) Int. J. Pharm.
279: 43–50.
Diaz, E., Frydman, L., Olivieri, C., Alejandro, C., Frydman, B. (1987) Anal. Lett. 20(10): 1657–1666.
Dixon, W., Schaefer, J., Sefcik, M., Steyskal, E. and Mckay, R. (1982) J. Magn. Reson. 49: 341–345.
Donso, M. and Ghaly, E. S. (2005) Pharm. Dev. Technol. 10: 211–217.
Duong, N.-H., Arratia, P., Muzzio, F., Lange, A., Timmermans, J. and Reynolds, S. (2003) Drug Dev. Ind.
Pharm. 29: 679–687.
Elkordy, A. A., Forbes, R. T. and Barry, B. W. (2004) Int. J. Pharm. 278: 209–219.
Findlay, W. P. and Bugay, D. E. (1998) J. Pharm. Biomed. Anal. 16: 921–930.
Frye, J. (1989) Concepts Magn. Reson. 1: 27–33.
Gao, P. Pharm. Res. (1996) 13(7): 1095–1104.
Geen, H. and Bodenhausen, G. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 1579–1580.
Grage, L., Gauger, R., Selle, C., Phole, W., Richter, W., Ulrich, S. Physical Chemistry Chemical Physics
(2000) 2(20): 4574–4579.
Griesser, U. J., Burger, A. and Mereiter, K. (1997) J. Pharm. Sci. 86: 352–358.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
66
Hailey, P. A., Doherty, P., Tapsell, P. Oliver, T. and Aldridge, P. K. (1996) J. Pharm. Biomed. Anal. 14:
551–559.
Haleblian, J., McCrone, W. (1969) J. Pharm. Sci. 58: 911–929.
Harris, R. (1985) Analyst 110: 649–655.
Ho, L., Cuppok, Y., Muschert, S., Gordon, K. C., Pepper, M., Shen, Y., Siepmann, F., Siepmann, J.,
Taday, P. F. and Rades, T. (2009) Int. J. Pharm. 382: 151–159.
Ho, L., Muller, R., Kruger, C., Gordon, K. C., Kleinebudde, P., Pepper, M., Rades, T., Shen, Y., Taday, P.
F. and Zeitler, J. A. (2009) J. Pharm. Sci. 99: 392–402.
Holzgrabe, U., Wawer, I. and Diehl, B. (1999) NMR Spectroscopy in Drug Development and Analysis.
Wiley-VCH, Weinheim, pp. 231–256.
Imai, T., Otagiri, M., Saito, H., Uekama, K., Chem. & Pharm. Bull. 36 (1) (1988) 354–359.
Islam, M. T., Rodriguez-Hornedo, N., Ciotti, S. and Ackermann, C. (2004) Pharm. Res. 21: 1844–1851.
Jackson, J. E. 1991. A User’s Guide to Principal Components. John Wiley & Sons, Inc., New York.
Jarvie, T., Went, G., Mueler, K. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 5330–5331.
Jee, R. D. (2004) Near-infrared Spectroscopy. In: Moffat, A. C., Osselton, M. D., Widdop, B and
Galichet, L. Y. (eds.) Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons. 3rd ed. Pharmaceutical Press. pp. 346–
357.
Johansson, J., Pettersson, S. and Folestad, S. (2005) J. Pharm. Biomed. Anal. 39: 510–516.
Johansson, J., Pettersson, S. and Taylor, L. S. (2002) J. Pharm. Biomed. Anal. 30: 1223–1231.
Jorgensen, A., Rantanen, J., Karjalainen, M., Khriachtchev, L., Rasanen, E. and Yliruusi, J. (2002)
Pharm. Res. 19: 1285–1291.
Jorgensen, A. C., Strachan, C. J., Pollanen, K. H., Koradia, V., Tian, F. and Rantanen, J. (2009) J. Pharm.
Sci. 98: 3903–3932.
Kazarian, S. G. and Matirosyan, G. G., (2002) International Journal of Pharmaceutics 232: 81–90.
Kimura, K., Hirayama, F., Arima, H., Uekama, K. (1999) Pharm. Res. 16(11): 1729–1734.
King, M. D., Buchanan, W. D. and Korter, T. M. (2010) J. Pharm. Sci., DOI 10.1002/jps.22339 1–14.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
67
King, T. H., Mann, C. K. and Vickers, T. J. (1985) J. Pharm. Sci. 74: 443–447.
Kirsch, J. D. and Drennen, J K. (1999) J. Pharm. Biomed. Anal. 19: 351–362.
Kontoyannis, C. G. (1995) J. Pharm. Biomed. Anal. 13: 73–76.
Kortüm, G. (1969) Reflectance Spectroscopy. Springer Verlag, New York.
Kubelka, P. and Munk, F. (1931) Ein Beitrag zur Optik der Farbanstriche. Z. Tech. Phys. (Leipzig) 12:
593–601.
Laasonen, M., Harmia-Pulkkinen, T., Simard, C., Rasanen, M. and Vuorela, H. (2003) Anal. Chem. 75:
754–760.
Langkilde, F. W., Sjoblom, J., Tekenbergs-Hjelte, L. and Mrak, J. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 15:
687–696.
Lee, H., Craig, C., Kannangara, K., Dawson, M., Conn, C., Robertson, J., Wilson, A., J. (1999) Forensic.
Sci. 44(4): 761–771.
Lefort, R., De Gusseme, A., Willart, J., Daneda, F., Descamps, M. (2004) Int. J. Pharm. 280(1–2): 209–
219.
Lied, T. T., Geladi, P. and Esbensen, K. H. (2000) J. Chemometrics 14: 585–598.
Lyon, R. C., Lester, D. S., Lewis, E. N., Lee, E., Yu, L. X., Everett, H. J. and Hussain, A. S. (2002) AAPS
PharmSciTech. 3(3, article 17): 1–15.
Maurin, B., Vickery, D. Rapel, C., Rowe, M., Everlof, G., Nemeth, A., Campell, C., Foris, M., J. Pharm.
Sci. (2002) 91(12): 2599–2604.
McMahon, L. E., Timmins, P., Williams, A. C. and York, P. (1996) J. Pharm. Sci. 85: 1064–1069.
Medek, A., Frydman, L. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 684–691.
Mehrens, S. M., Kale, U. J. and Qu, X. (2005) J. Pharm. Sci. 94: 1354–1367.
Middleton, A., LeDuff, S., Peng, X., Reid, G., Saunders, D., J. Am. Chem. Soc. (2000) 122(6): 1161–
1170.
Miller, J., Collman, B. M., Greene, L. R., Grant, D. J. W. and Blackburn, A. C. (2005) Pharm. Dev.
Technol. 10: 291–297.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
68
Morissette, S. L., Almarsson, O., Peterson, M. L., Remenar, J. F., Read, M. J., Lemmo, A. V., Ellis, S.,
Cima, M. J. and Gardner, C. R. (2004) Adv. Drug. Del. Rev. 56: 275–300.
Moshashaee, S., Bisrat, M., Forbes, R. T., Quinn, E. A., Hakan, N. and York, P. (2003) J. Pharm.
Pharmacol. 55: 185–192.
Murray, I. and Williams, P. C. (1987) Chemical Principles of Near-Infrared Technology. In: Williams, P.
and Nonis, K. (eds.) Near Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries. American
Association of Cereal Chemists, Inc. pp. (ch. 2) 17–34.
Nerdal, W., Gundersen, A., Thorsen, V., Hoiland, H., Holmsen, H., Biochimica et Biophysica Acta, 1464
(1) (2000) 165–175.
Newman, A. W. and Byrn, S. R. (2003) Drug Discovery Today 8: 898–905.
Neville, G. A., Beckstead, H. D. and Shurvell, H. F. (1992) J. Pharm. Sci. 81: 1141–1146.
Nguyen, L. T, Wiencek, J. M. and Kirsch, L. E. (2003) PDA J. Pharm. Sci. Tech. 57: 429–445.
Novoselsky, A., Glaser, R. (2002) Mag. Reson. in Chem. 40(11): 723–728.
Offerdahl, J., Munson, J., Am. (2004) Pharm. Rev. 7(1): 109–112.
Okumura, T. and Otsuka, M. (2005) Pharm. Res. 22: 1350–1357.
O’Neil, A. J., Jee, R. D., Lee, G., Charvill, A. and Moffat, A. C. (2008) J. Near Infrared Spectrosc. 16 (3):
327–333.
O’Neil, A. J., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (1998) Analyst. 123: 2297–2302.
O’Neil, A. J., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (1999) Measurement of the cumulative particle size
distribution of microcrystalline cellulose using near-infrared reflectance spectroscopy. Analyst 124:
33–36.
Opella, S. and Frey, M. (1979) J. Am. Chem. Soc. 101: 5854–5856.
Osborne, B. G., Fearn, T. and Hindle, P. T. (1993) Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food
and Beverage Analysis. Longman Scientific & Technical, Harlow.
Otsuka, M., Kato, F., Matsuda, Y. and Ozki, Y. (2003) AAPS PharmSciTech. 4(2): Article 19.
Otsuka, M., Nishizawa, J., Shibata, J. and Ito, M., (2010) J. Pharm. Sci. 99: 4048–4053.
Park, J. W., Lee, D. J., Yoo, E. S., Im, S. S., Kim, S. H. and Kim, Y. H. (1999) Korean Polym. J., 7: 93–101.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
69
Pines, A., Gibby, M., Waugh, J., J. Chem. Phys. 59 (1973) 569–590.
Plugge, W. and Vlies, van der, C. (1993). J. Pharm. Biomed. Anal. 11: 435–442.
Plugge, W. and Vlies, van der, C. (1996) J. Pharm. Biomed. Anal. 14: 891–898.
Pratiwi, D., Fawcett, J. P., Gordon, K. C. and Rades, T. (2002) European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics. 54: 337–341.
Rantanen, J., Lehtola, S., Ramet, P., Mannermaa, J. -P., Yliruusi, J. (1998) Powder Technol. 99: 163–
170.
Remenar, F., Wenslow, R., Ostovic, D., Peresypkin, A. (2004) Pharm. Res. 21(1): 185–188.
Reutzel-Edens, M., Bush, K., Am. Pharm. Review (2002) 5(2): 112–115.
Reutzel-Edens, M., Bush, K., Magee, A., Stephenson, A. R. Byrn, R. (2003) Crystal Growth and Design
3(6): 897–907.
Ringqvist, A., Taylor, L. S., Ekelund, K., Ragnarsson, G., Engstrom, S. and Axelsson, A. (2003) Int. J.
Pharm. 267: 35–47.
Saindon, J., Cauchon, S., Sutton, A., Chang, J., Peck, E., Byrn, R. (1993) Pharm. Res. 10(2): 197–203.
Sane, S. U., Wong, R. and Hsu, C. C. (2003) J. Pharm. Sci. 93: 1005–1018.
Santos, S., Lee, K., Hallock, J., Ramamoorthy, A. (2002) Recent Res. Dev. in Phys. Chem. 6: 179–211.
Sasic, S., Clark, D. A., Mitchell, J. C. and Snowden, M. J. (2005) Appl. Spectrosc. 59: 630–638.
Scafi, S. H. F. and Pasquini, C., (2001) Analyst 126: 2218.
Schachter, M., Xiong, J., Tirol, C. (2004) Int. J. Pharm. 281(1–2): 89–101.
Schmidt, A. C. (2005) Eur. J. Pharm. Sci. 25: 407–416.
Sekulic, S. S., Wakeman, J., Doherty, P. and Hailey, P. A. (1998) J. Pharm. Biomed. Anal. 17: 1285–
1309.
Skoog, D. A., Holler, F. J. and Nieman, T. A. (1998) Principles of Instrumental Analysis. 5 edn.
Thomson Learning, London.
Skoulika, S. and Georgiou, C. (2003) Appl. Spectrosc. 57: 407–412.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
70
Spiegeleer, de, B., Seghers, D., Wieme, R., Schaubroeck, J., Verpoort, F., Slegers, G. and Vooren, van,
L. (2005) J. Pharm. Biomed. Anal. 39: 275–280.
Stephenson, A., Pfeiffer, R., Byrn, R., Stephen, R. (1997a) Int. J. Pharm. 146(1): 93–99.
Stephenson, A., Stowell, G., Toma, H., Pfeiffer, R., Byrn, R. (1997b) J. Pharm. Sci. 86(11): 1239–1244.
Stoltz, M., Oliver, W., Wessels, L., Chalmers, A. (1991) J. Pharm. Sci. 80(4): 357–362.
Suzuki, N., Kawasaki, T. (2005) J. Pharm. Biomed. Anal. 37(1): 177–181.
Svensson, O., Josefson, M. and Langkilde, F. W. (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 141–155.
Szostak, R. and Mazurek, S. (2002) Analyst. 127: 144–148.
Taylor, L. S. and Langkilde, F. W. (2000) J. Pharm. Sci. 89: 1342–1353.
Taday, P. F. (2004) Phil. Trans. R. Soc. Lond. 362: 351–364.
Taday, P. F., Bradley, I. V., Arnone, D. D. and Pepper, M. (2003) J. Pharm. Sci. 92: 831–838.
Taylor, L. S., Langkilde, F. W. and Zografi, G. (2001) J. Pharm. Sci. 90: 888–901.
Tekely, P., Brondeau, J., Elbayed, K., Retournard, A. and Canet, D. (1988) J. Magn. Reson. 80: 509–
516.
Thosar, S. S., Forbess, R. A., Ebube, N. K., Chen, Y., Rubinovitz, R. L., Kemper, M. S., Reier, G. E.,
Wheatley, T. A. and Shukla, A. J. (2001) Pharm. Dev. Technol. 6(1): 19–29.
Timonen, T., Pohjala, E., Nikander, H., Pakkanen, T. (1998) Pharm. Res. 15(1): 110–115.
Tishmack, P., Bugay, D., Byrn, S. (2003) J. Pharm. Sci. 92(3): 441–474.
Tudor, A. M., Melia, C. D., Binns, J. S., Hendra, P. J., Church, S. and Davies, M. C. (1990) J. Pharm.
Biomed. Anal. 8: 717–720.
Tyndall, J. (1869) On the blue colour of the sky, the polarization of skylight and on the polarization of
light by cloudy matter generally. Phil. Mag. 37: 384–394.
Uekama, K., Hirayama, F., Fujise, A., Otagiri, M., Inaba, K., Saito, H. (1984) J. Pharm. Sci. 73(3): 382–
384.
Ufret, C. and Morris, K. 2001. Drug Dev. Ind. Pharm. 27: 719–729.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
71
Underhang, G., Anja, H., Holm, N., Nerdal, W. (2004) Biochimica et Biophysica Acta 1682(1–3): 28–37.
Van Hoof, P., Lammers, R. Van Puijenbroek, R., Vander Schans, M., Carlier, P., Kellenbach, E. (2002)
Int. J. Pharm. 238(1–2): 215–228.
Vehring, R. (2005) Appl. Spectrosc. 59: 286–292.
Vergote, G. J., Vervaet, C., Remon, J. P., Haemers, T. and Verpoort, F. (2002) Eur. J. Pharm. Sci. 16:
63–67.
Vergote, G. J., Beer, de, T. R. M., Vervaet, C., Remon, J. P., Baeyens, W. R. G., Diericx, N. and
Verpoort, F. (2004) Eur. J. Pharm. Sci. 21: 479–485.
Ward, S., Perkins, M., Zhang, J., Roberts, C. J., Madden, C. E., Luk, S. Y., Patel, N. and Ebbens, S. J.
(2005) Pharm. Res. 22: 1195–1202.
Wartewig, S. and Neubert, R. H. H. (2005) Adv. Drug. Del. Rev. 57: 1144–1170.
Watts, P. J., Tudor, A., Church, S. J., Hendra, P. J., Turner, P., Melia, C. D. and Davies, M. C. 1991.
Pharm. Res. 8: 1323–1328.
Wikstrom, H., Marsac, P. J. and Taylor, L. S. (2005) J. Pharm. Sci. 94: 209–219.
Williams, A. C., Cooper, V. B., Thomas, L., Griffith, L. J., Petts, C. R. and Booth, S. W. (2004) Int. J.
Pharm. 275: 29–39.
Wong, M. W. Y. and Mitchell, A. G., Physicochemical characterization of a phase change produced
during the wet granulation of chlorpromazine hydrochloride and its effects on tabletting, (1992) Int.
J. Pharm. 88: 261–273.
Wu, X., Zilm, K. (1993) J. Mag. Reson. 102: 205–213.
Wulff, M., Alden, M., Tegenfeldt, J. (2002) Bioconjugate Chemistry 13(2): 240–248.
Yang, H. and Irudayaraj, J. (2002) J. Pharm. Pharmacol. 54: 1247–1255.
Yang, L., Venkatesh, G. and Fassihi, R. (1996) J. Pharm. Sci. 85: 1085–1090.
Yoon, W. L., Jee, R. D. and Moffat, A. C. (1998) Analyst. 123: 1029–1034.
Yu, L. X., Lionberger, R. A., Raw, A. S., D’Costa, R., Wu, H. and Hussain, A. S. (2004) Adv. Drug. Del.
Rev. 56: 349–369.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
72
Zeitler, J. A., Taday, P. F., Newnham, D. A., Pepper, M., Gordon, K. C. and Rades, T. (2007) J. Pharm.
Pharmacol., 59: 209–223.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
73
4. Termická analýza – konvenční techniky
4.1.Úvod do termické analýzy
Běžně používaná metoda u většiny R&D laboratoří je termická analýza (TA), konkrétně diferenční
skenovací kalorimetrie (Differential Scanning Calorimetry (DSC)), která je vhodná pro pochopení
fyzikálních vlastností léčivových substancí, interakcí léčivových substancí s neaktivními substancemi
(většinou nosiči léčiv) a stability konečného produktu obsahujícího léčivo. Termická analýza je termín
používaný pro popis všech analytických technik, které měří fyzikální a chemické vlastnosti vzorku jako
funkci teploty nebo času.
Tato kapitola si klade za cíl vysvětlit použití DSC a termogravimetrické analýzy (TGA) při výzkumu a
kvantifikaci různých fyzikálněchemických parametrů důležitých během charakterizační fáze vývoje
farmaceutického produktu. Tam, kde to bude nutné k pochopení metodologie, budou uvedeny
příklady z literatury. Další termická technika, která bude zmíněna, je dynamická mechanická analýza
(DMA), jejíž aplikace byly nedávno vyvinuty pro farmaceutické materiály použitím tabletových držáků
a nádobek pro práškový materiál.
Každá z těchto technik bude diskutována s ohledem na odpovídající praktické uplatnění v různých
oblastech aplikace. Vzhledem k tomu, že praktické využití DSC je často považováno za velmi důležité,
bude tomuto tématu věnována větší pozornost.
Informace v této kapitole jsou z větší části převzaty z kapitoly Principles and Applications of
Thermal Analysis (Gabbot 2008), kde lze o této technice nalézt detailnější informace.
4.2. Diferenční skenovací kalorimetrie
Diferenční skenovací kalorimetrie je nejrozšířenější používanou termickou technikou poskytující
rychlou a snadnou metodu pro získání velkého množství informací o materiálu ať už je jeho použití
jakékoliv. Tato technika je používána k měření změn energie, které nastávají, když je vzorek ohříván,
ochlazován nebo udržován v isotermickém prostředí, stejně tak k měření teploty, při které tyto
změny nastávají.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
74
Tyto změny energie umožňují uživateli nalézt a kvantitativně změřit přechody, které nastávají ve
vzorku, a tak charakterizovat materiál vzhledem k procesům tání, skelným přechodům a dalším
složitějším dějům. Při analýze DSC je třeba vzorky neprodyšně uzavřít, což lze snadno provést buď bez
úpravy vzorku a nebo jen s malou úpravou, a proto může být měření provedeno snadno a rychle.
4.2.1. Měření tepelného toku
Hlavní veličina, která je měřena DSC, je tepelný tok (tok energie do vzorku (endotermický děj)
nebo ze vzorku (exotermický děj)), který je zaznamenáván jako funkce teploty nebo času a
v termickém záznamu je obvykle uváděn na ose y v jednotkách mW. Ty odpovídají mJ/s, a proto je
tepelný tok často popisován jako tok energie za jednotku času. Zahřívání nebo ochlazování vzorku se
na záznamu projevuje ve formě píků nebo schodů na základní linii, někdy velmi malých, jejichž
zdrojem jsou přechody ve vzorku. Počátek křivky na ose y může být zvolen jako jeden z počátečních
parametrů a měl by být umístěn blízko nebo přímo do nuly.
Existují dvě různé konvence pro zobrazování křivky tepelného toku, jedna zobrazuje endotermy
v klesajícím směru, druhá v rostoucím. U většiny programů si lze toto nastavení zvolit. Při analýze DSC
dat je důležité stanovit směr tepelného toku. V této kapitole je většina dat zobrazena s rostoucími
endotermami. Typický DSC sken vzorku v oblasti tání je ukázán na obrázku 4.1. Bod tání je určen jako
průsečík píku a extrapolovaného začátku nárůstu teploty. Pokud je materiál amorfní (není
krystalický), pak může být pozorován skelný přechod jako schod v základní linii obvykle následovaný
rekrystalizací a následným táním, jak je ukázáno na obrázku 4.2.
Obrázek Bod tání (Tm) krystalu je určen z extrapolovaného začátku tání, který je označen šipkou.
Skupenské teplo tání je získáno z plochy pod křivkou. (Endoterma je zobrazena v rostoucím směru.)
Obrázek Typická křivka získaná zahříváním amorfního (skelného) materiálu. Skelný přechod (Tg) je
v oblasti vzestupu tepelného toku. Malý pík na vrcholu tohoto schodu je relaxační jev. Následuje
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
75
studená krystalizace v oblasti širokého exotermického píku, za níž následuje endotermický pík, který
odpovídá tání vzniklých krystalů.
Pokud je použita odpovídající metodologie, mohou být také provedena specifická měření, která
berou do úvahy příspěvek tepelného toku z pece, pánvičky použité pro vzorek a referenčního měření.
Většina farmaceutických aplikací však nevyžaduje stanovení isobarické tepelné kapacity (Cp), jejíž
měření vyžaduje více práce, a proto se většinou používá pouze měření tepelného toku.
4.2.2. Derivační křivky při DSC
Derivační křivky jsou snadno získatelné z křivek tepelného toku matematickým algoritmem a
pomáhají interpretovat data. Mohou pomoci při definování výpočetních limitů a při rozlišení dat,
obzvláště když jsou v záznamu překrývající se píky. Křivka první derivace je užitečná pro vyhodnocení
postupných přechodů, jako je skelný přechod a je velmi užitečná pro TGA studie, ve kterých má ztráta
hmoty za následek schod. Druhá derivace píku je snadněji interpretovatelná než první derivace,
protože také vytváří pík. V tomto případě jsou data invertována, ale jakákoliv raménka v původních
datech se zobrazí jako separátní píky v křivce druhé derivace. To je obzvláště užitečné při zkoumání
procesů tání při identifikaci ramének v píku v případě několikanásobných jevů. Příklad je ukázán na
obrázku 4.3. Druhá derivace vytváří maximum nebo minimum pro každý inflexní bod původní křivky.
Čím vyšší je úroveň derivace, tím vyšší je generovaný šum, a proto je pro vyšší derivační studie
potřeba dobrá kvalita dat. Fitovací a vyhlazovací techniky mohou být velmi užitečné při redukci šumu
analyzované křivky, pokud jsou uplatněny před derivací dat. Obecně se dá říct, že ostré jevy a inflexní
body vytváří nejlepší derivační křivky. Studie při vysokých rychlostech také vytváří velmi dobré
derivační křivky, protože děj probíhá rychleji.
Obrázek Indomethacinová forma 2 skenovaná při 500 °C/min. Raménko na křivce tání vytváří ve
druhé derivaci samostatný pík. 2. derivace křivky tání tak vytváří dublet směřující dolů. (Zdroj:
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
76
Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul
Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
4.2.3. Praktické pokyny pro DSC experiment
Čistota je pro DSC to nejdůležitější. Kontaminace nastává, pokud je pánvička položena na špinavý
povrch a poté je dána do pece. Proto udržujte přístroj a pracovní oblast čistou a uklizenou a
odstraňujte použité pánvičky, abyste se vyhnuli jejich zaměnění s čistými. DSC pece by také měly být
udržovány čisté odpovídajícími čistícími metodami dle instrukcí výrobce. Vyvarujte se abrazivům a
dávejte zvýšený pozor při použití hořlavých rozpouštědel. Postupujte dle specifických instrukcí pro
každý konkrétní typ pece.
Konkrétně:

nepřeplňujte pánvičku,

nepřehřívejte a nerozkládejte vzorky v DSC (kromě kontrolovaných experimentů pro to
určených),

nezahřívejte hliníkovou pánvičku nad 600 °C,

nepracujte v peci s oxidující atmosférou nad její doporučený limit,

nepoužívejte nadbytečnou sílu při čištění pece.
4.2.4. Enkapsulace pro DSC měření
Enkapsulace je nezbytná pro předejití kontaminace analyzátoru a pro dobrý tepelný kontakt
vzorku s pecí. Většina výrobců poskytuje různé pánvičky na vzorky určené pro různé účely, s různými
velikostmi, materiály, ze kterých jsou pánvičky vyrobeny a pro které jsou vždy stanoveny odpovídající
rozsahy teplot a tlaků. Při výběru pánvičky a enkapsulace vzorku by měla být věnována pozornost
následujícím bodům:
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
77
Množství vzorku. Nepřeplňujte pánvičku. Kontaminace je nejčastěji způsobena použitím příliš
velkého množství vzorku, obzvláště pokud bude vzorek roztaven, mohl by vytéct z pánvičky a
způsobit tak chybu v měřených datech. Zmenšení objemu vzorku při tání nebo měknutí může
způsobit šum během nebo po přechodu do jiného stavu. Zmenšením objemu vzorku se zmenšuje
šance, že se výše uvedené stane. Často je dostačující několik mg, obvykle se jedná o 1–3 mg
farmaceutické látky, ale pro velmi slabé změny stavů a pro přesné měření skupenského tepla je
zapotřebí vzorku více. Poznámka: Pokud uvažujete přesnost měření energie, měli byste vzít také do
úvahy přesnost vah. Pro většinu analýz jsou třeba pětimístné váhy, šestimístné (schopné měřit
mikrogramová množství) jsou třeba pro přesnější měření skupenského tepla. A ještě jedna
poznámka, pokud je plánováno, že vzorek roztaje, je třeba navážit ho menší množství a vybrat
pánvičku, do které se dané množství vejde.
Teplotní rozsah. Ujistěte se, že pánvička je určena pro požadovaný teplotní rozsah a nebude tát
během měření. Pamatujte, že hliník nemůže být použit nad 600 °C. Pánvičky ze zlata (teplota tání
1063 °C), platiny nebo hliníku mohou být použity při vyšších teplotách.
Narůstání tlaku a deformace pánvičky. Narůstání tlaku v nevhodně zvolené pánvičce způsobuje
problémy. Je důležité zjistit, zda je potřeba analyzovat vzorek v hermeticky uzavřené pánvičce nebo
ne. Suché vzorky, u kterých není pravděpodobné uvolňování velkých množství těkavých látek, ještě
než dojde k rozkladu vzorku, není třeba hermeticky uzavírat. Při analýze v hermeticky uzavřené
pánvičce může narůstající vnitřní tlak deformovat pánvičku (ne nutně viditelně), což má za následek
špatnou reprodukovatelnost a možný výskyt artefaktů na křivce kvůli změně přenosu tepla do vzorku.
Únik vzorku má většinou za následek kontaminaci analyzátoru. Nejlepším řešením pro takový systém
je pracovat se zvlněnými pánvičkami nebo použít víčka s otvory. V případě materiálu obsahujícího
vodu je důležité hermetické uzavření, protože ztráta těkavých látek může zakrývat jiné přechodové
jevy a vysušovala by vzorek. V tom případě je nezbytné použít vhodný typ pánvičky schopný vydržet
předpokládaný tlak. Běžně jsou dostupné různé typy pánviček s tlakovou odolností kolem 150 bar.
Pro zacházení s rizikovými vzorky by měly být použity pozlacené pánvičky, které vydrží velký tlak a
které by měly být ke vzorku inertní.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
78
Čistota pánviček. Většina pánviček může být použita rovnou po obdržení, ale někdy se stane, že je
dodávka slabě kontaminována, pravděpodobně stopami oleje z přístrojů vyrábějících pánvičky. Pokud
tomu tak je, pánvičky musí být vyčištěny odtěkáním oleje. Zahřátí na 300 °C je proto víc než
dostačující. Pokud použijete plotýnku, nezahřívejte příliš pánviček pohromadě, neboť se mohou
spojit navzájem. Použití čistých pánviček je také důležité při velmi citlivých analýzách, například při
rychle skenující DSC. Po enkapsulaci se vzorek zkontroluje a odstraní se jakákoliv kontaminace
z pánvičky, obzvláště z jejího dna. Na odstraňování práškového materiálu je vhodný měkký kartáček.
Pánvičky s velmi malými otvory. Ke zvýšení rozlišení výsledných píků odpovídajících ztrátě hmoty
byly vyvinuty některé typy pánviček a víček s velmi malými otvory, obvykle okolo 50 mikrometrů
v průměru, které jsou určené k použití pro hydráty a materiály obsahující rozpouštědla. Mohou být
použity i pro běžné vzorky pro uvolnění vnitřního tlaku dokud není otvor zablokován.
Tepelný kontakt. Je třeba, aby byly vzorky v dostatečném tepelném kontaktu s pánvičkou.
Kapaliny a stlačené prášky poskytují dobrý tepelný kontakt, ale ostatní vzorky nebo větší kousky
materiálu by měly být rozetřeny po povrchu pánvičky. Vyvarujte se použití hrudkovitých materiálů,
pokud si nejste jisti, že materiál nebude měnit svoje vlastnosti. Pokud je to možné, filmy by neměly
být převrstvovány, aby se předešlo opakovaným efektům pocházejících ze stejného přechodového
jevu, ačkoli převrstvování může být jediná cesta jak dodat dostatečné množství vzorku do pánvičky.
V tom případě se ujistěte, že jsou k sobě filmy velmi dobře stlačeny. Malá hustota vzorků vykazuje
nízký přenos tepla, a proto by měly být vzorky stlačeny. Některé analyzátory to dělají automaticky.
U ostatních je dobré stlačit vzorek mezi dvěma spodními částmi pánviček. Dávejte pozor, abyste
nezdeformovali pánvičku a odstraňte všechny pánvičky, u kterých máte podezření na deformaci.
Některé pánvičky s tenkou vrstvou hliníku mohou poskytnout lepší přenos tepla, protože mají tenčí
dno.
4.2.5. Teplotní rozsah běžných DSC měření
Počáteční teplota by měla být zvolena dostatečně nízko pod začátkem prvního přechodu, který
chceme měřit, abychom jasně viděli vodorovnou základní linii. Je třeba si uvědomit, že ze začátku
analýzy ještě není rychlost skenování plně kontrolována a základní linie není stabilní (viz sekce 4.2.7).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
79
U běžných DSC systémů je počáteční teplota často kolem 30 °C. Konečná teplota měření by měla být
pod teplotou rozkladu vzorku. Rozklad materiálu v DSC vede většinou ke vzniku velmi zašuměné
fluktuující odezvy a uvolnění těkavých látek, které mohou kontaminovat systém. Je proto vhodné
nejprve stanovit teplotu rozkladu použitím TGA analyzátoru a pak zastavit analýzu před zjištěnou
teplotou rozkladu.
4.2.6. Rychlost skenování při DSC experimentu
Nejčastěji používaná rychlost skenování je 10 °C/min, ale s komerčně dostupnými přístroji mohou
být rychlosti měněny od jednotek po stovky °C/min, což poskytuje značné výhody. Výběr rychlosti
skenování ovlivňuje následující oblasti:

Citlivost. Čím vyšší rychlost skenování, tím vyšší citlivost. Důvod je ten, že DSC měří tok
energie a během rychlého skenování tok energie vzrůstá, ačkoli analýza trvá kratší dobu.
Protože se DSC data obvykle zobrazují s teplotou na ose x, vypadá to, že přechod je vyšší
při vyšších rychlostech skenování (viz obrázek 4.4a a b). Protože zvýšená rychlost
skenování vede ke zvýšené citlivosti, nedoporučuje se, pokud to není nezbytné, používat
pomalé rychlosti kvůli následnému obtížnému zjišťování přechodů.

Rozlišení. Protože jsou ve vzorku teplotní gradienty, vyšší rychlost skenování rozlišení
snižuje a pomalejší rychlost skenování rozlišení zvyšuje. Teplotní gradienty mohou být
zmenšeny omezením velikosti vzorku a zlepšením tepelného kontaktu s pánvičkou
vhodným zapouzdřením nebo použitím vodivějšího proplachovacího plynu, jako je helium.

Kinetika přechodu. Pomalé děje, jako je studená krystalizace, nemusí proběhnout úplně,
pokud je použita velká rychlost skenování a mohou být posunuty k vyšším teplotám, kde
probíhají rychleji. Při výběru rychlosti skenování nemusí být uvažována kinetika dějů.

Efekt rychlosti ochlazování na krystalizaci také nemusí být uvažován a je zde tedy
potenciál pro využití vyšších rychlostí skenování.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
80
ObrázekEfekt zvýšení rychlosti skenování na indium. Na obrázku 4.4a (horní křivka) je na ose x
vynesen čas. Na obrázku 4.4b (dolní křivka) je na ose x vynesena teplota. Stejné energie tečou rychleji
při kratších časech a vyšších rychlostech a poskytují tak vyšší píky. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott,
Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell.
Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
4.2.7. Ustavení rovnováhy v DSC přístroji
Z důvodu vytvoření požadované rychlosti zahřívání trvá po zahájení analýzy nějakou dobu, než je
energie přenesena jak do vzorku, tak do referenčního materiálu. Proto je zde vždy na počátku analýzy
krátká doba nestability do té doby, než se ustaví stabilní ohřívání (nebo ochlazování). Tento jev se
často projevuje jako endotermní schod, ale může být různě velký pro každou analýzu. Tato doba je
označována jako doba ustavení rovnováhy (viz Obrázek). Na obrázku, kde jsou zobrazeny celé
záznamy, je vidět ustavení rovnováhy jako nestabilita základní linie na začátku analýzy před tím, než
začne být základní linie vodorovná. Čas potřebný k ustavení rovnováhy je různý pro každý přístroj, ale
projevuje se vždy. Hodnoty mohou být malé, například sekundy, ale mohou být i několikaminutové,
přičemž částečně záleží i na tepelné kapacitě pece. Po této době může základní linie vykázat malý
sklon díky změněné tepelné kapacitě vzorku. Ustavení rovnováhy se také projevuje po dokončení
skenu, například při změně na isotermu, a může příležitostně maskovat měření prováděná během
isotermy. Pokud toto nastane, mělo by být možné minimalizovat efekty odečtením referenčního
záznamu. Data použitá pro odečtení mohou být vzata z analýzy inertního vzorku o stejné hmotnosti,
jakou měl analyzovaný vzorek.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
81
4.2.8. Kalibrace DSC
Je důležité rozlišovat mezi procesy kalibrace a procesy validace nebo kontroly. Pokud se jedná
o přístroj nové značky, měla by provedena servisní prohlídka, nebo pokud je přístroj používán za
nových podmínek, měla by být provedena kalibrace, ale i přístroj v běžném chodu by měl být
pravidelně kontrolován a kalibrován, pokud výkon poklesne pod stanovená kritéria. Mnoho systémů,
obzvláště ve farmaceutickém průmyslu, je provozováno použitím správné laboratorní praxe nebo
jiných regulací a mají stanovené návody, kdy a jak často by měly být kontroly prováděny. Všeobecně
jsou používány běžné výkonnostní testy. Pokud je systém kontrolován jednou za šest měsíců a pak je
zjištěna chyba, je těchto šest měsíců práce pochybných. Pokud je po kontrole zjištěno, že přístroj
vyžaduje kalibraci, pak se postupuje dle instrukcí popisujících provedení kalibrace. Pro dodržení
přesnosti a opakovatelnosti měření musí být systém kalibrován a validován za podmínek použití.
Dobrý přehled v současnosti používaných standardů pro DSC s ohledem na přesnost a postup je
uveden v referencích (Della Gatta et al. 2006).
4.2.9. Faktory ovlivňující DSC kalibraci
Je známo mnoho faktorů ovlivňujících odezvu systému, a pokud jsou měněny, je nutné nastavení
různých podmínek kalibrace, které zahrnují:

nastavení přístroje a stability,

použití chladicího systému,

rychlost skenování,

proplachovací plyn a jeho průtoková rychlost,

typ pánvičky.
Změna kteréhokoliv z výše uvedených faktorů může ovlivnit kalibraci. Tyto změny však mohou být
různě významné pro různé typy přístrojů. Nejprve je třeba se ujistit, že je přístroj správně nastaven a
všechna příslušenství jsou zapnuta a jsou stabilní. Většina analyzátorů může obsahovat analogové
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
82
okruhy, které způsobují malý posun při zahřívání, a proto by měl být nějakou dobu (obvykle alespoň
hodinu) přístroj zapnutý než se provede kalibrace. V analyzátorech jsou také další nastavení, která
ovlivňují kalibraci, takže by s nimi měl být uživatel seznámen, než začne s kalibrací. Použití chladicích
systémů může způsobit změnu teploty, a proto je třeba se přesvědčit, že jsou zapnuty a stabilní.
Pokud jsou použity různé rychlosti skenování, obzvláště při velmi vysokých rychlostech používaných
v rychle skenujícím DSC, je třeba se ujistit, že je analyzátor vhodně nakalibrovaný pro danou rychlost
skenování. Proplachovací plyny, jako je vzduch, kyslík a dusík, mají podobné tepelné vlastnosti a
mohou být zaměněny mezi sebou bez ovlivnění rychlostí skenování. Vyšší vodivost helia nebo nižší
vodivost argonu může mít velmi podstatný vliv na kalibraci, a proto musí být systémy kalibrovány
s těmito plyny, pokud budou použity. Obvykle je helium používáno při nízkých teplotách nebo při
vysokých rychlostech skenování, zatímco argon může být vhodnější při teplotách nad 500 °C. Různé
typy pánviček obecně nemají takový vliv, ale pokud je změněn tepelný kontakt, například použitím
různé tloušťky nebo materiálu pánvičky, pak to může kalibraci ovlivnit. V případě pochybností je to
třeba zkontrolovat.
4.2.10.
Systém DSC s dvojitou pecí
Tento typ DSC, který je často označován jako výkon kompenzující DSC, měří energetický tok přímo
v mW nebo J/s a skládá se ze dvou malých pecí, jedné pro vzorek a druhé pro referenční vzorek
(obvykle prázdnou pánvičku). Referenční bývá pec vpravo (viz obrázek 4.5). Obě pece jsou zahřívány
předem naprogramovanou rychlostí zahřívání (nebo ochlazování) a je kontrolován výkon, aby byla
tato rychlost udržována. Ve výsledném DSC záznamu je porovnáván energetický tok do pece se
vzorkem s tokem do pece s referenčním materiálem a zobrazen jako funkce teploty nebo času.
Základní rovnice DSC je
DSC signál (W/g) = tepelná kapacita (J/K/g) × rychlost skenování (K/s)
dH/dt = dH/dT × dT/dt
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
83
Z tohoto důvodu odpovídá nezpracovaný signál tepelného toku tepelné kapacitě. V praxi odráží
DSC záznamy změny v tepelné kapacitě, a když jsou vzaty v úvahu příspěvky prázdných pánviček a
referenčního vzorku, je získána její absolutní hodnota.
Malé pece v tomto systému mohou být zahřívány nebo chlazeny velmi pomalu i velmi rychle a
jsou ideální pro řadu různých technik, obzvláště pro rychle skenující DSC. Tento přístup také dovoluje
skutečné isotermické operace, protože za konstantních teplotních podmínek je držen jak vzorek, tak
referenční materiál. Teplotní rozsah použití je od teploty kapalného dusíku po přibližně 730 °C.
Obrázek Schéma dvojité pece (výkon kompenzující DSC). V tomto systému jsou vzorková a
referenční pec zahřívány/chlazeny naprogramovanou rychlostí zahřívání/chlazení. Když nastane
přechod ve vzorku, výkon kompenzující obvod zvýší nebo sníží výkon pece tak, aby byla udržena
rychlost zahřívání. Výkon kompenzující obvod tím pádem odráží změny energie, ke kterým dochází ve
vzorku, a jsou zobrazeny na obrazovce jako funkce teploty na čase. Tato technika tedy přímo měří
změny energie. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal
Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
4.2.11.
Systém DSC s jednoduchou pecí
Tento typ DSC (DSC tepelného toku) využívá jednu pec se senzorem (nebo více senzory) teploty
pro pánvičky se vzorkem i s referenčním materiálem umístěnými uvnitř pece (viz obrázek 4.6).
Pánvičky se vzorkem a referenčním materiálem jsou umístěny na určených místech a pec je zahřívána
předem naprogramovanou rychlostí zahřívání (nebo ochlazování). Když ve vzorku nastanou
přechody, vznikne teplotní rozdíl mezi vzorkem a referenčním materiálem. Při pokračování
v zahřívání po přechodu se tento rozdíl teplot snižuje, protože systém dosahuje rovnováhy v souladu
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
84
s časovou odezvou systému. Základní měřený parametr je rozdíl teplot nebo t signálu. Moderní
analyzátory jsou pečlivě kalibrovány tak, aby byl t signál převeden na ekvivalent tepelného toku,
který je následně zobrazen jako funkce teploty na čase. Důvod pro použití rozdílu teploty lze snadno
vysvětlit na tání. Když nastává tání jednoho krystalu, výsledná směs pevné látky a kapaliny zůstává při
bodu tání, dokud není tání dokončeno, a tak teplota vzorku poklesne pod teplotu referenčního
materiálu. Typická jednoduchá pec může být použita od teploty kapalného dusíku po přibližně 700 °C,
podobně jako analyzátory se dvěma pecemi. Vysokoteplotní DSC (nebo DTA) systémy také používají
tento princip, ale podstatně se liší vnitřním uspořádáním.
Obrázek Schéma jednoduché pece (DSC tepelného toku). V tomto systému je vystaven jak vzorek,
tak referenční materiál stejnému tepelnému toku, ale příkony energie se liší. Efekty zahřívání nebo
ochlazování se liší, což vede k vytvoření rozdílu teplot mezi vzorkem a referenčním materiálem. Tento
rozdíl v teplotě je převeden na ekvivalent energie analyzátorem a poskytuje tak známý DSC signál
v mW. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis,
edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
4.3. Diferenční termická analýza (DTA)
Princip diferenční termické analýzy a její uspořádání jsou podobné jako v případě DSC tepelného
toku s tím rozdílem, že t signál zůstává ve formě signálu v mikrovoltech a není konvertován na
ekvivalent tepelného toku. Toto byl původní princip takovéhoto zařízení do té doby, než bylo
vyvinuto kvantitativní měření energie za použití DSC. Tohoto principu stále využívají zařízení schopná
dosáhnout teplot okolo 1500 °C a jsou označována jako DTA analyzátory. Uspořádání pece je dost
odlišné od systémů pracujících při nižších teplotách, ačkoli moderní přístroje mohou nabídnout volbu
signálu tepelného toku nebo signálu v mikrovoltech.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
85
4.3.1. Modulovaný profil teploty
Když je na vzorek aplikován sinusoidní teplotní profil, signál tepelného toku bude oscilovat
následkem teplotního programu a velikost oscilace bude funkcí tepelné kapacity vzorku. Z tohoto
důvodu může být z amplitudy signálu tepelného toku získána hodnota tepelné kapacity. Přínos této
metody oproti již existujícím metodám poskytujícím měření tepelné kapacity je ten, že měření
tepelné kapacity je odděleno od potenciálně překrývajících se dějů, jako jsou reakce, relaxace tlaku, a
je také dosaženo vyšší citlivosti vzhledem k pomalým lineárním rychlostem běžných DSC.
Sinusoidní Readingův přístup (Reading et al. 1994; Reading and Hourston 2006) zavedl
terminologii obráceného tepelného toku, pro který je nezbytná křivka tepelného toku, celkový
tepelný tok pro průměrnou modulovanou křivku tepelného toku, což je běžná DSC křivka, a
neobrácený tepelný tok pro kinetickou odezvu. Protože je Tg pozorován jako schod v křivce
tepelného toku, je ke změření Tg použit signál obráceného tepelného toku. Tato křivka by měla
ukázat děje, které jsou opravdu obrácené v tom smyslu, že stejné děje mohou být pozorovány
opětovným zahřáním nebo ochlazením. Skelný přechod může tedy být odlišen od relaxace,
rekrystalizace a dalších dějů, které mohou nastat, a to činí toto měření jasnějším.
Relaxace a další neobrácené děje by se tak měly objevit na neobrácené křivce a pro získání
relaxační energie spjaté se skelným přechodem může být provedeno měření této křivky. Teplotně
modulovaná DSC (MTDSC) může být také použita v kvazi termickém módu tak, že není vložena
teplotní rampa, což umožňuje měřit Cp hodnoty v jednom bodě. To může zlepšit rozlišení dějů, při
kterých je pozorována změna v Cp. Pozornost by také měla být věnována analýze profilů tání, protože
během tání je materiálem absorbována latentní tepelná energie a ustálený stav není vždy dosažen,
což činí analýzu dat složitější.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
86
4.4. Postupné/krokové metody termické analýzy
Použitím postupné/krokové metody se výpočet termodynamické (obrácené) a isokinetické
základní linie (neobrácené) liší od metod popsaných v předešlé sekci. Obvyklý přístup k výpočtu tepla
používá postupnou metodu, při které je isoterma následována teplotní rampou. Běžně je teplotní
rampa přes 10 °C, ale pokud je rampa omezena na jeden stupeň nebo méně a opakována mnohokrát,
pak jsou data ekvivalentní k obrácenému tepelnému toku (viz obrázek 4.7). Kinetika nebo
neobrácená odezva je získána z isotermických částí dat. Pro dosažení rozumné (pokud použijeme
aproximaci) separace v obrácených nebo rychlých a neobrácených nebo pomalých signálech je
důležité, aby byla správně vybrána doba isotermy. Pokud je příliš krátká, objeví se nepřirozeně vysoký
signál v neobrácené křivce. Dá se říct, že by isotermická doba měla být dostatečně dlouhá pro
dosažení stability systému, typicky 30–60 s. Typická křivka získaná při průchodu vzorku Tg a
následnou rekrystalizací je ukázána na obrázku 4.8. Aktuální tepelná kapacita vzorku při rekrystalizaci
je získána z modulované křivky oddělené od rekrystalizačního tepla.
Obrázek 4.7 Diagram teplotního profilu používaného v metodě založené na jednotlivých krocích a
výsledný signál tepelného toku. Tepelná kapacita je spočítána buď z výšky píku jako u klasické
metody nebo z plochy píku křivky tepelného toku. Kinetická odezva je získána z isotermické části.
(Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited
by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
Obrázek 4.8 Křivka získaná analýzou polyethylentereftalátu zobrazená jako funkce času. V horní
křivce znázorňující Cp odpovídá schod skelnému přechodu, zatímco při rekrystalizaci vzorku také
nastává malá redukce. Toto měření je odděleno od energie rekrystalizace. Kvantitativní data tepelné
kapacity mohou být získána odečtením základní linie v souladu s požadavkem standardních Cp
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
87
metod. Pokud to ale není provedeno, mohou být získána kvantitativní data znázorňující jednotlivé
děje. Křivka odpovídající dolní obálce oscilujících dat tepelného toku se nazývá základní linie IsoK.
4.5. Termogravimetrická analýza (TGA)
Ve většině farmaceutických laboratoří je DSC analýza doplněna termogravimetrickou analýzou
(TGA), kde se změny hmotnosti vzorku měří jako funkce teploty nebo času. Velmi často jsou tato
měření jednoznačná a umožňují stanovení zbytkových rozpouštědel, nebo tepelné či oxidační
stability materiálu. Měření jsou také velmi užitečná, ne-li nezbytná, při interpretaci endotermních
křivek z DSC. Ztráta rozpouštědla nebo vody může vypadat velmi podobně jako vrchol tání v DSC
křivce, ale lze snadno rozeznat použitím TGA. Proto může být velmi užitečné použití DSC spolu s TGA
analýzou vzorku.
4.5.1. Design přístroje pro TGA
Existuje řada typů přístrojů, které jsou dostupné s různými specifikacemi a nastaveními. Pokud je
nutné použít malou hmotnost vzorku (což je obvykle případ mnoha farmaceutických laboratoří), pak
je potřeba mít váhy s velmi vysokou přesností. Většina moderních vah je založena na kompenzaci síly,
jejichž princip spočívá v měření síly, která je potřebná k udržení stejné pozice vah a která se pak
přepočítává na hmotnost. Toto uspořádání poskytuje nejlepší účinnost. Na trhu v zásadě existují tři
různé typy analyzátorů:
a)
S vertikálně sestupným uspořádáním, kde je vzorek umístěn v pánvičce zavěšené na drátku
pod vahami. Vzhledem k tomu, že se pánvička bude vždy houpat vertikálně, eliminuje toto
uspořádání polohu vzorku a pohybové efekty.
b)
S vertikálně vzestupným uspořádáním, které je jednodušší na používání.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
88
c)
S horizontálním uspořádáním.
Pro vysokou účinnost je důležité se přesvědčit, aby jak horizontální, tak vertikálně vzestupné váhy
byly navrženy pro minimalizaci efektu způsobeného různou pozicí vzorku.
Mnoho moderních TGA systémů také zahrnuje možnost měřit tepelný tok a jsou označovány jako
simultánní systémy, protože TGA a DSC signál lze získat současně. To je samozřejmě velmi užitečné,
ale používané metody nejsou naneštěstí optimalizovány pro DSC analýzy a získané DSC signály
nemusí mít stejnou kvalitu jako ty, které jsou zjištěny z DSC analyzátoru pro tento účel určeného.
Teplotní rozsah většiny TGA přístrojů je od laboratorní teploty do 1000 °C, i když vysokoteplotní
systémy dosahují i 1500 °C a výše, a některé systémy mohou být chlazeny pod laboratorní teplotu.
Možnost chlazení může být užitečná nejen ke snížení teploty v průběhu cyklu, ale umožňuje vložit
vzorek při laboratorní teplotě, což je výhodnější, neboť při vyšší teplotě je rychlost ztráty těkavých
látek ze vzorku vyšší a dochází tak k chybě při určování počáteční hmotnosti.
4.5.2. TGA kalibrace – základní pokyny
Při práci s analyzátorem je důležité řídit se pokyny výrobce. U většiny analyzátorů se bude jednat
o měření teploty, měření hmotnosti a regulaci teploty, které vyžadují kalibraci, a jejichž principy jsou
stejné jako pro kalibraci DSC, viz sekce 4.2.8. Pro kalibraci teploty je lepší použít bod tání standardů
než curiovy body, což umožňuje mnoho moderních analyzátorů použitím křivky tepelného toku
získané z analýzy standardů.
4.5.3. Praktická upozornění pro TGA experiment
Korekce na vztlak. Jak se zvyšuje teplota vzorku, hustota atmosféry kolem vzorku se snižuje, což
zdánlivě vede ke zvýšení hmotnosti vzorku se zvyšující se teplotou. Přístroj již může zahrnovat postup
k minimalizaci tohoto efektu například tím, že automaticky odečte předem zaznamenanou základní
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
89
linii, ale i tak je důležité si uvědomit, že se mohou objevit účinky vztlaku. Pokud je nutné přesné
měření, pak nejlepší přístup ke korekci vztlaku je změřit prázdnou pánvičku při požadovaném
teplotním rozsahu a za stejných podmínek, a to odečíst od vzorku.

Hmotnost vzorku. Obvykle se používá 3 až 5 mg, lze použít i méně pokud není dostatek
vzorku, ale hmotnost by měla být dostatečná, aby bylo dosaženo požadované přesnosti.
Mnoho standardních operačních postupů specifikuje požadovanou hmotnost. Pokud se
používají velká množství vzorku, pak je přesnost zjištění ztráty hmoty lepší, ale snižuje se
rozlišitelnost dějů. Při vyšších hmotnostech mohou být také patrné účinky pohybu vzorku.

Ztráta vlhkosti. Jsou-li vzorky, které byly před tím ponechané na vzduchu, umístěny do
suchého prostředí TGA, je často pozorováno okamžité snížení hmotnosti. To může být na
obtíž, protože může dojít ke ztrátě různého množství látky ještě před začátkem analýzy.
Pokud je to významné, je třeba se přesvědčit, že metoda je dobře nastavena a připravena
ke spuštění jakmile je vložen vzorek. Také je třeba zvážit, zda by mohla být použita nějaká
forma zapouzdření, viz poznámka pod odstavcem „vzorkovací pánvičky“ uvedeném níže.

Rychlost skenování. Obvykle se provádí skenování při 10 °C/min. Rychlejší skenování
nemusí poskytnout dostatek času na požadovanou ztrátu hmotnosti a může způsobit
malé rozlišení. Pokud je ale požadováno pouze zjištění celkové ztráty hmotnosti při dané
teplotě, může být vzorek rychle zahřán na požadovanou teplotu a udržován při této
teplotě potřebnou dobu. Je-li potřeba větší rozlišení, může být skenovací rychlost snížena.
Nevýhodou je pouze zvýšená doba potřebná k analýze. To je jeden z důvodů pro použití
proměnlivé rychlosti nebo metod kontrolovaných vzorků (SCTA), které umožňují zvýšit
rozlišení v časových blocích, které nejsou příliš rozsáhlé.

Atmosféra. Dusík je pravděpodobně nejpoužívanější proplachovací plyn pro všechny TGA
analyzátory, ale pokud je vyžadována oxidační reakce nebo spálení vzorku, může být
použit vzduch nebo kyslík. Z tohoto důvodu jsou užitečná pomocná příslušenství
umožňující kontrolu toku plynu a automatické přepínání plynu. Může být také použito
helium, obzvláště pokud je pro analýzu plynů použit hmotnostní spektrometr. Důvodem je
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
90
možnost záměny iontů dusíku o molekulové hmotnosti 28 s oxidem uhelnatým, který má
stejnou molekulovou hmotnost, takže helium je dobrou alternativou. Helium také
umožňuje lepší přenos tepla do a ze vzorku, což může mít za následek lepší rozlišení
(v případě, že je přenos tepla rozhodujícím krokem) a také je výhodnější pro rychlejší
ochlazování vzorku. Další plyny, jako je argon, nejsou neobvyklé. Rovněž může být použito
redukční prostředí. Ve všech případech je třeba pracovat v rámci pokynů výrobce,
zejména pokud se používají reaktivní nebo redukující plyny.

Vzorkovací pánvičky. Pánvičky z platiny nebo oxidu hlinitého jsou normou pro TGA a za
předpokladu, že jsou čisté, mohou být znovu použity. Čištění často jednoduše spočívá ve
vypálení. Pokud i poté zůstanou na pánvičce zbytky, může být znovu použita za
předpokladu, že v průběhu analýzy nedochází k úbytku hmotnosti a že zbylý materiál nijak
neovlivňuje nově nanesený vzorek. V případě potřeby mohou být použity různé typy
vložek do pánviček. Při použití autosamplerů se stále více využívají hliníkové pánvičky,
protože mohou být uzavřeny a pak automaticky otevřeny těsně před použitím, což zabrání
vysychání vzorku nebo jeho interakci s atmosférou před samotným měřením. Pánvičky
s velmi malým otvorem (typicky 50 mikronů v průměru) mohou posloužit stejně dobře, i
když všechna tato uspořádání také způsobují úbytek hmoty při vyšších teplotách.
Otevřené hliníkové pánvičky jsou také užitečné, protože jsou levné a mohou být po použití
zlikvidovány. Poznámka: hliníkové pánvičky nelze použít nad 600 °C.

Typ vzorku. Velké krystaly nebo kusy vzorku mohou způsobit vystřikování či jiné
mechanické efekty, zatímco jemný prášek má tendenci vést k lepším údajům. Zjemnění
vzorku nemusí být možné, protože mohou být vyvolány nechtěné změny, takže pokud je
to možné, je lepší zvolit jemnější vzorek. Pokud je to nezbytné, zjemňujte vzorek opatrně
teprve potom, co se ujistíte, že to neovlivní výsledné vlastnosti vzorku.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
91
4.5.4. Interpretace TGA záznamu vzorku
Nejobvyklejší křivka získaná z TGA zobrazuje křivku ztráty hmotnosti v procentech, méně často se
používá křivka aktuální hmotnosti, ačkoli obě tyto možnosti jsou běžně dostupné. Navíc se často
zobrazuje první derivace křivky, která je velmi užitečná pro interpretaci a umožňuje určení mezních
hodnot a počet dějů, které nastaly. Obrázek 4.9 ukazuje typickou TGA křivku s výpočty v každém
kroku pro síran měďnatý. Mezní hodnoty pro výpočty první derivace jsou užitečné při rozhodování,
kdy děje začínají nebo končí, nebo jsou nejlépe odděleny. Obrázek 4.10 ukazuje rozklad šťavelanu
vápenatého spolu s křivkou první derivace (DTG).
Zatímco TGA umožňuje kvantitativní měření množství těkavých látek uvolněných během zahřívání,
neidentifikuje je. Možnost spřažené emisní termoanalýzy (EGA) může být velmi užitečná. Nejčastěji
se provádí pomocí TGA-FTIR nebo TGA-MS technik, viz obrázek 4.11, ve kterém jsou identifikovány
plyny uvolňované ze šťavelanu vápenatého.
Obrázek 4.9 Rozčlenění TGA křivky pentahydrátu síranu měďnatého při 10 °C/min. Jednotlivé
kroky odpovídají postupným eliminacím následujících molekul: 2 H2O, 2 H2O, 1 H2O, SO3, 0,5 O2.
Zbytek je Cu2O. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal
Obrázek 4.10 Postupný rozklad monohydrátu šťavelanu vápenatého: hmotnost vzorku 19 mg,
rychlost zahřívání 30 °C/min, dusík. TGA křivka byla normalizována (vydělena hmotností vzorku), a
proto začíná na 100 %. Teplotní rozsah tří ztrát hmotnosti je obvykle jasný v normalizované první
derivaci nebo DTG křivce. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of
Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
92
Obrázek 4.11 TGA-DTG-MS křivky termického rozkladu monohydrátu šťavelanu vápenatého
měřeného při 30 °C/min v 70 L hliníkové pánvičce. Proplachovací plyn argon, 50 ml/min. Diagram
ukazuje, že se monohydrát šťavelanu vápenatého rozkládá ve třech jednotlivých krocích.
Fragmentované ionty MS křivek pro vodu (m/z 18), CO (m/z 28) a CO 2 (m/z 44) ukazují píky
odpovídající jednotlivým krokům TGA křivky. První ztráta hmoty odpovídá eliminaci a odpaření
krystalické vody (1); druhý krok odpovídá rozkladu bezvodého šťavelanu vápenatého za tvorby CO
(2); a třetí krok odpovídá rozkladu uhličitanu vápenatého na oxid vápenatý a CO2 (3). Křivka iontu m/z
44 ukazuje, že se CO2 také tvoří ve druhém kroku při 550 °C (vedle CO). To je výsledek
disproporcionační reakce CO na CO2 a uhlík. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles
and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se
souhlasem Wiley-Blackwell)
4.6. Dynamická mechanická analýza (DMA)
Nedávný vývoj měřicích systémů, které umožnily jednoduché a účinné měření prášků, znamenal,
že různé metodiky dynamické mechanické analýzy (DMA) mohou nyní významně přispět k vývoji a
pochopení farmaceutických výrobků.
4.6.1. Definice dynamické mechanické analýzy
Dynamická mechanická analýza je technika pro měření tuhosti nebo tvrdost materiálu spolu
s aspekty viskosní povahy vzorku (McCrum et al. 1967). Tyto techniky jsou používány již mnoho let
k měření vlastností termoplastů a kompozitů a nyní s příchodem měřicích systémů umožňujících
analýzu prášků byly aplikace rozšířeny do farmaceutických laboratoří, kde mohou být prostudovány
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
93
fyzikální vlastnosti léčiv, zejména oblast skelného přechodu amorfních materiálů. To platí i pro
roztoky a materiály, které jsou kapalné při pokojové teplotě, protože mohou být vloženy do vhodné
nádoby a zmraženy v analyzátoru před samotným měřením.
4.6.2. Principy dynamické mechanické analýzy
Pokud jsou různé materiály natažené nebo ohnuté konstantní silou, je zřejmé, že čím bude
materiál měkčí, tím více se bude deformovat, a čím bude materiál tvrdší, tím méně bude
deformován. To je základ DMA. V podstatě je materiál deformován známou silou a měří se rozsah
deformace. Působící síla je popisována jako aplikovaná zátěž, kdy se bere do úvahy velikost a tvar
vzorku, a výsledná deformace je popisována jako zátěž vztažená na velikost a tvar vzorku. Zátěž
podělená deformací odpovídá tvrdosti vzorku, která se nazývá modul pružnosti materiálu.
Youngův modul pružnosti a Hookův zákon by měly být známé pojmy. Hookův zákon říká, že
deformace je úměrná zátěži, viz obrázek 4.12. Sklon křivky vypočtené jako podíl zátěže a deformace
odpovídá modulu pružnosti. Tento přístup lze označit jako statický test, protože je k dispozici
dostatek času k tomu, aby pružina dosáhla maximálního napnutí a setrvává v této pozici, zatímco je
prováděno měření. V DMA však síla působí na vzorek sinusoidním způsobem. Tento přístup spočívá
v měření frekvence, neboť se zvyšující se frekvencí má vzorek stále méně času na to, aby se
deformoval. To znamená, že čím vyšší je frekvence, tím vyšší je ve většině případů změřený modul
pružnosti. To je patrné zejména u viskosních materiálů, neboť čím viskosnější materiál, tím pomaleji
reaguje na aplikované změny síly. V sinusoidním systému může být tato zpožděná odezva měřena,
neboť se projevuje jako rozdíl fázového úhlu mezi aplikovanou zátěží a výslednou deformací. Tato
odezva se nazývá fázový úhel a obvykle se značí symbolem delta (δ), viz obrázek 4.13.
Obrázek 4.12 Efekt zvyšující se zátěže na pružinu ilustrující Hookův zákon.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
94
Obrázek 4.13 Ve viskoelastickém materiálu existuje zpoždění mezi aplikovanou zátěží a výslednou
deformací. Toto zpoždění je znázorněno jako fázový úhel delta (δ).
Prakticky všechny materiály jsou viskoelastické, což znamená, že mají viskosní a elastické
vlastnosti. Modul pružnosti měřený DMA je celkový modul pružnosti obsahující aspekty obou těchto
vlastností. Pokud je znám fázový úhel, může být modul pružnosti rozdělen na jednotlivé složky.
Vzhledem k tomu, že fázový úhel je jedna z hodnot naměřených v DMA, jsou získány tři hlavní křivky:

Paměťový modul pružnosti. Měří se tvrdost materiálu a křivka odpovídá odezvě vzorku ve
fázi nebo-li elastické odezvě. Pokud je získán z měření ohybu vzorku, vyjadřuje se jako
symbol E´ (primární E).

Ztrátový modul pružnosti. Měří se viskosní odezva materiálu. Křivka odpovídá odezvě
vzorku mimo fázi, nebo-li zjednodušeně viskosní odezvě. Pokud je získán z měření ohyb
vzorku, vyjadřuje se pomocí symbolu E´´ (sekundární E).

Tangens delta. Vyjadřuje poměr ztrátového modulu pružnosti k paměťovému modulu
pružnosti, což je tangenta k fázovému úhlu. Jak je vzorek zahříván přes skelný přechod a
jiné děje, Tangens delta (tan δ) nabývá maximálních hodnot a poskytuje tak snadno
odlišitelný pík.
Obrázek 4.14 ukazuje vztah těchto křivek. Celkový modul pružnosti je získán z DMA analýzy a
skládá se z paměťové a ztrátové složky. Klasický příklad DMA záznamu lze získat změřením
kompozitního materiálu jako je epoxid. V těchto materiálech může být těžké najít skelný přechod
pomocí DSC, ale při Tg se fyzikální vlastnosti mění enormně, což se odráží v DMA křivce. Příklad je
uveden na obrázku 4.15, kde bylo zjištěno, že se paměťový modul pružnosti výrazně snížil na
logaritmické stupnici a odpovídající píky se nacházejí v křivkách tan δ a ztrátového modulu pružnosti.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
95
Obrázek 4.14 Ukázka toho, jak je měření celkového modulu pružnosti (který je výsledkem
dynamického měření na DMA analyzátoru) rozděleno do ztrátové (viskosní nebo-li mimo fázové) a
paměťové (elastické nebo-li fázové) složky. Tangenta fázového úhlu delta (tan δ) nabývá maximálních
hodnot při mnoha přechodech a poskytuje tak snadno odlišitelný pík.
Obrázek 4.15 Typický příklad měření skelného přechodu. Je vidět, že se paměťový modul
pružnosti výrazně snížil na logaritmické stupnici a odpovídající píky se nacházejí v křivkách tan δ a
ztrátového modulu pružnosti. Pro skelné přechody je k dispozici řada různých výpočtů poskytujících
různé hodnoty. Výsledky je proto nejlepší uvádět i s metodou výpočtu.
Analýza prášků v praxi spočívá ve vložení vzorku do příslušné nádobky, ve které je prášek stlačen
ocelovým obalem (nebo podobným zařízením), viz obrázek 4.16. Nádobka je pak umístěna do
měřícího systému, například do jednoduchého nosníku, kde je jeden konec pevný a druhý je ohýbán.
Je aplikována deformační síla (zátěž) a je měřena výsledná amplituda (deformace).
Obrázek 4.16 Prášky mohou být vloženy do nádobky tak, jak je uvedeno. Uvedený příklad nádobky
je v podstatě ocelový plášť. Ten je pak vložen do DMA pracující v kmitajícím režimu. Do nádobky
mohou být také vloženy kapaliny a analýza je provedena po jejich zmražení.
Nejvíce DMA analýz je prováděno při frekvenci 1 Hz, pro kterou lze vybírat z různých materiálů pro
nádobky. Nicméně multifrekvenční skenování má navíc tu výhodu, že děj, jako je skelný přechod,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
96
který je frekvenčně závislý, může být odlišen od dějů tání nebo rekrystalizace, které frekvenčně
závislé nejsou. Na obrázku 4.17 je ukázán příklad, kde lze Tg sacharosy identifikovat z posunu teploty
jako funkce frekvence.
Obrázek 4.17 Sacharosa v nádobce při frekvenci 1 Hz (první pík) a 10 Hz (druhý pík). Vliv frekvence
na pík u 75 °C indikuje, že se jedná o skelný přechod. Vyšší teplotní přechody nejsou frekvenčně
závislé, a proto se pravděpodobně jedná a rekrystalizaci amorfní povahy. (Courtesy of Paul Royall,
2011)
Pomocí DMA může být také zjišťován vliv vlhkosti na chování vzorku. To vyžaduje použití
generátoru vlhkosti, který je připojen k DMA, a dále též použití vhodného propustného zapouzdření.
Například sacharosa na obrázku 4.17 byla vystavena prostředím s různou vlhkostí od suchého až po
prostředí s 50% relativní vlhkostí a byly pozorovány účinky na přechody. Bylo zjištěno, že s rostoucí
vlhkostí klesají teploty Tg a rekrystalizace (obrázek 4.18).
Obrázek 4.18 Vliv vlhkosi na sacharosu. Zvýšení vlhkosti z A (suché prostředí) na C (50% relativní
vlhkost) má vliv jak na Tg, tak na rekrystalizaci. (Courtesy of Paul Royall, 2011)
4.7. Zjištění chování pevných krystalických látek v průběhu tání
Snad nejčastější parametr získaný z DSC experimentu je bod tání testované sloučeniny. Bod tání
krystalické pevné látky je teplota, při které se změní skupenství z pevného na kapalné (pokud se
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
97
stanovuje teplota opačného přechodu, tj. ze skupenství kapalného do pevného, označuje se jako bod
tuhnutí). Během tání je měřena změna standardní entalpie (skupenské teplo tání), což je množství
tepelné energie, které musí být pohlceno nebo uvolněno jedním gramem látky, který přešel
z pevného skupenství do kapalného nebo naopak. U většiny látek jsou body tání a tuhnutí stejné,
například bod tání a bod tuhnutí rtuti je 234,32 K (-38,83 °C, -37,89 °F). Nicméně některé látky mají
různé teploty přechodů, například agar taje při teplotě 85 °C (185 °F) a tuhne od 32 do 40 °C (89,6 až
104 °F). V praxi vykazuje většina látek při ochlazení v DSC podchlazení (superpodchlazení), což činí
přesné měření teploty tuhnutí velmi obtížným. Z toho důvodu také neexistují žádné doporučené
standardy pro kalibraci DSC analyzátorů během ochlazování.
Z hlediska termodynamiky je změna Gibbsovy volné energie (G) při teplotě tání vzorku nulová,
protože jak entalpie (H), tak entropie (S) vzorku se zvyšují (H, S > 0). Tání nastává, když je Gibbsova
volná energie kapaliny menší než pevné látky.
4.7.1. Vyhodnocení přechodu bodu tání
Před provedením jakéhokoliv DSC pokusu je užitečné provést odpovídající termogravimetrickou
analýzu (TGA) s cílem určit přesný bod rozkladu. Překročení rozkladné teploty se v DSC nedoporučuje,
protože to může vést k chybným výsledkům v důsledku četných exotermních a endotermních dějů
spojených s přechodem. Také z praktického hlediska mohou vést možné kondenzace organických
těkavých látek ze vzorku ke kontaminaci DSC přístroje, což ovlivní následnou analýzu.
Vzhledem k charakteru měření při DSC experimentu bude vždy patrné rozšíření píku související
s jakoukoli změnou fáze. Teoreticky by mělo tání čistého monokrystalu při nekonečně pomalé
rychlosti skenování vést k píku, který je nekonečně úzký, ale k rozšíření píku dochází vlivem teplotních
gradientů, které se vyskytují napříč vzorkem. Teplotní gradienty jsou způsobeny časem potřebným
pro přenos energie vzorkem. Důsledkem toho je jediná přesná metoda měření bodu tání čistého
krystalického materiálu ta, ve které se extrapoluje začátek růstu teploty při začátku tání. Teplota
odpovídající hodnotě v maximu píku se bude lišit v závislosti na velikosti částic a hmotnosti vzorku a
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
98
neodpovídá skutečnému bodu tání. Pokud by se naopak začátek růstu teploty neměnil se změnami
těchto zmíněných parametrů a ani se změnami v rychlosti ohřevu, kalibrace byla provedena správně.
Pro určení začátku růstu teploty, je křivka extrapolována ze sklonu náběžné hrany píku na ose x.
Bod, ve kterém křivka protíná osu x je označován jako extrapolovaný začátek růstu teploty (obr. 4.1).
4.7.2. Určení bodu tání pro identifikaci vzorků
Stanovení bodu tání analyzované sloučeniny umožňuje tuto sloučeninu identifikovat (pokud jsou
k dispozici vhodné referenční standardy) a lze ho také použít k rozlišení mezi různými formami
(polymorfy) (Giron 1995), různými izomery (Briehl a Butenuth 1992) a různými solemi stejné
sloučeniny. To je mimořádně důležité v počátečních fázích vývoje produktů, protože polymorfy a sole
jedné sloučeniny mohou mít nejen různé body tání, ale také různé rychlosti rozpouštění, různé
„zdánlivé“ rozpustnosti a v některých případech i různou biologickou dostupnost (Kobayashi et al.
2000). Poznamenejme, že termodynamicky stabilnější polymorf může mít vyšší bod tání, ale není to
vždy pravda.
Diferenční skenovací kalorimetrie se ideálně hodí pro stanovení bodů tání, protože umožňuje
přímé měření nejen bodu tání, ale také skupenského tepla tání dané látky. Hodnoty entalpie jsou
získávány z plochy píku tání, jak je znázorněno na obrázku 4.1. Další výhodou použití DSC je, že
vyžaduje pouze malé množství materiálu (obvykle jen několik mg), což je výhodné především proto,
že v počáteční fázi vývoje farmaceutického produktu je k dispozici pouze velmi malé množství vzorku.
Poznamenejme, že pokud se používají pouze malá množství vzorku, pak jsou k měření hmotnosti
vzorku potřeba velmi přesné váhy, které by měly mít šest desetinných míst (tj. mikrogramová
úroveň).
Pro každou čistou sloučeninu je bod tání termodynamicky pevný bod, takže může být použit pro
identifikaci materiálu. Mnoho léčiv vykazuje polymorfismus (viz kapitola 4.6), kde každá krystalová
struktura má jiný bod tání. Proto měření bodu tání pomocí DSC v zásadě dává analytikovi schopnost
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
99
rozlišovat mezi různými krystalovými formami. To představuje jednu z největších aplikačních oblastí
pro termické analýzy ve farmaceutickém průmyslu, což je rozepsáno podrobněji v následující části.
4.8. Polymorfismus a termická analýza
Polymorfismus je vlastnost pevného materiálu existovat ve více než jedné formě nebo struktuře
krystalové mřížky. Polymorfismus může být potenciálně nalezen v každém krystalickém materiálu
včetně polymerů a kovů a odpovídá alotropii, která vypovídá o struktuře pevných látek (například
grafit a diamant jsou alotropy uhlíku). Spolu s polymorfismem je kompletní morfologie materiálu
popsána dalšími proměnnými, jako je krystalové uspořádání, amorfní frakce nebo krystalografické
vady.
V zásadě všechny organické molekuly existují ve více než jedné odlišné krystalové formě (tj.
polymorfu). Skutečnost je taková, že pro přibližně 70 % všech léků na trhu bylo prokázáno, že mohou
existovat ve více než jednom odlišném uspořádání bezvodé krystalické mřížky nebo odlišné
polymorfní formě (McCronův zákon říká, že každá látka má různé polymorfní formy a že obecně je
počet známých forem dané sloučeniny přímo úměrný času a penězům poskytnutým na výzkum této
látky). Ve skutečnosti moderní počítačové programy předpovídají možnost existence více
krystalových forem pro většinu léčiv, z nich jsou ale většinou objeveny pouze některé. Dříve se pojem
„polymorfní“ obecně používal k popisu krystalového uspořádání bezvodé formy krystalické látky, ale
polymorfismus, jak byl definován na Mezinárodní konferenci o harmonizaci (ICH) Guideline Q6A, viz
Eur. J. Pharmaceut. Sci. 6, suppl. 1 (August 1998): S18, nyní zahrnuje solvatační/hydratační produkty
a amorfní formy.
Když je z DSC získán profil tání polymorfního materiálu, je často zjištěno, že obsahuje řadu
endotermních píků odpovídajících tání různých krystalových forem, případně jsou odděleny
exotermními píky, jak roztátý materiál rekrystalizoval do stabilnější formy. Obrázky 4.22, 4.23b a 4.24
(popsané níže) jsou příklady tohoto typu chování. Někdy jsou teploty tání různých forem tak blízko
sebe, že jsou vidět jen jako raménka a nebo mohou být pozorovány neobvyklé tvary píků, jak se
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
100
jednotlivé děje překrývají, a proto je vhodné použít různé rychlosti skenování, aby se zjistilo, co se
děje. Výběr rychlosti skenování by měl vzít v úvahu požadované rozlišení, citlivost a kinetiku dějů.
Více informací o těchto možnostech je uvedeno v kapitole 4.2.6. Měly by být také změřeny TGA
analýzy pro potvrzení, zda nějaké endotermické píky odpovídají ztrátě hmotnosti a jsou tedy
výsledkem ztráty hmoty.
4.8.1. Význam polymorfismu ve farmaceutických aplikacích
Polymorfní formy léčivových substancí mohou mít různé chemické a fyzikální vlastnosti včetně
bodu tání, chemické reaktivity, zdánlivé rozpustnosti, rychlosti rozpouštění, optických a
mechanických vlastností, tlaku par a hustoty (Pirttimäki a Laine 1994; Bartolomei et al 1999;
Spartakov et al. 2002). Tyto vlastnosti mohou mít přímý dopad na výrobu léčivové substance a
léčivového přípravku, stejně jako na stabilitu léčivového produktu, rozpouštění, biologickou
dostupnost (BA) a bioekvivalenci (BE). Polymorfismus tak může ovlivňovat kvalitu, bezpečnost a
účinnost konečného složení léčivového přípravku, a proto musí být důsledně kontrolován a sledován
ve všech fázích procesu vývoje léku.
Když jsou léčivové látky vystaveny celé řadě výrobních procesů, jako je sušení, mletí, mikronizace,
vlhká granulace, sušení rozprašováním a zhutnění, mohou v závislosti na vzájemné stabilitě mezi
různými polymorfními formami procházet konverzní fází. Vzorky použité pro analýzu by proto neměly
být drceny nebo mlety před analýzou, protože to může změnit vzorek. Vystavení podmínkám
prostředí s různou vlhkostí a teplotou může také vyvolat polymorfní konverzi (např. vznik hydrátu
nebo změnu fáze pevné látky). Rozsah konverze obecně závisí na relativní stabilitě polymorfů,
kinetických bariérách fázové konverze a aplikovaném tlaku. Nicméně přeměnami fází se není nutno
obecně vážně zabývat za předpokladu, že dojde k trvalé přeměně, která je součástí validovaného
výrobního procesu, který je dobře popsán a kontrolován a kde byla prokázána BA/BE léčivového
přípravku.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
101
Nejvíce termodynamicky stabilní polymorfní formy léčivové látky jsou často vybrány během
vývoje z důvodu minimální možné konverze na jinou polymorfní formu a z důvodu její větší chemické
a fyzikální stability. Méně stabilní (metastabilní) forma může být vybrána z různých důvodů (včetně
zvýšení biologické dostupnosti), nicméně je třeba poznamenat, že tato forma je nestabilní s ohledem
na termodynamickou stabilitu a v závislosti na použitých podmínkách zpracování a skladování může
nastat přeměna na termodynamicky nejstabilnější polymorfní formu. Aby se zabránilo jakémukoli
nečekanému selhání v pozdní fázi výroby nebo při skladování kvůli polymorfní přeměně, je ve vývoji
většinou použita stabilní forma, která je obecně považována za nejvhodnější formu. V kapalných a
plynných stavech, se polymorfy stejné sloučeniny chovají stejně, protože historie krystalové mřížky
byla zcela odstraněna.
4.8.2. Termodynamické a kinetické aspekty polymorfismu:
enantiotropie a monotropie
Pokud je zjištěn polymorfismus v kterékoli sloučenině vybrané pro vývoj farmaceutických
produktů, je nezbytné získat přesné znalosti vztahů termodynamické stability mezi různými pevnými
fázemi, aby byl plně pochopen proces krystalizace a specifická stabilita pevné formy dané látky. Při
krystalizaci materiálu ze zvoleného rozpouštědla v závislosti na rozsahu přesycení a teplotních
křivkách rozpustnosti jednotlivých polymorfů nebo pseudopolymorfů, jsou obvykle první nukleační
krystaly kineticky preferovány nebo tvořeny metastabilně. Následně, jak je obnovena
termodynamická rovnováha v důsledku změn v rozpustnosti produktu při krystalizaci vzorku (tj.
roztok se stává méně nasycený nebo koncentrovaný), prochází pevný vzorek rozpouštědlem
zprostředkovanou fázovou konverzí do více stabilního stavu. Nicméně, v závislosti na faktorech, jako
je růst krystalů, teplota a rozpustnost, nemusí tato konverze nastat a metastabilní forma převáží
v pevné fázi. V případě enantiotropie se stabilní formy liší teplotou reverzibilní rovnováhy a za
použitých podmínek dojde ke konverzi na konkrétní formu. Termín monotropie se používá v případě
nevratného přechodu z jedné formy na druhou. Známý vztah mezi termodynamickými veličinami H
(entalpie), G (volná energie), S (entropie) a T (teplota), lze často jednoduše použít pro reprezentaci
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
102
rovnovážných stavů vynesením volné energie G jako funkce teploty pro každou formu. Pokud se obě
křivky protínají před bodem tání, jedná se o reverzibilitu, tj. enantiotropii, a pokud je tomu naopak,
jedná se o monotropii (obrázek 4.19).
Obrázek 4.19 Vztah mezi Gibbsovou energií (G) a teplotou pro dvě modifikace v případě
enantiotropické (reverzibilní) a monotropické (ireverzibilní) přeměny mezi formami. (Zdroj: Otisknuto
z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott,
Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
V případě monotropie je vždy forma s vyšším bodem tání termodynamicky stabilnější formou.
V případě enantiotropie má forma s nižším bodem tání vyšší skupenské teplo v porovnání s formou
s vyšším bodem tání a je termodynamicky stabilnější formou při teplotách pod bodem přechodu
(forma s vyšším bodem tání je termodynamicky stabilnější formou při teplotách nad bodem
přechodu). Vztah mezi entalpií tání dvou pevných fází A a B, HfA a HfB a skupenským teplem
přechodu, Ht, je:
Ht = HfA – HfB .
(4.1)
Bod přechodu může být měřen termickou analýzou, měřením rozpustnosti nebo kombinací
měření rozpustností a entalpií tání. Forma, která je termodynamicky stabilní při teplotě a tlaku
měření je ta, která má nejnižší volnou energii a zdánlivou rozpustnost. Pro každou modifikaci platí
následující rovnice:
log C = (–Hdiss + K) / (RT)
kde C je rozpustnost, R je univerzální plynová konstanta, T je teplota, Hdiss je rozpouštěcí teplo
(teplo rozpouštění) pro dané rozpouštědlo a K je konstanta. V případě enantiotropie mají obě formy
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
103
stejnou rozpustnost v bodě přeměny. Z měření DSC může být získán bod tání, entalpie tání a většinou
i bod přeměny. Vztahy mezi polymorfy lze nejlépe ukázat na grafech termodynamických veličin H
(entalpie) a G (volná energie). Obrázky 4.20 a 4.21 ukazují tyto grafy a DSC křivky, které lze získat
analýzou monotropních nebo enantiotropních látek ve stabilním nebo metastabilním stavu. Tabulka
4.1 je přehledem termodynamických pravidel stanovených Burgerem a Ramburgerem (1979) pro
snadné odlišení mezi monotropními a enantiotropními přechody.
Obrázek 4.20 Energetické diagramy znázorňující H (entalpii tání) a G (volnou energii) pro
monotropní polymorfismus a odpovídající DSC křivky: TAf je teplota tání A; TBf je teplota tání B. DSC
skeny: A) forma A s vyšším termodynamickým bodem tání taje; B) forma s nižší teplotou tání
podstupuje exotermický přechod na A; C) B taje a A krystalizuje z taveniny, pak A taje. (Zdroj:
Obrázek 4.21 Energetické diagramy znázorňující H (entalpii tání) a G (volnou energii) pro
enantiotropní polymorfismus a odpovídající DSC křivky: T0 je teplota přechodu A na B; TAf je teplota
tání A; TBf je teplota tání B. DSC skeny: A) endotermní přechod pevné látky na B, pak A nebo B taje a
eventuálně B krystalizuje z taveniny; B) záznam je naměřen při pokojové teplotě, při které nastává
spontánní exotermní přechod na A nebo tání B. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M.,
Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008)
se souhlasem Wiley-Blackwell)
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
104
Tabulka Termodynamická pravidla pro polymorfní přechody (Burger and Ramburger 1979). I je
forma s vyšší teplotou tání. V některých případech bylo prokázáno, že tato pravidla neplatí, proto je
není možné brát jako všeobecně platná pravidla.
Enantiotropie
Monotropie
teplota přechodu < teplota tání I
teplota přechodu > teplota tání I
I je stabilní nad teplotou přechodu
I je vždy stabilní
II je stabilní pod teplotou přechodu
přechod je reverzibilní
přechod je ireverzibilní
pod teplotou přechodu je rozpustnost I větší než rozpustnost II
rozpustnost I je vždy menší než II
nad teplotou přechodu je rozpustnost I menší než rozpustnost II
přechod II  I je endotermní
přechod II  I je endotermní
HfI < HfII
HfI > HfII
hustota I < hustota II
hustota I > hustota II
4.8.3. Charakterizace polymorfů pomocí diferenční skenovací
kalorimetrie (DSC)
Existuje celá řada metod, které mohou být použity pro charakterizaci polymorfů léčivové látky.
Prokázání neekvivalentní struktury pomocí rentgenové difrakce jednoho krystalu (Cox a Wardell
2000) je v současnosti považováno za jednoznačný důkaz polymorfismu. Pro potvrzení existence
polymorfů může být také použita X-ray prášková difrakce. Kromě toho jsou ale dále vyžadovány údaje
získané z řady dalších doplňkových metod včetně mikroskopie za zvýšené teploty, spektroskopie,
například infračervené (IR), Ramanovy (Pratiwi et al. 2002), nukleární magnetické rezonance v pevné
fázi (ssNMR) (Vickery et al. 2002) a metod termické analýzy, především DSC.
V literatuře existuje mnoho příkladů studií s použitím DSC jako metody pro predikci přítomnosti
polymorfních sloučenin (Bottom 1999). Nedávným příkladem je karbamazepin, léčivo používané
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
105
k léčbě epilepsie. Pomocí DSC bylo úspěšně prokázáno, že existují tři odlišné polymorfy
karbamazepinu. Toto zjištění bylo podpořeno výsledky experimentů z FT-IR a práškové rentgenové
difrakce (XRPD) (Rustichelli et al. 2000). Nicméně, i když se DSC osvědčilo při zjišťování přítomnosti
několika polymorfů měřením rozdílů v bodech tání, není vždy možné charakterizovat formy
sloučeniny mající nižší bod tání (metastabilní látky). To proto, že materiál během tání často
spontánně rekrystalizuje do více stabilních forem. Výsledkem tohoto děje je konkurenční exotermní
odezva během endotermního tání (příklad je uveden na obrázku 4.22). Při rychlostech zahřívání
používaných v běžných DSC experimentech (obvykle kolem 10 °C/min) forma karbamazepinu III taje a
rekrystalizuje současně, takže píky nejsou odděleny. V tomto případě nelze přesně změřit skupenské
teplo a ani rekrystalizační teplo. Tento děj pokračuje táním nové stabilnější formy. Je třeba
poznamenat, že tato stabilnější forma nemusí být nutně termodynamicky stabilní formou materiálu.
Jsou také metody využívající isotermickou kalorimetrii, která tyto informace poskytuje (Sturtevant
1987; Chowdrhy a Cole 1989; Wiseman et al. 1989; Noble 1995).
Obrázek 4.22 Typické polymorfní chování, jak je patrné z DSC. Počáteční krystalová forma taje při
zahřívání (asi 175 °C) a poskytuje počáteční endotermu a rekrystalizuje do druhé formy, která
poskytuje exotermu. Tato forma pak taje při vyšší teplotě. Je pravděpodobné, že píky tání původní
formy a následné krystalizace nejsou zcela odděleny, takže v tomto případě nejsou možná měření
energie těchto dějů. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of
Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
Skutečnost, že jsou na obr. 4.22 pozorovány dva píky oddělené exotermou, je užitečná informace
a křivky mohou být snadno interpretovány. Až příliš často se stává, že separace píku, jenž přísluší tání,
není tak velká a je pozorován pouze jeden pík s raménkem indukující, že dochází k více než jednomu
ději tání. Příkladem je pík odpovídající tání při vyšší teplotě v obrázku 4.22. Další příklad je uveden na
obrázku 4.23a, kde může být pozorován velmi malý pík na konci hlavního píku odpovídajícího tání.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
106
Chcete-li zjistit další informace o tom, co se děje, je vhodné měnit rychlost skenování. Na obrázku
4.23b je stejný vzorek analyzován při rychlosti skenování snížené z 10 °C/min na 3 °C/min. Děje jsou
nyní zřetelnější, protože je vidět, že jedna forma přechází na druhou formu. Přítomnost exotermy je
jasným důkazem rekrystalizace. Další snižování rychlosti skenování může být také užitečné, často se
používají různé rychlosti skenování k snadnější interpretaci probíhajících dějů.
Obrázek 4.23a V tomto příkladu se profil tání nevrací úplně na základní linii, což svědčí o možnosti
přechodu v oblasti nad 110 °C. Tento předpoklad může být potvrzen snížením rychlosti skenování.
Obrázek 4.23b Při snížené rychlosti skenování může být pozorováno oddělení dějů. Počáteční
forma taje a rekrystalizuje a výsledná forma taje při trochu vyšší teplotě. Rozlišit tyto děje může být
často výzvou. Pomalejší rychlosti ohřívání a zmenšení hmotnosti vzorku pomáhají zlepšit rozlišení.
V některých případech mohou vyšší rychlosti zahřívání úplně zamezit rekrystalizaci, což umožňuje
změřit skupenské teplo počátečního tání (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and
Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem
Wiley-Blackwell)
Neobvyklé tvary píků mohou být také způsobeny špatným provedením analýzy. Například jestliže
vzorek změní objem během tání, změny v teplotním kontaktu mohou vyvolat změnu tvaru píku.
Z tohoto důvodu je obecně užitečné zkoumat jev tání na relativně malých vzorcích, typicky kolem 3
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
107
mg, které byly dobře komprimované v pánvičce, aby umožňovaly dobrý tepelný kontakt. Existuje-li
pochybnost o naměřené křivce, je nejlepší měření zopakovat.
4.8.4. Zjišťování polymorfní čistoty pomocí diferenční skenovací
kalorimetrie
Rekrystalizační chování pozorované při relativně nízkých rychlost skenování má vliv na schopnost
charakterizovat materiál umístěný v pánvičce, protože pozorované změny v materiálu ovlivňují
měření. Konkrétně, polymorfní čistotu daného vzorku není možné určit ze skupenské entalpie
metastabilního stavu a ani z měření píků odpovídajících tání při vyšší teplotě, protože se mohou, ale
nemusí, tvořit během skenování. Pokud se vrátíme k příkladu karbamazepinu popsaného na obrázku
4.22, kvantifikace skupenské entalpie čisté formy III nebyla možná z důvodu současné rekrystalizace
této formy z kapaliny tající na více termodynamicky stabilní formu I (při pomalé rychlosti skenování
(5–10 °C/min)). Až donedávna nebylo pro tuto metastabilní formu stanoveno správné skupenské
teplo. Tento typ měření však může být proveden s použitím velmi velkých rychlostí skenování (až
750 °C/min), které jsou u některých zařízení dostupné (Gabbott et al. 2003). Při vyšších rychlostech
skenování nemá vzorek potřebný čas k rekrystalizaci na formu tající při vyšší teplotě, a proto mohou
být provedena kvantitativní měření skupenské entalpie pro formu tající při nižší teplotě.
Vysokorychlostní DSC metody (Hyper™) byly použity ke studiu karbamazepinu a bylo ukázáno, že při
zvýšení rychlosti skenování byla rekrystalizace na formu I (termodynamicky stabilní stav) inhibována
(McGregor et al. 2004). Obrázek 4.24 ukazuje, že i při 250 °C/min vzorek stále rekrystalizuje a tvoří
formu s vyšší teplotou tání, zatímco obrázek 4.25 ukazuje, že při rychlosti skenování 500 °C/min je
tento rekrystalizační přechod úplně potlačen (pro přehlednost je ukázána endoterma tání pro
metastabilní formu).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
108
Obrázek 4.24 Efekt zvýšené rychlosti skenování z 20 °C/min na 250 °C/min na tání karbamazepinu
III. Při zvýšené rychlosti skenování je méně času na rekrystalizaci a pík počátečního tání se zvyšuje a
pík koncového tání se proporčně zmenšuje. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles
Obrázek 4.25 Pouze při vysoké rychlosti skenování 500 °C/min je počáteční profil tání
karbamazepinu bez následných dějů tání, což indikuje, že rekrystalizace byla plně potlačena. (Zdroj:
Při inhibici rekrystalizace formy III na formu I bylo ukázáno, že je možné vypočítat skupenskou
entalpii přímo z kalorimetrických dat. Naměřená hodnota 109,5 J/g by mohla být určena pouze
z normálních DSC experimentů. Je třeba však poznamenat, že použitím podmínek rychlého skenování
není možné v některých případech přechodu předejít (kvůli rychlé kinetice krystalizačních přechodů).
Přesná kvantifikace je důležitá, pokud v léčivových materiálech existují polymorfní nečistoty jako
samostatné krystalické fáze ve stopových množstvích. Znečištění léčivového materiálu jeho možnou
metastabilní polymorfní formou, která se může objevit při nekontrolované precipitaci nebo
neoptimalizované krystalizaci, zjemňování/mletí nebo jakékoliv jiné formě mechanických úprav, je
vážný problém, protože přítomnost takové polymorfní nečistoty by mohla ohrozit i stabilitu a
účinnost konečných produktů. S cílem omezit tyto nežádoucí pevné nečistoty ve farmaceutických
materiálech se stala důležitým tématem přesná kvantifikace stopových množství těchto nečistot
existujících jako samostatné krystalické fáze. Nejpoužívanější metody pro charakterizaci pevné fáze,
jako je rentgenové práškové difrakce (pXRD), infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací
(FTIR) a spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR), ale nejsou obvykle dostatečně citlivé pro
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
109
detekci relativně nízkých koncentrací (< 5 %) polymorfních nečistot. Měření polymorfní čistoty
pomocí DSC použitím pomalé rychlosti skenování také není bez problémů, viz výše.
McGregor a kol. (2004) použili DSC s vysokou rychlostí skenování pro stanovení polymorfní čistoty
směsných systémů, které obsahovaly množství metastabilních forem, o kterých je známo, že
podstupují současně tání i rekrystalizaci při malých rychlostech skenování, typicky 10 °C/min. Směsi
obsahující známé poměry forem karbamazepinu I a III (0-100 % w/w) byly analyzovány s rychlostí
skenování 250 °C/min a pro každou směs byly vypočítány entalpie endoterm tání.
Obrázek 4.26 ukazuje typický teplotní profil získaný ze směsi obsahující 40 % a 60 % w/w) formy
III. Zřetelně jsou detekovány endotermické přechody tání obou forem I a III a bylo dosaženo úplného
rozlišení mezi dvěma přechody. U směsí, které obsahují i jen 1 % (w/w) formy III, byla také zjištěna
endoterma tání. Když byl stejný vzorek analyzován při rychlosti skenování 10 °C/min, nebyla tato
endoterma tání detekována, což ukazuje na užitečnost vysokorychlostního DSC pro detekci malých
množství polymorfních nečistot, které by jinak nemohly být zjištěny.
Obrázek 4.26 DSC křivky směsí forem I a III karbamazepinu skenované při 250 °C/min. Tání malého
množství krystalické látky může být obtížně detekováno při nízkých rychlostech, ale je snadné ho najít
při vyšších rychlostech skenování, při kterých mohou být změřena i 1% množství. (Zdroj: Otisknuto
Graf naměřené entalpie endotermního přechodu v závislosti na procentuálním obsahu formy III ve
směsi je na obrázku 4.27. Pro srovnání je zahrnuta teoretická entalpie endotermního přechodu na
procentuálním obsahu formy III. Teoretické entalpie byly vypočteny z entalpie endotermního
přechodu čisté formy III a z množství formy III ve směsi.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
110
Obrázek 4.27 Změřené entalpie tání karbamazepinové formy III jsou porovnány s teoretickými
hodnotami pro různé složení směsi. Změřené hodnoty jsou výrazně nižší než očekávané, což vede
k domněnce, že probíhají interakce mezi polymorfy. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M.,
Pro naměřené entalpie endotermního tání pro formu III ve směsi dvou krystalových forem bylo
zjištěno, že jsou výrazně nižší oproti vypočteným hodnotám v celém rozsahu od 1 do 99 % (w/w) pro
formu III. Bylo již ukázáno, že při rychlosti ohřevu 250 °C/min je nezbytná úplná inhibice
rekrystalizace formy I při tání formy III. Nicméně bylo předpokládáno, že přítomnost formy I ve směsi
před analýzou má za následek krystalizaci formy I a částečnou rekrystalizaci formy III, která při tání
tvoří formu I. To potvrzují i naměřené entalpie endoterm tání pro formu I. Jak je ukázáno na obrázku
4.28, rekrystalizace formy s nižší teplotou tání vedla k relativnímu zvýšení entalpie endotermického
přechodu pro formu I vzhledem k teoretickým hodnotám. Například entalpie při 99 % (w/w) byla
162,5 J/g v porovnání s vypočtenou hodnotou 107,7 J/g. Entalpie endotermního přechodu pro čistou
formu I měřená při rychlosti ohřevu 250 °C/min byla, jak se očekávalo, srovnatelná s měřením při
10 °C/min. Teoretické entalpie byly vypočteny z této hodnoty a množství formy I ve směsi.
Obrázek 4.28 Změřené entalpie tání karbamazepinu formy I jsou porovnány s teoretickými
hodnotami. Naměřené hodnoty jsou vyšší než očekávané a korelují s nižšími hodnotami zjištěnými
pro formu III na bázi interakcí mezi krystalovými formami, viz obrázek 4.27. (Zdroj: Otisknuto z P.
Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
111
Když byly různé polymorfy fyzicky separovány v pánvičce tak, aby spolu nemohly vzájemně
interagovat, byly získány údaje uvedené na obrázku 4.29, který srovnává naměřenou a teoretickou
entalpii pro endotermní přechod jako funkci obsahu formy III.
Obrázek 4.29 Změřené entalpie tání karbamazepinu formy III jsou porovnány s teoretickými
hodnotami pro směs karbamazepinu formy III a karbamazepinu formy I. V tomto experimentu byly
jednotlivé polymorfy fyzicky separovány tak, aby spolu nemohly vzájemně interagovat. Fakt, že
naměřené a teoretické hodnoty jsou totožné (po zmíněné separaci), indikuje, že dochází k interakci,
když jsou látky ve vzájemném kontaktu. To bylo potvrzeno předchozími experimenty. (Zdroj:
Z obrázku 4.29 lze vidět, že zde nejsou významné rozdíly mezi změřenou entalpií endoterm tání a
vypočtenými teoretickými hodnotami, což indikuje, že nedochází k interakci a ani k částečné
krystalizaci formy I při tání formy III.
Tyto výsledky ukazují, že pomocí DSC s rychlostí zahřívání 500 °C/min je rekrystalizace formy III
karbamazepinu inhibována, a proto je pro tento polymorf pozorována jedna endoterma tání, což
umožňuje určení termodynamických parametrů, jako je skupenská entalpie metastabilního
endotermního tání. Endoterma tání související s formou III byla zjištěna dokonce i při 1 % (w/w), a
proto je třeba při kvantifikaci směsí pracovat pečlivě, protože interakce mezi formami mohou ovlivnit
výsledky.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
112
4.8.5. Interpretace naměřených DSC termogramů vzorků vykazujících
polymorfismus
Tato část stručně pojednává o některých typech DSC křivek, které lze získat při zkoumání
polymorfních tendencí složek léčiv a také vysvětluje některá omezení při používání DSC ke studiu
polymorfního chování.
Při měření je důležité se přesvědčit, že nedochází ke ztrátě hmoty v měřícím rozsahu teplot
přechodu, což lze zjistit z příslušné TGA křivky, a tak zajistit, že odezva není kvůli
desolvataci/dehydrataci, ale kvůli tání metastabilního polymorfu. Z tohoto důvodu by měly být
rutinně prováděny TGA skeny látek. Ty také indikují teplotu rozkladu látek a horní teplotní mez DSC
měření by měla být nastavena pod tuto hodnotu, aby se zabránilo kontaminaci.
4.8.5.1. Křivky typu 1: Přechod pevná látka-pevná látka
Obrázek 4.30 ukazuje DSC křivku vzorku podstupující nízkoteplotní, endotermický přechod pevná
látka-pevná látka (při asi 25 °C).
Obrázek 4.30 DSC křivka vzorku podstupujícího endotermický přechod pevná látka-pevná látka při
asi 25 °C. Na TGA křivce by neměla být odpovídající ztráta hmoty a děj by měl být reverzibilní. Pro
transformaci pevná látka-pevná látka je tento přechod exotermní pro monotropii a endotermní pro
enantiotropii. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal
Z DSC křivky ukázané na obrázku 4.30 je vidět, že nízkoteplotní přechod pevná látka-pevná látka
nastává před hlavní endotermou odpovídající formě tání. Tento přechod může být odlišen od
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
113
nízkoteplotního desolvatačního procesu, protože pomocí TGA není detekována ztráta hmoty a
přechod je reverzibilní (tj. při ochlazování bude také detekován opačný přechod). Buergerova
Rambergerova pravidla naznačují, že pro transformace pevná látka-pevná látka je tento přechod
exotermní pro monotropii a endotermní pro enantiotropii. Prakticky to závisí na rozsahu entropie a
entalpie příslušného polymorfu při teplotě, při které je pozorován přechod.
4.8.5.2. Křivky typu 2: Rekrystalizace kapalina-tavenina
Tento typ se týká materiálů, jako je již zmíněný karbamazepin, které při tání rekrystalizují do
stabilnější formy, která pak taje při vyšší teplotě. Toto klasické polymorfní chování bylo pozorováno
pomocí DSC, viz obrázek 4.21.
Takový DSC sken může odpovídat jak monotropii, tak enantiotropii, přičemž vzorek je buď v čisté
formě, nebo ve směsi. Rychlé skenování může kineticky skrýt tuto transformaci a lze tak získat
podrobné informace o aktuálním složení vzorku. Experimenty by měly být prováděny na známé, čisté,
nízkotající látce, aby se zjistilo, zda je tato inhibice rekrystalizace možná při rychlém zahřívání.
4.8.5.3. Křivky typu 3: Zjišťování bodu tání
Každá krystalická modifikace má pík tání a není vidět konverze mezi jednotlivými formami.
V souvislosti s termodynamickou stabilitou při pokojové teplotě nemůže být učiněn žádný závěr,
výpočtem skupenské entalpie každého přechodu však lze získat informace týkající se čistoty vzorků
obsahujících směs forem a lze tak spočítat vlastnosti čistých složek.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
114
4.9. Solváty a hydráty (pseudopolymorfismus) a termická analýza
V roce 1965 Walter C. McCrone představil pojem „pseudopolymorfismus“ (McCrone 1965). Podle
jeho definice, pseudopolymorfní účinky zahrnovaly desolvataci/dehydrataci produktů, přechody
druhého řádu a dynamický izomerismus, ale dnes je termín obecně omezen na všechny jevy spojené
se solvatací a hydratací. Jakákoli látka používaná ve farmaceutickém průmyslu má schopnost tvořit
tzv. krystalické hydráty nebo solváty. V těchto strukturách nejsou těkavé látky (buď voda, nebo
rozpouštědlo) jen fyzicky sorbovány na rozhraní pevná látka-vzduch, ale jsou také začleněny do
struktury krystalové mřížky (chemisorbovány) jako hostující molekuly, a to buď ve stechiometrických,
nebo nestechiometrických množstvích. Zjišťování solvatačních stavů pro farmaceutický vývoj je třeba
věnovat pečlivou pozornost, protože přítomná krystalická rozpouštědla jsou klasifikována jako
nečistota ve vzorku a denní dávky tohoto specifického rozpouštědla by neměly překročit limity, jež
jsou stanoveny v pokynech FDA (ICH Topic Q 3C (R3) Nečistoty: zbytková rozpouštědla).
4.9.1. Faktory ovlivňující experimentální DSC křivky hydrátů a
solvátů
Je důležité zvolit správný typ DSC pánvičky. Všimněte si, že je to ztráta těkavých látek (ztráta
hmotnosti) z pánvičky, která vede ke vzniku velkého endotermního píku pozorovaného při zahřívání
rozpouštědel v otevřené pánvičce, což odráží skutečnost, že odpařování materiálu vyžaduje značné
energetické vstupy. Proto při zkoumání pseudopolymorfního chování pomocí DSC je třeba si
uvědomit, že volba pánvičky může výrazně ovlivnit získanou křivku.
S hermeticky uzavřenými pánvičkami je vzorek uzavřen v systému tak, aby těkavé látky nemohly
uniknout a zůstaly v horním prostoru pánvičky i po odstranění vzorku. V tomto typu pánvičky může
být pozorován pík tání rozpouštědla, ale ne ztráta těkavých látek.
Pokud je vytvořena malá dírka v krytu pánvičky nebo pokud je použita zvlněná nebo otevřená
pánvička, pak mohou těkavé látky uniknout, ale tvar DSC křivky a vývoj teploty bude záviset na
rychlosti úniku těkavých látek, která závisí na rozsahu zvlnění nebo velikosti otvoru vytvořeného
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
115
v krytu pánvičky spolu s experimentálními podmínkami, jako je rychlost ohřevu a velikost vzorku.
Výsledkem je, že získané údaje nemusí být dobře reprodukovatelné. V některých případech může
docházet jak k tání rozpouštědla, tak k desolvataci v pevném skupenství, což vede ke dvěma
endotermním píkům.
Obrázek 4.31 ukazuje vliv typu pánvičky na analýzu síranu měďnatého. Pokud je použita otevřená
nebo zvlněná pánvička, aby mohly těkavé látky snadno uniknout, jsou pozorovány dva široké, špatně
rozlišitelné píky, protože se voda snadno uvolní ze vzorku a unikne z pánvičky. Použití zvlněné
pánvičky může způsobit různé výsledky, protože se rozsah zvlnění může lišit pro každou pánvičku, což
ovlivňuje rychlost ztráty těkavých látek. Pokud je ale spolu s pánvičkou použit kryt s otvorem 50 m,
jsou pozorovány série ostřejších, reprodukovatelnějších a lépe rozlišených píků trochu posunutých
k vyšší teplotě. V tomto případě se voda neztratila z pánvičky, dokud nedosáhla potřebný tlak k tomu,
aby unikla skrz velmi malou dírku ve víčku. V případě čistého rozpouštědla toto nastane, když
parciální tlak par přesáhne atmosférický tlak, což je definice bodu varu, takže tento přístup umožňuje
stanovit bod varu kapalin. Je-li vzorek hermeticky uzavřen v pánvičce (uzavřený systém), nemůže být
rozpouštědlo odstraněno a jsou pozorovány pouze fázové změny.
Obrázek 4.31 Vliv typu pánvičky na DSC křivky síranu měďnatého. Spodní křivka ukazuje typický
záznam ze zvlněné pánvičky, odkud mohou těkavé látky snadno uniknout. Horní křivka ukazuje
pánvičku s pouze 50 m otvorem, kterým mohou těkavé látky uniknout. To poskytuje podrobnější a
reprodukovatelnější informace než z otevřené nebo zvlněné pánvičky. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott,
Když je použita uzavřená pánvička, je třeba se ujistit, že je schopna odolávat vnitřnímu
generovanému tlaku, a postarat se o to, aby byla správně uzavřena. Pokud pánvička nevydrží
vznikající tlak, může se protrhnout a může způsobit vážné znečištění přístroje. Také si všimněte, že
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
116
přítomnost rozpouštědla nebo vody jako páry kolem krystalu v atmosféře pánvičky může umožnit
vznik metastabilních forem bez rozpouštědla (v důsledku difúze par rozpouštědla do pevné fáze a
výsledné rozpouštědlem indukované transformace pevná látka-pevná látka) a také amorfního stavu.
Při provádění pokusů na DSC solvatovaných/hydratovaných sloučeninách se může termogram DSC
často stát poměrně složitým kvůli mnoha dějům, které mohou probíhat. K interpretaci je nezbytné
provést odpovídající TGA experiment tak, aby byl potvrzen teplotní rozsah ztráty těkavých látek.
Důležité může být také zvýšení průtoku plynu, aby se odstranily těkavé látky ze systému. Velké
množství uniklých těkavých látek může změnit atmosféru obklopující vzorek nebo pec a způsobit
artefakty v důsledku změny tepelné vodivosti.
4.9.2. Typy desolvatace/dehydratace v termické analýze
Tato část stručně pojednává o některých typech DSC křivek, které mohou být získány při zkoumání
solvátů a hydrátů a také vysvětluje některé z faktorů, které mohou být zodpovědné za mylné
interpretace dat.
4.9.2.1. Křivky typu 1: Dehydratace/desolvatace bez
rekrystalizace
Experimentální DSC křivky typu 1 jsou běžné ve vzorcích, které buď existují jako kanálková
hydrátová/solvátová struktura (tj. těkavé látky jsou zkondenzovány v kapilárách nebo kanálcích
uvnitř struktury) nebo ve vzorcích, u kterých dochází k dehydrataci/desolvataci za vzniku
desolvatované/dehydratované mřížkové struktury a které zůstávají termodynamicky stabilní
(nedochází ke spontánní rekrystalizaci na termodynamicky výhodnější bezvodé mřížkové uspořádání).
Obrázek 4.32 ukazuje typickou DSC křivku získanou pro hydratovanou sloučeninu vykazující tento
druh chování.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
117
Obrázek 4.32 V tomto příkladu je první pík při 150 °C důsledkem ztráty těkavých látek (hydrátu) a
pík při vyšší teplotě odpovídá tání krystalové struktury. Tento výsledek je potvrzen TGA, viz obrázek
4.33. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal Analysis,
edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem Wiley-Blackwell)
V DSC křivce znázorněné na obrázku 4.32 odpovídá první endotermický pík termické desorpci
molekul vody, které tvoří krystalickou hydratovanou formu. Na odpovídající TGA křivce uvedené na
obrázku 4.33 je vidět profil ztráty hmoty zaznamenaný během tohoto rozsahu teplot, který odpovídá
desorpci těkavých látek ze vzorku a následného odpaření z pánvičky. Poloha a energie tohoto
endotermického píku závisí na fázovém diagramu dvou složek, léčivové látky a přítomného
rozpouštědla, jakož i na stabilitě vytvořené směsi. Z tohoto důvodu mohou různé hydráty nebo
solváty stejné sloučeniny nebo sérií sloučenin ztratit přítomné těkavé látky při různých teplotách.
Obecně, pokud je vzorek pouze mokrý (vlhký), pak je získána široká endoterma typicky kolem 60 °C
až 70 °C, která se stává ostřejší a je posunuta k vyšším teplotám, pokud je ztráta těkavých látek
omezena v důsledku navázání na vzorek.
Obrázek 4.33 Překryv DSC dat obrázku 4.32 s TGA daty. Ztráta hydrátu je jasně identifikována.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
118
4.9.2.2. Křivky typu 2: Dehydratace/desolvatace
provázená rekrystalizací
U mnoha hydrátů a solvátů je hostující molekula začleněna do buněčné jednotky mřížkového
uspořádání a má stabilizační účinek na krystalickou strukturu. Během tání nebo krátce po tání
hydratovaného/solvatovaného stavu pak dochází k dehydratačnímu nebo desolvatačnímu procesu
(obrázek 4.34). V takových případech nejprve hydrát/solvát taje a rozpouštědlo je eliminováno
z kapalné fáze. Následný exotermický přechod nastává v důsledku krystalizace bezrozpouštědlové
formy z taveniny do stabilnějšího bezvodého uspořádání. V tomto případě se překrývá tání
rozpouštědla a desolvatace pevné fáze a následný vyšší endotermický přechod je výsledkem tání
bezvodé formy. Je také možné, že je molekula vypuzena z krystalové struktury, a tak ji destabilizuje.
Výsledná destabilizovaná struktura je pak náchylná k přeuspořádání ve velmi rychlém procesu, viz
obrázek 4.35.
Obrázek 4.34 DSC a TG skeny látky, ve kterých se překrývají dehydratační děj a tání a bezvodá
forma ihned krystalizuje z taveniny. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and
Applications of Thermal Analysis, edited by Paul Gabbott, Blackwell. Copyright (2008) se souhlasem
Wiley-Blackwell)
Obrázek 4.35 Příklad dehydratace bez tání vedoucí k následné extrémně rychlé rekrystalizaci
pevného stavu. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
119
4.10.
Spřažená emisní termogravimetrická analýza (EGA) a
simultánní měření
Během standardního TGA experimentu je hmotnost vzorku zaznamenávána jako funkce teploty
nebo času za definovaných atmosférických podmínek a může být porovnána s výsledky získanými pro
odpovídající DSC experiment. To umožňuje provádět kvantitativní analýzy složení za předpokladu, že
uvolněné látky, které jsou tepelně desorbovány ze vzorku, jsou známy před analýzou. Vzhledem
k tomu, že TGA je kvantitativní technika a ne kvalitativní technika, nemůže být použita k identifikaci
neznámých těkavých látek.
Emisní termoanalýza (EGA) je metoda, která dává kvalitativní informace, což umožňuje
identifikovat produkované těkavé látky. To je často významné, protože mnohokrát uživatel
předpokládá, že se může uvolňovat vlhkost nebo jiné očekávané těkavé látky, ale v praxi je to jen
předpoklad nebo odhad. Jindy to může pomoci identifikovat simultánní reakce (Sorrenti et al. 1998;
Fang et al. 2006). Příklad připojení TGA k vyhřívané lince určené pro připojení k hmotnostnímu
spektrometru je uveden na obrázku 4.36.
Obrázek 4.36 TG-MS termostatované spojení. Hmotnostní spektrometr čerpá těkavé látky ze
vzorku přes malou vyhřívanou kapiláru umístěnou vedle TGA pece. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott,
Pro EGA lze použít dva různé přístupy. V nejpopulárnějším přístupu jsou dvě analytické metody
spojeny za vzniku hybridního přístroje a látky jsou zkoumány v reálném čase. Příkladem jsou TG-FTIR
nebo TG-MS analýzy, ve kterých lze těkavé produkty, které se uvolňují během zahřívání, sledovat
současně druhým analyzátorem. Druhý (méně používaný) přístup je kombinovaná analytická
technika, kde jsou těkavé látky absorbovány na vhodné médium (typicky chromatografickou
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
120
trubičku) a pak desorbovány na příslušný analyzátor, čímž vzniká technika TGGC-FTIR nebo podobná.
GC krok může být vybrán, aby byl selektivní, a lze se tak zaměřit na konkrétní analýzu.
Výběr systému pro emisní termoanalýzu může být ovlivněn zkušenostmi uživatele. Zkušený FTIR
spektroskopista shledá obvykle FTIR spektra snadněji řešitelnými a zkušený hmotnostní
spektrometrista shledá obvykle MS data jednodušší k řešení. Ačkoli může být FTIR užitečnější, když
jsou produkovány velmi komplexní molekuly jako výsledek rozkladu polymerního produktu, a MS
naproti tomu může být užitečnější, když jsou produkovány jednodušší molekuly, jako je rozpouštědlo
z farmaceutik, což znamená, že tento typ systému převládá ve farmaceutickém průmyslu.
Většina TG-MS systémů profituje z použití helia při proplachování, neboť to umožňuje měřit
hmotnost 28. Na počátku měření v heliu je potřeba vyčkat krátkou dobu, než je vzduch v peci
nahrazen heliem a je vytvořena stabilní atmosféra. Je třeba si ale uvědomit, že ne všechny těkavé
látky uvolněné ze vzorku budou v tomto kroku monitorovány, a proto může být užitečné analyzovat
vzorek od počátku analýzy, před stabilizací, a pak znovu opakovat měření po stabilizaci v heliu. Je
třeba vzít na vědomí různé vlivy vztlaku vzduchu a helia, takže lze také předpokládat posun
v zaznamenané hmotnosti v průběhu počátečního ustalování rovnováhy.
Příklad křivky ztráty hmoty překryté různými křivkami detekcí iontů je ukázán na obrázku 4.37 a
naznačuje, že se spolu může uvolňovat řada různých molekul.
Obrázek 4.37 Příklad křivky získané použitím TG-MS. Ztráta hmoty je zobrazena jako plná linka.
Během jediného děje ztráty hmoty je identifikováno několik různých rozpouštědel. (Zdroj: Otisknuto
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
121
Nejen že je možné analyzovat uvolněný plyn, ale je také možné provést současné měření stejného
vzorku spojením technik dohromady. Jak TG-DTA, tak i DSC měření jsou klasickým příkladem, ale je
také možné současně vytvořit experimentální uspořádání pro DSC-FTIR měření a DSC-Ramanovo
měření. Jednoduchost použití Ramanova systému a jeho schopnost identifikovat materiály nebo
přesněji jednotlivé krystalové (i amorfní) formy při zahřívání vyvolala v posledních letech značný
zájem nejen ve farmacii, a proto jsou nyní k dispozici komerční DSC-Ramanovy systémy využívané při
termické analýze široké palety vzorků.
4.11.
Složení amorfních látek a jejich význam ve farmacii
4.11.1.
Úvod k amorfním látkám
Kromě dokonalých krystalů obsahují všechny krystalické pevné látky nějakou oblast poruchy nebo
málo krystalickou oblast. Když tyto regiony s poruchami tvoří převážnou část materiálu, je možné říct,
že materiál existuje v amorfní formě a pod Tg je definován jako skelný stav. Amorfní pevné látky lze
odlišit od jejich krystalických protějšků chybějícími makroskopickými a mikroskopickými vlastnostmi,
jako je tvar částic, dvojlom (Osaki et al. 1994) a frakční mechanismus. Při analýze pomocí
rentgenových metod práškové difrakce vykazují široký „halo“ efekt bez znatelné difrakce (Murthy a
Minor 1990). Dále je jejich NMR spektrum v pevné fázi široké nebo nezřetelné (Gustafsson et al.
1998). Důvodem je to, že amorfní materiály nemají pravidelné uspořádání krystalové mřížky v celém
objemu, ale mají pouze lokální uspořádání velké obvykle několik Ångströmů.
Amorfní formy materiálů jsou obvykle připraveny vymražováním (Craig et al. 1999), sušením
rozprašováním (Yu 2001) nebo rychlým ochlazením z taveniny (Forster et al. 2001). Ochlazení
z taveniny je použitelné pro anorganické materiály, ale méně vhodné pro léčiva, protože mnoho
organických sloučenin se rozkládá v blízkosti jejich bodu tání. Amorfní léčiva byla také připravena
lyofilizací s polymery (Badwan a Abu-Malooh 1991), jako je polyvinylpyrolidon (PvP) nebo
polyethylenglykol (PEG).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
122
Z hlediska stability jsou amorfní formy termodynamicky méně stabilní (metastabilní) než
odpovídající krystalické formy. Teoreticky může být amorfní forma považována za rozšíření
kapalného stavu i pod bodem tání pevné látky. Proto může být amorfní forma léčiva eventuálně
přeměněna do krystalického stavu pomocí nukleace a růstu krystalů. Tento proces je nezávislý na
typu sloučeniny a rychlost konverze bude záviset na nukleaci a rychlosti růstu, které se týkají
pohyblivosti molekul v amorfním prostředí.
4.11.2.
Charakterizace amorfní pevné látky pomocí termických
metod: teplota skelného přechodu
Jak již bylo řečeno, amorfní pevné látky nemají pravidelné uspořádání krystalové mřížky v celém
objemu. Při použití termických metod, jako je DSC, ke studiu takových materiálů nemohou být tyto
materiály charakterizovány výraznými endotermickými přechody tání, které jsou běžně pozorovány
u odpovídajících krystalických struktur. Nicméně jeden přechod je pro amorfní pevné látky
charakteristický, a tím je „skelný přechod“, často zkracovaný jako Tg (teplota skelného přechodu). Tg
(charakteristická oblast pro každý systém) je teplota, pod kterou jsou molekuly konfiguračně
zmraženy ve skelném stavu, a proto postrádají pohyby molekul, ke kterým obvykle dochází
v kapalině. Nad Tg je amorfní materiál pružný a vykazuje určitý stupeň toku.
Tg amorfního materiálu není jediný bod, ale je to teplotní rozsah a jeho hodnota se může lišit
v závislosti na tom, jak se měří. Nicméně pro suchou a čistou amorfní pevnou látku by se měl skelný
přechod vyskytovat v definované oblasti a neměl by se měnit v závislosti na čase a tlaku za
předpokladu, že je látka uložena v suchém prostředí a při teplotě dostatečně nízko pod Tg. Fukuoka a
kol. (1986, 1989, 1991) připravili řadu amorfních léčiv rychlým ochlazením z taveniny. Následně byla
změřena Tg suché látky z charakteristických kroků v tepelné kapacitě a z neobvyklé endotermy v DSC
křivce. Výsledky jejich výzkumu jsou uvedeny v tabulce 4.2. Je zřejmé, že poměr Tg/Tm (v Kelvinech)
určený pro čistou, suchou a amorfní pevnou látku je mezi 0,7 a 0,85. Tato zdánlivá shodnost poměru
Tg/Tm ukazuje, že teplota skelného přechodu (Tg) může být určena z bodů tání. Znalost teploty
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
123
skelného přechodu umožňuje předvídat teplotu skladování nezbytnou k zajištění stability amorfní
látky, aby se zabránilo rekrystalizaci nebo transformaci (jak fyzikální, tak chemické).
Tabulka 4.2 Změřené Tg (K), Tm (K) a hodnoty poměru Tg/Tm pro řadu farmaceutických sloučenin
(Fukuoka et al. 1989, 1991).
Sloučenina
Tg (K)
Tm (K)
Tg/Tm
Acetaminofen
302
441
0.69
Antipyrin
256
380
0.67
Aspirin
243
408
0.59
Atropin
281
379
0.74
Cholekalciferol
296
352
0.84
Cholová kyselina
393
473
0.83
Dehydrocholová kyselina
348
502
0.69
Deoxycholová kyselina
377
447
0.84
Ergokalciferol
290
376
0.77
Ethakrynová kyselina
282
398
0.71
Fulfenamová kyselina
290
406
0.71
Griseofulvin
370
497
0.74
Methyltestosteron
270
421
0.64
Fenylbutazon
277
377
0.73
Progesteron
279
399
0.70
Quinidin
326
445
0.73
Quinidin ethyluhličitan
278
362
0.77
Salicin
333
466
0.71
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
124
Santonin
290
434
0.67
Stilbesterol
308
439
0.70
Sulfadimethoxin
339
465
0.73
Sulfathiazol
334
471
0.71
Sulfisoxazol
306
460
0.67
Vinná kyselina
289
430
0.67
Ačkoli Tg uvedené v tabulce 4.2 odpovídají čistým, suchým a amorfním pevným látkám, Tg může
být významně snížena přidáním změkčovadel nebo hostující molekuly do matrice (například absorpce
molekul vody během skladování při zvýšené relativní vlhkosti vzduchu). Toto chování je známé již
mnoho let a bylo popsáno Zografim a jeho kolegy, kteří navrhli, že se tyto menší molekuly
změkčovadla chovají jako nečistota po začlenění mezi molekuly amorfní pevné látky (Ahlneck a
Zografi 1990). To účinně zvyšuje mezery a volný objem vzorku a má za následek zvýšení stupně
molekulární mobility. Například „vůně nového auta“ je způsobena počátečním uvolňováním malých
těkavých molekul změkčovadel používaných k úpravě plastového interiéru (jako je palubní deska),
aby se předešlo popraskání v chladném a zimním počasí. V léčivech je velmi důležité, jak skladování
nad teplotou skelného přechodu zvyšuje molekulární mobilitu a pravděpodobnost krystalizace.
Například amorfní cefalexin absorbuje největší množství vody, když je vystaven zvýšené vlhkosti a
skladován nad kritickým bodem relativní vlhkosti (75%), což má za následek dostatečnou plasticizaci
skelného přechodu tak, že se amorfní forma stává pružnou a je schopna krystalizovat (Otsuka a
Kaneniwa 1983). Proto, pokud existuje pravděpodobnost, že amorfní materiál bude začleněn do
vzorků jako vedlejší produkt zpracování nebo výroby, je nezbytné, aby byla podrobně známa relativní
stabilita začleněné amorfní frakce, stejně jako její velikost.
Měření Tg může být provedeno DSC, jak je popsáno v další části a také DMA, viz kapitola 4.4. To
poskytuje alternativní metodu stanovení Tg prášku a zároveň jsou modulované hodnoty jiné než
kvantitativní a obsah amorfní látky může být odhadnut z výšky píku tangens delta křivky.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
125
4.11.3.
Kvantifikace amorfních látek použitím diferenční
skenovací kalorimetrie
Ačkoli se diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) často používá pro výzkum fázového chování,
kompatibility a polymorfismu, není obvykle používána v oblasti stanovení amorfního obsahu.
Většinou je obtížné kvantifikovat velmi nízké úrovně amorfního obsahu pomocí DSC (pod 10 % w/w)
kvůli malým energetickým změnám spojeným s měřením skelného přechodu (Tg) při těchto nízkých
úrovních (Saklatvala et al. 1999). Nicméně vysokorychlostní DSC (HyperDSCTM) byla úspěšně použita
pro kvantifikaci malých úrovní amorfního obsahu identifikací a kvantifikací energetické změny
spojené se skelným přechodem (Saunders et al. 2004). V této studii byl jako testovaná sloučenina
použit monohydrát α-laktosy. DSC skeny amorfní laktosy odhalily oblasti skelného přechodu,
krystalizace a tání (jak alfa, tak beta tání), ale pro tuto studii byl oblastí zájmu skelný přechod. Na
obrázku 4.38 je zobrazen vliv zvyšující se rychlosti skenování na skelný přechod amorfní laktosy. Bylo
zjištěno, že velikost DSC odezvy se podstatně zvyšuje se zvyšující se rychlostí skenování, změna
tepelné kapacity (W/g) byla asi 1 při 100 °C/min, 3 při 250 °C/min, 5 při 400 °C/min a 10 při
500 °C/min. Rekrystalizace byla také posunuta k vyšším teplotám, což mělo za následek zřetelnější
údaje při vyšších rychlostech skenování.
Obrázek Tg amorfní laktosy změřené na DSC použitím různých rychlostí ohřevu. Největší citlivost
byla dosažena při nejvyšší rychlosti zahřívání. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
126
Pro amorfní vzorek může být v souladu s literaturou snadno pozorována suchá Tg okolo hodnoty
116 °C (Hill et al. 1998). I přes rychlé skenovací rychlosti až 500 °C/min byly stále pozorovány
krystalizační exotermy, což indikuje rychlou mobilitu a kinetiku krystalizace malých molekul ve
srovnání s polymery (Pijpers et al. 2002). Zkoumání vztahu mezi krystalizací a rychlostí ohřevu může
být využito k charakterizaci mobility amorfního léčiva.
Odezvy Tg pro směsi amorfní a krystalické laktosy jsou uvedeny na obr. 4.39 (hodnoty byly kvůli
lepší přehlednosti Tg posunuty v ose y). Tg odezva pro 100% amorfní vzorek je příliš velká, aby se
plně vešla na osu, ale za to je lépe vidět nižší amorfní obsah (např. 1,5 %). Nástup Tg nebyl ovlivněn
rychlostí skenování (80 °C pro všechny rychlosti), ale byl mnohem nižší než přijatelná hodnota Tg
laktosy, pravděpodobně kvůli vlhkosti.
Obrázek Oblast Tg pro směsi amorfní a krystalické laktosy změřená DSC při 500 °C/min (procenta
složky sušené rozprašováním odpovídají amorfnímu obsahu). (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott,
Při skenovací rychlost 500 °C/min je možné velmi dobře vidět detail Tg pro vzorek s obsahem 1 %
amorfní látky. Fakt, že při vysoké skenovací rychlosti je snadné zjistit Tg těchto vzorků, výrazně
zlepšuje tradiční přístupy. Saleki-Gerhardt a kol. (1994) ukázali, že aby mohl být vzorek detekován
konvenčními DSC (použitím pomalých skenovacích rychlostí), měl by mít kolem 10 procent amorfního
obsahu a tato hodnota nebyla od té doby nikdy zpochybněna. V jedné studii bylo ukázáno, že
teplotou modulovaná DSC lze použít k detekci přibližně 1 % w/w amorfní látky (Guinot a Leveiller
1999). Údaje zde prezentované však ukazují, že vysoké skenovací rychlosti mohou rychle (mnohem
rychleji než s pomalými modulovanými teplotními experimenty) detekovat Tg pro vzorky s velmi
nízkým obsahem amorfní látky a bez potřeby čekat na temperování při měření. To přináší velkou
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
127
výhodu, protože tato metoda je schopna detekovat malý amorfní obsah. A vzhledem k tomu, že
amorfní forma není termodynamicky stabilní, je další velkou výhodou schopnost rychlé detekce, čímž
se minimalizuje šance na rekrystalizaci amorfní formy během experimentu. (I když je krystalizace
velmi rychlá nad Tg, je také možné, aby látky krystalizovaly, byť pomaleji v blízkosti Tg, a byly tak
ovlivněny relaxací, pokud jsou použity nedostatečné skenovací rychlosti.)
Následně byla pro tyto vzorky laktosy stanovena změna v signálu tepelného toku při Tg jako
změna výšky kroku od začátku do maximální výšky vzorku, což indikovalo změnu specifického tepla
přechodu pro Tg. Tyto údaje tvoří lineární závislost od 0 do 100 % obsahu amorfní látky, jak je
znázorněno na obrázku 4.40. Analýza dat ukázala detekční limit 1 % amorfního obsahu. Podle metody
popsané Millerem a Millerem v United States Pharmacopoeia (Miller a Miller 1993) je možné stanovit
teoretický limit pro detekci a kvantifikaci amorfní laktosy podle výše uvedené metody. Na základě
těchto údajů je teoretická mez detekce této metody 0,57 % a mez kvantifikace 1,89 % amorfního
obsahu, ačkoli pro sacharosu byly dokonce stanoveny nižší limity (Lappalainen et al. 2006).
Obrázek 4.40 Výška Tg jako funkce obsahu amorfní laktosy sušené rozprašováním smíchané
s krystalickým alfa monohydrátem. Obrázek ukazuje lineární závislost mezi výškou Tg a amorfním
obsahem. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M., Principles and Applications of Thermal
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
128
4.12.
Stanovení čistoty preparátů použitím diferenční skenovací
kalorimetrie
4.12.1.
Typy nečistot ve farmacii
Nečistoty ve farmaceutickém odvětví jsou různé nežádoucí chemické látky, které zůstávají
s aktivními farmaceutickými substancemi (API) po syntéze nebo které mohou vzniknout během všech
kroků výrobního procesu nebo skladování a dopravy jak meziproduktů, tak i aktivní léčivé látky,
stejně jako samotného konečného léčivého přípravku v konrétné formulaci. Obecně lze nečistoty
rozdělit do následujících hlavních kategorií:

organické nečistoty (související s procesem výroby a produktovým léčivem),

anorganické nečistoty (související s výrobním procesem a pomocnými látkami),

zbytková rozpouštědla (používaná v procesu výroby).
Organické nečistoty mohou vzniknout během výrobního procesu a nebo skladování nových
léčivových substancí. Nečistoty mohou nebo nemusí být identifikovány, mohou být těkavé nebo
netěkavé a zahrnují:

výchozí materiál,

vedlejší produkty,

meziprodukty,

degradační produkty,

reakční činidla, ligandy a katalyzátory.
Anorganické nečistoty mohou vzniknout během výrobního procesu. Jsou většinou známé a
identifikované a zahrnují:

reakční činidla, ligandy a katalyzátory,

těžké kovy nebo zbytky kovů,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
129

anorganické soli,

další látky (například složky filtrů, sorbentů, např. aktivní uhlí).
Rozpouštědla jsou anorganické nebo organické kapaliny použité jako transportní systémy pro
přípravu roztoků nebo suspenzí při syntéze nové léčivové látky. Tato rozpouštědla mají známou
toxicitu, a proto lze pro jejich stanovení snadno vybrat odpovídající metodu (ICH Q3C (R3):
Impurities: Guideline on Residual Solvents).
Přítomnost těchto nežádoucích chemických látek, a to i v malých množstvích, může mít vliv na
účinnost a bezpečnost léčivových přípravků. Proto se profilování nečistot (zjištění shodnosti, stejně
jako množství nečistot v produktu) nyní dostává významné pozornosti od regulačních orgánů. Různé
lékopisy, například British Pharmacopoeia (BP) a United States Pharmacopoeia (USP) pomalu
začleňují limity na povolené hladiny nečistot přítomných v API nebo léčivových formách. Mezinárodní
konference o harmonizaci (ICH) rovněž vydala pokyny týkající se nečistot v nových léčivových látkách,
výrobcích a zbytkových rozpouštědlech (Q3A Impurities in New Drug Substances, Q3B(R) Impurities
in New Drug Products, Q3C Impurities: Residual Solvents, and Q6A Specifications: Test Procedures
and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances).
Obecně platí, že v souladu s pokyny ICH týkajícími se nečistot v nových léčivových přípravcích, se
identifikace nečistot pod 0,1 % nepovažuje za nutnou, pokud nejsou očekávány potenciální nečistoty,
které budou neobyčejně aktivní nebo toxické (nečistoty by ale měly být určeny ve všech případech).
Pokud nejsou k dispozici údaje pro stanovení konkrétního množství nečistoty, je třeba provést studie
k získání těchto údajů.
4.12.2.
Diferenční skenovací kalorimetrie jako metoda pro
stanovení čistoty ve farmacii
Pokud je látka v DSC pomalu zahřívána až za bod tání, může být profil tání v principu použit ke
zjištění čistoty látky s ohledem na organické nečistoty, které tvoří eutektickou směs s látkou. Zjištění
čistoty látky ale vyžaduje znalosti o její molekulové hmotnosti. Spolehlivě může být měření
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
130
provedeno pro jednotlivé krystalické materiály s 96% a vyšší čistotou. V praxi je to často případ
znečištění prekurzory a vedlejšími produkty, které jsou výsledkem výrobního procesu, a které mohou
stále zůstávat v substancích v malých množstvích. Tato jednoduchá a rychlá metoda pro stanovení
čistoty je tedy potenciálně významná pro aplikace, ale je to jen empirický přístup a jeho použití je
omezeno interferencemi z jiných dějů, které se vyskytují současně s táním a ovlivňují tvar píku a
následný výpočet čistoty. Mezi tyto interference patří například interakce pevná látka-kapalina a
polymorfní transformace. Další nečistoty, které netvoří eutektické směsi a neinteragují žádným
způsobem s látkou, nebudou brány podle tohoto výpočtu v úvahu a je třeba je posuzovat odděleně, i
když je možná interakce neeutektických nečistot, a tím i ovlivnění bodu tání. Za předpokladu, že
žádné interakce nemají vliv na tvar píku, není výpočet čistoty ovlivněn, takže je možné, aby byly
z jediného skenu určeny jednotlivé čistoty dvou vzájemně nekompatibilních látek ve směsi. Povaha
těchto omezení znamená, že je potřeba velká péče, pokud je technika aplikována na řadu neznámých
vzorků, ale může dobře fungovat, pokud je použita pro kontrolování kvality látek, o kterých je známo,
že nemají interference. Plato a Glasgow zjistili, že z 95 krystalických organických sloučenin, které
analyzovali, by tato metoda mohla být úspěšně aplikována na více než 75 % z nich, pokud by byly
dostatečně čisté (Plato a Glasgow 1969).
Základní teorie je založena na poznatku, že přítomnost malého množství nečistot v organické
sloučenině snižuje bod tání (Gustin 1980), viz obrázek 4.41. Bod tání se snižuje s rostoucím
množstvím nečistot, a proto voda s přídavkem kuchyňské soli (NaCl) mrzne až při teplotě pod 0 °C.
Vztah mezi snížením bodu tání a množstvím nečistoty pro zředěný systém je definován Van't
Hoffovou rovnicí:
T0 – Tm = RT02 X2 / Hf x 1 / F ,
(4.3)
kde T0 a Tm jsou absolutní teploty tání čistého a znečištěného materiálu, Hf je molární entalpie
tání, F je odpovídající roztavená část při teplotě Tm a R je plynová konstanta. Vynesení Tm proti 1/F by
mělo dát přímku, jejíž směrnice odpovídá molární frakci nečistoty (X2). Další podrobnosti o vývoji
rovnic a jejich využití lze najít ve Grayově studii, který jako první použil techniku DSC a podrobně
popsal termodynamické teorie, na kterých je založena (Gray 1966; Brennan et al. 1984).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
131
Obrázek 4.41 DSC křivky ukazují efekt zvyšování množství nečistot na tvar píků tání phenacetinu.
4.12.3.
Praktické provedení termické analýzy a potenciální
interference
V praxi společnosti vyvíjející zařízení poskytují software za účelem provádění výpočtu čistoty, ale i
tak je této metodě stále potřeba věnovat hodně péče. V první řadě je třeba poznamenat, že teplotní
gradienty v celém vzorku budou mít vliv na rychlost tání a výsledný tvar píku. Z tohoto důvodu musí
být velikosti vzorků malé, typicky asi 1 mg a rychlost skenování pomalá, asi 1 °C/min. I v tomto
případě však bude mít rychlost přenosu tepla do vzorku, vyjádřená jako konstanta tepelného odporu
R0, vliv na rychlost tání a tento odpor se bude lišit přístroj od přístroje a typu použité pánvičky. R 0 je
typicky určen z rychlosti tání india (sklon předního okraje) a musí být stanoven za podmínek
experimentu a použit ve výpočtech. Je velmi důležité to provést správně, protože metoda není
založena na srovnání čistého materiálu oproti znečištěnému materiálu, ale ve skutečnosti je rychlost
tání testovaného materiálu porovnávána s rychlostí tání 100% čistého materiálu (obvykle india) a
pokud není tato hodnota (R0) správná, pak bude výsledek chybný. Například v některých případech
může dát výpočet čistoty hodnotu vyšší než 100 % (v případě, že software nemá mezní hodnoty). To
ukazuje na možné chyby v hodnotě R0.
Je pravděpodobné, že použití helia jako čistícího plynu by mohlo zlepšit přenos tepla a umožnit
analyzovat potenciálně větší vzorky za rychlejších podmínek, které můžeme najít u rychlých
skenovacích technik, avšak pomalé rychlosti jsou také vyžadovány, aby mohlo být naměřeno
potřebné množství bodů během ekvilibrace v oblasti tání. Pokud je tání příliš rychlé (ostré), pak je
kompromisem částečná integrace. Ta se provádí při řadě teplot v průběhu tání pro získání hodnoty
podílu taveniny jako funkce teploty. Je podmínkou, aby tato hodnota byla získána v rovnovážné
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
132
oblasti tání, kde vedle sebe existuje pevná látka a kapalina, a tak v ideálním případě dochází k tání
pomalu. Byly navrženy metody, ve kterých byla čistota získána z řady izotermických kroků v místě
pomalého skenování, ale většina software používá metodu pomalého skenování.
Vzorek by měl být dobře stlačen v pánvičce pro zajištění dobrého tepelného kontaktu. Pokud je to
možné, měly by být pánvičky uzavřeny, aby se zabránilo ztrátám těkavých látek nebo možné
sublimaci při tání. Volný prostor nad vzorkem v uzavřené pánvičce může vést k mikroklimatu a
možným „sněžným“ efektům, a proto je nejlépe se mu vyhnout. Interval tání se nejlépe určuje
prostřednictvím rychlejšího skenování, které může být také použito k ukázání dalších dějů
netýkajících se nečistoty a měření čistoty by mělo začít výrazně níž pod očekávaným rozsahem tání a
pokračovat až do vytvoření ploché základní linie. Je s podivem, kolik látek může tát při nižších než
očekávaných teplotách kvůli efektům nečistot, takže by měla být křivka vhodně rozšířena v ose y, aby
byly tyto informace zobrazeny tak, aby mohly být správně vybrány integrační meze, viz obrázek 4.42.
Obrázek 4.42 Výběr integračních mezí pro integraci plochy píku pro výpočet čistoty. Je třeba se
ujistit, že počáteční mez je vhodná pro nízkotající látky. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M.,
Jakmile jsou data získána, měla by být pečlivě prohlédnuta. Při zkoumání křivky může být
detekována většina interferencí. Případné nesrovnalosti ve tvaru píku nebo možná raménka
naznačují případné interference a údaje by měly být odstraněny. Samozřejmý postup pro zkoumání
profilu tání je jiná indikace. Pro další kontrolu by měla být použita druhá derivace křivky. Někdy
mohou být nesrovnalosti způsobeny pohybem vzorku v průběhu tání, což vede k předpokladu, že
určení čistoty může být provedeno při opětovném zahřátí, ale šance, že se podaří ochlazení do
stejného stavu bez jakékoli změny, je pro většinu materiálů malá, takže by se nemělo používat
opakované zahřívání, pokud tento přístup nebyl již dříve ověřen. Objeví-li se podezření na pohyb
vzorku, je třeba opakovat analýzu s novým vzorkem.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
133
Pokud se křivka jeví jako přijatelná, pak je možné začít se zjišťováním čistoty nastavením mezí pro
částečnou integraci. V některých systémech mohou být meze určeny softwarem, v jiných vybrány
operátorem. Počáteční část tání pod 5 % je pravděpodobně neužitečná a meze jsou často nastaveny
mezi 5 % a 60 % plochy píku, které odpovídají rovnovážné oblasti tání (počáteční okraj tání) pro
většinu látek (Plato a Glasgow 1969). Pokud 60% limit připadá na koncovou oblast píku, je to důkaz
nadměrné energie pod touto oblastí, což může být díky interakcím pevná látka-kapalina, které mají
tendenci mít za následek neúměrně symetrický tvar píku.
Pokud dílčí oblast integrace vypadá přijatelně, pak může být získána křivka 1/F v závislosti na Tm.
Ve skutečnosti je téměř vždy získána křivka, i když se očekává, že to bude přímka, viz obrázek 4.43.
Příčinou je podhodnocení celkového tepla tání. To nemůže být vysvětleno ničím jiným než tím, že
nečistota taje s malým množstvím hlavní složky v eutektickém bodě, který je pod hlavním bodem tání
a zůstává nezměřen. Navíc může být zpochybněna přesnost měření 1 mg materiálu zahřívaného při
1 °C/min, protože generovaný tepelný tok bude velmi malý. Výsledkem je zahrnutí hodnot jiných
skupenských tepel do algoritmu výpočtu, dokud není získána přímá fitovaná linie. Použitá korekce se
nazývá x-korekcí a představuje odhad chyby v původním výpočtu skupenského tepla. Tato oprava by
neměla být příliš velká. Hodnoty 5 % nejsou neobvyklé, ale hodnoty nad 10 % by měly při měření
v moderním přístroji vyvolat znepokojení. Velikost odchylky by se také měla lišit v závislosti na
množství nečistot.
Obrázek 4.43 Van’t Hoffův graf ukazující výpočet čistoty pomocí DSC. Čtverečky znázorňují
původní data před použitím korekčního algoritmu. (Zdroj: Otisknuto z P. Gabbott, Saunders, M.,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
134
Díky této korekci je možné použít výpočet čistoty, i když se vzorek rozkládá během tání. Za
předpokladu, že počáteční oblast tání není ovlivněna rozkladem (tj. vypadá rovná a bez vad), je
možné použít algoritmus x-korekce i v případě, kdy nemůže být provedeno přesné změření spalného
tepla (i když pro tento konkrétní účel může být vybrán přesnější algoritmus). Stejný argument lze
v zásadě použít i pro jiné interference, ale pokud existují pochybnosti o správnosti jeho použití, je
moudré data nepoužívat.
Analýzy by měly být pro jistotu opakovány a jako u všech extrapolovaných dat lze i zde očekávat
jejich variabilitu. Do jisté míry to bude závislé na operátorovi, ale zpravidla by nejistota měla být
několik desetin procenta. Metoda může být optimalizována pro danou látku dodržením doporučení,
že čím je materiál čistší, tím by měla být použita pomalejší skenovací rychlost a naopak čím
znečištěnější materiál, tím by měla být použita vyšší skenovací rychlost (protože píky budou širší).
Bylo zjištěno, že 0,5 °C/min poskytuje nejpřesnější a nejreprodukovatelnější data pro jakýkoliv čistý
materiál.
4.13.
Kompatibilita pomocných látek
Při vývoji jakéhokoliv léku pro úspěšný farmaceutický produkt je potřeba pro konečnou formu
léčiva prokázat přijatelnou chemickou stabilitu při distribuci a podmínkách skladování a vhodnou
trvanlivost. Všechna léčiva jsou vytvořena s řadou pomocných látek, jako jsou pojiva, rozvolňovadla,
plniva a maziva. Je důležité, aby lék neinteragoval s některou z pomocných látek způsobem, který
může snížit jeho účinnost, a proto je kompatibilita pomocných látek důležitá při posuzování stability
léčiva.
V průběhu let byly vyvinuty různé metody kompatibility pomocných látek jako vodítko pro výběr
pomocných látek. Screening kompatibility pomocné látky je obecně považován za nezbytnou součást
vývojového procesu, ale protože nejsou během počátečních fází vývoje k dispozici data v reálném
čase, musí být vytvořeny zrychlené studie stability na modelovém složení léčiva pro odhadnutí a
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
135
předpovězení dlouhodobé stability za běžných podmínek. Tyto studie jsou nákladné a časově
náročné, a proto je žádoucí minimalizovat počet provedených studií.
Existuje mnoho způsobů jak provést screening kompatibility pomocné látky. Ve všech případech je
ale základní postup stejný: smíchají se dvě nebo více látek a sledují se všechny následné reakce.
V jednom typu studie jsou směsi léčiva a pomocné látky skladovány za podmínek zrychlené stability
jako binární směsi, směsi léčivové formy v malém měřítku, nebo statisticky navržené směsi a pak
analyzovány v průběhu času pomocí TLC, HPLC nebo spektrofotometrie. Nevýhodou této techniky je,
že směsi musí být sledovány po dobu několika týdnů. Protože kvalita výsledků závisí na přesnosti
testů, jsou také požadovány dobře vyvinuté a dostatečně ověřené metody.
4.13.1.
Screening kompatibility pomocné látky pomocí diferenční
skenovací kalorimetrie
DSC byla navržena jako rychlá metoda pro vyhodnocení fyzikálně-chemické interakce mezi dvěma
složkami a může poskytovat rychlé a spolehlivé informace o možných fyzikálních nebo chemických
nekompatibilitách mezi složkami léčivové formy od vzniku, posunutí nebo vymizení endoterm či
exoterm nebo změnách v příslušných hodnotách entalpie (Tan et al. 1992). Interpretace výsledků DSC
není ale vždy snadná a je nutné promyšlené vyhodnocení pro vyvarování se nesprávného výkladu a
chybného závěru (Hardy 1982).
Základní přístup je ten, že se smíchají dvě složky (léčivo a pomocná látka) zpravidla v 50/50 směsi
a pak je provedeno DSC měření. Profil tání jednotlivých složek je pak srovnán se skenem směsi.
Pokud nedojde k žádné interakci, směs by měla v ideálním případě ukázat stejné přechody jako
jednotlivé složky. Pokud tomu tak není, nastala nějaká interakce.
Při analýze DSC křivek směsi však nastává problém, neboť není možné jednoznačně odlišit fyzikální
a chemické interakce, přičemž chemické interakce jsou hlavní příčinou potíží při vývoji léčiva.
Příkladem je roztok jedné ze složek v tavenině jiné látky. To znamená, že bude získáno mnoho
„falešných“ výsledků, které je obtížné odlišit od výsledků, které jsou zdrojem problémů. Navíc
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
136
skutečnost, že interakce byly pozorovány při zvýšené teplotě, není nezbytně významná v případě, že
teplota je mimo testované parametry. Validita použitím 50/50 směsi může být také diskutabilní. Dále,
přítomnost interakce pevná látka-pevná látka nemusí nutně znamenat farmaceutickou
nekompatibilitu (Van Dooren a Duphar 1983), ale mohlo by to být naopak výhodné, například jako
vhodnější forma systému pro aplikaci léčiva (Bettinetti et al., 1988). Proto musí být ve spojení s DSC
často použity další analytické metody pro adekvátní doložení výsledků, jako je mikroskopie horké
fáze, hmotnostní spektrometrie a HPLC umožňující stanovení chemické čistoty.
Po tom, co bylo řečeno, zkušení analytici uvádějí, že z DSC interakčních studií byly získány užitečné
informace a je třeba zdůraznit, že údaje, které neindikují interakce, poskytují významné důkazy, že
k žádné interakci nedochází. To může být ve skutečnosti velmi užitečná informace a lze ji z těchto
studií získat. Alternativní přístup už byl vynalezen a spočívá v použití DSC metod rychlého skenování.
Směsi, které byly dříve připraveny a zestárly, mohou být nyní zahřány použitím velkých rychlostí
ohřevu, při kterých nejsou fyzikální interakce tak významné, protože není čas na to, aby nastaly.
Literatura
Ahlneck, C. and Zografi, G. (1990) Int. J. Pharmaceut. 62: 87–95.
Badwan, A. A. and Abu-Malooh, A. (1991) Eur. J. Pharm. Biopharm. 37(3): 166–170.
Bartolomei, M., Bertocchi, P., Cotta Ramusino, M., Santucci, N. and Valvo, L. (1999) J. Pharmaceut.
Biomed. Anal. 21(2): 299–309.
Bettinetti, G. P., Mura, P., Liguori, A., Bramanti, G. and Giordano, F. (1988) Farmaco Ed. Prat. 43: 331–
343.
Bottom, R. (1999) Int. J. Pharmaceut. 192(1): 47–53.
Brennan W. P., DiVito, M.P., Fyans, R. L. and Gray A. P. (1984) An overview of the Calorimetric Purity
Measurement. In Purity Determinations by Thermal Methods (ed. Blaine, R. L. and Schoff, C. K.).
American Society for Testing and Materials.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
137
Briehl, H. and Butenuth, J. (1992) Thermochimica Acta 211(10 December 1992): 121–130.
Burger A. and Ramburger R. (1979) Mikrochim.Acta II: 259–271.
Chowdhry, B. Z., Cole, S. C. (1989) TIBTECH 7: 11–18.
Cox, P. J. and Wardell, J. L. (2000) Int. J. Pharmaceut. 194(2): 147–153.
Craig, D. Q. M., Royall, P. G., Kett, V. L. and Hopton, M. L. (1999) International Journal of
Pharmaceutics 179(2): 179–207.
Della Gatta, G., Richardson, M. J., Sarge, S. M. and Stølen, S. (2006) Pure Appl. Chem. 78(7): 1455–
1476.
Fang, M.X., Shen, D. K., Li, Y. X., Yu, C. J., Luo, Z. Y. and Cen, K. F. (2006) J. Anal. and Appl. Pyrolysis
77(1): 22–27.
Forster, A., Hempenstall, J., Tucker, I. and Rades, T. (2001) Int. J. Pharmaceut. 226(1–2): 147–161.
Fukuoka, E., Makita, M. and Nakamura, Y. (1991), Chem. Pharm. Bull. 39, 2087–2090.
Fukuoka, E., Makita, M. and Yamamura, S. (1986) Chem. Pharm. Bull. 34(10): 4314–4321.
Fukuoka, E., Makita, M. and Yamamura, S., (1989) Chem. Pharm. Bull. 37, 1047–1050.
Gabbott, P. (ed.) (2008) Principles and Applications of Thermal Analysis. Wiley-Blackwell.
Gabbott, P., Clarke, P., Mann, T., Royall, P., Shergill, S (2003) Amer. Lab. (August).
Giron, D. (1995) Thermochimica Acta 248(2 January 1995): 1–59.
Gray A. P. (1966) Determination of purity by differential scanning calorimetry. Thermal Analysis
Newsletter No 5, The Perkin-Elmer Corporation.
Guinot, S. and Leveiller, F. (1999) Int. J. Pharmaceut. 192: 63–75.
Gustin, G. M. (1980) Thermochimica Acta 39(2): 81–93.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
138
Hardy, M. J. (1982) Anal. Proc. 19: 556–557.
Hill, V. L., Craig, D. Q. M. and Feely L. C. (1998) Int. J. Pharmaceut. 161(1): 95–107.
Kobayashi, Y. Ito, S., Itai, S. and Yamamoto, K. (2000) Int. J. Pharmaceut. 193(2): 137–146.
Kunihiro Osaki, Tadashi Inoue, Eui-Jeong Hwang, Hirotaka Okamoto and Osamu Takiguchi (1994) J.
Non-Crystalline Solids 172–174(2): 838–849.
Lappalainen M., Pitkänen, I. and Harjunen, P. Quantification of low levels of amorphous kontent in
sucrose by HyperDSC. (2006) Int. J. Pharmaceut. 307: 150–155.
McCrone, W. C. (1965) Polymorphism in Physics and Chemistry of the Organic Solid. State, vol. II (ed.
Fox, D., Labes, M. M. and Weissberger, A.). Interscience, pp. 726–767.
Sorrenti, M., Bettinetti, G. P. and Negri, A. (1998) Thermochimica Acta 321(1–2): 67–72.
McCrum, N. G., Read, B. E. and Williams, G. (1967) Anelastic and Dielectric Effects in Polymeric Solids.
John Wiley & Sons, Ltd.
McGregor, C., Saunders, M. H., Buckton, G. and Saklatvala, R. D. (2004) Thermochimica Acta 417(2):
231–237.
Miller, J. C. and Miller, J. N. (1993) Statistics for Analytical Chemistry, 3rd ed. Ellis Horwood.
Murthy, N. S. and Minor, H. (1990) Polymer 31(6): 996–1002.
Gustafsson, C., Lennholm, H., Iversen, T. and Nyström, C. (1998) Int. J. Pharmaceut. 174(1–2): 243–
252.
Noble, D. (1995) Anal. Chem. 67: 323A–327A.
Otsuka, M. and Kaneniwa, N. (1983) Chem. Pharm. Bull. 31: 230–236.
Phipps, M. A., and Winneke, R. A. (1997) Proc. Workshop Microcalorim. Energ. Mater.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
139
Pijpers, F. J., Mathot, V. B. F., Goderis, B., Scherrenberg, R. L. and Van der Vegte, E. W. (2002)
Macromolecule 35: 3601–3613.
Pirttimäki, J. and Laine, E. (1994) Eur. J. Pharmaceut. Sci. 1(4): 203–208.
Plato C. and Glasgow A. R. (1969) Anal. Chem. 41: 330.
Pratiwi, D., Fawcett, J. P., Gordon, K. C. and Rades, T. (2002) Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut.
54(3): 337–341.
Reading M. and Hourston D. J. (2006) Modulated Temperature Differential Scanning Calorimetry:
Theoretical and Practical Applications in Polymer Characterisation. Springer.
Reading, M., Luget A. and Wilson R. (1994) Thermochimica Acta 238(1–2): 295–307.
Rustichelli, C., Gamberini, G., Ferioli, V., Gamberini, M. C., Ficarra, R. and Tommasini, S. (2000) J.
Pharmaceut. Biomed. Anal. 23(1): 41–54.
Saklatvala, R., Royall, P. G. and Craig, D. Q. M. (1999) Int. J. Pharmaceut. 192: 1(1): 55–62.
Saleki-Gerhardt, A., Ahlneck, C. and Zografi, G. (1994) Int. J. Pharmaceut. 101: 237–247.
Saunders, M., Podluii, K., Shergill, S., Buckton, G. and Royall, P. (2004) Int. J. Pharmaceut. 274(1–2):
35–40.
Spartakov, A., Trusov A. and Vojtylov V. (2002) Colloids and Surfaces A: Physicochemical and
Engineering Aspects 209(2–3): 131–137.
Sturtevant, J. M. (1987) Ann. Rev. Phys. Chem. 38: 463–488.
Tan, X., Meltzer, N. and Lindenbaum, S. (1992) Pharm. Res. 9: 1203.
Van Dooren, A. A. and Duphar, B. V. (1983) Drug Dev. Ind. Pharm. 9: 43–55.
Vickery, R. D., Nemeth, G. A. and Maurin, M. B. (2002) J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 30(1):125–129.
Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J., Lin, L. (1989) Anal. Biochem. 79: 131–137.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
140
Yu, L. (2001) Advanced Drug Delivery Reviews 48(1): 27–42.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
141
5. Mikroskopie
5.1.Úvod k mikroskopickým technikám
Mikroskopické techniky, využívané při charakterizaci farmaceutik v pevném skupenství, poskytují
specifické informace, které je s využitím ostatních technik možné získat jen nepřímo nebo vůbec.
Mikroskopie umožňuje univerzální, rychlou a většinou nedestruktivní analýzu a charakteristiku
malých množství vzorku z hlediska mnoha fyzikálně-chemických vlastností, například: tvar a velikost
částic, optické vlastnosti, krystalografie, vlastnosti povrchu, krystalinita, krystalizace, rozpouštěcí a
tepelná charakteristika. Přesněji, termín chemická mikroskopie, definovaný Émile Chamotem
(Chamot 1915) jako „použití mikroskopu při řešení chemických problémů“, lépe popisuje využití
mikroskopie (v širším smyslu) pro výzkum fyzikálně-chemických vlastností materiálů a pro
porozumění těmto vlastnostem. Význam mikroskopie pro určení charakteristiky farmaceutik
v pevném skupenství je uznáván již několik desetiletí, zejména v kombinaci s dalšími analytickými
technikami (např. Biles 1962, Haleblian a McCrone 1969, Brittain a kol. 1991, Windram a Threlfall
1992, Byrn a kol. 1995, Threlfall 1995, Yu a kol. 1998, Bernstein 2002, Smoliga 2004, Nichols 2006).
Přestože je využití mikroskopie podporováno mnoha výzkumníky v oblasti farmacie, možnost
jejího plného využití jako analytické metody pro charakterizaci pevné fáze ještě není ve většině
laboratoří zcela doceněna. Tato kapitola pojednává o využití zavedených mikroskopických technik,
jako polarizační mikroskopie (včetně termomikroskopie), skenovací elektronové mikroskopie (včetně
elementární rentgenové mikroanalýzy) a nedávno vyvinuté a rychle se rozvíjející mikroskopie
atomárních sil. Kombinace těchto tří technik je využívána v mnoha průmyslových i akademických
laboratořích při výzkumu a objasňování chování farmaceutických materiálů v pevném stavu.
Samozřejmě, mikroskopie v jedné ze svých podob je využívána v každém výrobním průmyslovém
závodě a specializované mikroskopické techniky vyvinuté jedním průmyslovým odvětvím jsou často
využívány ostatními odvětvími. V této kapitole je kladen důraz na mikroskopickou charakterizaci
farmaceuticky aktivních látek (Active Pharmaceutical Ingredients – APIs). Mikroskopické techniky
jsou rovněž nedocenitelné při řešení problémů spojených s krystalizací a zpracováním, charakterizaci
pomocných látek, vyhodnocování homogenity práškových směsí, určování velikosti a struktury zrn a
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
142
odlišování farmaceuticky aktivních látek od pomocných látek v konečných produktech jako tabletách,
kapslích, suspenzích, inhalačních směsích, nitrožilních a lokálně aplikovaných přípravcích.
Mikroskopie je rovněž nedocenitelná při detekci a identifikaci cizích částic v klinických a komerčních
produktech.
Mikroskopická pozorování jsou cenná sama o sobě, ale pokud jsou použity pro doplnění údajů
získaných jinými technikami charakterizace pevné fáze, mohou poskytnout rozhodující informace
potřebné pro vysvětlení neobvyklého nebo nečekaného úkazu. Zkušený mikroskopista je hodnotný
pracovník, jehož speciální schopnosti by měly být využívány v průběhu charakterizace a vývoje
farmaceutických materiálů.
5.2. Mikroskop jako analytický přístroj
Mikroskop je užíván při zvětšení obrazu vzorku pro rozlišení jemných detailů, které jsou pouhým
okem neviditelné. V případě mnoha materiálů, tyto jemné detaily se mohou stát viditelnými, když je
kontrast obrazu zvýšen modifikací, například, technik přípravy vzorku, výběrem a kontrolou osvětlení
mikroskopu nebo podmínek snímání obrazu, nebo zpracováním získaného obrazu. Mikroskopy
poskytují nejen obrazy vzorků při různých zvětšeních, ale mohou sloužit i jako výkonné analytické
přístroje pro základní výzkum i řešení problémů.
Mikroskopie zahrnuje širokou škálu technik, které poskytují obrazy vzorků jak při nízkých
rozlišeních umožňujících postihnout rysy velkého měřítka jako je tvar a velikost, tak při velmi
vysokých rozlišeních za účelem získání informací na úrovni jednotlivých atomů. Jedinečné a
charakteristické optické vlastnosti krystalů jsou určovány s využitím polarizační mikroskopie s nízkými
až
středními
rozlišeními.
Skenovací
elektronový
mikroskop
vybavený
rentgenovým
mikroanalyzátorem se stává výkonným analytickým přístrojem, s jehož pomocí lze prozkoumat jemné
detaily povrchu vzorku a určit jejich prvkové složení. Zisk informací o složité struktuře a chemických
vlastnostech povrchů na molekulární úrovni umožňuje mikroskopie atomárních sil.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
143
Mikroskopická pozorování neposkytují jen jedinečný pohled na krystalické a amorfní materiály, ale
jsou používána i při rozhodování o potřebnosti dalších analýz a, což je důležitější, při výběru
analytické metody nebo metod. S využitím mikroskopických metod lze získat velké množství
diagnostických informací při použití malého množství vzorku, což je zvlášť významné při volbě a
časných stádiích vývoje farmaceutických produktů.
5.3. Jaký mikroskop použít?
Při analýze vlastností materiálů v pevné fázi závisí volba mikroskopu na tom, jaké informace o
materiálu mají být zjištěny a jaká je jejich požadovaná přesnost. Pro studium optických vlastností a
vnitřních rysů krystalů (jako jsou praskliny a inkluze) nebo pro určení tvarů a velikostí částic
v práškových materiálech je nejvhodnějším přístrojem transmisní optický mikroskop. Pro studium
povrchů krystalů a pro zjištění rozměrů malých částic, které nemohou být rozlišeny v optickém
mikroskopu, by měla být použita skenovací elektronová mikroskopie nebo mikroskopie atomárních
sil. Pokud je požadováno rozlišení na atomární úrovni, je optimální volbou mikroskopie atomárních sil
nebo transmisní elektronová mikroskopie. Nicméně, všechny tyto techniky jsou navzájem
komplementární a pro zahrnutí nejvhodnějších a nejinformativnějších technik by měl být navržen
Když
je
vzorek
zkoumán
poprvé,
je
namísto
hledání
nejdražšího,
nejvýkonnějšího
a nejsofistikovanějšího mikroskopu vhodnější prohlédnout si vzorek pouhým okem nebo použít lupu.
Při tomto úvodním přezkoumání lze zjistit takové vlastnosti vzorku, které nemusí být při vyšším
rozlišení viditelné, jako barevnost, různé typy krystalů, plynulost pohybu částic při přesýpání vzorku,
výskyt aglomerací, variabilita ve velikostech částic. Nikdy nepodceňujte význam prohlédnutí vzorku
bez zvětšení. Vodítka pro určení tvaru částic v práškových materiálech umístěných ve skleněné vialce
nebo pytli mohou být někdy získána při sledování materiálu při jeho přesýpání; plynulý pohyb částic
indikuje jejich kulovitý nebo pravidelný tvar, zatímco nepravidelný pohyb lehkého, nadýchaného
prášku napovídá, že jeho částice mají pravděpodobně tvar jehlic. Na základě výsledků těchto
předběžných pozorování může být poté zvolen vhodný mikroskop, který bude sloužit pro podrobnější
prozkoumání vzorku.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
144
Nízkovýkonný stereobinokulární mikroskop, vybavený optikou pro vstupní i propuštěné záření, je
nedocenitelný při přípravě vzorků, které mají být analyzovány jinými technikami. Krystalografisté
používají stereobinokulární mikroskopy vybavené polarizačními filtry při rutinním výběru a pěstování
krystalů vhodných pro difrakční analýzu jednotlivých krystalů.
Transmisní optická mikroskopie mikroskopie je bezpochyby nejvšestrannější a nejrychlejší ze
všech mikroskopických technik používaných při zkoumání mnoha vlastností farmaceutických
materiálů v pevné fázi. Například pro zjištění rychlosti růstu krystalů z nasyceného roztoku, nebo pro
zjištění, zda je přítomnost zbytkového rozpouštědla v práškovém materiálu zapříčiněná inkluzemi
uvnitř krystalů, by měla být použita optická mikroskopie spíše než skenovací elektronová mikroskopie
nebo mikroskopie atomárních sil.
Přestože je tato kapitola zaměřena na aplikace polarizační optické mikroskopie, skenovací
elektronové mikroskopie a mikroskopie atomárních sil, pro charakterizaci farmaceutických materiálů
z fyzikálně-chemického hlediska může být využito mnoho dalších mikroskopických technik. Tyto
techniky zahrnují: transmisní elektronovou mikroskopii, infračervenou mikroskopii s Fourierovou
transformací, Ramanovu mikroskopii, mikroskopii v blízké infračervené oblasti, konfokální
mikroskopii a metody povrchové analýzy, jako je fotoelektronová spektroskopie (XPS), Augerova
spektroskopie a hmotnostní spektroskopie sekundárních iontů s ToF detektorem (ToF – SIMS).
5.4.Optická mikroskopie
Optická mikroskopie je důležitá technika, s jejíž pomocí je možné korelovat data získaná s využitím
jiných technik při charakterizaci látek z fyzikálně-chemického hlediska (např. Reutzel-Edens a kol.
2003, Panchagnula a kol. 2004) nebo pro vysvětlení změn tvaru krystalů (např. Brittain 1997).
Většina pevných a polotuhých farmaceuticky aktivních látek a příměsí, s nimiž se lze setkat během
vývoje farmaceutických produktů, je průhledná nebo průsvitná a může být zkoumána s využitím
prozařovacího optického mikroskopu. Optická mikroskopie je nejdéle zavedenou z mnoha technik
užívaných pro charakterizaci farmaceutik v pevném skupenství. První mikroskop, vybavený dvěma
konvexními čočkami zasazenými v kovovém tubusu, byl vynalezen Hansem Janssenem okolo roku
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
145
1590 (Moe 2004). O téměř 250 let později, v roce 1834, sestrojil průkopník fotografie William Fox
Talbot polarizační světelný mikroskop přidáním dvou optických hranolů do základního optického
mikroskopu (Kile 2003). Tento stěžejní objev stál na počátku systematického zkoumání anorganických
a organických krystalů a od těchto skromných začátků
Prozařovací optický mikroskop bez polarizovaného světla může být použit při zjišťování vlastností
krystalů jako barvy, tvaru a velikosti. Po přidání polarizačních filtrů se základní mikroskop v režimu
světlého pole změní ve výkonný analytický přístroj, s jehož pomocí lze studovat mnoho optických
vlastností krystalů. Polarizační mikroskopie se stala hlavní technikou optické mikroskopie používanou
pro charakterizaci farmaceutických materiálů, a proto bude dále popsána v této kapitole.
Různé formy pevných látek, jako polymorfy, hydráty, solváty, mezofáze a skla, mohou být při
pozorování pod rovinně nebo křížově polarizovaným světlem navzájem rozlišeny díky rozdílným
optickým vlastnostem. Optický mikroskop by měl být nedílnou součástí každé analytické laboratoře,
jelikož poskytuje pracovníkům možnost nahlédnout do struktury látek na úrovni atomů na základě
pozorování jejich interakce se světlem (Bowen a Sparenga, 2008). Optické krystalografické metody
mohou být rovněž využity pro zařazení krystalu do jedné ze sedmi krystalografických soustav a,
v některých případech, může poskytnout informace o struktuře krystalu (Hartshorne a Stuart, 1970).
Směs obsahující různé polymorfy může být rovněž prozkoumána a jednotlivé polymorfy mohou být
rozlišeny na základě různých optických vlastností.
Optická mikroskopie je, ve spojení s dalšími mikroskopickými technikami, často používána při
získávání odpovědí na řešení výzkumných otázek, které nemohou být získány s využitím jedné
techniky. Například v rámci studie porovnávající tvary, chemické vlastnosti a topografie povrchů
monokrystalů dvou polymorfů sulfamerazinu byla kombinována optická mikroskopie, mikroskopie
atomárních sil a Ramanovy mikroskopie (Cao a kol. 2005). Jiným příkladem vhodné kombinace
komplementárních technik, vedoucí k lepšímu poznání vlastností organických sloučenin v pevné fázi,
je studie polymorfního farmaceutického meziproduktu, kyseliny p-hexadecylaminobenzoové (HABA)
(Reffner a Ferrillo 1988). Pro studium polymorfismu HABA byly připraveny směsné vzorky, ale fázová
přeměna z Formy II na Formu III nemohla být pomocí polarizační mikroskopie přímo pozorována.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
146
Nicméně, s využitím FT-IR termomikroskopie mohly být tyto dvě fáze rozlišeny a fázová přeměna byla
pozorována při 74°C.
5.4.1. Polarizační optický mikroskop pro studium vlastností látek
v pevné fázi
Jako rychlý testovací přístroj pro charakterizaci široké řady vlastností polymorfních krystalických
látek a dalších pevných látek je polarizační mikroskopie nenahraditelná. Různé krystalové modifikace
mají odlišné struktury, které se projevují rozdíly v optických vlastnostech, jako je index lomu, barva,
extinkční úhel a optická disperze. Tyto jedinečné vlastnosti mohou být pozorovány s využitím rovinně
polarizovaného světla, při pozorování mezi křížovými polarizátory lze rozlišit různé krystalové formy,
a to jak v případě čistého vzorku jedné formy, tak v případě směsi více forem. Mezi další vlastnosti a
jevy, které jsou s pomocí polarizačního mikroskopu snadno pozorovatelné, patří dvojčatění krystalů,
aglomerace, distribuce krystalů různých velikostí, rozdíly ve vzhledu krystalů, rozpustnost krystalů
v různých rozpouštědlech, sublimace a mezomorfie.
Polarizační mikroskopie využívá dvojlomu, který je výsledkem uspořádání molekul v krystalu při
jejich interakci s polarizovaným světlem. S využitím polarizačního mikroskopu mohou být pozorovány
a popsány optické vlastnosti mnoha různých materiálů. Nejdražší a nejsložitější polarizační
mikroskopy nabízejí mnoho vylepšení s pomocí kvalitní optiky a ergonomického designu, možné je
též automatické ovládání stolku na vzorky a automatická fokusace pro obrazovou analýzu. Levnější
mikroskopy bývají jednodušší, ale jsou dostatečně výkonné pro provádění rozhodujících optických
stanovení za předpokladu, že kvalita optiky je odpovídající. Vysoká kvalita mikroskopie nezávisí na
složitosti mikroskopu, ale na zkušenostech a zručnosti mikroskopisty, který umí připravit vzorky a
ovládat mikroskop a dokáže rozpoznat a korigovat výchylky osvětlení. Nejdůležitější součástí
optického mikroskopu není uvedena v žádném katalogu; je to kombinace oka a mozku mikroskopisty,
který dokáže pozorovat, porozumět a interpretovat obrazy smysluplným a analytickým způsobem.
Schematický nákres prozařovacího optického mikroskopu, využívajícího polarizované světlo,
s nezbytnými součástmi potřebnými ke zobrazení a vyhodnocení optických vlastností vzorků, je
uveden na Obrázku 9.1.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
147
Obrázek 9.1 Schematický nákres znázorňující hlavní součásti prozařovacího polarizačního optického
mikroskopu
Kromě součástí, z nichž se skládá základní mikroskop (např. iluminátor, kondenzor, sadu objektivů
umožňujících pozorovat vzorek při větším nebo menším zvětšení, okulár), jsou v optické dráze světla
jako pod, tak nad vzorkem, umístěny dva polarizační filtry, zvané polarizátor a analyzátor. Roviny
světla procházejícího polarizátorem a analyzátorem jsou na sebe kolmé, aby bylo dosaženo jevu
zvaného křížová polarizace (polarizátor je nastavený tak, že kmitová rovina má pravolevou orientaci).
Aby mohl být vzorek zkoumán jak s využitím nepolarizovaného světla (bez polarizačních filtrú), tak
i s využitím rovinně (pouze polarizátor) resp. křížově (polarizátor a analyzátor) polarizovaného světla,
je nezbytné, aby mohly být jak polarizátor, tak analyzátor dočasně odstraněny z optické dráhy.
V ideálním případě je jak polarizátor, tak analyzátor otočný a vzorek může být pozorován rovněž při
polohách odlišných od polohy, v níž jsou polarizační filtry navzájem kolmé (bude diskutováno níže).
Referenční zorné pole mezi zkříženými polarizátory je černé, protože žádné světlo neprochází, ale
pokud je přítomen anizotropní (dvojlom vykazující) vzorek, bude při vhodné orientaci vykazovat jasné
interferenční barvy (Harts;horne a Stuart 1970).
Při určování některých optických vlastností musí být krystal pozorován pod různými úhly vzhledem
k rovině polarizovaného světla. Taková pozorování mohou být snadno provedena, pokud je
mikroskop vybaven otočným stolkem s úhlovou stupnicí. U dobře vyvinutých krystalů mohou být
provedena měření úhlů, které spolu svírají krystalové roviny nebo hrany, a extinkčních úhlů (pokud je
krystal mezi navzájem kolmo orientovanými polarizačními filtry ozařovaný pod extinkčním úhlem
vzhledem ke krystalové rovině, jeví se tmavý). Aby byly úhly přesně změřeny, krystal musí být
vyrovnán s nitkovým křížem, který je umístěn v jednom z okulárů. Tento nitkový kříž je orientován
rovnoběžně s rovinami polarizace obou polarizačních filtrů.
Do polarizačního mikroskopu mohou být umístěny další přídavné součásti pro zvýšení jeho
všestrannosti při zkoumání optických vlastností krystalů. Speciální pomocné destičky, známé jako
kompenzátory, mohou být umístěny do optické dráhy před vzorek. Pravděpodobně nejčastěji
používaná je citlivá barevná destička (známá také jako červená destička prvního řádu, celovlnová
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
148
destička nebo sádrová destička), která zabarvuje zorné pole do jednotné tmavě purpurové barvy.
Tento kompenzátor je velmi výhodný při zkoumání protáhlých krystalů mezi kolmo orientovanými
polarizačními filtry pro zjištění, ve kterých směrech je index lomu vyšší a ve kterých nižší; například,
pokud je index lomu nízký ve směru rovnoběžném s podélnou osou jehličkovitého krystalu, protože
světlo se šíří rychleji ve směru, podél nějž je index lomu nižší. Plný popis využití citlivé barevné
destičky a dalších, jako čtvrtvlnové destičky a křemenného klínku, je uveden ve specializovaných
odborných knihách (např. Walhstrom 1960; Hartshorne a Stuart 1970).
Vzorky jsou nejčastěji zkoumány kvůli zjištění vlastností jako tvar a velikost v normálním (nebo
ortoskopickém) režimu s využitím rovinně polarizovaného světla a mezi navzájem kolmo
orientovanými polarizačními filtry. Doplňkové informace o optických vlastnostech mohou být získány
při zkoumání monokrystalů umístěných rovněž mezi navzájem kolmými polarizačními filtry, ale
pozorovaných v konoskopickém módu, umožňujícího zobrazení obrazu na zadní ohniskové rovině
objektivu. Při vhodné orientaci krystalu odhalí pozorování v konoskopickém módu charakteristické
interferenční obrazce, skládající se z barevných a tmavých pruhů nebo izogyrů (Hartshorne a Stuart
1970). Existuje více možností, jak získat obraz v konoskopickém režimu, ale nejvšestrannější z nich
(protože konoskopický obraz může být rovněž zobrazen a nahrán za pomoci kamerového systému) je
založena na umístění pomocných čoček, zvaných Bertrandovy čočky, mezi analyzátor a okulár.
Pozorování v konoskopickém režimu nabízí možnost, jak rychle rozlišit jednoosé a dvouosé krystaly
(viz 9.4.4), což je zvláště důležité pro rozeznání odlišných polymorfů ve směsi, pokud patří do různých
krystalových soustav (Nichols 2006).
Některé vzorky obsahují složky, které jsou navzájem málo kontrastní (například amorfní léčiva ve
směsi s polymerem v pevnou disperzi nebo polotuhá fáze v lokálně aplikovaných mastech a krémech)
a běžný optický polarizační mikroskop pravděpodobně nebude vhodný pro pozorování rozdílů mezi
jednotlivými složkami. Pro zvýšení kontrastu je možné vložit vzorek do kapalného média (viz 9.4.2),
ale to není vždy praktické. Techniky pro zvýšení kontrastu, jako mikroskopie interferenčního
kontrastu (využívá polarizované světlo) a fázově kontrastní mikroskopie (nejčastěji využívaná biology
pro zobrazení buněčných struktur s nízkým kontrastem), se možná stanou nedocenitelnými při
zkoumání vzorků obsahujících složky s nízkým kontrastem, protože i špatně viditelné nebo
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
149
neviditelné detaily jsou díky nim viditelné (Oldfield 1994). Na obrázku 9.2 je znázorněn příklad
zvýšení viditelnosti pevných a polotuhých složek v komerčním krému pro lokální aplikaci při
pozorování pomocí fázově kontrastního mikroskopu.
Nezbytnou součástí optického mikroskopu při zjišťování vzhledu vzorku je kamera a většina
mikroskopistů dnes používá digitální kamery. Digitální mikrofotografie poskytuje vysoce kvalitní
snímky s dobrým rozlišením, za nízkou cenu a především umožňuje lepší kontrolu snímků, které je
možné okamžitě vyhodnotit (rozhodující vlastnost při zkoumání labilních vzorků), a elektronickou
archivaci. Při studiu vzorků za jiných než běžných podmínek, například při použití vyhřívaného stolku
(sekce 9.7.1), je možnost nahrát videosekvenci, zachycující tepelně závislé změny pro jejich pozdější
zhlédnutí, velmi výhodná. Mnohé mikroskopické snímky, které jsou součástí „nemikroskopických“
vědeckých
článků
a
časopisů,
jsou,
naneštěstí,
velmi
často
významně
nekvalitní,
v neakceptovatelných barvách, jsou rozostřené, jsou na nich viditelná rozmazaná zrnka prachu nebo
jim chybí měřítko. Zručnost mikroskopisty je posuzována podle kvality mikrofotografií pořizovaných
jako součást interních zpráv, prezentací a publikací. Mikroskopista zajišťuje kvalitu mikrofotografií
správnou přípravou vzorků, správným nastavením osvětlení mikroskopu a vyvarováním se zobrazení
v barvách, pokud je jednobarevný obrázek dostatečný pro znázornění požadovaných detailů. Digitální
kamera nemusí být drahá ani složitá; dostatečně kvalitní mikrofotografie mohu být získány pomocí
kompaktní ruční kamery, umístěné přímo v okuláru mikroskopu.
Obrázek 9.2 Mikrofotografie tenkého filmu připraveného krému pro lokální aplikaci (Eumovate®),
znázorňující nízkou viditelnost pod rovinně polarizovaným světlem (vlevo) a dobrou viditelnost při
využití fázového kontrastu
5.4.2. Příprava vzorku pro optickou mikroskopii
Mikroskopické preparáty, například prášky, připravené na mikroskopickém sklíčku, mohou být jak
dočasné tak trvalé a většinou se skládají z malého množství vzorku rozptýleného v kapalném médiu,
rozprostřeného mezi podložní a krycí sklíčko. Lze rovněž vyzkoušet přípravu vzorku za sucha, lae
kontrast pak může být tak vysoký (kvůli velkému rozdílu hodnot indexů lomu vzduchu a vzorku), že
částice, zejména malé, se mohou jevit jako neprůhledné. Dočasné preparáty se připravují
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
150
rozptýlením malého množství vzorku (1 – 2 mg) v nepřilnavém kapalném médiu, jako je silikonový
olej, voda, glycerin nebo parafínový olej, a jsou prohlédnuty a před zlikvidováním případně
vyfotografovány. Použité množství vzorku by mělo být natolik malé, aby dispergované částice nebyly
viditelné, ale musí být dostatečné, aby mohlo být považováno za reprezentativní. Trvalé preparáty se
skládají ze vzorku rozptýleného v průsvitné, bezbarvé pryskyřici, která tvrdne (ztuhnutím taveniny,
odpařením rozpouštědla nebo po ozáření ultrafialovým zářením), a mohou být skladovány po
neomezeně dlouhou dobu jako reference pro porovnávání s ostatními vzorky.
Při přípravě mikroskopických preparátů z práškových vzorků je důležité ujistit se, že podložní i
krycí sklíčko je čisté (nepředpokládejte, že jsou čistá, jen proto, že je to napsané na krabičce!) a že při
přípravě nedošlo ke kontaminaci preparátu. Preparát by měl být co nejtenčí, aby byla potřebná
hloubka ostrosti minimální a aby byly velké i malé částice dobře viditelné při malém a středním
zvětšení. Pro předcházení problémům s hloubkou ostrosti, zejména při velkém zvětšení, je k dispozici
snadno ovladatelný software zvyšující hloubku ostrosti snímáním sérií obrazů při různém stupni
fokusace a jejich kombinací (Piper 2008).
Pro přípravu preparátů je k dispozici mnoho různých typů vodných i nevodných podpůrných médií
(McCrone a Delly 1973). Nejdůležitější je, aby se vzorek v podpůrném médiu nerozpouštěl ani s ním
nereagoval a aby mezi médiem a částicemi vzorku byl dostatečný kontrast na to, aby byly částice
viditelné. Pro přípravu dočasných preparátů je ideální silikonový olej, jelikož je prakticky inertní,
rozpouští se v něm jen velmi málo pevných organických látek a má dobrý optický kontrast. Kontrast
je zapříčiněn nízkým indexem lomu silikonového oleje (přibližně 1,4), který je mnohem nižší než
indexy lomu většiny pevných organických látek (podle zkušeností autora se indexy lomu většiny
pevných farmaceutik pohybují v rozmezí od 1,5 do 1,7). Na Obrázku 9.3a jsou znázorněny rozemleté
krystaly sildenafil citrátu, jejichž viditelnost je nízká, jelikož jsou rozptýleny v kapalině o vysoké
hodnotě indexu lomu, která je srovnatelná s hodnotou indexu lomu krystalů. Když je stejná
sloučenina rozptýlena v kapalině, jejíž index lomu je odlišný (silikonový olej), kontrast mezi částicemi
a kapalinou se zvýší a částice jsou snadno viditelné (viz Obrázek 9.3b).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
151
Obrázek 9.3 Rozemleté krystaly farmaceuticky aktivní látky (sildenafil citrátu) rozptýlené (a)
v kapalině s hodnotou indexu lomu téměř rovnou hodnotě indexu lomu látky, a (b)v silikonovém oleji
(index lomu 1,4)
5.4.3. Charakterizace krystalických a amorfních materiálů s využitím
polarizační optické mikroskopie
Průhledné pevné látky jsou považovány za nekrystalické (amorfní) nebo krystalické a jejich optické
vlastnosti mohou být zjištěny s využitím polarizační mikroskopie. Nekrystalické pevné látky jsou ty,
jejichž molekuly jsou orientovány náhodně, bez uspořádání na velké vzdálenosti. Krystalické pevné
látky jsou ty, jejichž atomy a molekuly jsou uspořádány v pravidelné, trojrozměrné mřížce
s dalekodosahovým uspořádáním. Navíc, krystalické pevné látky mohou být jak izotropní (jejich
vlastnosti nejsou závislé na směru pozorování), tak anizotropní, jejichž optické, fyzikální a chemické
vlastnosti jsou závislé na směru pozorování.
Pokud jsou anizotropní (dvojlomné) krystaly zkoumány mezi zkříženými polarizačními filtry,
nabývají jasných barev, známých jako interferenční barvy nebo polarizační barvy (Hartshorne a Stuart
1970). Tyto barvy jsou výsledkem interakce světla s krystalovou strukturou. Rovinně polarizované bílé
světlo vycházející z polarizačního filtru a vstupující do anizotropního krystalu je rozděleno na dva
navzájem kolmé paprsky, jejichž směry sledují hlavní směry vibrací (které odpovídají rozdílným
indexům lomu). Když tyto dva paprsky prostupují krystalem, jeden z nich je zpomalován více než
druhý, protože prochází prostředím s vyšším indexem lomu. Poté, co oba paprsky opustí krystal, je
jeden opožděn za druhým o několik nanometrů a barvy vznikají jako důsledek konstruktivní a
destruktivní interference při rekombinaci obou paprsků v jedné rovině v analyzátoru. Opoždění
narůstá s tloušťkou krystalu a s rozdílem mezi nejvyšší a nejnižší hodnotou indexu lomu. Rozdíly
v tloušťce krystalu (například v důsledku šikmosti rovin) vedou ke vzniku různých barev, které jsou
většinou pozorovány v barevných pásech, jež jsou ve skutečnosti zobrazením rovnoměrného
zpomalení.
Pokud je krystal orientován hlavními směry vibrací rovnoběžně s rovinami obou polarizačních
filtrů, což je jev zvaný extinkce (bude diskutováno níže), žádné barvy nejsou viditelné. Izotropní
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
152
krystaly polarizační barvy nevytvářejí, protože světlo jimi procházející se šíří ve všech směrech stejně
rychle a k interferenci nemůže dojít.
Amorfní pevné látky (jako sklo, vymrazované nebo sprejově sušené prášky) a kubické krystaly
(jako chlorid sodný) jsou izotropní a mají pouze jeden index lomu, značený n. Následkem toho
nevykazují dvojlom a při pozorování mezi zkříženými polarizačními filtry nedávají vznik
interferenčním barvám. Přestože jsou izotropní krystaly farmaceutických látek vzácné, možnost jejich
výskytu ve vzorcích, i jen malého množství, by nikdy neměla být vyloučena (např. malé krystaly
chloridu sodného vzniklé po neutralizaci kyseliny nebo báze). Častější jsou vymrazované nebo
sprejově sušené materiály jako konečné produkty. Je nutné říct, že izotropní pevné látky (zejména
rychle ochlazené sklo) může někdy vytvářet slabé interferenční barvy kvůli částečnému uspořádání
molekul vzniklého v důsledku pnutí.
Kromě krystalických pevných látek se řada farmaceutických látek vyskytuje ve formě kapalných
krystalů nebo mezofází. Kapalné krystaly jsou látky s vlastnostmi pevných látek i kapalin a je snadné
je zkoumat a charakterizovat s využitím polarizační mikroskopie, což bude detailněji popsáno v oddíle
9.7.4.
5.4.4. Určování optických vlastností krystalů
Vzorek může být zkoumán bez polarizačních filtrů (t. j. nepolarizovaným světlem), nebo s využitím
jednoduše polarizovaného (t. j. rovinně polarizovaného) světla, nebo mezi dvěma polarizačními filtry
orientovanými kolmo na sebe (t. j. zkříženými polarizačními filtry). Při použití nepolarizovaného světla
nemohou být optické vlastnosti vztaženy k rovině polarizace a zjištěny mohou být jen průměrné
vlastnosti (jako index lomu nebo barva); tvary a velikosti částic mohou být rovněž určeny. Pozorování
s využitím rovinně polarizovaného světla nabízí diagnostické analytické informace o optických
vlastnostech krystalů, například o směrech, v nichž je hodnota indexu lomu nejnižší resp. nejvyšší,
vzhledem ke krystalografickým osám nebo určitým plochám krystalu. V případě barevných
anizotropních krystalů je další diagnostickou vlastností pleochroismus, při němž je při pozorování
rotujícího krystalu pod rovinně polarizovaným světlem selektivně absorbováno světlo o určité vlnové
délce (Hartshorne a Stuart 1970). Absorpce je řízena strukturou krystalu a pleochroismus nevykazují
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
153
bezbarvé krystaly, ale lze jej předpokládat u výrazně barevných farmaceuticky aktivních látek
(žlutých, oranžových nebo červených) a je pozorován jako, někdy velmi nepatrná, změna barvy nebo
její intenzity.
Na rozdíl od izotropních materiálů, anizotropní krystaly jsou běžnými farmaceutickými látkami a
při pozorování mezi zkříženými polarizátory vykazují jasné interferenční barvy díky dvojlomu. Jsou
charakteristické tím, že mají dvě hlavní hodnoty indexu lomu (zvané „epsilon“ a „omega“, nebo E pro
mimořádný (Extraordinary) a O pro řádný (Ordinary)) v případě jednoosých krystalů, nebo tři hlavní
hodnoty indexu lomu (zvané „alfa“, „beta“ a „gamma“ nebo X, Y a Z v pořadí podle zvyšující se
hodnoty indexu lomu) pro dvouosé krystaly (Hartshorne a Stuart 1970). Jednoosé krystaly mají jednu
optickou osu a patří do hexagonální, trigonální nebo tetragonální krystalové soustavy. Dvouosé
krystaly, které mají dvě optické osy, patří do orthorombické, monoklinické a triklinické soustavy.
Pečlivým určením optických vlastností pevných látek (jak dobře formovaných krystalů, tak fragmentů
nepravidelných tvarů) s využitím polarizační mikroskopie je možné velmi rychle zjistit, zda jsou
amorfní nebo krystalické a zda jsou jednoosé nebo dvouosé. Hlavní hodnoty indexu lomu
anizotropních krystalů mají jednoznačné směry, které jsou navzájem kolmé a které se shodují se
směry, v nichž krystalem prostupuje světlo (Hartshorne a Stuart 1970). U hexagonálních, trigonálních,
tetragonálních a orthorombických krystaly se tyto směry shodují rovněž s hlavními krystalografickými
osami. V případě monoklinických krystalů se s krystalografickými osami shodují pouze dva směry
šíření světla (nebo i tři v případě, že velikost krystalografického úhlu β je blízká 90°, přičemž tento
krystal může být zaměněn za orthorombický krystal, tj. je pseudo-orthorombický). V případě
triklinických krystalů, všechny tři, dva, jeden nebo žádný ze směrů šíření světla souhlasí se směrem
krystalografických os.
Při pozorném mikroskopickém zkoumání optických vlastností krystalů v různých směrech
vzhledem k rovině polarizovaného světla je možné dát tyto vlastnosti do souvislosti s tvary krystalů a
určit, do které krystalografické soustavy, a případně i bodové grupy, krystaly náleží. Pro měření
krystalových ploch a orientovaných úhlů, které plochy svírají, s přesností nutnou pro výpočet poměrů
os je třeba užít optickou goniometrii (pro mikroskopické krystaly) nebo kontaktní goniometrii (pro
velké krystaly) a dobře formované monokrystaly (Terpstra a Codd 1961). Po stanovení těchto
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
154
základních parametrů mohou být identifikovány krystalové plochy a vypočítány Millerovy indexy.
Tato metoda byla užívána krystalografy před téměř 100 lety, kdy ještě nebyla k dispozici metoda
rentgenové difrakce. Při použití mikroskopu s otočným stolkem (t. j. používaným jako jednokruhový
goniometr) je možné měřit skutečné úhly svírané sousedními krystalovými plochami, ale jen pokud
jsou kolmé k rovině stolku (Donnay a O´Brien 1945). Krystalové plochy orientované šikmo k rovině
stolku svírají zdánlivý úhel a skutečný úhel může být změřen pomocí grafických metod. Pro příliš malé
krystaly (např. o velikosti 10 µm nebo menší) byly za účelem měření s využitím optického mikroskopu
nebo v upevnění na dvoukruhovém goniometru využity obrazy krystalových ploch získané při měření
na skenovacím elektronovém mikroskopu (Strom 1976). Nicméně, mikroskopické goniometrická
měření by byla časově náročná a nejspíš nejsou praktickou alternativou moderních krystalografických
technik používaných ve vytížených laboratořích s omezenými časovými možnostmi. Pro podporu
regulací a patentových přihlášek farmaceutických látek, jednoznačné a co nejpřesnější zařazení
krystalu do prostorové grupy vyžaduje přesnost rentgenové krystalografie. Některé krystalové
struktury, které byly popsány před více lety s využitím rentgenových krystalografických metod, jsou
dnes znovu měřeny kvůli opravám nepřesností v určení indexů hlavních ploch, příkladem budiž
aspirin (Aubrey-Medendorp a kol. 2008). Mikroskopická pozorování jsou stále užitečná, protože
pomáhají určení a ověření krystalové struktury. Popsané nákresy krystalů nejsou většinou pro
regulační orgány nezbytné, ale mohou být užitečné při monitorování změn ve vzhledu krystalů
během vývoje léčiv. Pokud nemůže být struktura krystalu určena, například u příliš malých krystalů,
může samotné pozorování pod mikroskopem poskytnout dostatek informací pro rozlišení různých
forem pevných látek a včasný výběr kandidátů pro další vývoj do doby, než budou k dispozici krystaly
vhodné pro analýzu.
Anizotropní monokrystal (t. j. neaglomerovaný a nezdvojčatělý) nebo jeho fragment je pozorován
mezi zkříženými polarizačními filtry, interferenční barvy jsou nejlépe viditelné při otočení stolku
o 90°. Mezi těmito čtyřmi maximy jsou čtyři polohy o minimální jasnosti, kde dochází k jevu známému
jako extinkce (zhášení), při němž se krystal stane neviditelným, protože se navzájem kolmé optické
směry překrývají s rovinami polarizace polarizátoru a analyzátoru. Extinkční úhly jsou diagnostickými
optickými vlastnostmi a mohou být využity pro zjištění, zda je krystal monoklinický nebo triklinický
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
155
(Hartshorne a Stuart 1970). Některé dvouosé krystaly v extinkční poloze nezčernají úplně, ale
zůstanou slabě zabarvené, nebo se jejich barva dokonce změní (např. ze žluté na modrou) po obou
stranách okolo polohy o minimální jasnosti; tento jev je znám jako disperzní extinkce a dochází k ní
například u monoklinického krystalu partacetamolu, který je pozorován podél osy b (Nichols 1998).
Při měření extinkčního úhlu je přední hrana krystalu umístěna rovnoběžně s jednou z úseček
nitkového kříže v okuláru mikroskopu (přitom je nutné dočasně vychýlit polarizační filtry ze zkřížené
polohy) a je zaznamenána velikost úhlu na kruhové stupnici otočného stolku. Stolek je poté otáčen,
dokud nedojde k extinkci, je zaznamenána aktuální velikost úhlu a velikost extinkčního úhlu je
vypočtena jako rozdíl zaznamenaných velikostí (podle konvence velikost extinkčního úhlu
nepřesahuje 45°). Hexagonální, trigonální, tetragonální a orthorombické krystaly vykazují přímou
(nebo rovnoběžnou) extinkci a zčernají, pokud jsou jejich dlouhé hrany, které jsou rovnoběžné
s optickými směry krystalu, rovnoběžné s úsečkami nitkového kříže v okuláru mikroskopu. Pokud není
dlouhá hrana rovnoběžná s optickým směrem, může dojít k extinkci v poloze, v níž je hrana sdílená
dvěma hlavními krystalovými rovinami půlená úsečkami nitkového kříže, a tato extinkce je nazývaná
symetrická extinkce. Nicméně, v případě monoklinických krystalů bude stejný krystal v různých
orientacích vykazovat jak přímou, tak šikmou (nebo nakloněnou) extinkci, což je nejvíce patrné u
protáhlých krystalů, jako jsou jehlice a hranoly. K tomuto jevu dochází, protože monoklinický krystal
bude při pozorování podél roviny souměrnosti, která obsahuje krystalografické osy a a c (t. j. která je
kolmá na krystalografickou osu b), vykazovat přímou extinkci. Pokud není směr pozorování kolmý
k této rovině, krystal bude vykazovat šikmou extinkci a pozorovaná velikost úhlu se bude zvyšovat až
do maximální hodnoty, které dosáhne, když je krystal pozorován ve směru rovnoběžném s osou b.
Pro objasnění je na Obrázku 9.4 znázorněn monoklinický monokrystal paracetamolu pozorovaný pod
dvěma různými úhly při otáčení po krocích o velikosti 45° kvůli demonstraci jak přímé, tak šikmé
extinkce (všimněte si, že tyto snímky byly pořízeny s využitím polarizačních filtrů lehce odkloněných
od zkřížené polohy, a proto jsou extinkční polohy viditelné). Za účelem prohlédnutí pod různými,
navzájem kolmými směry, byl krystal otočen v kapalném médiu o 90° a byl tedy pozorován jak ve
směru kolmém na krystalografickou osu b, tak i v jejím směru.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
156
V případě triklinických krystalů může dojít k přímé extinkci, ale není to běžné, charakteristická je
šikmá extinkce. Při zkoumání nepravidelně tvarovaných krystalů nebo jejich rozdrcených úlomků
nebude nejspíš možné určit, zda mají charakteristický extinkční úhel, pod nímž není viditelná žádná
z hlavních hran krystalu. Nicméně, pečlivé prozkoumání úlomků krystalu může odhalit přítomnost
lineárních charakteristik závislých na struktuře, jako jsou štěpné plochy nebo stopy okluzí kapaliny,
které kopírují krystalové plochy, které mohou být využity při měření extinkčního úhlu.
Izotropní částice může být ve formě dobře vyvinutého krystalu nebo, nejčastěji, ve formě
skelného materiálu (jako jsou podchlazené taveniny nebo materiály získané sprejovým sušením nebo
vymrazováním). Aby byly od sebe tyto formy odlišeny, částice by měla být prohlédnuta (s využitím
rovinně polarizovaného světla) kvůli zjištění přítomnosti krystalových ploch nebo stop štěpných rovin
(někdy jsou viditelné jako přímé rovnoběžné linie uvnitř krystalu), které mohou být nevyvratitelným
důkazem, že jde o krystal. Nedeformované izotropní krystaly zůstávají při rotaci stolku trvale
v extinkci. Částice skelného materiálu nemají tyto vlastnosti, ale jsou obvykle nepravidelného tvaru
s ostrými hranami a pravděpodobně i se zakřivenými lomnými plochami. Částice získané sprejovým
sušením mají sklený charakter a jsou často kulové a duté.
Obrázek 9.4 Složená mikrofotografie znázorňující dva pohledy na monokrystal monoklinického
paracetamolu v pozici přímé (vlevo) a šikmé (vpravo) extinkce při rotaci s krokem 45° z pozice o
maximální jasnosti; je vyznačen úhel šikmé extinkce (asi 36°) při pohledu rovnoběžném s osou b,
mikrofotografie byly pořízeny při mírném vychýlení polarizačních filtrů z navzájem kolmých poloh pro
zviditelnění extinkčních poloh
Polykrystalická částice, skládající se z mnoha malých krystalků, pravděpodobně nebude mít při
pozorování mezi zkříženými polarizátory přesnou extinkční pozici. Práškové materiály mohou
obsahovat tyto částice, které se mohou vyskytovat jako aglomeráty, shluky nebo jehlice (možná i jako
sferulity ), vrstvy plochých krystalů, nebo dokonce jako pseudomorfy, které se zformovaly po
konverzi mezi dvěma pevnými polymorfními fázemi nebo po desolvataci solvátu. Příklad
polykrystalického pseudomorfu latovitého tvaru, jehož krystalky jsou orientovány nahodile jako
mozaika, je uveden na Obrázku 9.5. Když je jeden z krystalků v extinkční poloze, sousední krystalky
jsou jasné a naopak. Celkový efekt je ten, že polykrystalická částice nevykazuje při rotaci mezi
zkříženými polarizátory jednu extinkční pozici.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
157
Dislokace v krystalu se obvykle objevují na úrovni molekul nebo atomů jako důsledek napětí
způsobených rychlým růstem krystalu nebo mechanickou deformací (jako je mletí) a mohou způsobit
ohnutí krystalové mřížky. Dislokace nejsou přímo viditelné v optickém mikroskopu, takže pro jejich
detailní studium je nutno použít mikroskop s rozlišením na úrovni atomů, jako transmisní elektronový
mikroskop nebo mikroskop atomárních sil. Nicméně pokud jsou dislokace v krystalu přítomny,
mohou způsobit narušení mřížky napětím a mohou být rozeznány při pozorování mezi zkříženými
polarizátory jako vlnitá extinkce. Vlnitá extinkce je patrná jako tmavá „vlna“ probíhající napříč
monokrystalem, když je jím otáčeno na stolku a různé části krystalu se dostávají do extinkce. Tato
nepřítomnost jediné extinkční polohy, způsobená napětím v krystalové mřížce, není totožná
s disperzní extinkcí (popsána výše) nebo polykrystalinitou, přestože v polykrystalu může rovněž dojít
k napětí mřížky v důsledku změn struktury při polymorfních přeměnách nebo desolvataci. Napětí
krystalové mřížky, které je výsledkem krystalizace z rychle zchlazené taveniny, je detailněji popsáno
v oddílu 9.7.1. Krystaly, v nichž došlo k napětí mřížky, se mohou rozpouštět rychleji než krystaly bez
mřížkového napětí, protože napětí je spojeno s částmi krystalu majícími velkou krystalizační energii.
Následkem toho může být napětí mřížky žádanou vlastností některých farmaceutických materiálů pro
zvýšení jejich rozpustnosti. Polarizační mikroskopie může být tedy použita kvalitativně při zjišťování
přítomnosti krystalů s napětím mřížky ve vzorku. Pro kvantitativní analýzu krystalů s napětím byl
vyvinutý automatický mikroskop, s jehož pomocí lze, s využitím zobrazení monochromatickým
světlem, rychle stanovit prostorové rozdělení změn dvojlomu napříč vzorkem (Glazer a Geday 2002).
Obrázek 9.5 Polykrystalický pseudomorf vytvořený během vývoje farmaceuticky aktivní látky, na
němž je patrná mozaikovitá textura krystalků, které při pozorování mezi zkříženými polarizátory
nevykazují jednu určitou extinkční polohu
Kvantitativní mikroskopie nebude vhodná pro mnoho práškových materiálů, zejména pro ty
tvořené malými částicemi, a pro zjištění velikosti napětí v těchto vzorcích bude tedy vhodnější
technikou prášková rentgenová difrakce, při níž bude sledováno rozšíření píku způsobené poruchou
mřížky.
U látek nevykazujících napětí ani dvojlom nejsou při pozorování mezi zkříženými polarizátory
patrné interferenční barvy, tyto látky se jeví černé na černém pozadí. Je to cenná a snadno
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
158
pozorovatelná vlastnost, díky níž lze odlišit izotropní vzorky od anizotropních. Nicméně, jelikož nejsou
viditelné, mohou být izotropní částice (jako je sklo) ve směsi s anizotropními krystaly při pozorování
mezi zkříženými polarizátory přehlédnuty. Naštěstí existuje mnoho jednoduchých způsobů nastavení
mikroskopu pro pozorování izotropních a anizotropních částic zároveň. Jedním z těchto způsobů je
odchýlení jednoho z polarizátorů jen o několik stupňů tak, že se zorné pole zbarví do šeda a všechny
částice se stanou viditelnými. Pro příklad, na Obrázku 9.6 je uvedena mikrofotografie směsi mleté
sacharózy (anizotropní) a částeček v mrazu sušené sacharózy (izotropní) rozptýlené v silikonovém
oleji, pořízená s využitím zkřížených polarizátorů. Jen pokud jsou polarizátory mírně vychýlené ze
zkřížené polohy (asi o 10°), se skelné a houbovité částice v mrazu sušené sacharózy stanou
viditelnými (Obrázek 9.6b).
Interferenční barvy vznikající při pozorování anizotropních částic mezi polarizátory částečně
vychýlenými ze zkřížené polohy budou podobné těm, které jsou pozorovány při zkřížené poloze
polarizátorů. Anizotropní částice umístěné v extinkční poloze mohou být zaměněny za izotropní. Pro
zjištění, zda jsou takové částice anizotropní, musí být stolek pootočen o několik stupňů dozadu a
dopředu a sleduje se, zda částice opustí extinkční polohu. Další metodou zobrazení směsi izotropních
a anizotropních částic je vložení citlivé barevné kompenzační destičky (byla popsána v oddíle 9.4.1),
ale, mimo zbarvení pozadí do purpurova, nemá tato metoda, ve srovnání s polarizátory vychýlenými
ze zkřížené polohy, žádné významné výhody, protože se při ní nelze vyhnout extinkční poloze. Aby
bylo jisté, že všechny anizotropní částice budou ve všech orientacích jasné, jsou jejich extinkční
polohy při použití kruhově polarizovaného světla vyloučeny. Toho je dosaženo zařazením dvou
zkřížených čtvrtvlnových kompenzátorů (jeden pod a druhý nad vzorkem, ale zároveň mezi
polarizačními filtry) a pro sledování izotropním i anizotropních částic ve směsi musí být polarizátory
částečně vychýleny ze zkřížené polohy (McCrone a kol. 1979).
Obrázek 9.6 Mikrofotografie znázorňující směs mleté anizotropní sacharózy a izotropních částic
v mrazu sušené sacharózy rozptýlené v silikonovém oleji, pořízená mezi zkříženými polarizátory (a) a
mezi polarizátory vychýlenými o 10°(b) pro zobrazení skelných, houbovitých částic v mrazu sušené
sacharózy
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
159
Anizotropní částice pozorované s využitím kruhově polarizovaného světla jsou rovněž ideální pro
obrazovou analýzu, jelikož všechny částice jsou jasné proti tmavému pozadí a obrazy jsou tedy
dostatečně binárně rozlišené a připravené pro počítačový záznam obrazu bez nutnosti komplexního
zpracování obrazů před analýzou.
Polarizační optická mikroskopie může být samozřejmě použita pro detekci dvojlomu v malých
množstvích vzorku pro zjištění, zda jsou krystalické, amorfní, nebo jde o směs obou dvou. Během
vývoje farmaceuticky aktivních látek je vyvíjena velká snaha o zajištění jejich krystality, která
umožňuje kontrolu čistoty a chemické stability, a o zajištění stálé produkce správné formy pevné
látky. Nicméně, krystalický materiál je méně rozpustný ve vodě než amorfní forma stejné látky a
proto může být výběr optimální formule o odpovídající vstřebatelnosti při orálním podání náročný.
Pro překonání špatné rozpustnosti některých krystalických farmaceuticky aktivních látek ve vodě
jsou mnohými vědci zkoumány nové formule, zvané pevné disperze. Osahují amorfní farmaceuticky
aktivní látky, které jsou důkladně promíchány s amorfním polymerním stabilizátorem, jako je PVP
nebo PEG, sprejovým sušením, lisováním horké taveniny nebo sušením v mrazu. Během vývoje
pevných disperzí je pro pozorování interakcí krystalických farmaceuticky aktivních látek s polymerem
za vysokých teplot často užívána polarizační termomikroskopie (Lloyd a kol. 1997); Lakshman a kol.
2008). Teplota, při níž farmaceuticky aktivní látka taje za vzniku pevné disperze, je rychle určena,
jelikož se z ní stává izotropní kapalina (možná ve formě eutektika s polymerem) a při pozorování mezi
zkříženými polarizátory nevykazuje žádné interferenční barvy. Roztavená farmaceuticky aktivní látky
by měla být, v ideálním případě, mísitelná s polymerem, což je dokázáno ochlazením preparátu a
potvrzením nepřítomnosti dvojlomných krystalů, které by vznikly při rekrystalizaci.
Zařízení pro detekci dvojlomu mohou být umístěna do automatizovaného, vysoce výkonného
systému pro kontrolu solí a polymorfů, aby bylo možno pátrat po známkách krystality v destičkách
s mnoha prohlubněmi (Desrosiers 2004; Sugano a kol. 2006). Nicméně, použití polarizační
mikroskopie pro detekci dvojlomu není způsob pro rozlišení mezi amorfními a krystalickými
materiály. Některé skelné částice mohou vykazovat napětí, například kvůli rychlé krystalizaci při
odpařování roztoku. Toto napětí může zapříčinit protažení molekul, při němž částice vykazují dvojlom
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
160
a často také interferenční barvy a extinkční polohy při pozorování mezi zkříženými polarizátory.
Nepřítomnost interferenčních barev a extinkčních poloh rovněž neznamená, že jsou částice amorfní.
Například trigonální nebo hexagonální krystal se při pozorování přesně ve směru jeho optické osy
(která odpovídá krystalografické ose c) nachází v extinkční poloze při jakémkoli natočení stolku
(Hartshorne a Stuart 1970). Taková částice může být při aplikaci testu pro charakterizaci krystality,
navrženém USP (US Pharmacopoeia 2009a) chybně označena za nekrystalickou. Izotropní částice,
které vykazují napětí, se budou naopak vyznačovat určitým stupněm uspořádanosti molekul a budou
vytvářet interferenční barvy nízkého řádu a při každém pootočení o 90° budou vykazovat extinkční
polohu. Díky tomu mohou být tyto částice chybně označeny za krystalické. Pro potvrzení
krystalického charakteru vzorku by měla být použita rentgenová difrakce ve spojení s mikroskopií.
Pro vyhodnocení stupně krystality není možné používat samostatně polarizační mikroskopii, a proto
by měly být využívány další techniky, jako rentgenová difrakce, kalorimetrie nebo NMR pevné fáze.
5.4.5. Měření indexu lomu pevných látek
Index (nebo indexy) lomu průhledné pevné látky patří mezi fyzikální konstanty a je cennou
diagnostickou vlastností, která může být využita pro charakterizaci materiálů. Různé pevné fáze jedné
sloučeniny (jako polymorfy a solváty) mají rozdílné hodnoty hlavních indexů lomu, protože jejich
krystalové struktury jsou odlišné (Hartshorne a Stuart 1970). Indexy lomu pevných látek jsou snadno
určeny s využitím optické mikroskopie při postupném vkládání krystalu nebo jeho úlomků do kapky
kapaliny o známém indexu lomu (jako jsou ty dostupné u Cargille Laboratoires, New Jersey, USA) na
podložním sklíčku. Beckova linie (pás jasného světla pohybující se při změně fokusace mikroskopu do
částice a zase ven z částice) je využívána pro zjištění, zda je index lomu částic vyšší nebo nižší než
index lomu kapaliny. Pokud má index lomu částic stejnou hodnotu jako index lomu kapaliny, nejsou
částice viditelné, protože mají minimální kontrast (Wahlstrom 1960). Tento nedostatek kontrastu je
znázorněn na Obrázku 9.3. Je potřeba pečlivě zajistit, aby se částice v kapalině nerozpouštěly (může
být nezbytné prohlédnout preparát mezi zkříženými polarizátory pro ujištění, že částice jsou stále
přítomny).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
161
Izotropní materiály, jako je sklo a kubické krystaly, mají jedinou hodnotu indexu lomu (při určité
teplotě a vlnové délce světla), která může být zjištěna s využitím nepolarizovaného světla na jakékoli
částici v jakékoli orientaci. V případě anizotropních krystalů, které mají dvě (jednoosé krystaly) nebo
tři (dvouosé krystaly) hlavní hodnoty indexu lomu, musí být pro definování roviny polarizace při
osvitu použito rovinně polarizované světlo. Jednou z metod, při níž je potřeba určit průměrnou
hodnotu indexu lomu práškového materiálu, je při výpočtu hodnoty podle Mieovy teorie při měření
velikosti částic pomocí rozptylu laserového záření.
Měření dvou nebo tří hodnot indexu lomu anizotropních krystalů je ztíženo kvůli skutečnosti, že
krystaly musí být pečlivě orientovány vzhledem k rovině polarizátoru, což se provádí jejich otáčením
v kapalině (Hartshorne a Stuart 1970). Jakmile je toto provedeno, je možné změřit dvě nebo tři hlavní
hodnoty indexu lomu podél navzájem kolmých směrů v krystalu. Tato metoda byla použita pro
měření a popis optických vlastností dvou forem paracetamolu (Nichols 1998).
5.4.6. Určení mikrorozpustnosti pevných látek
Kvalitativní určení rozpustnosti sloučeniny v různých rozpouštědlech může být provedeno rychle
za pokojové teploty s využitím malého množství vzorku nebo i jen jednotlivých krystalů při jejich
pozorování v optickém mikroskopu. Jednoduchý způsob provedení tohoto testu rozpustnosti je
založen na pomalém přikapávání rozpouštědla z mikropipety na hranu krycího sklíčka, pod nímž je
umístěno několik částic látky. Částice by měly být pozorovány ve chvíli, kdy rozpouštědlo proniká pod
krycí sklíčko a přichází s částicemi do kontaktu. Čas, který je potřeba na rozpuštění sloučeniny (pokud
se rozpouští) je úměrný její rozpustnosti v daném rozpouštědle. Dobře rozpustné sloučeniny se
většinou začnou rozpouštět už v parách rozpouštědla, které předchází kapalnou fázi a dostává se do
kontaktu s částicemi dříve. U špatně rozpustných látek je patné pouze lehké zaoblení hran a rohů, a
proto může být rychlost rozpouštění zvýšena rozdrcením částic nebo lehkým zahřátím sklíčka (pokud
rozpouštědlo není příliš těkavé).
Jiná metoda spočívá v přidání jediné částice testovaného vzorku do jedné kapky rozpouštědla na
podložním sklíčku bez použití krycího sklíčka. I špatná rozpustnost látky může být potvrzena vznikem
prstence z malých krystalů okolo okraje kapky nebo soustředných prstenců obkružujících částici při
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
162
odpařování rozpouštědla. Tyto malé krystaly mohou samozřejmě být solváty, ale jejich přítomnost
naznačuje, že testovaná částice je v rozpouštědle do určité míry rozpustná. Příklad použití této citlivé
metody je uveden na obrázku 9.7, kde je znázorněn úlomek phenacetinu o velikosti 1 mm, který byl
vložen do malé kapky vody přibližně 10 minut předtím, než vyschla. Přestože je phenacetin jen
částečně rozpustný ve studené vodě (přibližně 0,5 mg/ml), vytvořilo se mnoho malých krystalů,
přičemž ty nejvíce vně odpovídají okraji kapky vody.
Další mikroskopický test rozpustnosti, který může být použit pro jednotlivé částice o hmotnosti
menší než 1 ng, spočívá ve vložení částice do par rozpouštědla. Oproti ostatním metodám má tato
metoda výhodu v možnosti postupně vystavit stejnou částici parám několika různých rozpouštědel.
Při této metodě je používána parní komora, skládající se ze skleněného kroužku (krátká část skleněné
trubice s jemně zaoblenými konci) umístěného na podložním sklíčku a krycího sklíčka uzavírajícího
komoru, pod něž se vkládá testovaná částice (McCrone 1983). Ke spodnímu okraji skleněného
kroužku je přidána jedna kapka rozpouštědla a díky kapilaritě je vtaženo do parní komory ve formě
syté páry.
Obrázek 9.7 Mikroskopický test rozpustnosti potvrzující částečnou rozpustnost phenacetinu ve vodě
při pokojové teplotě. Velký úlomek částečně rozpuštěného phenacetinu je obklopen kroužky malých
krystalů phenacetinu, které rekrystalizovaly při odpařování kapky vody
Částice je pozorována pod mikroskopem (při velkém zvětšení, pokud je to nutné) skrz krycí sklíčko
a je sledováno, zda páry kondenzují a rozpouštějí částici. Při výměně rozpouštědla je krycí sklíčko
opatrně nadzvednuto ze skleněného kroužku (aby mohl zbytek páry uniknout a aby, pokud je to
nutné, mohla částice oschnout a rekrystalizovat) a poté je umístěno zpět, a procedura se může
opakovat s dalším rozpouštědlem. Autor jednou použil tuto proceduru pro testování rozpustnosti
jediné částice o velikosti 20 µm v sedmnácti různých rozpouštědlech a pro výběr nejlepšího
rozpouštědla pro hmotnostní spektrometrii malého množství kontaminantu izolovaného z produktu
pro parenterální použití.
V ideálním případě by mělo být výhodné provést kvantitativní mikroskopický test rozpustnosti,
zejména pokud je k dispozici pouze malé množství materiálu. Naneštěstí neexistuje žádná snadný
způsob kvantitativního provedení mikroskopického testu rozpustnosti (W. C. McCrone, personální
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
163
komunikace, 18. leden 1994). Jeden způsob vyžaduje přesné určení hmotnosti jednotlivé částice
nebo krystalu, a to vážením na ultramikrovahách nebo měřením jeho rozměrů pro výpočet hmotnosti
ze vztahu objem x hustota. Jen poté může být rozpustnost určena při použití známého objemu
rozpouštědla. Tato metoda může poskytovat výsledky zatížené chybami a nejspíš bude stále
používána jen pro zjištění relativní rozpustnosti.
5.5. Tvar krystalů
Při charakterizaci farmaceutických materiálů v pevném stavu poskytuje pozorování jejich krystalů
v práškové nebo kašovité formě pod mikroskopem cenné informace o jejich tvarech.
Vnější tvar krystalu, nebo přesněji jeho vzhled, je ovlivněn jeho vnitřní strukturou a společným
růstem vzájemně symetrických ploch. Změna tvaru krystalů rostoucích z roztoku je silně ovlivněná
mnoha faktory, mezi něž patří stupeň přesycení, rychlost ochlazování, polarita rozpouštědla, teplota
a obsah nečistot (Davey a Garside 2000). Krystaly rostoucí z taveniny nebo páry nejsou ovlivněny
rozpouštědlem a v důsledku toho ovlivňuje tvar krystalů teplota, rychlost ochlazování a tlak par.
Tvary krystalů známým způsobem ovlivňují proces jejich zpracovávání, filtrovatelnost, chemickou
a fyzikální stabilitu, chování při tabletování a chování při rozpouštění (Haleblian 1975; Tiwary 2001).
Rozpoznání jakýchkoli změn, jakkoli nepatrných, ve tvaru krystalů z různých dávek sloučeniny může
být varováním upozorňujícím na změny v průběhu krystalizace, které mohou ovlivnit zpracovatelnost
výsledného produktu. Byla provedena i studie porovnávající experimentálně zjištěné tvary tří
polymorfů jedné farmaceutické sloučeniny s tvary předpovězenými z krystalové struktury (Coombes
a kol. 2002). Závěrem tohoto výzkumu bylo, že rozdíly mezi skutečnými a vypočítanými tvary
potvrzují význam rozpouštědla při růstu krystalů.
Krystaly jsou trojrozměrné objekty a pro přesný popis jejich tvarů je potřeba sledovat a změřit
jejich délky, tloušťky a šířky. Nicméně jakmile je podložní sklíčko připravené, ploché a protáhlé
krystaly budou mít tendenci se pokládat a ležet ve stabilní pozici na svých největších plochách (stav
známý jako preferovaná orientace) a zobrazena je největší promítnutá oblast. Následkem toho není
vždy patrná tloušťka krystalu a částice jsou pod mikroskopem pozorovány jako dvourozměrné
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
164
objekty. Bez znalosti jejich tloušťky nemůže být jejich tvar popsán s jistotou. Vědomí o jejich tloušťce
může být získáno zaostřováním nahoru a dolů skrz krystal a jejich trojrozměrné tvary mohou být
získány velmi rychle (je nutné poznamenat, že jemné zaostření optického mikroskopu je stupňováno
po jednotkách o velikosti přibližně 1 µm). Jiný, praktičtější a rychlejší postup je otáčení krystalů tak,
že jejich trojrozměrné tvary mohou být pozorovány, jemným pohybováním krycím sklíčkem po
preparátu s pomocí jehlové sondy.
Vzhled krystalů může být popsán pomocí mnoha termíny, z nichž většina je odvozená z termínů
užívaných mineralogy a krystalografy. Specifické typy krystalů mají specifické názvy, jako osmistěn
nebo hexagonální bipyramida, a může být obtížné je přiřadit, zejména pokud jsou tyto krystaly
pozorovány jen v jednom směru, jejich růst nebyl pravidelný nebo byly popisovány spíš podle
dvourozměrné mikrofotografie než podle „živého“ obrazu. Specifické názvy by proto měly být
užívány, jen pokud neexistují žádné pochybnosti o tvaru krystalu; název jako „podobný osmistěnu“
stačí pro vyhnutí se jakékoli nejasnosti. Pro jednoduchost a srozumitelnost je zavedeno šest
základních tvarů (Hartshorne a Stuart 1970; McCrone a Delly 1973). Ty s nízkým poměrem šířky k
výšce mají vysokou symetrii, ať už jsou krychlovité nebo kulovité; destičky jsou ploché a mají vzhled
tablet; vločky jsou ploché a tenké; laťky jsou dlouhé a lístkovité; hranoly jsou sloupcovité; jehlice jsou
dlouhé a tenké s vysokým poměrem šířky k výšce. Na obrázku 9.8 jsou tyto základní tvary znázorněny
a krystaly těchto tvarů mohou patřit do kterékoli ze sedmi krystalografických soustav.
Obrázek 9.8 Šest základních tvarů krystalů
Tyto názvy tvarů jsou doporučeny pro popis tvarů částic farmaceutických látek (US
Pharmacopoeia 2009a). Další termíny, jako: stužkovitý, vláknitý, tyčinkovitý, čtvercového tvaru,
šestiúhelníkového tvaru, zaoblený a hranatý, by měly být rovněž užívány pro detailnější a
srozumitelnější podání informací o tvaru (Nichols 2006).
Popis tvaru krystalu může být poněkud subjektivní, i pokud je jako vodítko užíváno šest základních
tvarů. Mnoho vědců se pokoušelo (s různou úspěšností) odstranit vliv pozorovatele pomocí
automatického rozeznávání tvarů s využitím obrazové analýzy. Automatizovaná analýza obrazu může
být využita pro laboratorní vzorky v systému založeném na mikroskopu pracujícím v off-line režimu
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
165
(Faria a kol. 2003) nebo jako část systému monitorujícího růst krystalů různých tvarů v krystalizéru
v reálném čase (Calderon De Anda a kol.2005).
Rozdílné polymorfní formy sloučeniny jsou často charakteristické svými rozdílnými tvary.
Například forma I paracetamolu (monoklinická) se vyskytuje ve formě destiček, kdežto forma II
(orthorombická) ve formě jemných jehlic, jak je vidět na Obrázku 9.9.
Obrázek 9.9 Jehličkovité krystaly formy II paracetamolu, které se mění při fázové přeměně
v nasyceném roztoku benzylalkoholu na destičky formy I (měřítko=250 µm)
Pokud tvoří jedna sloučenina krystaly různých tvarů, neznamená to vždy, že jde o různé polymorfy,
ale spíše to znamená, že tyto krystaly rostly za různých podmínek.
Obrázek 9.10 Různé tvary krystalů monomorfní farmaceuticky aktivní látky krystalizované z toluenu
(vlevo) a z IPA (vpravo)
Například, na Obrázku 9.10 jsou znázorněny dva výrazně odlišné tvary krystalů monomorfního
protiplísňového léku, které krystalizovaly z roztoků v různých rozpouštědlech; výsledky práškové
rentgenové difrakce těchto dvou vzorků potvrdily shodnost jejich krystalových struktur, přestože
ukázaly výrazný vliv preferované orientace. Různé polymorfní formy téže látky naopak mohou být
tvořeny krystaly stejných tvarů.
5.6. Velikost částic
Chování látky v práškové formě neovlivňují jen tvary krystalů (viz kapitola 9.5), ale i distribuce
částic různých velikostí bude mít velký vliv na její chování při rozpouštění, na tokové vlastnosti, na
aerodynamické vlastnosti částic aerosolu a na stabilitu suspenzí (Brittain a kol. 1991).
Mikroskopy zvětšují obrazy vzorků nad velikost viditelnou pouhým okem a jsou používány pro
pozorování a měření částic, jejichž velikost se pohybuje v řádu od několika milimetrů v průměru do
několika nanometrů v průměru. Většina práškových materiálů, s nimiž se lze setkat během vývoje
medicínských produktů, má distribuci velikostí částic pohybující se mezi přibližně 1000 µm (1 mm) a
přibližně 0,01µm (10 nm). Velikost krystalů farmaceuticky aktivních látek, vzniklých při krystalizaci
z objemu roztoku, se pohybuje typicky od cca 1 mm do cca 10 µm a jsou snadno pozorovatelné
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
166
v optickém mikroskopu. Pro pozorování a měření částic mikropráškových materiálů o typických
velikostech mezi cca 10 µm a 0,1 µm je nejvhodnější skenovací elektronový mikroskop. Pro měření
ještě menších částic, například těch, jsou potřebná extrémně vysoká zvětšení poskytovaná
mikroskopem atomárních sil nebo transmisním elektronovým mikroskopem.
Výběr mikroskopu pro měření částic v určitém vzorku závisí na velikostech částic, které vzorek
obsahuje, jak je znázorněno na Obrázku 9.11. Aby nebyly přehlédnuty žádné důležité rysy vzorku,
může být výhodné použít při zkoumání vzorku více než jednu techniku; například velké shluky
v mikroprášku nemusí být pozorovatelné (kvůli variabilitě vzorkování) pokud je práškový materiál
zkoumán pouze s využitím SEM a nikoli s využitím optického mikroskopu.

transmisní elektronový mikroskop
nanočástice

mikroskop atomárních sil
nanočástice

skenovací elektronový mikroskop
nanočástice, mikroprášek

optický mikroskop

stereobinokulární mikroskop
prášek farmaceuticky aktivní látky

pouhé oko
granule tablety, prášek farmaceuticky aktivní látky
y
Obrázek 9.11 Diagram znázorňující typické intervaly velikostí částic některých farmaceutických
materiálů a různé mikroskopické techniky použitelné k jejich měření
Pokud je částice v prášku potřeba jen rychle přeměřit, například kvůli kontrole procesu
krystalizace, je technikou volby optická mikroskopie, protože příprava vzorku je rychlá a jednoduchá.
Složený optický mikroskop vybavený kalibrovanou měřící stupnicí umístěnou v okuláru, společně
s objektivy s nízkým, středním a vysokým zvětšením, je velmi užitečný nástroj pro široké použití při
měření částic o velikostech v rozsahu přibližně od 1000 µm do 1µm. Obraz měřící stupnice je položen
na obraz částic a velikosti jednotlivých částic jsou zjišťovány přímo. Když je potřeba změřit několik
stovek nebo tisíců částic pro statistické výpočty, není praktické provádět měření ručně z důvodu
časové náročnosti, náchylnosti k chybnému měření a pracnosti. Pro odstranění těchto nevýhod byly
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
167
vyvinuty automatizované analyzátory obrazu ovládané počítačem, umožňující rychlé objektivní
změření a spočítání částic stálým a opakovatelným postupem s využitím motorizovaného x-y stolku,
který umožňuje získání více obrazů povrchů preparátů.
Nejdůležitějším krokem při jakékoli obrazové analýze je příprava vzorku, nereprezentativní vzorek
poskytne nereprezentativní výsledky, zejména v případě práškových materiálů s širokým rozsahem
velikostí částic. Je nezbytné, aby částice byly dostatečně kontrastní (aby byla zajištěna jejich
viditelnost), dobře dispergované (pro odstranění nebo minimalizaci překrývání částic) a aby byl částic
dostatečný počet pro reprezentaci distribuce jejich velikostí v objemu vzorku. Jak je zmíněno v oddílu
9.4.4, využití kruhově polarizovaného světla může výrazně zlepšit viditelnost anizotropních částic při
použití obrazové analýzy. Dostatečná a reprodukovatelná disperze částic je hlavní těžkostí při
obrazové analýze a pro odstranění variability, která je při přípravě vzorků různými pracovníky
nevyhnutelná, bylo vyzkoušeno mnoho technik (Jillavenkatesa a kol. 2001). Nedávno vyvinutý plně
automatický systém pro analýzu obrazů, založený na optickém mikroskopu (the Malvern Morphology
G3) obsahuje rovněž jednotku pro tvorbu suchých disperzí pro přípravu dobře dispergovaných vzorků
před měřením velikostí a tvarů částic v práškových materiálech (Willen 2008).
Ideálním tvarem částic pro jakoukoli metodu zjišťování velikosti je koule, protože její velikost je
popsána jediným parametrem, průměrem. Nicméně, částice obsažené v práškových farmaceutických
materiálech jsou kulovité jen zřídka (kromě sprejově sušených materiálů) a častěji bývají jehličkovité,
destičkovité nebo nepravidelně tvarované. Pro tyto částice je jeden parametr velikosti nedostatečný;
existuje mnoho možných rozměrů, jako je největší délka, minimální šířka, obvod, průměr zobrazené
plochy (McCrone a Delly 1973), které mohou být změřena na jednotlivé nekulovité částici, všechny
mohou být rozdílné a všechny jsou správné! Vyvíjeny jsou počítačové algoritmy pro automatické
výpočty tvarů nekulových částic v práškových farmaceutických materiálech (Pons a kol. 2002).
5.7. Optická mikroskopie za nestandardních podmínek
Optická mikroskopie za nestandardních podmínek je používána pro výzkum materiálů za různých
teplot, vlhkosti a ve vakuu. Pozorování mohou pomoci interpretovat a vysvětlit data získaná z jiných
analytických technik za nestandardních podmínek, jako diferenční kalorimetrie, dynamická sorpce
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
168
par a prášková rentgenová difrakce s kontrolovanou teplotou a vlhkostí (viz Kapitola 2.).
Farmaceuticky aktivní látka může být během výroby, kdy dochází k její krystalizaci, je rozmíchávána,
filtrována, sušena a mleta, vystavena různým teplotám a vlhkostem. Navazující procesy zahrnující
granulaci za vlhka nebo za sucha, mrazové sušení, míchání, lisování a potahování filmem, vystavuje
farmaceuticky aktivní látku dalším fyzikálně-chemickým podmínkám při její přeměně ve finální
produkt. Pro porozumění změnám, které mohou nastat při převádění procesu do výrobního měřítka
(jako je dehydratace hydrátů při nízkých vlhkostech, vznik hydrátů nebo lyotropních mezofází při
vysokých vlhkostech, nebo polymorfní přeměny při vysokých teplotách) a jejich kontrolu,
experimenty za nestandardních podmínek by měly být provedeny, co nejdřív je to možné v průběhu
vývoje sloučeniny.
5.7.1. Termomikroskopie
Termomikroskopie, nebo mikroskopie s vyhřívaným stolkem, je rychlá a univerzální technika,
s jejíž pomocí lze charakterizovat malé množství vzorku na základě sledování jeho chování při
zahřívání a ochlazování s využitím polarizační mikroskopie. Termomikroskopii vyvinuli Ludwig a
Adelheid Koflerovi ve 40. letech 20. století pro identifikaci organických látek a farmaceutických
materiálů na základě studia jejich chování při změnách teploty (Vitez a kol. 1998). Od té doby je
termomikroskopie důležitou analytickou technikou pro charakterizaci pevných fází při vývoji
farmaceutických látek. Vyhřívané stolky jsou využívány pro studium jednotlivých látek, pro zjištění
jejich teplotně závislého chování, nebo pro studium vzájemné interakce dvou látek při různých
teplotách (Kuhnert-Brandstätter 1971).
V případě jednotlivých látek jsou s využitím termomikroskopie snadno určeny diagnostické
vlastnosti jako: rovnovážná teplota tání, důkaz rozkladu, zjištění čistoty, desolvatace, sublimace, a je
rychle
zjištěn
termodynamický
vztah
mezi
matastabilními
polymorfy
(McCrone
1957).
Termomikroskopie je v mnoha laboratořích skutečně často využívaná jako jedna z nejrychlejších, na
množství vzorku nenáročných a nejvíce informativních technik, s jejichž pomocí lze zkoumat
polymorfní charakter sloučeniny.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
169
McCrone (1975) popisuje několik testů, v nichž může být termomikroskopie použita pro zjištění,
zda má sloučenina nějaké polymorfní formy, nebo zda jsou dva vzorky dvěma různými polymorfy
jedné sloučeniny. Tyto testy, při nich se předpokládá, že se sloučeniny při zahřívání a tání
nerozkládají, zahrnují zahřívání několika krystalů rozptýlených na podložním sklíčku a jejich
pozorování při tání, zjišťování zda stabilnější forma krystalizuje, ať už spontánně nebo na okolních
kapičkách.
Často používaný test, určitě ten nejestetičtější, spočívá v pozorování krystalizace v tenkých filmech
taveniny mezi zkříženými polarizátory. Preparát z taveniny je připraven úplným roztavením malého
množství testované sloučeniny mezi podložním a krycím sklíčkem a následným pomalým ochlazením
(při ochlazení vyhřátého stolku) nebo prudkým ochlazením sklíčka na studeném povrchu. Tenký film
je pozorován při tuhnutí a krystalizaci. Krystalizace, pokud k ní dojde, je často rychlá, ale může trvat i
mnoho hodin a v tomto případě je nutná trpělivost. Pokud není krystalizace spontánní, může být
někdy vyvolána novým ohřátím preparátu nebo škrábáním v okolí krycího sklíčka. Transformace
jedné pevné formy na druhou je pozorována jako změna vzhledu krystalického filmu, jako je růst
nových krystalů nebo změna interferenčních barev, jak je ilustrováno na příkladu paracetamolu na
Obrázku 9.12.
V případě mnoha transformací jedné pevné formy na druhou je změna jasně viditelná při
pozorování mezi zkříženými polarizátory, jak je vidět při konverzi paracetamolu z formy II na formu I
na Obrázku 9.12, při níž rekrystalizace zapříčinila vznik hrubých krystalů. Někdy může polymorfní
přeměna v tavenině tak nepatrná, že není vizuálně pozorovatelná. Například transformace HABA
z formy II na formu III nebyla viditelná, ale byla detekována s využitím infračervené spektroskopie
(Reffner Ferrillo 1988).
Pokud v podchlazené tavenině v preparátu vykrystalizuje velmi nestabilní forma sloučeniny a poté
je přeměněna na stabilnější formu, může být transformace tak rychlá, že jediným důkazem
přítomnosti pseudomorfu je vznik zákalu (Haleblian a McCrone 1969). Tyto metastabilní polymorfy
jsou často tak nestabilní, že nemohou být izolovány za běžných podmínek krystalizace, a
termomikroskopická pozorování umožňují lépe porozumět chování polymorfů na základě screeningu
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
170
pevných forem sloučenin. Pro příklad jsou na Obrázku 9.13 znázorněny roztavené kapičky acetanilidu
(připravené rozptýlením krystalů na podložní sklíčko, bez krycího sklíčka, a jejich úplným roztavením
při přibližně 120°C), které vykrystalizovaly po podchlazení při pokojové teplotě. Metastabilní forma II
vykrystalizovala spontánně v izolovaných kapičkách ve formě redukovaných, „vějířovitých“ krystalů a
při pokračující krystalizaci se okamžitě přeměnila na formu I (McCrone 1962).
Obrázek 9.12 Preparát z rekrystalizované taveniny paracetamolu znázorňující přeměnu jedné
polymorfní formy na druhou. (1) hraniční plocha mezi dvěma sferulity skládajícími se z paprskovitých,
jemných, jehličkovitých krystalů formy II (krystalizované z taveniny při 65°C); (2) částečná přeměna
formy II na formu I po zahřívání na 120°C po dobu 10 minut a; (3) úplná přeměna na hrubé krystaly
formy I po dalších 10 minutách zahřívání na 120°C (měřítko = 100 µm)
Obrázek 9.13 Vykrystalizované kapky acetanilidu s viditelnými tmavými, vějířovitými pseudomorfy
formy II s paprskovitými krystaly formy I
Pseudomorfy formy II byly jasně viditelné jako tmavé části vrostlé ve formě I.
Při studiu preparátů z tavenin pro zjištění přítomnosti polymorfů může být pozorován růst zrn
(nebo migrace přes fázovou hranici), který může být chybně interpretován jako fázová transformace
mezi dvěma pevnými fázemi, protože oba tyto jevy mohou vypadat podobně (McCrone 1965). Růst
zrn, který je příkladem pseudopolymorfismu, je vzácný (nebo vzácně popisovaný) jev, k němuž může
dojít při vzniku pnutí v jednom nebo více směrech v krystalové mřížce anizotropní sloučeniny při její
krystalizaci z podchlazené taveniny, a to kvůli velkým rozdílům v jejích koeficientech teplotní
roztažnosti. Migrace přes fázovou hranici byla rozpoznána a dobře zdokumentována pro pesticid DDT
a pro výbušninu TNT (McCrone a McCrone 2000). Jakmile jsou krystaly s vnitřním pnutím zahřáty,
jsou žíhány a procházejí rekrystalizací v pevné fázi, při níž dojde k přesunu vnitřního pnutí a ke vzniku
nových krystalů bez vnitřního pnutí, které jsou pozorovány v preparátu z taveniny. I když růst krystalů
probíhá odlišně a nové krystaly bez vnitřního pnutí vypadají jinak než původní krystaly, jde o stejnou
krystalovou formu. Krystaly s vnitřním pnutím a krystaly bez vnitřního pnutí jsou tudíž při analýze
ostatními technikami analýzy pevné fáze nerozlišitelné. McCrone (1965) uvádí, že při rozeznání růstu
zrn od polymorfismu odhalí pozorování rekrystalizace v pevné fázi skutečnost, že krystaly s vnitřním
pnutím a krystaly bez vnitřního pnutí do sebe při zvyšování teploty vrůstají a rovnováha mezi krystaly
s pnutím a bez pnutí se mění.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
171
Farmaceutický materiál, u něhož byl zjištěn růst zrn, byla sloučenina s azolovým kruhem v
molekule (Nichols 1996). Růst zrn této nesolvatované, monomorfní sloučeniny byl zjištěn zrn při
studiu preparátů z taveniny během rutinního zjišťování přítomnosti polymorfů při vývoji sloučeniny.
Ze začátku panoval názor, že růst nových krystalů reprezentuje polymorfní přeměnu v pevné fázi
z dříve neznámé metastabilní formy. I přes rozsáhlý výzkum, zahrnující práškovou rentgenovou
difrakci při vyšší teplotě, nebyly nalezeny žádné další polymorfní formy. Prášková rentgenově
difraktometrická měření ukázala, že se krystalová mřížka sloučeniny s azolovým kruhem při zahřátí
z pokojové teploty těsně pod teplotu tání rozpíná podél jedné z krystalografických os asi čtyřikrát více
než podél druhých dvou os. Na Obrázku 9.14 je znázorněna sekvence mikrofotografií
vykrystalizované taveniny azolové sloučeniny, pořízených při růstu zrn mezi třemi paprskovitými
sferulity. Potvrzení, že došlo k růstu zrn a ne k přeměně polymorfů, bylo dosaženo zjištěním, že nové,
hrubší krystaly přestávají růst, když je teplota udržována na určité hodnotě a tedy jen část vzorku se
zbaví pnutí. Při zvýšení teploty o několik stupňů růst zrn pokračoval, protože původní nežíhané
krystaly získaly vnitřní pnutí při nové teplotě. Pro porovnání, polymorfní přeměna by začala při
specifické teplotě a pokračovala by až do konce, i kdyby byl vzorek udržován při teplotě těsně nad
teplotou přeměny.
Termomikroskopie má mimořádnou cenu při použití k interpretaci nebo potvrzení výsledků
získaných jinými technikami termické analýzy, jako je diferenční skenovací kalorimetrie (DSC).
Například během charakterizace orthorombické polymorfní formy (forma II) paracetamolu, který
vyrostl z roztoku, bylo zjištěno, že jeho teplotní chování je odlišně od téhož materiálu
krystalizovaného z taveniny (Nichols a Frampton 1998). I když výsledky práškové rentgenové difrakce
krystalů, které rostly z roztoku, ukázaly, že forma II není přítomna, diferenční skenovací
kalorimetrická analýza ukázala, že téměř nepřítomna je forma I, protože hlavní endoterma tání se
nachází u 171°C a ne u 157°C, což je teplota tání formy II (viz Obrázek 9.15). Navíc se neočekávaně
objevil velmi slabý, široký, nízkoenergetický endotermický přechod, sotva rozeznatelný nad základní
linií, se středem přibližně u 122°C. Při studiu krystalů formy II mezi zkříženými polarizátory s využitím
termomikroskopie bylo zjištěno, že samostatné krystaly formy II se přeměnily na krystaly formy I
v pevné fázi při změně teploty v intervalu zhruba 75°C, přičemž k nejvýraznější přeměně došlo
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
172
přibližně mezi 120°C a 135°C. Přibližně při 157°C několik zbývajících krystalů formy II roztálo, a
jakmile přišla tavenina do kontaktu s krystaly formy I, přeměnila se spontánně na formu I.
Obrázek 9.14 Růst zrn pozorovaný na rozhraní tří sferulitů ve vykrystalizované tavenině sloučeniny
s azolovým kruhem v molekule. Na (1) začala rekrystalizace při teplotě 65°C a, (2) po 15 minutách při
65°C, růst zrn skončil, protože zaniklo pnutí. Na (3) byl preparát pro obnovení růstu zrn zahřát na 75°C
a tato teplota byla udržována po dobu 15 minut. Na (4) může být další růst zrn vyvolán jen zahřátím
preparátu na 90°C,načež po 15 minutách skončí. Měřítko = 100 µm
Obrázek 9.15 Termogram z diferenční skenovací kalorimetrie pro paracetamol formy II krystalizovaný
z roztoku, v němž je viditelný široký, nízkoenergetický endotermický pík na přibližně 122°C
Obrázek 9.16 Mikrofotografie znázorňující přeměnu monokrystalu paracetamolu z orthorombické
formy II na monoklinickou formu I (detaily viz text)
Na Obrázku 9.16 je uvedena sekvence mikrofotografií (pořízených s použitím zkřížených
polarizátorů s citlivou barevnou destičkou pro zviditelnění všech krystalů), na nichž monokrystal
formy II, který má při 25°C (Obrázek 9.16A) přímou extinkci (protože je orthorombický) prochází
přeměnou v pevné fázi na formu I při zahřátí na 110°C. Na Obrázku 9.16B je znázorněn krystal během
přeměny (objevují se světlá místa) od dolního levého okraje podél úhlopříčky. Nakonec je přeměna
dokončena (Obrázek 9.16C) a krystal tedy již nevykazuje přímou, ale šikmou extinkci (viz 9.4.4) a musí
být otočen do nové extinkční pozice (jak je vidět na Obrázku 9.16D). Toto pozorování potvrzuje, že
krystal prošel transformací z formy II (orthorombická) na formu I (monoklinická) (Nichols 1999). Jen
pokud jsou termomikroskopická data použita pro porozumění výsledkům diferenční skenovací
kalorimetrie a jejich interpretaci, je zřejmé, že se polymorfně čisté krystaly formy II paracetamolu
přeměnily v pevném stavu tepelně indukovaným procesem vyvolaným přítomností defektů. Ty
vznikly nejpravděpodobněji při rychlém růstu krystalů formy II po naočkování roztoku.
Jiným příkladem, v němž je termomikroskopie potřebná pro vysvětlení dat z diferenční skenovací
kalorimetrie, je charakterizace polymorfů chlordiazepoxidu. Nízkoenergetický ednotermický přechod
v termogramu formy II je způsoben přeměnou jehliček formy II na malé destičky formy I (Singh a kol.
1998).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
173
Komplexní zkoumání dvou bezvodých polymorfů a hydrátu hydrochloridu 2-amino-5methylthiazolu bylo provedeno s využitím mikroskopie s vyhřívaným stolkem (Jones a McCrone
1964). Jde o vynikající příklad aplikace mikroskopie s vyhřívaným stolkem jako rychlé a spolehlivé
metody pro charakterizaci chování sloučeniny v pevné fázi.
Dosud popsané metody jsou vhodné pro jednotlivé pevné látky. Adelheid Kofler vyvinula a použila
kontaktní metodu pro studium interakcí mezi dvěma pevnými látkami, která se poté vyvinula
v cennou kvalitativní techniku, jež je využívána pro identifikaci a charakterizaci organických látek a
farmaceuticky významných sloučenin. Tato kontaktní metoda má mnoho využití, například při
zjišťování, zda enantiomerní formy sloučeniny tvoří racemát nebo konglomerát nebo zda dvě rozdílné
sloučeniny tvoří eutektikum, molekulární sloučeninu (známou také jako adiční sloučenina nebo
kokrystal) nebo pevný roztok (jako smíšené krystaly). Kontaktní metoda, zvaná také metoda směsné
taveniny Waltera McCrona (McCrone 1975), je jednoduchý a rychlý způsob zkoumání jakýchkoli
tepelně indukovaných interakcí dvou sloučenin.
Malé množství materiálu s nejvyšší teplotou tání je umístěno k jednomu okraji krycího sklíčka na
podložním sklíčku a je zahřáto k tání. Tavenina se nechá roztéct pod krycí sklíčko přibližně do
poloviny jeho plochy, poté je ochlazena a rekrystalizuje. Druhá látka (s nižší teplotou tání) je
umístěna ke druhému okraji krycího sklíčka a celý preparát je znovu zahřát tak, že jen druhá látka
roztaje, rozteče se pod krycí sklíčko a dostane se do kontaktu s první, rekrystalizovanou látkou. Při
udržení preparátu při stálé teplotě po dobu několika sekund dojde k promíchání obou látek v úzké
zóně předtím, než jsou ochlazeny a zcela rekrystalizují. Zóna, v níž došlo k promísení obou látek, je
poté pozorována mezi zkříženými polarizátory při zahřívání preparátu na vyhřívaném stolku. Po
roztavení zóny promísení látek může být pozorován jeden z mnoha jevů, které jsou dobře
zdokumentovány, takže interakce může být důvěryhodně vysvětlena (McCrone 1957; KuhnertBrandstätter 1971). Za zmínku stojí, že teploty, při nichž eutektika, molekulární sloučeniny a ostatní
fáze tají, mohou být využity pro sestrojení diagramů tání znázorňujících závislost teploty tání na
složení (jako jsou ty na Obrázku 9.17 a 9.18).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
174
Pokud testované látky neinteragují, vzniká při kontaktní metodě eutektikum a při jeho tání je
pozorován pruh kapaliny mezi dvěma pevnými sloučeninami, jehož nejvýraznějším projevem při
pozorování mezi zkříženými polarizátory je tmavý pruh. Například na Obrázku 9.17 je znázorněno
roztavené eutektikum phenacetinu a paracetamolu při 115°C.
Molekulární sloučenina (kokrystal) je snadno pozorovatelná v zóně smísení obou látek jako třetí
krystalická fáze mezi dvěma eutektiky, která se liší svými teplotami tání. Na Obrázku 9.18 je
znázorněn pruh kokrystalů s teplotou tání 98°C, který vznikl v zóně smísení mezi dvěma eutektiky při
opětovném zahřátí preparátu p-nitrofenolu a benzamidu.
Obrázek 9.17 Eutektikum (bod tání 115°C) vzniklé v zóně smísení v preparátu phenacetinu (vlevo, bod
tání 134,5°C) a paracetamolu (vpravo, bod tání 171°C)
Obrázek 9.18 Kokrystal (bod tání 98°C) vzniklý v zóně smísení mezi dvěma roztavenými eutektiky (při
84°C a 91°C) v preparátu p-nitrofenolu (bod tání 113,5°C) a benzamidu (bod tání 128°C)
Následkem pátrání mnoha vědců po kokrystalech, které by mohly zlepšit vlastnosti pevných forem
farmaceutických látek, Koflerové kontaktní metoda byla znovu zavedena jako jednoduchý a rychlý
způsob pro rychlé zkoumání dvojic látek (Davis a kol. 2004; Stahly 2007; Berry a kol. 2008).
Kontaktní metoda byla rovněž použita pro důkaz izomorfie dvou lokálních anestetik, falicaine
hydrochloridu a dyclonine hydrochloridu. Důkaz byl proveden pozorováním růstu smíšených krystalů,
ve formě pevného roztoku, v zóně smísení (Schmidt 2005).
Termomikroskopie byla úspěšně aplikována při charakterizaci enantiomerů pseudoefedrinu a
efedrin hydrochloridu jako rychlý způsob zjištění, zda jde o jednotlivé enantiomery nebo dvojici
enantiomerů (Crantz 2004). Čisté enantiomery sloučenin mají stejnou teplotu tání, a proto by při
použití kontaktní metody měly být taveny společně při stejné teplotě a ne odděleně, jako by byly
taveny odlišné sloučeniny (jak bylo popsáno výše). Když je rekrystalizovaný preparát znovu zahřát a
přitom je pozorována zóna smísení, je pozorována jedna ze tří možných interakcí: vznik racemické
sloučeniny (nebo racemátu), racemické směsi (konglomerátu) nebo pseudoracemátu (pevný roztok)
(Jacques a kol. 1994). Jelikož je studován binární systém, může být sestrojen diagram závislosti
teploty tání na složení a, jelikož čisté enantiomery tají při stejných teplotách, bude diagram
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
175
symetrický podle osy složení. Racemická směs tvoří třetí homogenní krystalickou fázi vzniklou
interakcí mezi dvěma enantiomery. Zóna jejich smísení je velmi podobná zóně smísení dvou
odlišných sloučenin, která je tvořena molekulární sloučeninou (viz Obrázek 9.18), ale eutektika po
obou stranách racemické sloučeniny mají stejnou teplotu tání. Racemická sloučenina může mít
teplotu tání vyšší, nižší nebo dokonce stejnou jako enantiomery. Racemická směs je naproti tomu
fyzikální směs, v níž nedochází k žádným interakcím mezi dvěma enantiomery, a je pozorována jako
jednotlivé eutektikum v zóně smísení, jehož bod tání bude vždy nižší než bod tání jednotlivých
enantiomerů (podobně jako eutektikum na Obrázku 9.17). Třetí, nejméně často pozorovaná
interakce se objevuje jako pevný roztok mezi dvěma enantiomery a může být pozorována v zóně
smísení jako souvislé řady směsných krystalů, které tají v širokém intervalu teplot.
Novou metodou opětovného ohřevu kontaktního preparátu za účelem pozorování zóny smísení je
umístění elektricky vyhřívaného drátu přímo nad krycí sklíčko v pravém úhlu k zóně smísení (Jones
1968). Když je teplota drátu udržována na hodnotě, při níž složka s nejvyšším bodem tání právě
roztává, vzniká lokalizovaný teplotní gradient na obou stranách drátu a zóna smísení (obsahující
eutektikum a kokrystaly) je snadno studována s využitím polarizační mikroskopie. Jde o elegantní a
velmi informativní techniku pro studium směsných tavenin, protože hranice mezi pevnou fází a
taveninou je spíše než přímkou tvořena křivkami, které vizuálně znázorňují fázový diagram závislosti
teploty tání na složení. Kromě studia kontaktních preparátů byl teplotní gradient vytvořený horkým
drátem použit pro pozorování sekvencí tekutých krystalických fází, které mohou vzniknout v případě
termotropních sloučenin (Hartshorne 1975).
Přidání okénka, propustného pro infračervené záření, na vyhřívaný stolek umožní provádění
sofistikovanějších mikroskopických experimentů. Kromě optické mikroskopie (pro pozorování
viditelných změn) může být prováděna analýza s pomocí FT-IR mikroskopie a Ramanovy
mikrospektroskopie pro detekci chemických změn potřebných pro charakterizaci solí, polymorfů a
solvátů. FT-IR termomikroskopie byla například použita při studiu fázové přeměny bezvodého
karbamazepinu (Rustichelli a kol. 2000) a dehydratace monohydrátu kofeinu při cca 46°C (Reffner
2003).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
176
Optické mikroskopické studie za nestandardních podmínek jsou často prováděny při vyšších
teplotách kvůli napodobení podmínek, jimž je materiál vystaven při zpracovávání ve velkých
množstvích. Experimenty při nízkých teplotách jsou prováděny na chlazeném stolku, což může být
vyhřívaný stolek s proudem studeného plynu. Kromě možnosti pozorovat polymorfní přeměny při
nižších než běžných teplotách spočívá hlavní aplikace této metody ve studiu zmrazených roztoků pro
optimalizaci experimentů s mrazovým sušením. Polarizační mikroskopie s chlazeným stolkem byla
použita jako jedna z technik při studii zmražených roztoků, obsahujících 3% w/v mannitolu, což je
pomocná látka používaná jako plnidlo v některých mrazově sušených produktech (Kett a kol. 2003).
Tato studie ukázala, že při ochlazení roztoku na přibližně -45°C se mannitol oddělil od krystalického
ledu ve formě charakteristických prismatických částic. Tyto částice, jež mohou být tvořeny
neidentifikovanou krystalickou pevnou formou mannitolu, nebyly předtím popsány, protože jsou
malé a ve zmražených vzorcích jich je příliš málo pro detekci nemikroskopickými metodami. Tento
objev upozorňuje na nedostatky v současných znalostech o fázových separacích farmaceutických
materiálů při zmražení.
Při studiu desolvatace hydrátů je termomikroskopie rychlou a citlivou technikou, s níž lze určit
interval teplot, v němž desolvatace probíhá (Kuhnert-Brandstätter 1971). Krystaly hydrátu nebo
předpokládaného hydrátu jsou smíchány se silikonovým olejem a pozorovány při zahřívání; při
uvolňování vody je možné pozorovat bubliny vodní páry. Pokud jsou krystaly solvatovány organickým
rozpouštědlem mísitelným se silikonovým olejem, bubliny vodní páry nebudou pozorovány. Při
zahřívání některých hydratovaných nebo solvatovaných krystalů na vzduchu a jejich pozorování
s využitím rovinně polarizovaného světla je uvolnění rozpouštědla zjištěno pozorováním změny
krystalů z čirých na zakalené za vzniku pseudomorfů. Příkladem jsou jehličkovité krystaly
monohydrátu teofilinu (vypěstované z vodného roztoku), uvedené na Obrázku 9.19, které byly při
25°C čiré a po zahřívání na 50°C po dobu jedné hodiny se staly neprůhlednými.
Bylo zjištěno, že monohydrát teofilinu rychle dehydratuje při zahřátí nad 35°C nebo při skladování
při nízké relativní vlhkosti (Byrn a kol. 1999). Některé hydráty dehydratují rovněž při vystavení vakuu,
a na Obrázku 9.20 jsou znázorněny krystaly monohydrátu teofilinu před a po uchovávání ve vysokém
vakuu (přibližně 10-3 Pa; 7,5·10-6 Torr) při přibližně 22°C po dobu jedné hodiny. Je zajímavé pozorovat,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
177
že krystaly zahřívané na vzduchu po dobu jedné hodiny jsou výrazně zakalenější než ty, které byly po
dobu jedné hodiny vystaveny vysokému vakuu. Nabízí se možnost, že krystalová voda může být při
zahřátí rychle uvolněna z objemu každého krystalu a možná mnohem pomaleji jen z povrchu při
vystavení vakuu. Při prozkoumání s využitím skenovacího elektronového mikroskopu je na povrchu
krystalů monohydrátu teofilinu skutečně viditelné množství jemných prasklin, tento jev je diskutován
v sekci 9.8.3.
Monokrystal se může při desolvataci přeměnit na polykrystal, získat mozaikovitou strukturu (jak je
vidět na Obrázku 9.5) nebo se může stát tak neuspořádaným, že se krystalová struktura zhroutí a
vznikají drobné krystalky, které mohou při pozorování mezi zkříženými polarizátory vypadat jako
izotropní (možná amorfní).
Obrázek 9.19 Krystaly monohydrátu teofilinu při 25°C (vlevo) a po zahřívání na 50°C po dobu jedné
hodiny (vpravo)
Obrázek 9.20 Krystaly monohydrátu teofilinu před (vlevo) a po (vpravo) dehydrataci pod vysokým
vakuem
Pokud je tento jev pozorován, měly by suché, desolvatované krystaly být vloženy do kapaliny
s odpovídajícím indexem lomu pro redukci jejich kontrastu, aby mohly být při velkém zvětšení
zkoumány i jemné detaily. U některých sloučenin je rozpouštědlo tak pevně vázáno v krystalové
mřížce, že jeho odpaření nemusí být viditelné, dokud krystal nezačne tát. Desolvatační děje mohou
být detegovány rovněž s využitím jiných technik, jako je termogravimetrická analýza a diferenční
skenovací kalorimetrie.
5.7.2. Stupeň vlhkosti
Vliv vodní páry nebo par organického rozpouštědla na stabilitu pevných farmaceutických látek
může být zkoumán jako součást charakterizace pevné fáze s využitím mnoha analytických metod,
jako je dynamická sorpce par, mikrokalorimetrie v perfuzní cele a prášková rentgenová difrakce při
proměnlivé vlhkosti. Pro doplnění těchto technik byla vyvinuta vzorková komora s kontrolovanou
vlhkostí (VGI 2000M ze Surface Measurement System Ltd., UK) pro použití ve spojení s optickým
mikroskopem, která umožňuje přímo monitorovat chemické a strukturní změny jako funkce vlhkosti,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
178
teploty (do 40°C) a času. Kromě optického mikroskopu může být komora s kontrolovanou vlhkostí
uzpůsobena pro vibračně spektroskopické experimenty s využitím FT-IR mikroskopie a Ramanovy
mikroskopie.
Komora s kontrolovanou vlhkostí byla využita pro pozorování a monitorování krystalizace
amorfního salbutamol sulfátu (Young a kol. 2003) a amorfní laktózy (Price a Young 2004)
v přítomnosti vodní páry. Sorpce vody na stlačené filmy, obsahující částice griseofulvinu rozptýlené
v polymerní matrici, při relativní vlhkosti v rozmezí od 0,5% do 90% byla studována s využitím FT-IR
mikroskopie (Chan a Kazarian 2004). V jiné studii bylo pozorováno, že monokrystaly bezvodého
teofilinu a karbamazepinu byly hydratovány při vysoké relativní vlhkosti, zatímco při přímém
kontaktu s hygroskopickými pomocnými látkami (polyvinylpyrrolidon K12 a K90) se hydratace obou
farmaceuticky aktivních látek změní s procesu v pevné fáze na proces probíhající za vzniku roztoku
(Salameh a Taylor 2006). Komory s kontrolovanou vlhkostí nejenže zvyšují hodnotu znalostí o
farmaceuticky aktivních látkách v pevném stavu, ale mají i velký potenciál pro výzkum a
charakterizaci sloučenin, které tvoří lyotropní mezofáze (sekce 9.7.4). Tyto komory umožňují zkoumat
uvedené soulčeniny při různých relativních vlhkostech, což je důležité při provádění výzkumu různých
formulací.
5.7.3. Stolek pro mrazové sušení
Pro optimalizaci procesu mrazového sušení (lyofilizace) pro malá množství materiálu může být
použit mikroskopický stolek pro mrazové sušení (Thomas a Cannon 2004). Tento stolek je vybaven
programem kontrolujícím zahřívání, chlazení a vakuum. Přímé pozorování vzorku při jeho mražení a
mrazovém sušení umožňuje vizuálně určit teploty, při nichž se koláč hroutí nebo dochází k tání.
Experimenty s mrazovým sušením s využitím zmražených vodných roztoků pomocné látky glycinu
byly provedeny pro kontrolu krystalizace polymorfu během přípravy produktů pro injekční podání
(Chongprasert a kol. 2001).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
179
5.7.4. Výzkum tekutých krystalů s využitím optické mikroskopie za
nestandardních podmínek
Tekuté krystaly (nebo mezofáze) se svými vlastnostmi nacházejí mezi pravými krystaly a
izotropními kapalinami (jako jsou roztoky nebo taveniny) a jako krystalické materiály mohou rovněž
vykazovat polymorfismus. Pokud farmaceutická látka tvoří kapalné krystalické fáze, může mít žádané
vlastnosti jako je lepší rozpustnost, které mohou být využity při přípravě nových přípravků.
Polarizační mikroskopie je technikou první volby pro detekci mezofází a mikroskopista by měl být
schopen rozpoznat ty znaky, které je odlišují od krystalických pevných látek. Mikroskopická
pozorování mezofází jsou značně zlepšena při studium vzorků na vyhřívaném stolku nebo v komoře
s kontrolovanou vlhkostí. Počet farmaceutických látek, u nichž byla zjištěna schopnost tvořit kapalné
krystaly, narůstá (Stevenson a kol. 2005; Bunjes a Rades 2005). Nicméně existuje mnohem více látek,
ať už ve vývoji nebo jako produkty na trhu, u nichž ještě nebyly vlastnosti kapalných krystalů
pozorovány. Z tohoto důvodu by měla být při charakterizaci farmaceutické látky (známé jako
mesogen) jako součást screeningu při výběru pevné formy zkoumána schopnost tvořit jednu nebo
více mezofází.
Sloučenina tvoří kapalné krystalické fáze při přidání rozpouštědla nebo změně teploty, nebo při
kombinaci obojího. Lyotropní mezofáze jsou dvousložkové systémy, které vznikají při rozpuštění
amfifilní látky v rozpouštědle (obvykle vodě) při určité teplotě a koncentracích rozpouštědel.
Termotropní mezofáze jsou jednosložkové systémy vznikající při zahřívání pevné látky nebo při
ochlazení její izotropní taveniny. Anizotropní sloučeniny jsou ty, které vykazují jak lyotropní, tak
termotropní chování. Lyotropní, termotropní a amfotropní mezofáze byly zjištěny u mnoha
farmaceutických materiálů (Stevenson a kol. 2005).
Mikroskopická charakterizace kapalných krystalů by měla zahrnovat pozorování s využitím
vyhřívaného stolku pro změření teplot a vlhkostí, při nichž nastávají fázové přeměny. Různé
mezofáze, jako nematická, cholesterická nebo lamelární, mají odlišné a charakteristické optické
struktury, které je odlišují od pravých krystalických pevných látek. Tyto textury mohou vzniknout
okamžitě nebo za několik minut či hodin (jak se molekuly navzájem organizují) a jsou snadno
pozorovatelné a rozpoznatelné při pozorování mezi zkříženými polarizátory (Hartshorne 1974).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
180
Obrázek 9.21 Lyotropní lamelární mezofáze lecitinu (vlevo) a termotropní cholesterická mezofáze
cholesterol acetátu při 98°C (vpravo) při pozorování mezi zkříženými polarizátory
Často mají interferenční barvy nižšího řádu (které jsou často šedé, bílé nebo žluté), což naznačuje,
že nejsou příliš krystalické. Pro ilustraci jsou na Obrázku 9.21 uvedeny dobře vyvinuté textury vodné
lyotropní lamelární mezofáze lecitinu a termotropní cholesterickou mezofázi cholesterol acetátu.
Dobře vyvinuté textury kapalných krystalů často vypadají, jakoby byly pevné a vysoce krystalické. Pro
zjištění, zda je vzorek opravdu tvořen kapalnými krystaly, je tedy zapotřebí mírně zatlačit na krycí
sklíčko a sledovat, zda dochází k pohybu preparátu a narušení textury.
Prvním znamením, že by sloučenina mohla být mezogen, je to, že se chová „zvláštním“ nebo
nepředvídatelným způsobem, jako je například vázání nestechiometrického množství krystalové vody
detekovaného během sorpce par a termogravimetrických experimentů. Při vysokých vlhkostech se
také může stát lepkavým, a poté se po vysušení změnit na pevný, vysoce neuspořádaný, jemně zrnitý
polykrystalický materiál bez dobře vyvinutých krystalů. Pokud sloučenina tvoří lyotropní nebo
termotropní mezofáze, je to jev, který není pouze analytickou kuriozitou, ale může to být cesta
k interpretaci dosud nevysvětlené vlastnosti pevné fáze, které ovlivňují například stabilitu,
hygroskopicitu a rozpustnost. Přínosem zjištění přítomnosti kapalných krystalů ve farmaceutických
sloučeninách a porozumění jejím důsledkům zahrnuje lepší kontrolu při výrobě farmaceuticky
aktivních látek, optimalizaci mletí a možnost vývoje nových přípravků. Je známo mnoho lyotropních
komerčně vyráběných léků, jako je nafcillin a leuprolid, ale málo termotropních léků, jako je
itraconazol a cyklosporin (Stevenson a kol. 2005).
Termotropní materiály jsou snadno studovány při různých teplotách na vyhřívaném stolku.
Nicméně pokud jsou s pomocí mikroskopie s vyhřívaným stolkem charakterizovány lyotropní
materiály, je potřebná opatrnost z důvodu možných ztrát rozpouštědla, které mohou způsobit
fázovou přeměnu. Tomu lze zabránit zkoumáním malého množství lyotropního vzorku v kontrolované
atmosféře s využitím komory s kontrolovanou vlhkostí (viz 9.7.2).
Sloučenina tvořící lyotropní mezofázi může být vyvinuta jako gelový přípravek nebo použita jako
„samozvlhčující se“ dávkovací forma, pokud má vlastnosti surfaktantu. Mletí lyotropní farmaceuticky
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
181
aktivní látky může být nutné provádět za velmi nízké vlhkosti, aby nedošlo ke zvlhnutí látky, která se
tím stává lepivou (i natolik, že ucpe mlýn). Další procesy využívající vodu, jako je vlhká granulace nebo
potahování tablet filmem na vodní bázi, by neměly být používány, pokud farmaceuticky aktivní látka
tvoří lyotropní mezofázi.
V případě termotropních sloučenin může být během mletí nutná pečlivá kontrola teploty, aby bylo
zabráněno vzniku lepkavých viskózních kapalných krystalů při zahřátí látky, jelikož to může způsobit
zvětšení částic jejich srůstáním. Kromě toho, pokud rozemletý materiál chladne z termotropního
stavu nebo schne z lyotropního stavu, může nekontrolovaně krystalizovat a vznikne vysoce
neuspořádaný produkt, nebo dokonce složitá směs polymorfů.
Přestože jsou ve srovnání s lyotropními sloučeninami vzácné, mají léky s termotropními
vlastnostmi komerční výhody, a když jsou objevovány nové kapalné krystalické formy, jsou využity
jako nové produkty. Například, když je hydratovaná krystalická forma kalcium fenoprofenu zahřáta
na 125°C, stává se termotropní a tato nová forma má vyšší rozpustnost (Patterson a kol. 2002).
Rovněž bylo zjištěno, že cyklosporin se při sprejovém sušení při výrobě vdechnutelných částic stává
termotropním, což zvyšuje jeho chemickou stabilitu ve srovnání s plně krystalickou solvatovanou
formou (Lechuga-Ballesteros a kol. 2003).
5.8. Skenovací elektronová mikroskopie
Skenovací elektronový mikroskop (SEM) umožňuje zobrazení vzorku s mnohem větším
zvětšením a rozlišením, než jakého je možno dosáhnout světelným mikroskopem. Obrázky
získané SEM zobrazují detail na povrchu vzorku (nebo těsně pod ním), proto jsou analogy
k obrázkům získaným pomocí světelné mikroskopie a zároveň jsou komplementární
k obrázkům z transmisní elektronové spektroskopie. Tři hlavní výhody SEM oproti světelným
mikroskopům: (1) větší zvětšení okolo 250000x (světelné mikroskopy jsou schopny
dosáhnout rozlišení až 1000x), (2) vysoká hloubka ostrosti (mnohem vyšší než jaké je možné
dosáhnout světelným mikroskopem), (3) prostorové rozlišení lepší než 3 nm (ve srovnání s 200
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
182
nm, které umožňují světelné mikroskopy). Širší pohled na využití skenovací elektronové mikroskopie
je podán v knize Goldsteina et al. (Goldstein et al. 1993 a 2003).
První komerční SEM, Stereoscan Mk.1 (vyrobený ve Velké Británii společností Cambridge
Instrument Company) na trhu dostupný od roku 1965 měl prostorové rozlišení okolo 50 nm (Breton
1999). Od té doby se SEM vyvinul z přístroje vyžadující značné odborné technické, operační a
udržovací, až po vysoce všestranný, počítačem řízený přístroj, přítomný v mnoha akademických i
průmyslových laboratořích, zabývajících se výzkumem materiálů. Díky tomuto vývoji jsou SEM
jednodušší a staly se hlavním nástrojem k určení a analýze povrchů širokého spektra materiálů. Ačkoli
jsou SEM přístupné širokému spektru uživatelů, s různou úrovní automatizace, interpretace obrázků
ze SEM stále vyžaduje vysokou úroveň dovedností a zkušeností. Nikdy by se nemělo předpokládat, že
jenom protože mají vědci k dispozici počítač, jsou okamžitě schopni ovládat SEM, zaznamenávat
vysoce kvalitní obrázky a rozumět tomu, co na nich vidí.
V současnosti je možné dosáhnout prostorového rozlišení až 1 nm využitím zdroje elektronů
s emisí pole (kapitola 9.8.1). K dosažení tohoto ultra-vysokého rozlišení musí být vzorek vystaven
paprsku dosahujícího napětí až okolo 15 kV. Avšak paprsek o takto vysokém napětí může způsobit
poškození vzorku a obzvláště u většiny vzorků organického původu může paprsek penetrovat několik
mikrometrů dovnitř vzorku, čímž dochází k překrytí a ztrátě obrázku díky rozptylu a absorpce
emitovaných elektronů. K tomu, abychom dostali obraz povrchu vzorku, SEM musí pracovat s nižším
napětím (5 kV a nižším), a proto dosahujeme pouze omezeného rozlišení. Praktické zkušenosti
dokazují, že většina farmaceutických vzorků studovaných pomocí SEM jsou analyzovatelné
s rozlišením 10000x nebo nižším, takže rozlišení nehraje až takovou roli.
Skenovací elektronové mikroskopy vytváří spoustu signálu, které poskytují cennou informaci o
většině typů vzorků, dokonce při nižším rozlišení, než při kterém pracují optické světelné mikroskopy.
Avšak při analýze neznámých vzorků je vhodné kombinovat SEM s optickou mikroskopií, které
poskytují komplementární informace umožňující lepšímu porozumění vzorku. Na obrázku 9.22 jsou
zobrazeny krystaly acetanilidu pod skenovacím elektronovým i optickým mikroskopem a, i přesto, že
jsou oba získány se stejným rozlišením, poskytují odlišné informace o vzorku. Obrázek ze SEM
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
183
ukazuje detail povrchu (jako jsou růstové kroky), zatímco krystaly pod světelným mikroskopem jsou
transparentní a jsou vidět kapalné inkluze, které mají refrakční index o hodně vyšší než silikonový olej
(R.I. = 1,403), ve kterých jsou umístěny.
Dalším typem elektronového mikroskopu používaného ke studiu materiálů je transmisní
elektronový mikroskop (TEM), který umožňuje získat obrázky tvaru a vnitřního uspořádání elektronů
v průhledných vzorcích. TEM je nejčastěji využíván ke studiu biologických vzorků a anorganických
materiálů (jako jsou kovy, polovodiče a minerály). Vzorky, studované pomocí TEM, musí být ultratenké (méně než 100 nm), zatímco vzorky pro SEM jsou obvyklé tlustší (většinou více než okolo 10
µm), aby bylo možno sledovat detail povrchu vzorku. V důsledku toho, TEM není vždy vhodným
nástrojem k analýze většiny vzorků, určených k charakterizaci solid-state vlastností farmaceutických
materiálů nebo vývoji of most formulations. Pro některé vzorky, jako například disperse liposomů,
které jsou používány jako nové systémy doručování léčiv, je vhodné použít TEM, protože SEM
postrádá zdroj rozlišení a schopnost zobrazit detail méně kontrastních vzorků (Bhareao a Raje
Harshal 2003).
Skenovací elektronová mikroskopie je široce používaná v rutinní analýze ve farmaceutickém
průmyslu, využívá se ke stanovení farmaceuticky aktivních látek (API), excipients, prášků, balicích
materiálů a kontaminací cizího původu. SEM hraje obzvláště důležitou roli ve vývoji a optimalizaci
výrobních procesů většiny lékových forem v pevném stavu, např. tablet, práškové směsi pro orální
suspenze, čípky, aerosoly k inhalaci, atd. (Schmidt 2002).
Jelikož technologický vývoj dovoluje kombinovat různé, ale komplementární analytické techniky
do jednoho instrumentu, možnosti studia solid-state vlastností materiálů jsou rozšířeny.
Až do konce osmdesátých let 20. Století bylo možno analyzovat vzorky SEM pouze za vysokého
vakua. To omezovalo použití SEM pouze na vzorky, které byly suché a elektricky vodivé (jako jsou
kovy) nebo takové, které bylo možno nanést na kovy ve formě tenkého filmu. Jeden z největších a
nejdůležitějších úspěchů vývoje SEM, které nastaly v posledních dvou desetiletí, bylo představení
SEM pracujících pod částečným vakuem, či dokonce pod kontrolovanou zemskou atmosférou, takže i
nevodivé, damp, … vzorky mohou být jednoduše analyzovány.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
184
5.8.1. Princip řádkovací elektronové mikroskopie (SEM)
V běžné SEM jsou získávány obrázky vzorků jako topografické features, které jsou pozorované
jako povrchové zdrsnění, cracks a krystalové soustavy. Přidáním speciálních detektorů, které jsou
citlivé na některou z chemických vlastností vzorků, může být SEM transformován ze zobrazovací
metody k významnému analytickému nástroji.
Na obr. 9.23 je zobrazen schématický diagram s hlavními komponenty SEM pro analytické účely.
Elektronový paprsek je emitován ze zdroje, tzv. katody, která se nachází v elektronové pistoli
umístěné v hlavě elektronově-optické kolony. K tomu, aby byl udržován stabilní zdroj elektronů a
nedocházelo ke kolizím elektronů s molekulami plynů, je elektronová pistole a kolona umístěna pod
vysokým vakuem. Elektrony jsou urychleny kolonou směrem dolů díky vysokému napětí, které je
většinou nastavené v rozsahu od 100 do 30000 V.
Obr. 9.23: Schématický diagram skenovacího elektronového mikroskopu a jeho hlavní
součásti – elektronová kolona a detektor signálu analytu.
Je dostupných několik typů katod (Goldstein et al. 2003). Nejlevnějším a nejvíce používaným
zdrojem elektronů je žhavené wolframové vlákno. Tento termický emisní zdroj je žhaven přímo
procházejícím vysokým proudem a jeho typická životnost je okolo 100 h, ale ne jako bright (má např.
nízký elektronový výtěžek) jako ostatní elektronové zdroje. Jako více brighter elektronový zdroj může
být jmenován krystal hexaboridu lanthanu (LaB6), který je žhaven nepřímo. LaB6 zdroje mají životnost
okolo 1000 h a musí pracovat pod mnohem vyšším vakuem než wolframové vlákno.
Moderní, ultra-vysoko rozlišené SEM pracují se zdrojem studeného nebo horkého emisního pole
(FE), které zaručují intensivní jas paprsku o nízkém průměru, který je takto generován. Zdroje s emisí
pole mají typickou životnost několik tisíc hodin. Ze dvou jmenovaných zdrojů, je horký zdroj
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
185
(Schottky) častěji používaný, protože má mnohem stabilnější paprsek. Výhody používání FE-SEM
v porovnání s ostatními SEM spočívají v dosažení většího rozlišení obrázků při nižším urychlovacím
napětí, zvětšení poměru signálu k šumu (dávající více kvalitní obrázky s nízkou hladinou šumu) a
zvýšení hloubky ostrosti (ve srovnání s ne-FE-SEM). Vzhledem k použití nízkého napětí také dochází
k nižšímu poškození vzorku paprskem a díky tomu, že svazek elektronů penetruje méně dovnitř
vzorku, je povrch zobrazen ve větším detailu.
Skleněné čočky v kondenzoru a objektivech světelného mikroskopu slouží k refrakci a fokusaci
světla k osvětlení a vytvoření obrazu vzorku. V SEM čočkami kondenzoru a objektivu jsou
elektromagnety s programovatelnými zdroji, které neslouží k vytvoření obrazu, ale k fokusaci
elektronového paprsku na vzorek a k osvětlení jeho povrchu. Elektronový paprsek je vychýlen tak,
aby prošel skenovacími cívkami (umístěnými obvykle v čočkách objektivu) a tím došlo k vytvoření
skenu (rastru, řádku) povrchu vzorku. Rastrovací generátor synchronizuje vychýlení elektronového
paprsku s řádkováním v zobrazovacím okně. Jas obrazu zobrazený na monitoru je nastavován pomocí
intenzity emitovaných elektronů z daného řádku povrchu vzorku.
Skenovací elektronový paprsek, fokusován pomocí čoček v objektivu, vstupuje do vzorkovací
komory a je směrován přímo na vzorek. V závislosti na použitém typu SEM, vzorkovací komora může
být pod vysokým vakuem nebo pod parciálním tlakem plynu (kapitola 9.8.4). Jakmile primární
elektronový paprsek dopadá na vzorek, elektrony a rentgenové záření je emitováno a detekováno
řadou detektorů umístěných pár milimetrů od sebe. Samotný vzorek může být posouván ve směru X,
Y a Z, otáčen a nakláněn pomocí manuálních nebo řízených polohovacích stolků.
Různého zvětšení je dosaženo změnou skenované oblasti vzorku vzhledem k fixní velikosti
zobrazujícího okna, čím menší skenovaná oblast vzorku, tím větší bude zvětšení. Skenovací
elektronový paprsek není vždy využit k získání informace o daném vzorku, může být využit
v elementární rentgenové mikroanalýze (kapitola 9.9) jednotlivých částic, např. skenovací paprsek
může být zastaven na určitém stacionárním bodě, který směřuje na vybraný bod na vzorku.
Ačkoli jsou moderní SEM docela jednoduché k obsluze, kvalita obrazu zobrazeného na monitoru
závisí nakonec na znalostech SEM operátora. K získání vysoce kvalitních a plnohodnotných obrázků je
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
186
zapotřebí vybrat a nastavit několik mechanických a elektrických parametrů (jako je pracovní
vzdálenost vzorku, jeho naklonění, urychlující napětí paprsku, korekce astigmatismu, šířka paprsku,
centrování apertury). Se zvyšujícím se urychlovacím napětím se elektronový paprsek stává více
nabitým a dostane se do nižších vrstev vzorku, čímž dojde k horšímu zobrazení povrchu. Snížením
průměru paprsku (snížení „spot size“) se zlepší prostorové rozlišení, aby se odhalily i jemnější detaily
na povrchu vzorku, což jde ale na úkor kvality signálu, protože poklesne proud paprsku (v řádu 1 až 2
nanoampérsekund), je emitováno méně elektronů ze vzorku a obraz je více zašumělý. Tomuto
problému lze často předejít pomalejším skenováním vzorku a použití digitální redukce šumu.
Stejně jako v optické mikroskopii, tvary a velikosti krystalu mohou být určeny také pomocí SEM.
Pokud je měřítko zobrazeno pod obrazem, může být využito k měření lineární vzdálenosti na vzorku.
Kontrolní software SEM zahrnuje základní analýzu obrazu dovolující určení vzdáleností, ploch a úhlů
na vzorku.
5.8.2. Příprava vzorku pro řádkovací elektronovou mikroskopii
Před vlastní přípravou vzorku je potřeba zvážit účel analýzy vzorku pomocí SEM, protože takto
můžeme ovlivnit způsob, jakým se bude vzorek připravovat. SEM operátoři pracující v různých
průmyslových odvětvích mají specifické typy vzorků, se kterými pracují a byly pro ně vyvinuty
originální způsoby přípravy těchto vzorků (DeNee 1987). Většina vzorků, se kterými se setkáváme při
charakterizaci tuhé fáze farmaceutik, jsou prášky, jednotlivé částice, pevné lékové formy (tablety a
kuličky) nebo balicí materiál (jako sklo, plasty a kov). Je životně důležité omezit manipulaci se
vzorkem na minimum a tím zabránit vstupu artefaktů a porušení povrchu. Jenom lehký dotek
povrchu vzorku může způsobit fyzické poškození při velkém zvětšení. Naštěstí příprava materiálu pro
SEM analýzu je velmi jednoduchá a zpravidla nezabere déle než pár minut. Pracovníci se zkušenostmi
v elektronové mikroskopii jsou zběhlí v navrhování specifických způsobů přípravy různých druhů
vzorků, z nichž některé mohou být opravdovou výzvou, tak, aby zajistili, že vzorek bude stabilní ve
vysokém vakuu a i poté, co na něj bude mířit elektronový paprsek.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
187
Prášky, jednotlivé částice, tablety, lyofilizované koláče, kapsule a kuličky jsou připevněny do
držáků vzorků, tzv. terčíky, pomocí různých metod. Rychle schnoucí lepidlo, stříbrný nátěr vedoucí
elektrický proud nebo uhlíkový nátěr jsou vhodné k udržení objektů velikosti až několik milimetrů,
zatímco jemné prášky a malé objekty mohou být dispergovány do oboustranné adhesivní pásky,
lepkavých podložek nebo etiket, nebo může být použitá tenká skvrna teplem tavitelného plastu.
Velké vzorky mohou být také zmenšeny tak, aby seděly na terčících, a jádra tablet mohou být
rozlomeny a řádně přitisknuty na terčík (Goldstein et al. 1992). S částicemi o velikosti 1 µm může být
manipulováno pomocí ostré jehly z wolframového drátu a mohou být automatizovány pro SEM nebo
EDX analýzu, ale k tomu jsou vyžadovány znalosti, trpělivost a zcela nehybná ruka (Brown a Teetsov
1980). Naštěstí většina vzorků ke stanovení pevné fáze farmaceutických preparátů jsou hrubé nebo
jemné prášky, které vyžadují méně náročné postupy přípravy. Prášky mohou být jednoduše sypané
nebo nalité na terčíky jako přilnavá tenká vrstva, přebytek prášku je jednoduše odstraněn pryč nebo
lehce odfouknut mírným proudem stlačeného plynu (US Pharmacopeia 2009b). Velmi rychlý,
jednoduchý a efektivní způsob rutinně používaný autorem je vložit adhezivní vložku na terčík a lehce
ji ponořit do prášku, tak aby tenká vrstva prášku ulpěla na vložce a přebytečný prášek odfouknout
pryč (je potřeba zabránit vstupu vzdušného prachu).
Za všech okolností je třeba zabránit vzájemné kontaminaci vzorků, obzvláště prášků. Jednotlivé
částice přenesené z jiného vzorku (které by byly jinak nezaznamenatelné nebo vůbec
nedetekovatelné pomocí analýzy v roztoku) se stanou součástí vzorku a vědecký úsudek může pak
být proveden na základě kontaminantu a ne analytu! Z tohoto důvodu není praktické používat
například kartáčky k nanášení práškových částic na terčík, protože by musely být buďto plně
dekontaminovány nebo vyhozeny po každém použití.
Chceme-li stanovit vzorky nevedoucí elektrický proud za vysokého vakua pomocí SEM (např. API,
pomocné látky, lékové formy a většinu primárních balicích materiálů), je potřeba je pokovit tenkou
vrstvou kovu (většinou méně než 20 nm, Goldstein et al. 1992). Různé kovy, jako např. zlato nebo
platina, mohou být použity k pokovování technikou naprašování (tyto techniky a jejich aplikace jsou
popsány v Lee 1995). Bez pokovování by vzorek poskytoval pouze čistě negativní náboj, který je
skenován s elektronovým paprskem, což může způsobit vychýlení dopadajícího elektronového
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
188
paprsku a zapříčinit tak ozáření vzorku, které pokud je přerušeno, tak způsobuje blesky a jasné pruhy
na obrazu. Kromě prevence vytvoření náboje, pokovování také zvyšuje výtěžek sekundárních
elektronů emitovaných z povrchu vzorku, což dává světlejší obrázek při nižším napětí elektrického
paprsku a pomáhá zlepšit tepelnou stabilitu odváděním tepla ze vzorku, zatímco je vzorek
bombardován proudem elektronů. Pokovení vzorku většinou není viditelné při zvětšení pod 15000x.
Při vyšších zvětšeních se stává viditelným, obzvláště při použití vysoce rozlišeného FE-SEM, jemně
zrnitá textura na povrchu může zakrývat prvky, které hledáme, nebo může být zaměněna za
skutečnou strukturu vzorku. Platina poskytuje mnohem jemnější zrnitost pokovení než zlato a proto
se používá ve vysoce rozlišené FE-SEM. Je-li vyžadováno zvětšení větší než 15000x, je možno použít i
jemně zrnité kovové povlaky, jestliže jsou vzorky podchlazeny pod teplotu prostředí během
naprašování (Goldstein 1992). V podstatě chlazení vzorku během naprašování může také ochránit
před tepelným rozkladem vzorky s nižším bodem tavení.
Abychom předešli potenciálním problémům a vyhnuli se artefaktům spojeným s pokovováním
vzorků, materiály nevedoucí elektrický proud mohou být analyzovány bez nutnosti pokovení pomocí
tzv. environmentální SEM nebo SEM s variabilním tlakem (kapitola 9.8.4). Rovněž pokud je vzorek
analyzován pomocí FE-SEM pod vysokým vakuem za urychlovacího napětí nižšího než 10 kV, není
potřeba ho pokovovat, protože energie sekundárních elektronů vyražených ze vzorku je vyrovnávána
energií vstupujícího paprsku, což eliminuje vytvoření náboje (Lee 1995).
Má-li být vzorek analyzován pomocí elementární rentgenové mikroanalýzy, je vhodnější, pokud
není pokoven, protože daný kov interferovat a v rentgenovém spektru se objeví navíc čáry kovu
použitého k pokovení. Je možné vytvoření tenké vrstvy uhlíku, avšak moderní většina moderních
prvkových analýz je schopna detegovat i lehké prvky (od boru dolů), a tudíž i tenká vrstva uhlíku
může interferovat. Avšak znovu environmentální SEM nebo SEM s variabilním tlakem dovoluje
nepokovené vzorky sledovat a analyzovat v jejich přirozeném stavu.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
189
5.8.3. Interakce elektronového paprsku se vzorkem
Při bombardování vzorku elektronovým paprskem dochází k pronikání paprsku pod povrch vzorku
až do hloubky několika mikrometrů a je rozptýlen do objemu zvaného interakční objem. Skutečná
hloubka, do které paprsek proniká je dána urychlovacím napětím paprsku (paprsek o vyšší energii
proniká hlouběji než paprsek o nižší energii) a průměrnou atomovým číslem prvků obsažených ve
vzorku (paprsek proniká hlouběji vzorkem obsahujícím lehčí prvky než těžší). Na obrázku 9.24 jsou
zobrazen různé druhy záření, které jsou emitovány vzorkem při interakci s elektronovým svazkem:
sekundární elektrony, zpětně rozptýlené elektrony, Augerovy elektrony, rentgenové záření a světlo
(Chandler 1980). Ze jmenovaných záření budou detailněji diskutovány především emitované
sekundární a zpětně rozptýlené elektrony a rentgenové záření, protože jsou každodenně využívány
ke stanovení vlastností pevné fáze farmaceutických preparátů. Další ze jmenovaných záření jsou
méně významné pro analýzu farmaceutických vzorků s výjimkou speciálních případů.
Signál, který poskytuje vzorek během bombardování elektronovým paprskem, nese jedinečnou a
doplňující topografickou a chemickou informaci, která může být zachycena pouze vhodným
detektorem pro SEM. Takže spíše než „odpadní“ a rentgenové záření, jsou součástí SEM řady
detektorů, schopny zachytit požadované záření. Některé SEM jsou schopny zachytit více různorodých
signálů a tím získat další dodatečné informace o vzorku.
Přenos energie z elektronového paprsku na vzorek, při jeho zpomalení dopadem na vzorek, může
způsobit lokální degradaci nebo dokonce roztavení některých organických materiálů. Paprsek, který
vyvolal degradaci, může být pozorován na obrázcích jako bublající (tento fenomén je často pozorován
u monohydrátu laktózy při větším zvětšení). Pokovení nevodivých materiálů vodivými vrstvami kovů
(kapitola 9.8.2) může pomoci rozptýlit teplo a redukovat poškození vzorku paprskem.
Obrázek 9.24: Druhy záření emitovaného při interakci elektronového paprsku se vzorkem
Některé vzorky, jako například kvazipevné nebo vlhké materiály, mohou být chlazeny či dokonce
mraženy pomocí studené fáze, aby bylo zabráněno rozkladu vzorku (Goldstein et al. 1992). FE-SEM
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
190
dovoluje analyzovat povrchy labilních vzorků použitím elektronového paprsku u velmi nízké energii
(např. 500 V nebo méně), což může pomoci minimalizovat nebo dokonce eliminovat zničení vzorku.
Pokud jsou pomocí SEM analyzovány hydratované nebo solvatované krystaly, je možno odstranit
vodu nebo jiné rozpouštědlo pomocí vakua. Některé krystaly zůstanou po desolvataci bez evidentní
změny, pokud je v nich voda nebo rozpouštědlo vázáno buďto velmi silně a nemůže být odstraněno,
nebo je v nich volně vázáno a pak může snadno uniknout po strukturních kanálech. Pozůstatky
desolvatace jsou obvykle pozorovatelné jako náhodně rozmístěné jemné trhlinky na povrchu krystalů
bez definované struktury nebo jako nebo jako pravidelný vzor s kontrolovanou krystalovou
strukturou. Např. na obr. 9.45 jsou zobrazeny jemné dehydratované trhliny na nakloněném konci
roviny a některých protáhlých, prismatických rovinách jehlovitých krystalů monohydrátu theofylinu.
Všimněte si, že minimálně jeden z viditelných prismatických rovin postrádá trhliny, což napovídá, že
pod vysokým vakuem (vyšším než 8 x 10-6 Torr) ztrácí tyto krystaly vodu anisotropicky. Analyzujeme-li
tyto vakuem dehydratované krystaly pomocí světelné mikroskopie, jsou-li průhledné, pak mohou být
pouze částečně dehydratovány (obr. 9.20). Je vyloučeno, aby dehydratace nastávala za použití pouze
středně vysokého vakua (okolo 0,06 Torr) během naprašování platinou. Krystaly monohydrátu
theofylinu byly naprašovány pod vakuem a podrobeny čistícímu cyklu (bez naprašování). Tyto
procesy nezpůsobily žádné zakalení krystalů, ke kterému dochází za vystavení vysokému vakuu v SEM
mikroskopu. Proto použití středně vysokého vakua během naprašování pro krystaly se slabě vázanou
vodou nebo jiným rozpouštědlem, může být vhodné k zamezení desolvatace.
5.8.3.1. Sekundární elektrony
Neelastický rozptyl elektronů, který nastává po interakci vstupujícího svazku elektronů se
vzorkem, způsobuje emisi sekundárních elektronů jako důsledek přenosu energie z paprsku na vzorek
do jeho interakčního objemu. Sekundární elektrony mají nízké energie (obvykle méně než 50 eV) a
jsou vyráženy z menší hloubky, obvykle méně než 50 nm pod povrchem vzorku. Většina SEM
obsahuje Everhart-Thornley (E-T) elektronový detektor, který je citlivý k těmto nízkoenergetickým
sekundárním elektronům.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
191
Obr. 9.25: Jemné trhliny na některých rovinách krystalu monohydridu theofylinu způsobené
dehydratací za vysokého vakua
E-T detektor obsahuje scintilátor, který přeměňuje sekundární elektrony na světelné záblesky.
Tyto záblesky procházejí světelnou trubicí do fotonásobiče, kde jsou přeměněny zpátky na elektrony,
které jsou násobeny, a tím vzniká signál, který je registrován jako zesílený proud odpovídající počtu
sekundárních elektronů emitovaných vzorkem.
Aby bylo zajištěno, že veškeré nízkoenergetické elektrony emitované vzorkem vytváří obraz a
žádné z nich se „neztrácejí“ ve vzorkové komoře, detektor sekundárních elektronů (běžně umístěný
k jedné straně vzorku) obsahuje positivně nabitou drátěnou mřížku, ke které jsou přitahovány
elektrony. Důsledkem toho, sekundární elektrony putují po zakřivených trajektoriích od místa na
vzorku až k na stranu detektoru, který nemusí být v přímé linii se vzorkem. Obrazy vytvořené ze
sekundárních elektronů bývají velmi kontrastní a vykazují skutečný detail povrchu, který
koresponduje topografickým vlastnostem, jako jsou trhliny, jamky, hrby a různé druhy povrchového
zdrsnění.
Kromě sekundárních elektronů jsou E-T detektory také citlivé k vysoce energetickým zpětně
rozptýleným elektronům, které jsou emitovány z těch oblastí vzorku, které jsou v přímé linii
k detektoru. Pokud je přepětí na mřížce E-T detektoru negativní (což není možné pro některé druhy
SEM), pak budou sekundární elektrony odráženy a obraz bude tvořen pouze vysokoenergetickými
zpětně rozptýlenými elektrony. To, co dělá obraz tří dimenzionální (obr. 9.22 a 9.25) se světlem a
stínem je kombinovaný obraz získaný ze sekundárních a zpětně odražených elektronů (které dávají
světlo částicím, které jsou ve směru k elektronům).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
192
5.8.3.2. Zpětně rozptýlené elektrony
Pokud je primární elektronový paprsek ve vzorku vystaven elastickému rozptylu, jsou emitovány
zpětně rozptýlené elektrony. Tyto zpětně rozptýlené elektrony mají větší energii než sekundární
elektrony. Jejich energie se obvykle blíží energii vstupního elektronového paprsku (až k několika kV).
Stejně jako sekundární elektrony, i zpětně rozptýlené elektrony poskytují obrazy ukazující
povrchovou topografii vzorku. Na rozdíl od sekundárních elektronů, obrazy zpětně rozptýlených
elektronů jsou nejvíce užitečné k ukázání změn chemického složení vzorků, neboť změny v průměrné
hodnotě atomového čísla se projevují jako změny světlosti napříč obrazem vzorku.
Ačkoli jsou E-T detektory citlivé k zpětně rozptýleným elektronům, běžně nejsou používány k jejich
zobrazování, protože jsou umístěny na jedné straně vzorku a tudíž většina emitovaného signálu není
zachycena. Za účelem zachytit zpětně rozptýlené elektrony, které jsou emitovány v širokém úhlovém
rozsahu, detektor musí být umístěn blízko a přímo nad vzorek. Mnoho SEM je v současnosti
vybaveno detektorem zpětně rozptýlených elektronů, který může být využit jako scintilátor a zároveň
pevný křemíkový diodový detektor. Scintilační detektor funguje stejně jako v případě sekundárních
elektronů – detekcí elektronů jako světelné záblesky (kap. 9.8.3.1), ale není zde žádná přepěťová
mřížka, která by přitahovala elektrony. Pevný křemíkový diodový detektor je tvořen čtyřmi nebo pěti
oddělenými diodami, které jsou sestaveny jako tenká prstencová deska, která je buďto fixně
připevněna na konec objektivových čoček, nebo na pohyblivém rameni. Diody mohou být zapínány a
vypínány v různých kombinacích, čímž můžeme vytvořit topografický, složený nebo kombinovaný
obrázek.
Pokud je detektor zpětně rozptýlených elektronů namontován nad vzorkem, typografický kontrast
není tak dobrý, jako by byl s detektorem sekundárních elektronů umístěným na straně. Takže
abychom dostali topografické obrazy, je vhodné scintilátor lehce vychýlit na jasnější stranu obrazu.
K tomu, abychom dostali topografické obrazy pomocí křemíkového detektoru, jsou diody odděleně
zapínány a vypínány a tím jsou elektrony snímány pouze z jedné strany prstence. Je dobré
poznamenat, že jak scintilační tak křemíkový detektor zpětně rozptýlených elektronů je také velmi
citlivý na viditelné záření, které je vzorkem emitováno jako důsledek katodoluminiscence (kap.
9.8.3.4).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
193
Výběr detektoru zpětně rozptýlených elektronů závisí na tom, jakou informaci chceme získat.
Scintilační detektory pracují dobře při nízkých napětích, avšak nejsou tak dobré jako diodové na
zobrazování rozdílů v atomových číslech. Scintilační detektory rovněž vyžadují větší prostorovou
kapacitu než diodové, což je předurčuje k práci s nízkými vzdálenostmi detektoru od vzorku
potřebnými k vysoce rozlišenému zobrazování. Ideální varianta je mít v SEM oba druhy detektorů,
čímž můžeme kombinovat výhodou obou a tím dosáhnout zobrazování širokého spektra typů vzorků.
Výhoda použití detektoru zpětně rozptýlených elektronů oproti detektoru sekundárních elektronů
spočívá v tom, že není ovlivněn elektrickým nábojem na povrchu vzorku (kap. 9.8.2). Takže jakmile
není nevodivý materiál dostatečně pokoven a je zde riziko výboje, může být zobrazen za vysokého
vakua použitím detektoru zpětně rozptýlených elektronů.
Oproti sekundárním elektronům, které pochází z vrstev těsně pod povrchem vzorku, zpětně
rozptýlené elektrony jsou emitovány z hlubších vrstev vzorku (hloubka roste se zvětšující se energií
paprsku). Důsledkem toho, obrazy zpětně rozptýlených elektronů mají nižší prostorové rozlišení než
obrazy sekundárních elektronů a zobrazují povrch v menším detailu.
Výtěžek zpětně rozptýlených sekundárních elektronů roste se zvyšujícím se průměrným
atomovým číslem vzorku. Proto, když stanovujeme API, směsi, pevné lékové formy a kontaminanty
cizího původu, změny v relativním jasu obrazu mohou odpovídat změnám v prostorové distribuci
lehkých a těžkých prvků. Materiály, obsahující těžší atomy nebo které mají vyšší průměrné atomové
číslo, vypadají světlejší než ty, které obsahují lehčí atomy. Obr. 9.26 ukazuje, jak je zobrazování
zpětně rozptýlených elektronů použito k získání topografického obrazu a rozdílů v chemickém složení
ve směsi obsahující deskovité krystaly volné báze API, které mají v průměru nízké atomové číslo ve
srovnání s jehlovitými krystaly její besylátovou solí.
Obrazy chemické kompozice ve skutečnosti nic neříkají o prvkovém složení vzorku, ale ukazují, ve
kterých oblastech vzorku se nachází prvky s vyšším atomovým číslem a ve kterých s nižším. Ke
stanovení prvkového složení se používá elementární rentgenová mikroanalýza (kapitola 9.9).
Zobrazování zpětně rozptýlených elektronů má také význam ve zkoumání upravovaných produktů,
jak je ukázáno na studii distribuce v mikroměřítku a homogenity prvků s nízkým atomovým číslem
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
194
částic léčiva dispergovaného v matrici pektinátu vápenatého, který má vyšší atomové číslo
(Sriamornsak a Thirawong 2003).
Obr. 9.26: Obrazy zpětně rozptýlených elektronů ukazující směs obsahující volnou bázi
(destičky) a bensylátovou sůl (jehličky) připraveného API zobrazené v topografickým (vlevo) a
kompozičním módě (vpravo)
5.8.3.3. Rentgenové záření v elektronové mikroskopii
Interaguje-li elektronový paprsek s atomy vzorku neelasticky, dochází k emitování ionizujícího
rentgenového záření. Pokud je atom bombardován elektronem o vysoké energii, je pravděpodobné,
že bude vyražen elektron z vnitřní elektronové slupky. To způsobí volné místo v elektronové slupce a
atom se stává dočasně ionizovaný. Elektron z vnější slupky o vyšší energii okamžitě přeskočí, aby
zaplnil prázdné místo, a zároveň dojde k vyzáření energie odpovídající tomuto pohybu elektronu.
Tato energie je emitována ve formě rentgenového fotonu. Energie a vlnová délka tohoto fotonu je
charakteristická pro daný atom (Loretto 1984). Charakteristické rentgenové záření je významný
vedlejší produkt interakce paprsku se vzorkem, protože může být využito k nedestruktivní prvkové
analýze vzorku (toto téma je blíže diskutováno v kapitole 9.9).
5.8.3.4. Katodoluminiscence
Je-li nějaká látka ozařována proudem elektronů, může lumineskovat a emitovat záření o vlnové
délce v oblasti od blízkého ultrafialového, přes viditelné až k blízké infračervené oblasti. Tento emisní
proces, tzv. katodoluminiscence, je většinou využívána v analýze anorganických materiálů (jako jsou
minerály a polovodiče), avšak hodně organických sloučenin mohou také poskytovat charakteristická
spektra, která mohou být analyzována za použití spektrometru zakomponovaného v SEM (De Mets et
al. 1974).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
195
5.8.3.5. Environmentální SEM a VP SEM (mód s proměnným
tlakem - „variable pressure“ mód)
Farmaceuticky aktivní krystaly a prášky jsou spíše elektricky nevodivého charakteru, a pokud je
chceme analyzovat s paprskem vysoce energetických elektronů za vysokého vakua, elektrony
nemůžou pronikat do země. Důsledkem toho, nevodivé vzorky vyžadují vytvoření negativního náboje,
který často vede k horší kvalitě obrazu, jelikož se vstupní paprsek občas odrazí. Chceme-li se
vyvarovat nabíjení, jsou vzorky většinou pokovovány velmi tenkou vrstvou kovu (kapitola 9.8.2) a tak
mohou být vzorky zobrazovány a elektronové mikrografy zaznamenávány bez rušivých artefaktů.
Vzorky, analyzované za vysokého vakua, musí být také suché, avšak fyzikální změny, jako zmenšení či
dokonce roztříštění krystalů může nastat, odstraňujeme-li vodu nebo jiné rozpouštědlo za sníženého
tlaku (kapitola 9.8.3). Proto byla vyvinuta metoda stanovení vzorku pomocí SEM v jejich přirozeném
stavu bez jakéhokoli pokovování.
První environmentální skenovací elektronový mikroskop (ESEM), kterým je možno analyzovat
vlhké vzorky, je komerčně dostupný od roku 1988. Tato metoda je jednou z posledních novinek na
poli skenovací elektronové mikroskopie (Danilatos 1991). Molekuly plynu jsou ve vzorkové komoře
pozitivně ionizovány a takto jsou bombardovány elektronovým paprskem. Mrak iontů v okolí vzorku
bude neutralizován negativním nábojem v procesu zvaném nábojová kompenzace (Stokes 2008).
ESEM dovoluje stanovovat nevodivé vzorky, vlhké i suché, v jejich přirozeném stavu za použití
širokého rozsahu parciálních tlaků v komoře s minimální přípravou vzorku a bez pokovování. Tato
metoda vyžaduje zachování elektronově optické kolony a (obzvláště) komory s elektronovým dělem
pod vysokým vakuem, za použití systému různých pump je vzorková komora udržována pod tlakem
blízkým atmosférickému a je částečně naplněna plyny, včetně vzduchu a vodní páry (Danilatos 1991).
To, že vzorková komora obsahuje plyn, znamená, že dochází k jakémusi postrannímu rozptylu
elektronového paprsku, tzv. skirting, neboť dochází ke kolizím elektronového paprsku s molekulami
plynu (Stokes 2008). Tomuto rozptylu by mělo být zamezeno ve vysoce rozlišených studiích, protože
paprsek nemůže být zaostřen tak jemně, jako by tomu bylo za vysokého vakua, nicméně zkrácením
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
196
dráhy paprsku (výběrem kratší pracovní vzdálenosti) je možno tento efekt minimalizovat. Je možno
také optimalizovat tlak plynu a tím eliminovat nabíjení vzorku, čímž je možno minimalizovat rozšíření
paprsku, a zlepšit tak kvalitu obrazu (Carlton 1999).
Jeden z důvodu, proč mnoho vědců využívá ESEM je, že vzorky netřeba pokovovat před vlastním
stanovením. Další SEM, kde se nemusí před stanovením pokovovat a má zároveň nižší náklady, je VPSEM (variable pressure SEM) (Mathieu 1996). Stejně jako ESEM i VP-SEM má oddělený systém vakua
vzorkové komory a elektronové komory, takže kolona je udržována pod vysokým vakuem, zatímco
řízené množství plynu (většinou vzduchu) je přiváděno do vzorkové komory. Rozdíl mezi ESEM a VPSEM je ten, že v ESEM, vzorky můžou po dobu stanovení zůstat vlhké, protože je zajištěna rovnováha
mezi kapalnou vodou, kterou obsahuje vzorek, a vodní párou ve vzorkové komoře. Ve VP-SEM není
možno naplnit vzorkovou komoru, takže vlhké vzorky velmi rychle uschnout za sníženého tlaku plynu.
Pokud je důležité stanovit vlhké vzorky nebo zjistit efekt přidané vody do vzorku, pak by měla být
požitá ESEM. Ačkoli obrazy nevodivých vzorků zobrazované ESEM nebo VP-SEM ukazují to, co
chceme vidět, obrazy pokovených vzorků budou vždycky jasnější a s lepším rozlišením detailů
povrchu, protože kovy mají vždycky lepší elektronová výtěžky než na uhlík bohaté vzorky a zároveň
protože paprsek nemůže penetrovat příliš hluboko pod povrch vzorku.
Není vždy nutné použít ESEM ke stanovení vlhkých vzorků. Poslední inovace přinesly WETSEM TM,
která umožňuje stanovovat plně hydratované vzorky za vysokého vakua. Jedná se o kapsli
s elektronově transparentním oknem, ve kterém jsou hydratované vzorky hermeticky uzavřeny a
udržovány ve vlhkém prostředí, zatímco jsou analyzovány pomocí zpětně rozptýlených elektronů
(Behar 2005).
S nárůstem používaní ESEM ve farmaceutickém výzkumu, jsou objevovány nové aplikace této
jedinečné metody. ESEM je označován jako nástroj nevyčíslitelné hodnoty k charakterizaci
mechanismu uvolňování léčiv z biologicky rozložitelných polymerních matric a studiu širokého
rozsahu přípravků a farmaceutických materiálů, jako jsou emulze, tablety, polysacharidy a krystaly
solí (DÉmanuele a Gilpin 1996). Další příklady zahrnují např. stanovení prostorové distribuce
hydratovaných částic nedokromilu sodného na laktózovém nosiči v inhalačních přípravcích (Clarke et
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
197
al. 1998) nebo schopnost sledovat dehydrataci a rehydrataci liposomů obsahujících rozpuštěné léčiva
(Mohammed et al. 2004).
ESEM je bezpochyby cenným nástrojem ke studiu vlhkých vzorků a její funkčnost je rozšířena i na
stanovení zmražených vzorků, pokud je použit mrazící stolek. Toho se využívá jako způsoby podpory
vývoje a optimalizace cyklů vysušování vzorků v laboratorním měřítku. Fyzikální stabilita
lyofilizovaného koláče koreluje s mikrostrukturními změnami, které byly pozorovány, když zmražené
roztoky manitolu a poly(laktid-co-glykolidu) sublimovaly pod vakuem v ESEM (Meredith et al. 1996).
Ačkoli mohou být vlhké vzorky jednoduše stanoveny pomocí ESEM, tato metoda neposkytuje
nutně náhled na to, co se děje uvnitř pevné lékové formy, když se rozpouští. K tomu, abychom získali
tuto informaci, jsou k dispozici další techniky SEM; např. rozpouštění promethazin hydrochloridu
z více částicových perliček může být monitorováno pomocí SEM za vysokého vakua použitím prvkové
rentgenové mikroanalýzy k vytvoření mapy distribuce síry a chloridu v perličkách. Toho bylo
dosaženo po přípravě vzorku vymražením, čímž se odstranily vlhké perličky z rozpouštěcí lázně
v daných časových intervalech. Perličky byly mraženy v tekutém dusíku a následně rozlomeny, aby
bylo odkryto jejich jádro, a udržovány zmražené během analýzy (Wilding et al. 1991).
5.8.4. Kvantitativní analýza SEM obrazů
Obrazy ze SEM ukazují dostatečné množství informací o tvarech, velikostech a povrchových
vlastnostech API, pomocných látek, pevných lékových forem i obalových materiálech. Vyhodnocení
těchto obrazů většinou provádí zkušený operátor, který může volit parametry obrazu tak, aby
zdůraznil specifické rysy povrchu vzorku a použít je ke srovnání obrazů z předchozích experimentů.
Toho vyhodnocení je kvalitativní a subjektivní, ale je adekvátní k mnoha situacím. Pro analytické
potřeby a kvantitativní srovnávání mezi různými vzorky, toto visuální hodnocení není dostatečné.
Mnoho SEM má ve svém softwaru zakomponovány nástroje k určení např. vzdálenosti mezi
jednotlivými vzory na obrazu nebo plochy vybraných objektů, jimiž jsou analyzovány vzorky.
Kvantitativní analýza obrazu je možná po převedení do formátu vhodného k analýze obrazu (daný
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
198
softwarový balíček může a nemusí být součástí SEM). Schopnost přesně analyzovat obrazy umožňuje
určit velikost částic a jejich 2D tvary (BéruBé et al. 2003; Feddah a Davies 2004; Tinke et al. 2005).
Tato schopnost je vhodná pro mnoho aplikací a je často užívána k podpoře vývoje produktů.
Kvalitnější rozlišovací výkon SEM umožňuje měřit velikosti částic, které by byly příliš malé pro
světelnou mikroskopii (Jillavenkatesa et al. 2001). Jak jako ve světelné mikroskopii, příprava vzorku
pro skenovací elektronovou mikroskopii je rozhodující pro zajištění dostatečné disperze částic. Při
provádějí analýzy obrazu k získání velikosti a tvaru částic, může široká škála šedi mezi světlými a
tmavými oblastmi v obrazech sekundárně rozptýlených elektronů způsobit problémy při vybírání
prahu kontrastu rozlišujícího mezi částicemi, které nás zajímají a pozadím. Abychom předešli těmto
problémům v analýze obrazu sekundárně rozptýlených obrazů, jež mají obvykle menší počet šedých
odstínů a méně výrazné okrajové efekty, je možné dosáhnout lepších výsledků prahováním snímků.
Během vývoje suchých práškových inhalačních přípravků bylo zjištěno, že mikroskopické
povrchové zdrsnění částic laktózového nosiče má značný vliv na jemné frakce částic léčiva spojené
s manipulací s přístrojem a doručováním léčiva do plic (Chan et al. 2003). Proto schopnost měřit
povrchové zdrsnění u takto malých částic je výhodné k získání optimální výroby produktů,
soudržnosti ve kvalitě pomocných látek a robustnosti výroby. Použití SEM k řešení těchto problému
je evidentní, avšak donedávna bylo kvantitativní měření (nebo povrchová profilometrie) topografie
povrchu časově i pracně velmi obtížné. Používaly se další mikroskopické techniky jako konfokální
laserová skenovací mikroskopie a mikroskopie atomárním sil (Entwistle 1996). Použitím SEM k určení
jemné struktury povrchu částic, např. laktózy, je potřeba dávat pozor při výběru kovu k pokovování
(platina), aby byl povrch dostatečně jemný a nezakrývaly se rysy, které chceme vidět. Pokud je to
nutné, je analyzovat nepokovené vzorky pomocí ESEM nebo VP-SEM.
Je možno získat pomocí 3D obrazy zaznamenáním páru elektronmikrografů (jeden pro pravé oko a
jeden pro levé) s obrazem vzorku umístěným pod eucentrickým úhlem mezi 5 až 10° vzhledem
k ostatním obrazům. Tyto mikrografy představují stereo pár a dovolují vnímání hloubky na vzorku
viděné jako stereoskopický pohled (binokulární pohlížení) pouhým okem nebo použitím softwaru
k převedení obou obrazů do jednoduchého, dvojbarevného anaglyfu, který můžeme pozorovat
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
199
použitím červeno-zelených nebo červeno-modrých brýlí. Tyto obrazy poskytují mnoho informací a
ukazují předtím neviditelné topografické rysy na vzorku. Ale jsou kvalitativní, protože skutečnou
hloubku (z) je těžké nebo dokonce nemožné změřit.
Naposledy vyvinutý 3D software k vytvoření rekonstrukce obrazu, nazvaný MeX® (Alicona Imaging
GmbH, Rakousko) využívá principu stereo-fotogrammetrie k vytvoření povrchové profilometrie.
Použití tohoto softwaru v SEM umožňuje využití nejen jako zobrazovacího nástroje, ale také jako
mikrometrický nástroj (Scherer a Piffer 2003). Stereo pár zaznamenaný s přesně definovanou
vzdáleností a úhlem měření, nebo trojce obrazu pro větší přesnost, je měřen SEM a importován do
MeX®. 3D topografické rysy vzorku, jako je povrchové zdrsnění krystalů, struktura filmem potažených
tablet nebo výška růstu kroků na povrchu krystalů, můžou být jednoduše vizualizovány a
kvantifikovány, jak je zobrazeno na obr. 9.27.
5.9. Prvková rentgenová mikroanalýza
Interaguje-li svazek vysoce energetických elektronů se vzorkem, je emitováno rentgenové záření,
charakteristické pro daný prvek. SEM s detektorem a spektrometrem rentgenového záření je
významným analytickým nástrojem, který umožňuje nedestruktivní analýzu vzorku.
Obr. 9.27: Elektronmikrograf zobrazující kroky růstu na povrchu API krystalu. 110 µm dlouhý
topografický profil (A-B) ukazuje 6,7 µm vysoký krok mezi body (XX)
Jsou dostupné spektrometry, které detekují rentgenové záření a zároveň dispersní, schopné
vytvořit rentgenové spektrum s emisními čarami, které korespondují s detekovanými prvky,
v závislosti na vlnových délkách nebo energiích (Loretto 1984; Goldstein et al. 1992).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
200
5.9.1. Detekce rentgenového záření
Vlnově dispersní rentgenové mikroanalytické systémy (WDX) detekují při dané vlnové délce
charakteristické rentgenové záření emitované prvky od lithia (Z = 3) výše. Detektor sekvenčně
skenuje přes rozsah úhlů, čímž sbírá fotony rentgenového záření, emitované vzorkem, tak jak jsou
rozptylovány z krystalu (Braggova difrakce) ve spektrometru, a počítá je. Pečlivým výběrem krystalu
může být optimalizována difrakce vlnových délek rentgenového záření, a tím je dáno rozlišení
emisních čar nacházejících se blízko sebe. S detekčním limitem okolo 0,01 hm. % (100 ppm), WDX je
vhodnou metodou ke stanovení stopového množství většiny prvků ve vzorku. Vlnově dispersní
rentgenová mikroanalýza je vhodná ke kvantitativní prvkové analýze, protože spektrometr může být
nastaven kvantifikovat právě jeden prvek. Pokud je analyzován neznámý prvek ve vzorku, kvalitativní
analýza může zabrat několik minut, protože spektrometr potřebuje skenovat přes široký rozsah úhlů,
aby posbíral všechno emitované záření. Za účelem provést kvantitativní analýzu, musí být vzorky
rovné a velmi dobře vyleštěné, aby bylo zajištěno, že geometrie mezi elektronovým paprskem,
vzorkem a detektorem je přesně známa a je minimalizován mimo-prvkový efekt (Goldstein et al.
2003). S takovými vzorky se velmi zřídka setkáváme ve farmaceutickém průmyslu a ve vývoji léčiv
(možná s výjimkou rovnoběžně stlačených prášků), důsledkem toho, WDX má velmi omezené
aplikace a není rutinní technikou (oproti dalším průmyslově studovaným materiálům jako jsou kovy,
horniny a polovodiče, které je možno jednoduše připravit rovné a hladké).
Energiově dispersní rentgenové mikroanalytické (EDX) systémy na druhou stranu nemají žádné
pohyblivé části a je možno jimi detekovat rentgenové záření prvků (teoreticky až po bor), emitované
současně přes široký rozsah emisních energií. Rentgenové záření emitované vzorky je rozptylováno
dle jejích energií (v elektronvoltech, eV) do oddělených kanálů a distribuce rentgenového záření je
zobrazována jako píky v histogramu napříč vybraným energetickým rozsahem, např. od 0 do 20 keV.
Energiově dispersní rentgenová analýza je bezpochyby rychlejší než WDX, kvalitativní spektrum může
být zaznamenáno během pár vteřin. Nejlehčí detekovatelný prvek závisí na použitém detektoru, což
bude diskutováno později. Ačkoli elementární data můžou být zaznamenány rychle, EDX nemá tak
dobré rozlišení čar blízko sebe jako WDX, a proto je detekční limit EDX pouze okolo 0,1 hm. % (1000
ppm). Stejně jako v WDX, i v EDX je možná kvantitativní analýza, ale vyžaduje stejné podmínky na
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
201
rovné a hladké vzorky. Jelikož je EDX velmi rychlá technika, je častěji než WDX používána v kvalitativní
nebo (v nejlepším případě) v semi-kvalitativní analýze a je častěji aplikovatelná pro prvkovou
mikroanalýzu ve farmaceutickém průmyslu (Tanninen et al. 1990).
Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza je vhodná pro rychlý a nedestruktivní screening
prvků ve vzorcích, což pak může být využito pro vybrané vzorky k další přesnější analýza pomocí
metod, jako je atomová absorpční (AA) spektroskopie nebo hmotnostní spektrometrie s indukčně
vázaným plasmatem (ICP-MS). Zbytek kapitoly proto bude zaměřen právě na EDX.
EDX obsahuje čtyři části: detektor (umístěný pouze pár milimetrů od vzorku), vícekanálový
analyzátor (spektrometr), počítač (který má zakomponovaný rentgenový pulsní procesor k rozlišení
mezi různými rentgenovými zářeními a počítač rentgenových pulsů) a zobrazovací monitor.
Většina EDX v současnosti používaných detektorů je složena z pevného, tzv. „lithium-drifted“
silikonového krystalu, který je chlazený pomocí tekutého dusíku nebo Peltierového článku. K ochraně
krystalu v prostředí vzorkové komory slouží obvykle tenké fóliové (beryllium nebo polymer) okénko
před krystalem, propouštěcí rentgenové záření (Goldstein et al. 2003). Prvky lehčí než sodík (Z = 11)
emitují rentgenové záření o nízké energii, jež je pohlceno tenkým beryliovým okýnkem. Tudíž mnoho
moderních detektorů mají ultratenké polymerové okénko, které umožňuje detekci lehčích prvků až
po bor (Z = 5) nebo nemají okénko a jsou schopny detegovat i beryllium (Z = 4). Bezokénkové
detektory mohou být používány pouze v ultračisté vzorkové komoře, která se nachází pod vysokým
vakuem, kde olej, uhlík a vlhkost nemohou kondenzovat na studeném silikonovém krystalu.
Bezokénkové detektory proto nejsou použitelné v kombinaci s ESEM a VP-SEM.
5.9.2. Rentgenové emisní spektrum
Počet emisních čar charakteristického EDX spektra jednoho prvku závisí na složitosti jeho
elektronové struktury. Pro lehké prvky, jako je uhlík (Z = 6), který má pouze dva elektronové obaly, je
dovolen pouze jeden elektronový přechod (kap. 9.8.3.3); a proto spektrum obsahuje pouze jednu
emisní čáru. Těžší prvky, které mají více elektronových obalů, poskytují také složitější spektra bohatší
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
202
na emisní čáry. Např. měď (Z = 29) má 6 možných rentgenových emisních čar, zatímco velmi těžký
atom, jako je olovo (Z = 82), může mít 13 emisních čar. Elektronový paprsek o urychlovacím napětí 20
kV má dostatečnou energii excitovat charakteristické rentgenové záření všech prvků od beryllia.
S ohledem na to excitovat dostatečné rentgenové záření ze vzorku, obzvláště pro kvantitativní
analýzu, je potřeba proud elektronového paprsku adjustovat výběrem vhodné velikosti bodu (kap.
9.8.1). Pokud je proud paprsku příliš velký, je produkováno příliš mnoho rentgenového záření a
detekční systém může být přetížen. Přebytek signálu také může způsobit artefakty ve spektru, jako je
spojení nebo zaniknutí některých čar a tím bude spektrum ještě složitější (Goldstein et al. 2003). Tyto
artefakty mohou být zaměněny s reálnými čarami, ale obvykle je lze odlišit od skutečného spektra,
protože jejich pozice jsou předvídatelné a identifikovatelné pomocí analytického softwaru.
Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza je universální metodou a může být využita k analýze
prvků přítomných ve velkém množství farmaceutických pevných materiálů, jako jsou API, pomocné
látky, práškových směsí, pevných lékových forem, částic cizího původu a obalových materiálů.
Nejlepší je analyzovat vzorky v jejich přirozeném, nepokoveném stavu, abychom eliminovali
interferující píky, pocházející z pokovování. Např. EDX spektrum zaznamenané ve VP módu z binární
směsi obsahující stálou laktózu (obsahující lehké prvky: C, H a O) a lék, obsahující lehké a těžké prvky
(C, H, O, S a Br) je ukázáno na obr. 9.28. Spektrum obsahuje všechny čáry prvků detekovaných ve
vzorku, které jsou zobrazeny jako graf energie rentgenového záření (v keV) versus intenzita čar (puls
za sekundu). Všimněte si, že emisní čáry (okolo 1,49 keV, 11,91 keV a 13,3 keV) náleží bromu, protože
je relativně těžší vzhledem k ostatním přítomným prvkům.
5.9.3. Energiově dispersní rentgenová mikroanalýza jednotlivých
částic a mapování prvků
Energiově dispersní rentgenovou mikroanalýzou může být analyzována široká oblast vzorků a to
skenováním pomocí elektronového paprsku nebo v jednotlivých bodech, jestliže je skenování
vypnuto (tzv. spot mode). Obě metody mají své výhody, skenování umožňuje analýzu v roztoku,
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
203
zatímco „spot mode“ dovoluje přesné lokalizování prvků, které jsou určovány v heterogenních
vzorcích v prostorovém rozlišení okolo 10 µm (ve VP módu není lepší než 20 µm). Díky pronikání
elektronového paprsku, může být rentgenové záření excitováno z chemicky odlišného prostředí nebo
oblastí pod povrchem vzorku, které nejsou viditelné v SEM obrazech, čímž může stoupnout riziko
zavádějících interpretací rentgenových dat. Dávat bychom si měli pozor především při analýze malých
částic obsahující lehké prvky (ty které jsou menší než 5 µm v průměru), neboť rozptýlený paprsek
v interakčním objemu (kap. 9.8.3) přesahuje objem samotných částic a může být detekováno i
rentgenové záření ze substrátu.
Obr. 9.28: EDX spektrum prášku obsahující binární směs laktózy a API s jeho
charakteristickými čarami pro brom a síru emitované z API
Důkaz, že vzorek obsahuje pevnou fázi s různým prvkovým složením, může být získán, jestliže je
napřed zobrazen obraz zpětně rozptýlených elektronů (kap. 9.8.3.2). Např. obraz zpětně rozptýlených
elektronů pro binární směs prášku analyzovaného pomocí EDX (Obr. 9.28) je ukázán na obr. 9.29b,
kde prostorová distribuce světlých částic léčiva (obsahujících síru a brom) je jasně viditelná. Metoda,
která má být využita k mapování prostorové distribuce vybraných prvků ve vzorku, vyžaduje EDX
systém, který bude kontrolovat vychýlení elektronového paprsku v SEM. To dovoluje EDX
automaticky detekovat před vybrané prvky ve vzorku a zobrazit je v digitální bodové mapě (Goldstein
et al. 2003). Je-li vybraný prvek skenován paprskem napříč vzorkem, body (např. pixely) v daném
místě jsou přidány do mapy. Po několika záznamech, oblast, která má detekovatelné koncentrace
prvků, je zobrazena jako oblast s body s vysokou koncentrací. Obr. 9.29b zobrazuje bodovou mapu
distribuce bromu napříč obrazem ukázaným na obr. 9.29a. Všimněte si, že rentgenové záření
emitované některými částicemi léčiv nebyly dříve detekovány nebo pouze jejich část. Je tomu tak
proto, že detektor rentgenového záření, oproti BSE detektoru, není přímo nad vzorkem, ale je
umístěný na jedné straně (níže napravo) a je nakloněný pod úhlem 45° ke vzorku. Důsledkem toho je
z povrchu částic emitováno pouze to rentgenové záření, které je v přímé linii s detektorem, a to je
zaznamenáno (protože rentgenové záření se pohybuje přímočaře). To znamená, že rentgenové záření
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
204
emitované chemicky různými částicemi v prášcích a dalších vzorcích s drsným povrchem není
dostatečně detekovatelné. Mapování rentgenového záření má proto omezené aplikace, obzvláště
pro prvkovou charakterizaci práškových vzorků, jako jsou práškové přípravky, protože rentgenové
záření nebude detekované ze všech částic. Naštěstí detekce rentgenového záření může být zlepšena
naklánění vzorku směrem k detektoru (jako tomu bylo dáno pro vzorek na obr. 9.29).
Kvalitativní a kvantitativní EDX analýzy mohou být prováděny pod lehkým vakuem v ESEM nebo
VP-SEM módu. Jelikož dochází k rozšíření paprsku (kap. 9.8.4), nelze zaměřit malý bod, a tak je EDX
analýza limitována na větší objekty s minimálně 20 µm v průměru (Carlton 1999).
Obr. 9.29: Binární směs čisté laktózy s API (obsahující S a Br) zobrazena pomocí zobrazování
zpětně rozptýlených elektronů (a) ukazující tmavé částice laktózy a světlé API a (b)
rentgenová distribuční mapa pro brom.
5.10.
Mikroskopie atomárních sil
Cílem této kapitoly je poskytnout základní informace k další metodě, mikroskopii atomárních sil,
používané ve farmaceutickém průmyslu, což dokládá nedávná diskuze o použití tohoto relativně
nového přístupu k analýze povrchu materiálů. Tato diskuze o principech a technikách této metody
není vyčerpávající, ale je zaměřena na nejčastěji používané přístupy (jak zobrazovací, tak i
charakterizace), které nalezneme ve farmaceutické literatuře. Je diskutována příprava vzorku a
nastavení přístroje, avšak důraz je kladen na přehled existujících farmaceutických aplikací, s cílem
ukázat jejich potenciál. Jsou také zdůrazněny rozvíjející se metody.
Mikroskopie atomárních sil je ve skutečnosti pouze jedna z široké skupiny mikroskopií, tzv.
mikroskopií se skenovací sondou (SPM). Každý člen této skupiny byl vyvinut k zobrazování různých
fyzikálních a chemických vlastností povrchů, využívající miniaturní sondy různých tvarů a popisu. Zlom
v SPM přišel se skenovacím tunelovacím mikroskopem (STM) a jeho schopností rozšířit rozlišovací
limit vlnových délek, základní fyzikální omezení kladené na světlo a na rozlišení založeném na
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
205
elektronové mikroskopii. Tento bod byl ilustrován na dnes již známém 7 x 7 křemíkovém povrchu,
ukazující opakující se vzor jednotlivých atomů (Binning et al. 1983). Jako uznání významu pokroku
poskytnutého v STM, byla udělena Nobelova cena Rohrerovi a Binningovi v roce 1986 a Ernestovi
Ruska v roce 1931 za jeho práci na vývoji skenovací elektronové mikroskopii.
Mikroskopie atomových sil byla vyvinuta jako rozšíření STM, jelikož zobrazování pomocí STM je
omezeno pouze na vodivé vzorky (Binning 1986). ATM nepracuje na principu tunelovacího proudu
mezi vodivou sondou a povrchem jako je tomu v STM, ale je zde ostrá sonda, která je upevněna na
jemné pružině tak, aby byla v kontaktu s povrchem vzorku a její pohyb po „hrbolatém“ povrchu je
zaznamenáván. Těsně po objevu ATM bylo získáno atomové rozlišení nevodivých vzorků (Albrecht a
Quate 1987). Klíčová vlastnost AFM je schopnost zobrazovat v různých prostředích, zahrnující okolní
prostředí, kontrolní plyny a kapaliny. To umožňuje zobrazování vzorku s jeho minimální přípravou a
v prostředí, ve kterém je vzorek využíván (např. za speciální vlhkosti nebo teploty). AFM se stala
obzvláště populární ve vědeckých laboratořích nejrůznějších odvětví, jakmile přišla na trh v roce
1988.
Mělo by být poznamenáno, že v současnosti existuje značné množství technik STM, které jsou
vyvinuty tak, aby zaznamenávaly fyzikálně-chemické vlastnosti různých povrchů. Což zahrnuje optické
systémy schopné lokální spektroskopické analýzy (Kirstein 1999), mikroskopy schopné studovat
magnetické (Michinobu 2003) a elektrostatické vlastnosti povrchů (Fujihira 1999) a zkoumat chování
vzorků při různých teplotách. Posledně jmenovaná, tzv. skenovací termální mikroskopie (SThM), je
obzvláště oceňovaná v analýze farmaceutik (Sanders 2000; Hussain 2004) díky relativní
jednoduchosti dat z této metody, které mohou být dále srovnávány se standardními kalorimetrickými
daty, s přidaným prostorovým odlišením, které nám poskytne STM. V posledních letech bylo rozlišení
této metody zlepšeno dokonce až k okolo 50 nm díky nástupu nanotermálních sond (Dai et al. 2009).
Popis těchto speciálních technik STM je nad rámec této kapitoly a proto je čtenář odkázán na
příslušnou literaturu (Poggi 2004; Loos 2005).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
206
5.10.1.
Princip jednotlivých technik mikroskopie atomárních sil
5.10.1.1. Zobrazování
Mikroskop atomárních sil obsahuje sondu s ostrým hrotem připevněnou na ultra-lehké a flexibilní
konzole, která se hýbe s ohledem na povrch vzorku pomocí piezoelektrického skeneru schopného 3D
pohybu s rozlišením v angströmech (Obr. 9.30). Obraz získaný pomocí takového skeneru může být
převeden do rastrovacího skenu hrotu relativně k vzoreku v xy rovině, zatímco hrot je v kontaktu
(nebo blízkosti) se studovaným povrchem. Přesněji řečeno, získaná data nejsou přímým obrazem
povrchu, ale ukazují, jak hrot AFM sondy interaguje s povrchem. Pokud je tato interakce konstantní (k
tomu dochází, pokud je vzorek homogenní), pak jsou AFM data přímým obrazem povrchu vzorku.
Bohužel heterogenita vzorku může zapříčinit vliv na data, která nemůžou být spojeny jednoduše
přímo s topografií. Tento zdánlivý problém je ve skutečnosti skvělou příležitostí, neboť řízením
povahy a úrovně hrotu a tím interakcí, můžeme sledovat nejen topografii, ale i složení a interakce
v nanoměřítku.
Obr. 9.30: Schématický diagram hlavních komponent mikroskopu atomárních sil
Tudíž jak je hýbe AFM hrot napříč povrchem, je monitorován rozsah interakcí hrot – povrch, který
odráží škálu fyzikálních vlastností. Např. v kontaktním módu AFM, je zaznamenávána odchylka
konzoly pomocí laserového paprsku odrážejícího se ze zadní části pomocné konzoly. Obvod zpětné
vazby je pak využit k nastavení z-pozice skeneru, tak aby byla zachována konstantní výchylka a tím i
interakce hrot – povrch.
Různé typy konstrukce instrumentu přispívají k vysokému rozlišení zobrazování v AFM. Ostré
hroty v nanoměřítku poskytují dobrou citlivost povrchové topografie. Nízká tuhost pružiny konzoly
spolu s optickou detekční metodou umožňuje sledovat slabé síly (10-11 N), čímž AFM snadno a
jednoduše dovoluje studovat síly mezi farmaceutickými materiály.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
207
Ačkoli kontaktní mód, jak byl již dříve diskutovaný, má vysoké prostorové rozlišení, má také své
omezení. Nejvýznamnější z nich je fakt, že během zobrazování jsou na vzorek aplikovány značné
postranní síly, tak jak je hrot postupně posouván napříč povrchem. To může vyústit ve dva
potencionální problémy. Ten první je spojen se skenovacím hrotem, který může být poškrábán při
zobrazování tvrdého materiálů a tím ztupěn, čímž se sníží jeho rozlišovací schopnost. K druhé
možnosti může dojít během zobrazování měkčích materiálů, jako třeba polymerů, některých
pomocných látek nebo biologických materiálů, které mohou být důsledkem postranních sil
poškozeny.
Další část se zabývá alternativní zobrazovací strategií, tzv. poklepovým módem. V tomto módu
jsou postranní síly redukovány tím, že hrot osciluje v jeho rezonanční frekvenci (nebo frekvenci blízké
rezonanční, 70 – 350 kHz v závislosti na typu vzorku) (Zhong et al. 1993). Intermitentní charakter
interakce vzorku a hrotu snižuje díky oscilacím postranní síly, které působí jak na hrot, tak i na vzorek.
Poklepový mód pracuje jako zobrazování amplitudy (nebo fáze) oscilace hrotu v jeho rezonanční
frekvenci (měření výchylky hrotu). Ztráta kinetické energie zapříčiněná volnou vibrací konzoly
přibližující se k povrchu vede ke vzniku intermitentního kontaktu s povrchem (Brandsch et al. 1997).
Tato energetická ztráta může způsobit změnu (obvykle pokles) v oscilační amplitudě v monitorovací
frekvenci. Zpětná vazba má udržovat konstantní oscilační amplitudu během skenování a nutné
úpravy se používají k vytvoření topografického obrazu v poklepovém režimu.
Rovněž může být zaznamenávána amplituda oscilace hrotu a fázový posun mezi excitační
frekvenci a odpovědí hrotu. Výsledné fázové obrazy jsou užitečným nástrojem v mapování
heterogenních povrchů. Ačkoli je často získán kontrastní obraz, je interpretace fázových posunů
obtížná a závislá na výše zmíněných parametrech poklepového režimu. Kontrast ve výsledných
obrazech může být přisuzován faktorům jako elasticita a disipace energie (Brandsch et al. 1997),
hydrofobicita (Chen et al. 1998a) a adheze (Finot a McDermott 1997). Tato data jsou omezena, avšak
poskytují informaci kvalitativního charakteru, která může sloužit k posouzení lokálních vlastností
vzorku. Poslední verze oscilačních režimů AFM jako je režim pulsních sil (Gigler et al. 2007) a
HarmoniXTM (Mullin et al. 2009) mohou poskytnout podobné odlišení složek v heterogenních
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
208
površích, ale poskytující kvantitativní informaci o vlastnostech jako je elasticita, adheze nebo
houževnatost.
Zobrazování kapalin, jež mají vztah k farmaceutické analýze, je možné pokud to dovoluje
dynamický charakter, jako je rozpouštění a zvětšování objemu. Zobrazování pod kapalinou může být
provedeno v kontaktním i poklepovém módu, jak bylo popsáno výše. Nicméně postranní síly
vyskytující se v kontaktním módu mohou často způsobit zničení vzorků, jelikož vzorky bývají často
jemnější po ponoření do kapaliny. Poklepový mód může snížit postranní síly, avšak běžné
implementace poklepového módu pro kapaliny většinou dosahují efektu tzv. „lesu píků“. K tomuto
nárůstu signálů dochází, protože v kapalinách je více akusticky excitovaných rezonančních píků, kvůli
dodatečnému tlumení. Nedostatek jedinečných rezonančních signálů vede ke ztrátě kvality obrazu a
snížení stability. Nabízejí se zde dva možné přístupy. První přístup spočívá v magnetickém ovládání
magneticky pokovené konzoly, čímž se vytváří efektivní energetický přenos a redukuje se počet
rezonančních píků (Han a Lindsay 1998). Alternativní přístup spočívá v aplikaci Q-kontroly (Rodriguez
a Garcia 2003), kde faktor kvality rezonance hrotu je elektronicky modifikován, aby také zlepšoval
výkon v kapalinách.
Tzv. měření silových vzdáleností dovoluje detailně studovat interakce mezi hrotem (často
s přiloženou definovanou chemickou vlastností nebo částicí) a vzorkem. Silová měření jsou
zaznamenávána měřením výchylky konzoly, když je hrot a vzorek napřed spojen a pak zase odpojen
od sebe. Rozsah výchylky konzoly (x) může být ve vztahu s působící silou podle Hookova zákona,
upravený o konstantu tuhosti pružiny konzoly k:
F = -kx
Data jsou zaznamenávána z různých míst na povrchu, obvykle v bodech, které byly zaznamenány
na předchozím obraze (např. fázový obraz může být využit k lokalizaci různých složek na
heterogenním povrchu).
Existují také různé křivky silových vzdáleností založené na experimentu v poklepovém módu.
V tomto případě je zaznamenávána amplituda a fáze oscilujícího hrotu jako separovaná funkce, která
roste v pořadí křivek amplituda-fáze-vzdálenost (a-p-d). Tyto křivky mohou také obsahovat informaci
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
209
o interakčních silách mezi sondou a substrátem. Navíc fázová křivka může pomoci lokalizovat
přitažlivé a odpudivé interakční módy, které mohou vést ke zvýšení stability fázových obrazů (Chen et
al. 1998a).
Mapování vlastností povrchu je umožněno díky rozšíření měření lokalizovaných silových
vzdáleností nebo měření amplituda-fáze-vzdálenost na záznam řady takových datových bodů napříč
oblastí na povrchu. Např. v případě měření silových vzdáleností je každý pixel složen z křivky silové
vzdálenosti, a ta obsahuje všechny detaily interakcí mezi sondou a povrchem v určitém místě.
Zobrazování sil v prostoru dovoluje prostorové mapování různých interakcí hrot-vzorek napříč oblastí
povrchu, což je užitečné k posouzení heterogenity vzorku (Radmacher et al. 1994). Z datového setu
mohou být také extrahována topografická data a tak heterogenní rysy mohou být vztaženy
k výškovým rozdílům vzorků. Takové řady křivek silových vzdáleností mohou být dávkově zpracovány
a získány tak mapy odvozených vlastností, včetně tvrdosti a adheze (Baselt a Baldeschwieler 1994;
Schonherr et al. 2000).
5.10.1.2. Příprava vzorku
Tak jak tomu bývá u všech analytických metod, výběr vhodné metody přípravy vzorku k AFM často
určuje úspěch či neúspěch. Nutným požadavkem k získání vzorku vhodného k AFM analýze je
zajištění dobré adhezivity částí komponent k přiloženému skeneru tak, aby skener a vzorek působil
jako rigidní celek. Pokud je použita adhezivní páska k upevnění vzorku, musíme upevnění provést tak,
aby se vzorek nemohl pohybovat a nemohlo tak dojít k topografickému zkřivení. Rovněž je třeba
zajistit, aby fixní prostředky nebo lepidla nebyly z těkavých složek, které by mohly kontaminovat
povrch vzorku. Obzvláště prášky je velmi těžké uchytit, jelikož jsou většinou velmi přilnavé a je těžké
je dispergovat. Jako dostatečně efektivní metody uchycení se jeví zalití částic do měkkého kovu jako
je indium nebo pokrývání tenkými vrstvami lepidla a následné posypání práškem (Baldwin et al.
1996). Výběr zobrazovacího módu může také ovlivnit stabilitu prášku během zobrazování, obzvláště
kontaktní módu může způsobit odtržení lehce přichycených částic díky postranním silám (Mechler et
al. 2001).
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
210
5.10.2.
Aplikace AFM ve farmaceutické analýze
5.10.2.1. Morfologická analýza
Mikroskopie atomárních sil je asi nejznámější pro její schopnost produkovat vysoce rozlišení 3D
obrazy povrchové morfologie s rozlišením, které je nemožné pro konvenční mikroskopii. Takovéto
obrazy umožňuje vytvořit během minut ze vzorku, který prošel minimální přípravou. Avšak vzorek
nesmí být příliš zdrsněný, protože by bylo velmi obtížné pro AFM sondu vést dráhu po jeho povrchu.
Je také důležité zdůraznit, že pod AFM může být najednou zobrazováno pouze malé množství vzorku
(typický obraz nepřekračuje velikost 5 – 20 mikronů), a proto chceme-li vytvořit reprezentativní obraz
vzorku, může to nějaký čas trvat.
Povrchová struktura má vliv na to, jakým způsobem materiál interaguje a to naopak ovlivní
farmaceutickou produkci. Příkladem může být vliv různých inženýrských postupů výroby částic na
vlastnosti prášků. Je dobře známo, že konvekční metody zmenšování velikosti částic jako mikronizace
může značně zvýšit zdrsnění takto zpracovaných částic, což vede k těžce zpracovatelným až příliš
kohezivním práškům. Jako vhodná alternativa se jeví použití sofistikovanějších metod zmenšení
velikosti částic jako je kapalinou zesílená disperze pomocí superkritických kapalin (SEDS), která
umožnuje získat lepší kontrolu nad vlastnostmi povrchu. Metoda AFM poskytuje kvantitativní
srovnání těchto různých metod zpracování.
Na obr. 9.31 je srovnání AFM povrchového zdrsnění krystalů paracetamolu, jejichž velikost byla
zmenšena pomocí mikronizace a SEDS metody. Pro oba příklady jsou zobrazeny různé částice
v zobrazené v poklepovém módu a byla stanovena průměrná hodnota drsnosti. Na 3D data sety byly
aplikovány různé algoritmy výpočtu hodnot drsnosti. V tomto případě je uvedena střední kvadratická
hodnota drsnosti, která byla vypočtena z odchylek každého bodu obrazu ze střední roviny
procházející prostředním bodem obrazu. Abychom byli schopni srovnání mezi různými vzorky, měření
drsnosti musí být vždy aplikováno na stejnou oblast vybranou tak, aby zahrnovala požadované rysy.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
211
Obr. 9.31 také ukazuje typický topografický obraz materiálu po zpracování metodou SEDS. Je možno
vidět, že povrch částic je rovný až na úroveň vlastních krystalových stop. Měření drsnosti závisí na
vlhkosti, proto by měla být uvedena, aby umožnila interpretovat adhezní chování částic (Berard et al.
2002). Zmenšování velikosti částic až na sub-mikronové částice se jeví jako velmi efektivní přístup
k zlepšení biologické dostupnosti ve vodě hůře rozpustných léčiv. To ovšem znamená výzvu
v charakterizaci takovýchto částic. AFM byla použita k potvrzení rozsahu zmenšení částic pomocí
„nanomletí“ (Shi et al. 2003). Distribuce velikostí získaná z AFM obrazu poskytuje výbornou korelaci
k hodnotám získaným pomocí metod rozptylu světla. Rozsah velikostí částic okolo 100 nm byl určen
jak pro již zmenšené částice, tak i pro částice stanovované během procesu zmenšování. Mezi další
přístupy kvantifikace AFM obrazů patří určování fraktální dimenze, metoda, která byla použita pro
mnoho farmaceutických materiálů (Li a Park 1998). Byla také více použita k získání unikátního
náhledu na vznik a růst krystalů (Ward 2001).
Obr. 9.31: Nahoře: Srovnání AFM povrchové drsnosti paracetamolových krystalů, jejichž
velikost byla zmenšována pomocí mikronizace a SEDS metody. Dole: Graf odchylek
povrchových zdrsnění se škálou pro tyto dva materiály.
Vysoce rozlišené AFM rovněž umožňuje zobrazování krystalových forem nanočástic léčiv
z kapalinové disperze a pevných lékových forem, které prošly ultramikrotromií k určení jejich
velikostí, tvaru a distribuce (Shi et al. 2003). Nanočástice každé lékové formy byly navzájem podobné
se středním průměrem 95 nm a průměrným poměrem 1.3. Distribuce velikostí částic stanovená
pomocí AFM souhlasí s daty naměřenými pomocí skenovací elektronové mikroskopie s emisním
polem, statického rozptylu světla a měření kalnosti pomocí RTG.
Jelikož pomocí AFM je možno analyzovat kapaliny a následné dynamické procesy na povrchu
v nanoměřítku, byla tato metoda aplikována k charakterizaci dynamických procesů jako rozpouštění,
uvolnění léčiva z matrice nebo potahování tenkou vrstvou (Ward 2001). Bylo to znázorněno na
srovnání rozpouštěcích rychlostí dvou různých rovin Aspirinu ve vodných roztocích (Danesh et al.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
212
2001). Před začátkem experimentu bylo známo, že (100) a (001) roviny mají různé rozpouštěcí
kinetiky, avšak původ tohoto jevu nebyl znám. AFM měření byla konstruována tak, že povrch
jednotlivých krystalů Aspirinu byl nastaven na požadovanou rovinu. Aby byla demonstrována
schopnost rychle měřit data, rychlost skenování byla navýšena na 40 Hz. Podmínky byly nastaveny
tak, aby zahrnovaly rozpouštěcí rychlost, jejíž dynamika mohla být pozorována při těchto skenovacích
rychlostech AFM během přidání 0,05 M HCl do čistého vodného média. Na obr. 9.32 je zobrazena
série obrazů zaznamenaných po sobě pro (001) rovinu. Aby bylo ukázáno, že nedošlo k žádnému vlivu
skeneru, pozice neměnných artefaktů je označena na obrazu. V tomto případě je vidět, že
rozpouštění pokračuje po ustupujících krocích hran, jak je ukázáno na vybrané hraně
označené šipkou.
Naproti tomu sekvenční řada obrazů pro (100) rovinu ukazuje jiný rozpouštěcí mechanismus, viz
obr. 9.33. Zde můžeme pozorovat klesající krystalové řady podle toho, jak se rozpouští aktivní složka.
Podrobná analýza sekvenčních obrazů umožnila stanovení průměrné rychlosti krokového pohybu
hrany a pokles krystalových teras (17 nm.s-1 a 2,93 nm.s-1).
Obr. 9.32: Série AFM sekvenčních obrazů zaznamenaných pro rozpouštění (001) roviny krystalu
Aspirinu.
Obr. 9.33: Sekvence AFM obrazů zaznamenaných pro rozpouštění (100) krystalové roviny Aspirinu.
Navíc na základě určení rychlostí a znalosti objemu rozpouštědla může být stanovena vnitřní
rozpouštěcí rychlost pro každou rovinu. Bylo ukázáno, že vnitřní rychlost rozpouštění pro (100) rovinu
je přibližně šestkrát rychlejší než pro (001) rovinu.
Mikroskopie atomárních sil také upozorňuje na výskyt některých faktorů, které mohou vést
k různým rozpouštěcím rychlostem. Srovnáním drsnosti obou rovin na základě určení pomocí AFM
bylo zjištěno, že (100) rovina má vyšší drsnost, což také odpovídá většímu povrchu k rozpouštění.
AFM experimenty, ve kterých byly použity chemicky modifikované sondy, byly využity k získání
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
213
relativní smáčivosti dvou rovin (Danesh et al. 2000b). V tomto experimentu byly zaznamenány křivky
„amplitudy-fáze-vzdálenosti“ s využitím sond modifikovaných pomocí methylových (hydrofobní) a
karboxylových (hydrofilní) samoskladných vrstev (z angl. Self-assembled monolayers, SAM), viz obr.
9.34. Srovnáním a-p-d křivek bylo možné určit relativní afinity hydrofobních a hydrofilních vrstev ke
každé krystalové rovině. Uvědomíme-li si, že stupeň interakce mezi sondou a substrátem, indikován
jako dolina na křivce fáze-vzdálenost, dokazuje, že (001) rovina vykazuje nejlepší afinitu k hydrofobní
sondě a ukazuje na přítomnost hydrofobní povrchové chemie. Naproti tomu (100) rovina vykazuje
nejvýraznější interakce s hydrofilní sondou, což naznačuje na přítomnost hydrofilních funkčních
skupin. Tyto závěry zároveň korespondují s rozpouštěcími daty, které dokazují, že více smáčitelná
rovina se rozpouští rychleji. Podobný přístup byl aplikován na jiný model krystalů ve farmacii a ukázal,
že AFM je schopno stanovit specifické vlastnosti rovin (Muster a Prestidge 2002).
Obr. 9.34: Křivka „amplituda-fáze-vzdálenost“ měřená pomocí AFM sondy modifikované
s methylovými (hydrofobními) a karboxylovými (hydrofilními) skupinami samoskladných
vrstev (SAM)
Schopnost vizualizovat krystalizační procesy pomocí AFM v nanoměřítku je využívána v mnoha
dalších oborech, včetně krystalového růstu proteinů (Yip et al. 1998; Ching-Erh et al. 1996). V tomto
případě rozlišení molekul dovoluje studium modifikací krystalových struktur nebo zabalování
krystalů. Ve studiu materiálů, jako je sádrovec nebo koordinační polymery, byl umožněn unikátní
pohled na růst a struktury krystalových modifikací v různých pufrovaných prostředích. Tyto výhody se
dostávají do vedení a poslední využití v analýze farmaceutik zahrnuje vizualizace procesů „habit
modification“, obzvláště efekt oktanové kyseliny na růst kyseliny adipové (Keel et al. 2004). In situ
zobrazování odhalilo vznik etch-pit (leptání-jámy) během rozpouštění a rychlý růst při větším
přesycení. Jasné změny byly pozorovány v krokové morfologii a růstovém módu po přídavku
oktanové kyseliny až do bodu, kdy krystal přestane růst.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
214
Schopnost fázového zobrazování pomocí AFM prostorově rozlišit povrchové vlastnosti
v nanoměřítku byla dokázána, aby byla umožněna polymorfní diskriminace. V případě léčiva
Cimetidin, jež existuje ve dvou polymorfních formách (A a B), bylo ukázáno, že fázové obrazy mohou
detekovat přítomnost obou forem, viz obr. 9.35 (Danesh et al. 2000b). Podobným způsobem, jaký byl
popsán výše, a-p-d křivky dosahují charakteristických tvarů pro každou z forem, což umožňuje jejich
jednoznačnou identifikaci.
Výhody fázového zobrazování byly rovněž využity k identifikaci složek biodegradabilních směsí,
založených na faktorech jako je relativní hydrofobicita (Chen et al. 1998b) nebo mechanických
vlastnostech stanovených jako lokální stupeň krystalinity (Magonov a Reneker 1997).
Obr. 9.35: AFM fázové zobrazení rozlišující mezi dvěma polymorfními formami Cimetidinu
(velikost obrázku 2µm x 2µm).
Obr. 9.35: Fázová separace styren:izobutylenových bloků kopolymerů ve stentu, uvolňujícím
léčivo – TaxusTM, a fázová separace léčivem plněné polymerové vrstvy a povrchová
morfologie po uvolnění léčiva.
Tyto studia vedly následně k aplikaci AFM a umožnili navržené mechanismy, narušení polymerních
směsí (Shakesheff et al. 1995a), uvolnění léčiv z polymerních matric (Shakesheff et al. 1995b),
kontrolované uvolnění pilulek (Ringqvist et al. 2003) a polymerních mezostruktur stentů (Ranade et
al. 2004) a nanoenkapsulace (Oliva et al. 2003). Jako příklad nám může posloužit obr. 9.36 (Ranade et
al.), který zobrazuje nejen fázovou separaci styren:isobutylenových bloků kopolymerů v TaxusTM, ale
rovněž fázovou separaci léčivem plněnou polymerovou vrstvu a povrchovou morfologii po
uvolnění léčiva.
Schopnost mikroskopů atomárních sil vizualizovat a zkoumat povrchy v nanoměřítku byla také
v poslední době využita k řešení klíčového problému v charakterizaci pevné fáze farmaceutik –
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
215
detekci nízkých množství amorfního materiálu. Je evidentní, že malé množství amorfní fáze přítomné
v přípravcích, které jsou označovány jako krystalové formy, může fungovat jako „hot spot“
k transformaci fyzikální formy. Např. amorfní materiál je schopen poskytnou základ k polymorfním
konverzím a v některých případech k chemické degradaci. Povrchové amorfní fáze jsou obvykle
mimořádně nestabilní vůči vlivům prostředí.
Např. poslední studium ukázalo, že AFM má potenciál stát se mapovacím nástrojem povrchových
amorfních domén (Ward et al. 2005). V této studii modelový systém povrchových amorfních domén
Sorbitolu byl vytvořen lokalizovaným ohřátím pomocí SThM sondy. Tím došlo k vytvoření chladem
vytvořených domén mikronových velikostí. Následně byla tato modifikovaná oblast a okolní
krystalové fáze charakterizovány pomocí poklepového módu, obr. 9.37. Mimo modifikovanou oblast
byla morfologie pozorovaná jako regulérní krystalová struktura s hranicemi, které byly zdůrazněny
pomocí fázových obrazů.
Obr. 9.37: AFM obrazy původního (nahoře) a chladem modifikovaného amorfního (dole)
sorbitolu (vlevo topografický a vpravo fázový obraz).
Obrazy s vyšším rozlišením ukázaly jemnou strukturu skládající se z rovnoběžných pruhů. Tato
vlastnost se vyskytuje díky lamelám, pravidelným latím z krystalického materiálu, obklopeným méně
uspořádanými oblastmi. Vysoce uspořádané lamely jsou lehce hustší a tužší než okolní, umožňující
detekovatelný fázový posun. Naproti tomu modifikované domény Sorbitolu vypadají jemnější bez
pravidelných morfologických struktur. V tomto případě odpovídající fázové obrazy ukazují malé
kruhovité oblastí světlejšího kontrastu. Tyto oblasti mohou odpovídat malým, více uspořádaným
oblastem, které jsou pozůstatkem původních krystalových struktur nebo důkazem malých
rekrystalizovaných oblastí.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
216
5.10.2.2. Analýza lokálních interakcí mezi sondou a vzorkem
Zobrazování založené na přístupu zobrazeném na obr. 9.37 spočívá v kvalitativní interpretaci
obrazových vlastností; nicméně AFM je schopno i kvantitativního rozlišení krystalové a amorfní fáze
díky analýze kontaktních oblastí křivek síla-vzdálenost, viz obr. 9.38. Je zřejmé, že amorfní fáze
ukazuje větší odsazení při daném zatížení, znamenající, že je jemnější než pravidelně balená
krystalická fáze. Aplikací Herzova deformačního modelu na zvolenou sekci odsazené křivky je možné
kvantifikovat Youngův model pružnosti (Davies et al. 2005) a tak získat numerickou identifikaci dvou
fází. Navíc rozdíl ve ztuhlosti a tvaru křivky síly-vzdálenosti v kontaktní oblasti rovněž rozlišuje dvě
fáze. Zatímco krystalizační křivky ukazují přiblížení a odstoupení dat, které se překrývají, křivky
zaznamenané pro amorfní fázi mají posun mezi přiblížením a odstoupením. To ukazuje na hysterezi
plněnými a neplněnými materiály a viskoelastické deformační reakce ve srovnání s elastickou
krystalizační formou.
Zářezová metoda v nanoměřítku popsaná výše otevírá další možnosti aplikací. Hlavní výhoda
testování materiálu pomocí AFM spočívá v tom, že potřebujeme pouze malé množství vzorku
k analýze. To by mohlo umožnit analýzu v raných fázích vývoje, předpovídat a vytvořit opatření pro
budoucí přípravky. Například spolu s detekcí amorfního materiálu je známá schopnost formulovat
materiál pomocí přímé komprese v závislosti na jeho deformačních vlastnostech, platí, že plastické
chování je upřednostňováno k elastickému.
Obr. 9.38: Analýza kontaktních oblastí křivek síla-vzdálenost vzorku Sorbitolu zobrazených na
obr. 9.37.
Jak bylo ukázáno výše, AFM je schopno rozlišit mezi těmito dvěma deformačními módy a tak
teoreticky umožnit včasnou indikaci uvolnění přípravku ve fázi selekce pevné fáze. Povrchová
smáčitelnost je další vlastnost, která může být zkoumána pomocí měření silových vzdáleností. Jelikož
je AFM sonda vtahována od vlhkého povrchu, výsledné kapilární síly uchytí AFM hrot na povrchu.
Tato síla může být měřena a následně korelována k tloušťce vrstvy vodního filmu (Dey 2000) a efektu
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
217
topografie v nanoměřítku na smočeném povrchu (Hooton 2004). V souvisejícím přístupu, kde bylo
využito „frictional measuremets“ (tření) mezi AFM sondou a povrchem bylo rovněž možno měřit čas
potřebný k vytvoření takovýchto kapilárních mostů (Szoszkiewicz 2005).
Obzvláště užitečným rozšířením AFM měření silových vzdáleností ve farmaceutické analýze bylo
přidávání jednotlivých částic farmaceuticky aktivních prášků do AFM hrotu a následné použití tohoto
materiálu k modifikaci dalších příslušných vzorků (Roberts 2005). Do doby než se stala tato metoda
přístupnou, přímé hodnocení interakcí částice-částice a částice-zařízení spoléhalo na dávno zavedené
metody, které pracují s velkým počtem částic, jako je centrifugace (Larsen 1958; Podczeck 1997).
Zatímco může být získán náhled na potenciální soudržnost a přilnavost vyrobených přípravků, získaná
data odhalují pouze málo z povahy a vzájemných ovlivňování některých základních sil (např. van der
Waalsovy, elektrostatické nebo kapilární síly). Přístup k těmto informacím by mohl přinést nejen
odhad složení, ale také by pomohl určit základy požadované modifikace částic a její optimalizace. Je
důležité podotknout, že jednotlivé částice „přilepené“ na AFM konzolu mohou být použity na sérii
srovnávacích měření zkoušející různé substráty. Navíc, jestliže zároveň zobrazujeme, může být
využita schopnost AFM pracovat v různých prostředích, jako je například prostředí s kontrolovanou
vlhkostí nebo v kapalinách.
Mnoho skupin využilo tento potenciál, obzvláště v oblastech terapií založených na inhalaci, kde
znalost interakcí mezi částicemi léčiva a pomocné látky a komponent zařízení je kritická k výrobě
úspěšného produktu. Z širšího pohledu experimentální strategie sledované do dnešního dne lze
rozdělit do dvou skupin: (1) hodnocení interakcí mezi vybranými materiály nebo (2) pokus o
kvantitativní stanovení vlastností jako je adheze nebo povrchová energie z pohledu nejen hodnocení,
ale i srovnání dat z dalších AFM experimentů a také z výsledků dalších technik. V jedné z nejstarších
publikací Louey et al. (2001) byla využita metoda měření stahovacích sil mezi modelem sondy z
koloidního oxidu křemičitého a laktosových částic použitelných jako nosiče v inhalačních přípravcích
na bázi suchých prášků (DPI). Sindel a Zimmermann (2001) aplikovali AFM jak kvalitativně, tak i
kvantitativně ke studiu sil interakcí mezi laktosovými substráty. Tento výzkum odhalil vliv morfologie
kontaktních drsností a povrchového zdrsnění a přímou souvislost těchto charakteristik k adhezním
silám. AFM byla také využita k hodnocení silových interakcí Salbutamolu s materiály určenými jako
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
218
inhalační nosiče v následujícím pořadí: sklo > laktóza > Salbutamol > polytetrafluoroethylen (PTFE).
Bylo zaznamenáno, že PTFE TRIBO-nabíjení nastalo po opakovaném kontaktu (Eve et al. 2002). Vliv
relativní vlhkosti byl předmětem mnoha studií. Young et al. (2004) ukázali, že soudržnost léčiv se
zvyšuje za zvýšené vlhkosti pro některé materiály, zatímco pro jiné klesá, pravděpodobně důsledkem
atraktivních elektrostatických interakcí dlouhého dosahu. Bylo ukázáno, že různorodost morfologie
kontaktních částic stejných materiálů je také příčinou podobného chování za zvyšující se vlhkosti
(Hooton et al. 2004). Za pomocí AFM efektu vytvořit amorfní složku na povrchu částic léčiva
Zanamiviru bylo ukázáno, že roste jeho afinita k povrchu laktosových nosičů (Berard et al. 2002).
Schopnost zaznamenat data v kapalinách byla také využita ke kvantifikaci a hodnocení interakcí na
modelu pohonné hmoty představující tlakem dávkovaný inhalátor (pMDI) (Hooton et al. 2003; Young
et al. 2003a; Ashayer et al. 2004; James et al. 2009).
Alternativní měření k měření interakcí mezi dvěma komponentami je zpochybnění sondy o
známém složení k určitému povrchu a tak určit jeho povrchovou energii (Zhang et al. 2005). Tímto
způsobem mohou být získány hodnoty povrchové energie jednotlivých částic s možným
prověřováním, jak bylo popsáno dříve pro nano-odsazovací metodu. Obecně je možné vidět, že AFM
poskytuje velmi flexibilní platformu, přizpůsobitelnou k širokému spektru experimentálních
geometrií. Poslední příklady určování interakcí mezi AFM sondou pokovenou železem a několika
léčivy k simulaci interakcí lisovaných tablet (Wang et al. 2003), silových interakcí bublin
v průmyslovém zpracování hornin (Nguyen et al. 2003) a určení třecích sil (Ecke et al. 2001) – na
rozdíl od adheze – jsou možnými příklady.
Nevýhoda měření dat jednotlivých částic a z opravdu malých procent povrchů těchto částic je že,
někdy je těžké vytvořit návaznost těchto dat na chování v roztocích. Vlastnosti roztoků, jako je tok
prášků, nutně zahrnují řadu vzájemně souvisejících faktorů a proto jednotlivé měření vlastností na
malých množstvích vzorků nemůže představovat jednoduchý model. Nicméně zde byl vytvořen
pokrok, např. v oblasti predikcí toků prášků z AFM interakčních měření (Jones 2003; Weth et al.
2001). Podobně se Perkins et al. (2009) zabýval lokalizovanými silovými měřeními k určení distribuce
povrchové energie a hodnot modulů pružnosti na třech polymorfních formách Karbamazepinu za
použití těchto hodnot k predikci jejich chování během mikronizace.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
219
Využití AFM adhezních měření se sondami modifikovanými specifickými skupinami umožnilo další
pohled do povahy studovaných interakcí. Od té doby, kdy Danesh et al. Ukázal hodnotu tohoto
přístupu ve farmaceutické analýze prostřednictvím identifikace specifických krystalových rovin
Aspirinu (Danesh et al. 2000b), množství autorů rozšířilo aplikace modifikovaných sond do různých
odvětví. Např. Sheng et al. Naposledy použili AFM adhezní měření k určení efektu bílkovin z moči na
různé krystalizační roviny krystalů monohydrátu oxalátu vápenatého (související s ledvinovými
kameny) pomocí karboxylátem a amidiniem modifikovaných AFM sond (Sheng et al. 2005). Souhrnně
tyto měření měly demonstrovat, že adheze funkčních skupin a vazba rozpustných aditiv, včetně
makromolekul z moči, je v přírodě vysoce specifická na krystalové povrchy a naznačuje cestu
k lepšímu pochopení onemocnění s ledvinovými kameny a navrhuje lepší vývoj terapeutik.
5.10.3.
Vyhlídky do budoucnosti
Závěrem bychom rádi podotkli, že AFM měření v krátkém časovém období přinesly řadu nových
náhledů na farmaceutickou analýzu přes jedinečnou schopnost mapovat topografii a další povrchové
vlastnosti s nesrovnatelným rozlišením a k tomu s časovým rozlišením, které umožňuje sledovat
procesy jako rozpouštění, uvolnění léčiv nebo růst krystalů. Stále více dalších využití AFM k měření
interakcí mezi složkami prokazují význam AFM, obzvláště v odvětví vývoje inhalačních zařízení.
Zatímco zde jen krátce zmíněná možnost různých AFM modifikací a s nimi spojené vyrobené
skenovací sondy k simultánnímu měření topografie a dalších fyzikálně-chemických vlastností, jako je
nabíjecí a termální chování, ukazuje, že je očekáváno, že mnoho těchto technik nové generace se
stane běžně používanými.
Očekáváme, že se objeví schopnost analyzovat velmi malé množství materiálu pomocí AFM, který
by mohlo být více použitelné v prověřovacích aplikacích a screeningu. Umíme si představit, že
techniky schopné přinést informace o rozpouštění, tvrdost, přilnavosti, soudržnosti a povrchové
energii jednotlivých částic se budou setkávat se současnou potřebou získat detailní charakterizaci API
pokud možno v časných fázích vývoje.
Ltd. ISBN: 978-1-405-13494-1
220

Spektrální a další charakterizační metody

Transkript

Podobné dokumenty

Minulý týden s velkým rámusem padl server megaupload, tento

ibuprofen rekrystalizační rozpouštědlo

ibuprofen rekrystalizační rozpouštědlo

Základní principy vývoje nových léčiv (OCH/ZPVNL)

12. Predikce polymorfů

ibuprofen rekrystalizační rozpouštědlo

Termická analýza

SKP

âESKÁ SPOLEâNOST PRO BIOCHEMII A MOLEKULÁRNÍ

Úvod do chemie léčiv

enalapril polymorfní

LÉKOVÉ FORMY PRO ŘÍZENÝ A CÍLENÝ PŘÍVOD LÉČIV

VODOHOSPODÁŘSKÉ INŽENÝRSTVÍ A ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ

Témata seminárních prací

Horská medicína stručně

Jak na CV a přijímací pohovor